Système musculosquelettique

Deux trous sont percés dans le crâne de chaque souris, de part et d'autre de la suture, puis comblés par impression laser de cellules et de matériaux directement sur la plaie. 130 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées deux mois après l'opération pour mesurer la repousse osseuse. Sept séances d'IRM de trente minutes sous anesthésie s'échelonnent du premier au trente-cinquième jour, cadence que le porteur classe comme non douloureuse. Parmi les bénéfices annoncés figure le dépôt de brevets sur les nouvelles formulations de bioencre, à côté de l'optimisation de la station de bioimpression du laboratoire.

Objectifs

Les pertes de susbtance osseuse, d'origine traumatique, tumorale ou dégénérative, constituent actuellement un problème majeur de santé publique. Les solutions thérapeutiques actuelles présentent toutes des limites et des risques (manque de disponibilité, infections, douleurs au niveau du site de prélèvement, rejet immunitaire). C'est dans ce contexte que se sont développées les stratégies d'ingénierie tissulaire osseuse. De précédentes études ont démontré l'intérêt des technologies de bioimpression pour produire des substituts osseux avec des propriétés optimisées, mimant fidèlement le tissu osseux natif et avec une prévascularisation permettant de limiter le risque de nécrose du greffon. De récents travaux ont pu démontrer la faisabilité d’imprimer des biomatériaux et cellules à l'aide de la Bioimpression Assistée par Laser (LAB) directement au niveau de défauts osseux crâniens chez la souris, pour favoriser une meilleure vascularisation et régénération osseuse. Malgré des résultats prometteurs, les conditions expérimentales n’ont pas permis une régénération osseuse complète. Par ailleurs, l’un des principaux obstacles rencontrés dans un précédent projet concernait l’imagerie et le suivi en temps réel des motifs imprimés in vivo. L'objectif principal de ce nouveau projet est d'optimiser les précédents résultats obtenus en développant une nouvelle bioencre, basée sur l'utilisation d'hydrogels naturels et synthétiques associés à différentes particules minérales, ainsi que des cellules souches ou dérivés cellulaires, afin d'améliorer la régénération osseuse par Bioimpression Assistée par Laser in vivo. Le second objectif du projet est de développer une nouvelle stratégie d'imagerie par IRM pour suivre l’organisation des motifs cellulaires, la vascularisation et la maturation tissulaire avec une haute résolution. Afin de répondre à ces deux objectifs, le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet de la bioimpression in vivo combinée à de nouvelles formulations de bioencre, impliquant des nouveaux biomatériaux associés à différentes particules minérales et cellules/dérivés cellulaires. Ces résultats nous permettront d'envisager un/des dépôts de brevet dans le cadre de ces nouvelles applications. Ce projet visera également à évaluer, au niveau biologique, si des dérivés cellulaires pourraient remplacer les cellules elles-mêmes au sein d'une bioencre et si leur ajout est pertinent dans le contexte de régénération osseuse (permettant ainsi à terme de s'affranchir de l'utilisation des cellules souches). D'un point de vue technologique, ce projet constitue une étape-clé dans l'optimisation de notre station de bioimpression in situ, par l'intégration en son sein du dispositif anesthésique, les optimisations technologiques du dispositif au service d'une bioimpression plus précise et l'utilisation d'une nouvelle interface plus intuitive. Enfin, ce projet permettra de valider l'utilisation d'une nouvelle stratégie d'imagerie non-invasive haute résolution, basée sur l'IRM, pour assurer le suivi en temps des cellules bioimprimées in vivo.

Procédures

Au sein du premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ) et une procédure de bioimpression in situ (15 secondes pour l'impression en elle-même ; 5 minutes au total en comptant l'installation de la souris et le paramétrage de l'impression), sous anesthésie. Les animaux seront également soumis à l'administration d'un anti-douleur à 3 reprises (par injection intra-péritonéale) à différents temps (durée 30 secondes pour chaque injection) dans le cadre de la procédure analgésique. Au sein du second établissement utilisateur, l'acquisition de chaque séquence IRM sera de 30 minutes, sous anesthésie, et réalisée à 7 reprises (J1, J4, J7, J14, J21, J28, J35).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie (phase d'induction dans la boîte, entre 2 et 5 minutes) avant la chirurgie. Des douleurs pourront être ressenties lors des injections (anti-douleur), ainsi qu'après la chirurgie (procédure de classe modérée), sur les 3 jours post-opératoires. Le protocole de bioimpression et d'imagerie in vivo (IRM) n'engendreront aucune douleur (classe légère).

Devenir

Les animaux seront mis à mort 2 mois après l'intervention chirurgicale, afin de pouvoir évaluer la vascularisation et la régénération osseuse d'un point de vue quantitatif et qualitatif (microCT, histologie).

Remplacement

Ces expérimentations doivent se faire dans un modèle animal, car un environnement multifactoriel ne peut pas être reproduit in vitro. Seules ces conditions in vivo chez l'animal permettent l’étude de processus dynamiques complexes tels que la vascularisation et la cicatrisation osseuse, étroitement liées, dans un milieu proche des conditions physiologiques. Néanmoins, des expérimentations in vitro préalables seront réalisées (actuellement en cours) afin de déterminer les formulations optimales pour chaque biomatériau à évaluer in vivo et ainsi réduire considérablement le nombre de conditions expérimentales et donc d'animaux. Cinq conditions expérimentales in vivo sont ainsi finalement prévues pour chacun des deux biomatériaux (soit 2 x (5 x n=10) = 100 animaux) et 3 conditions expérimentales pour le suivi par IRM (soit 3 x n=10 = 30 animaux).

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, deux défauts osseux seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture crânienne. Il y aura 10 animaux par groupes, ce qui est le nombre minimal d'animaux que l'ont peut utiliser pour avoir ensuite des analyses statistiques qui soient pertinentes, compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe (5 par cage), dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur environnement possible pendant l'étude (nid de coton, litière en copeaux de peupliers et jouets). Les expérimentateurs sont tous titulaires d'une formation Concepteur ou Applicateur, et satisfont aux obligations de formation continue en expérimentation animale. Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. Du gel lacrymal sera employé afin de limiter la sécheresse oculaire. Les interventions seront réalisées sous anesthésie. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin, après concertation avec le responsable du suivi du bien-être des animaux et en présence du vétérinaire référent. Les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée inférieure à 24h après l’opération pour préserver les sutures et permettre un meilleur rétablissement, puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe pré-opératoire. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet présentent une immuno-déficience marquée, les rendant compétentes pour l’implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Elles seront hébergées à l’animalerie pour une durée maximale de 4 semaines avant l’opération et 10 semaines après l’opération. Elles seront protégées des pathogènes et des opportunistes car hébergées en portoirs ventilés. Le défaut osseux de taille critique de calvaria chez ces souris est un modèle qui est largement validé dans la littérature scientifique. Il s’agit d’un modèle de choix en ingénierie tissulaire osseuse pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Ce modèle animal est également le seul ayant une taille adaptée à la procédure de bioimpression assistée par laser in vivo à l'heure actuelle, permettant son insertion dans la station de travail. De plus, le site d’implantation au niveau de la surface du crâne permet d’avoir une surface facilement accessible et relativement plane, permettant la focalisation du laser sur le centre du défaut osseux. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 à 12 semaines, donc dans un stade adulte pour éviter des faux résultats liés à la croissance de l’animal.

Sept séances d'IRM de trente minutes sous anesthésie, du premier au trente-cinquième jour, et deux défauts osseux percés de part et d'autre de la suture crânienne : 130 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées deux mois après l'opération. La chirurgie dure cinq minutes, l'impression de bioencre au laser directement dans le crâne quinze secondes, et trois injections d'antidouleur suivent l'intervention. Le projet vise à améliorer une bioencre pour la régénération osseuse et à valider une station de bioimpression, des dépôts de brevet figurant parmi les bénéfices annoncés. Les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui permet de leur implanter des cellules humaines, et le porteur indique que ce modèle est le seul dont la taille rentre aujourd'hui dans sa station de bioimpression.

Objectifs

Les pertes de susbtance osseuse, d'origine traumatique, tumorale ou dégénérative, constituent actuellement un problème majeur de santé publique. Les solutions thérapeutiques actuelles présentent toutes des limites et des risques (manque de disponibilité, infections, douleurs au niveau du site de prélèvement, rejet immunitaire). C'est dans ce contexte que se sont développées les stratégies d'ingénierie tissulaire osseuse. De précédentes études ont démontré l'intérêt des technologies de bioimpression pour produire des substituts osseux avec des propriétés optimisées, mimant fidèlement le tissu osseux natif et avec une prévascularisation permettant de limiter le risque de nécrose du greffon. De récents travaux ont pu démontrer la faisabilité d’imprimer des biomatériaux et cellules à l'aide de la Bioimpression Assistée par Laser (LAB) directement au niveau de défauts osseux crâniens chez la souris, pour favoriser une meilleure vascularisation et régénération osseuse. Malgré des résultats prometteurs, les conditions expérimentales n’ont pas permis une régénération osseuse complète. L'objectif principal de ce nouveau projet est d'optimiser les précédents résultats obtenus en développant une nouvelle bioencre, basée sur l'utilisation d'hydrogels naturels et synthétiques associés à différentes particules minérales, ainsi que des cellules souches ou dérivés cellulaires, afin d'améliorer la régénération osseuse par Bioimpression Assistée par Laser in vivo. Le second objectif du projet est de développer une nouvelle stratégie d'imagerie par IRM pour suivre l’organisation des motifs cellulaires, la vascularisation et la maturation tissulaire avec une haute résolution. Afin de répondre à ces deux objectifs, le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet de la bioimpression in vivo combinée à de nouvelles formulations de bioencre, impliquant des nouveaux biomatériaux associés à différentes particules minérales et cellules/dérivés cellulaires. Ces résultats nous permettront d'envisager un/des dépôts de brevet dans le cadre de ces nouvelles applications. Ce projet visera également à évaluer, au niveau biologique, si des dérivés cellulaires pourraient remplacer les cellules elles-mêmes au sein d'une bioencre et si leur ajout est pertinent dans le contexte de régénération osseuse (permettant ainsi à terme de s'affranchir de l'utilisation des cellules souches). D'un point de vue technologique, ce projet constitue une étape-clé dans l'optimisation de notre station de bioimpression in situ, par l'intégration en son sein du dispositif anesthésique, les optimisations technologiques du dispositif au service d'une bioimpression plus précise et l'utilisation d'une nouvelle interface plus intuitive. Enfin, ce projet permettra de valider l'utilisation d'une nouvelle stratégie d'imagerie non-invasive haute résolution, basée sur l'IRM, pour assurer le suivi en temps des cellules bioimprimées in vivo.

Procédures

Au sein du premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ) et une procédure de bioimpression in situ (15 secondes pour l'impression en elle-même ; 5 minutes au total en comptant l'installation de la souris et le paramétrage de l'impression), sous anesthésie. Les animaux seront également soumis à l'administration d'un anti-douleur à 3 reprises (par injection intra-péritonéale) à différents temps (durée 30 secondes pour chaque injection) dans le cadre de la procédure analgésique. Au sein du second établissement utilisateur, l'acquisition de chaque séquence IRM sera de 30 minutes, sous anesthésie, et réalisée à 7 reprises (J1, J4, J7, J14, J21, J28, J35).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie (phase d'induction dans la boîte, entre 2 et 5 minutes) avant la chirurgie. Des douleurs pourront être ressenties lors des injections (anti-douleur), ainsi qu'après la chirurgie (procédure de classe modérée), sur les 3 jours post-opératoires. Le protocole de bioimpression et d'imagerie in vivo (IRM) n'engendreront aucune douleur (classe légère).

Devenir

Les animaux seront mis à mort 2 mois après l'intervention chirurgicale, afin de pouvoir évaluer la vascularisation et la régénération osseuse d'un point de vue quantitatif et qualitatif (microCT, histologie).

Remplacement

Ces expérimentations doivent se faire dans un modèle animal, car un environnement multifactoriel ne peut pas être reproduit in vitro. Seules ces conditions in vivo chez l'animal permettent l’étude de processus dynamiques complexes tels que la vascularisation et la cicatrisation osseuse, étroitement liées, dans un milieu proche des conditions physiologiques. Néanmoins, des expérimentations in vitro préalables seront réalisées (actuellement en cours) afin de déterminer les formulations optimales pour chaque biomatériau à évaluer in vivo et ainsi réduire considérablement le nombre de conditions expérimentales et donc d'animaux. Cinq conditions expérimentales in vivo sont ainsi finalement prévues pour chacun des deux biomatériaux (soit 2 x (5 x n=10) = 100 animaux) et 3 conditions expérimentales pour le suivi par IRM (soit 3 x n=10 = 30 animaux).

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, deux défauts osseux seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture crânienne. Il y aura 10 animaux par groupes, ce qui est le nombre minimal d'animaux que l'ont peut utiliser pour avoir ensuite des analyses statistiques qui soient pertinentes, compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe (5 par cage), dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur environnement possible pendant l'étude (nid de coton, litière en copeaux de peupliers et jouets). Les expérimentateurs sont tous titulaires d'une formation Concepteur ou Applicateur, et satisfont aux obligations de formation continue en expérimentation animale. Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. Du gel lacrymal sera employé afin de limiter la sécheresse oculaire. Les interventions seront réalisées sous anesthésie. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin, après concertation avec le responsable du suivi du bien-être des animaux et en présence du vétérinaire référent. Les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée inférieure à 24h après l’opération pour préserver les sutures et permettre un meilleur rétablissement, puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe pré-opératoire. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet présentent une immuno-déficience marquée, les rendant compétentes pour l’implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Elles seront hébergées à l’animalerie pour une durée maximale de 4 semaines avant l’opération et 10 semaines après l’opération. Elles seront protégées des pathogènes et des opportunistes car hébergées en portoirs ventilés. Le défaut osseux de taille critique de calvaria chez ces souris est un modèle qui est largement validé dans la littérature scientifique. Il s’agit d’un modèle de choix en ingénierie tissulaire osseuse pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Ce modèle animal est également le seul ayant une taille adaptée à la procédure de bioimpression assistée par laser in vivo à l'heure actuelle, permettant son insertion dans la station de travail. De plus, le site d’implantation au niveau de la surface du crâne permet d’avoir une surface facilement accessible et relativement plane, permettant la focalisation du laser sur le centre du défaut osseux. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 à 12 semaines, donc dans un stade adulte pour éviter des faux résultats liés à la croissance de l’animal.

La mise à mort est fixée à huit semaines après l'opération, soit quatre semaines avant l'apparition des douleurs spontanées et handicapantes que le porteur attribue à ses modèles d'arthrose. 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. 96 subissent l'ablation d'un ménisque sous anesthésie par injection, 96 reçoivent dans l'articulation une molécule qui déclenche une arthrose inflammatoire, 96 une injection intrapéritonéale supprimant un gène, et les 192 passent un test de sensibilité à la douleur une fois par semaine pendant huit semaines. L'objet est de savoir si la protéine COMT pourrait un jour devenir une cible médicamenteuse contre l'arthrose, dont les mécanismes de la douleur restent, de l'aveu du porteur, largement inconnus.

Objectifs

L’étude proposée vise à examiner le rôle de la catéchol-O-méthyltransférase (COMT), une protéine associée à la régulation des molécules de communication entre les nerfs, dans l’arthrose (OA) et la douleur associée. Nous cherchons à clarifier la relation entre les différentes formes génétiques de COMT existant dans la population (appelées aussi variants) et la physiopathologie de l’arthrose, une maladie chronique et multifactorielle liée au vieillissement, caractérisée par l’altération des tissus articulaires et la douleur. Il est bien établi que les variants de COMT sont associés à la douleur liée à l’arthrose. Cependant, le rôle de COMT dans l’arthrose et les mécanismes responsables de la douleur associée à cette maladie restent encore largement inconnus. Dans ce contexte, l’objectif de l’expérimentation animale dans ce projet est d’élucider le rôle de COMT dans les tissus articulaires au cours de l’arthrose. Les résultats obtenus permettront, à terme, d’évaluer si le ciblage de COMT par des molécules thérapeutiques peut réduire la progression de l’arthrose et la douleur associée. Scientifiquement, nous espérons mieux comprendre la physiologie et la physiopathologie des articulations et de l’arthrose, et plus particulièrement le rôle de COMT (via l’utilisation de souris dépourvues du gène COMT spécifiquement dans le cartilage) ainsi que celui de ses variants génétiques dans les tissus articulaires (grâce à l’utilisation de lignées murines dans lesquelles le gène COMT de la souris a été remplacé soit par le variant méthionine, soit par le variant valine humain).

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus au cours du projet auront sans aucun doute de larges implications pour notre compréhension de la biologie ostéoarticulaire et du processus de la douleur, ainsi que pour le traitement de l'arthrose. Le projet proposé est donc à la fois fondamental et translationnel : il devrait permettre la découverte de nouveaux mécanismes pathologiques, de biomarqueurs utiles en clinique, et de cibles thérapeutiques dans le cadre de l'arthrose. Ces recherches auront des applications en génétique et en pharmacologie.

Procédures

Les 192 souris seront utilisées. Parmi elles, 96 souris génétiquement modifiées recevront une injection intrapéritonéale sous sédation gazeuese (20 secondes) avec une molécule permettant la perte du gène COMT Par ailleurs, 96 souris subiront une ablation du ménisque afin de mimer l’arthrose mécanique ; pour cela, elles seront anesthésiées pendant 15 minutes par injection. En outre, 96 souris recevront une injection intra-articulaire d’une molécule pouvant induire l’arthrose inflammatoire ; ces dernières seront anesthésiées pendant 5 minutes par inhalation gazeuse. L’ensemble des 192 animaux sera soumis à un test de sensibilité à la douleur une fois par semaine pendant 8 semaines. Ce test sollicitera l’animal durant une période de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le marquage des souris provoque une douleur momentanée qui ne nécessite pas de prise en charge antalgique. L’injection intrapéritonéale de la molécule permettant la perte du gène COMT peut également entraîner une douleur localisée et passagère au niveau du site d’injection, ne nécessitant pas non plus de prise en charge antalgique. L’anesthésie par injection peut entraîner une baisse temporaire de la température corporelle durant la période de réveil. L’induction de l’arthrose dans nos différents modèles provoque l’apparition de douleurs spontanées et handicapantes à partir de la douzième semaine suivant les interventions. Une légère perte de poids a été observée 24 heures après l’opération, avec un retour au poids initial attendu dans les 48 heures. Dans nos deux modèles d’arthrose, les souris seront euthanasiées à 8 semaines, soit avant l’apparition des douleurs spontanées. Le test de sensibilité à la douleur provoque un réflexe de retrait de la patte, sans induire de douleur prolongée ou significative.

Devenir

. Mis à mort pour prélèvement d’organes

Remplacement

L'étude des chondrocytes in vitro est un modèle qui revêt un intérêt majeur pour la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires associés à l'arthrose. Il est également possible de réaliser des cultures ex vivo d'explants de cartilage humain, présentant l'avantage de préserver la complexité des différentes couches du cartilage. Cependant, l'arthrose, notre sujet d'étude, est une maladie affectant l'ensemble de l'articulation, englobant ainsi le cartilage, le ménisque, le muscle, la synoviale, le ligament et l'os. Les publications scientifiques bont démontré l'importance de chacun de ces éléments dans la physiopathologie de l'arthrose. Actuellement, que ce soit dans le développement d'organoïdes ou de puces biologiques, ces approches reproduisent de manière très lacunaire la complexité de ces interactions tissulaires, rendant ainsi leur utilisation peu pertinente. De plus, le développement de l'arthrose implique des mécanismes complexes tels que l'inflammation et les forces biomécaniques (pression, tension et cisaillement), difficiles à modéliser. C'est pour l'ensemble de ces raisons qu'à l'heure actuelle, l'utilisation du modèle animal, notamment le modèle murin, malgré ses imperfections, demeure la plus complète.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé afin d'assurer une puissance suffisante dans la détection de différences attendue de l’ordre de 20% (seuil de pertinence clinique). Dans cette perspective, il a été décidé de garantir une puissance d'au moins 80% pour détecter des différences lorsqu'elles sont attendues, correspondant à une taille d'effet estimée pour chaque expérience grâce aux études préliminaires réalisées. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Ce calcul de puissance permet d'obtenir le nombre minimal d'animaux nécessaire pour que nos tests statistiques soient exploitables et que nos expérimentations soient concluantes.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des cages transparentes, nourris ad libitum, dans un environnement enrichi. Les souris seront systématiquement acclimatées à la chambre d’expérimentation 60 minutes avant chaque expérience. Concernant les procédures chirurgicales : dans un premier temps un antalgique sera administré par injection sous cutanée une heure avant l’anesthésie générale. Celle-ci sera administré par injection intrapéritonéale. Ce type d'anesthésie permet une ventilation spontanée de l’animal. Un test du réflexe de retrait de la patte sera effectué pour s’assurer de l’endormissement des animaux. Nous supposons que la douleur postopératoire peut persister jusqu'à 24 heures, avec un pic entre 6 et 8 heures après l'intervention, ce qui justifie une deuxième injection d’antalgique 6 heures après l’intervention. Seuls les animaux présentant des signes de douleur le lendemain recevront une dose supplémentaire d’antalgique. Les souris seront placées dans une couveuse et observées jusqu’à leur réveil complet. Notre expérience, ainsi que les données de la littérature, montrent que la douleur directement associée à l'arthrose apparaît, quel que soit le modèle, 12 semaines après les procédures. Notre protocole prévoit une mise à mort 8 semaines après l'intervention, évitant ainsi l'apparition de cette douleur.

Choix des espèces

Les expériences in vitro de cultures cellulaires ne permettent pas de mimer la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein de l’articulation. De plus, l’influence de la composante mécanique est fondamentale dans cette pathologie. Le modèle murin combine les avantages d’intégrer les différents tissus de l’articulation avec les possibilités de modification génétique, est accéder à une évaluation de la douleur. Les données in vivo sont donc indispensables à la compréhension des mécanismes physiopathologiques. L’ensemble des souris seront méniscectomisées ou injectées MIA à l’âge de 10 semaines, âge à partir duquel la maturité osseuse est atteinte

952 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie gazeuse, chacune reçoit dans le muscle tibial antérieur d'une patte une injection de toxine de venin de serpent qui détruit les fibres musculaires, l'autre patte recevant du sérum physiologique pour servir de témoin, ce qui permet au porteur de diviser par deux l'effectif utilisé. La mobilité peut être altérée par la lésion, et un analgésique est administré les jours suivants si une douleur est observée pendant les déplacements. Le porteur indique ne pas savoir reproduire la régénération musculaire in vitro et conclut que la souris est "le modèle idéal", les gènes visés ayant pourtant déjà montré leur effet sur des cellules myoblastiques en culture.

Objectifs

L'identification de gènes impliqués dans le développement musculaire ouvre des perspectives de nouveaux traitements thérapeutiques pour régénérer une croissance musculaire suite à certains traumatismes musculaires ou dans le cas de pathologies génétiques. La régénération musculaire est essentielle au maintien du muscle squelettique et une meilleure compréhension de ce processus est cruciale pour l'élucider les mécanismes à l'origine de la différenciation musculaire, mais aussi pour les études consacrées aux thérapies de maladies des muscles squelettiques ou traumatismes musculaires. La régénération des muscles squelettiques consiste en deux étapes : la dégradation des fibres musculaires et une période de reconstruction du muscle, suite à l’activation, la prolifération et la différenciation de cellules souches musculaires. L'utilisation de différents modèles cellulaires et de souris nous a permis d'identifier de nouveau gènes impliqués dans la différenciation musculaire. L'objectif de ce projet est maintenant de comprendre leur rôle dans la réparation d'un muscle endommagé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices premiers du projet sont d'apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de la régénération musculaire. A long terme, ces données pourront être utiles pour comprendre les défaillances du processus de régénération dans des conditions physiologiques ou pathologiques et envisager de nouvelles voies thérapeutiques pour activer la régénération musculaire.

Procédures

1. Anesthésie gazeuse des animaux (en cage induction puis avec un masque - temps total moins de 5 minutes) aucours de laquelle les points 2 à 4 seront réalisés. 2. Rassage au niveau du muscle du tibia (1 min) 3. Injection dans le muscle tibial antérieur d'une toxine de venin de serpent (moins de 1 min) . 4. Injection en sous-cutané d'un analgésique Chaque point ne sera effectué qu'une seule fois. 5. Traitement analgésique en sous cutanée les jours suivants en cas de douleur observée au cours des déplacements de l'animal.

Impact sur les animaux

Stress de courte durée au moment de l'anesthésie (contension et mise dans la boite d'induction avant l'endormissement de l'animal). Mobilité peut être altérée suite à l'injection de la toxine engendrant une lésion au niveau du muscle. Le point d'injection de toxine sera éxaminé pour éliminer tout risque d'infection (rougeur synonyme d'inflammation, pus synonyme d'infection).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les muscles injectés avec la toxine ou le sérum physiologique nécessaires à la suite des expériences.

Remplacement

Des expériences in vitro sur des cellules myoblastiques ont monté un effet des gènes étudiés sur la prolifération et différenciation des cellules. Actuellement, nous ne savons pas reproduire in vitro la régénération musculaire. La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères.

Réduction

Nous utiliserons les mâles et les femelles afin d’étudier la régénération chez les deux sexes. Le nombre d’animaux minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs a été déterminé avec un calcul de puissance. Une première série d’expériences permettra d’analyser s’il existe des différences entre les mâles et les femelles. Si aucune différence n’est observée, les résultats des 2 sexes seront regroupés et le second réplica ne sera pas réalisé permettant de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires à cette étude. Pour chaque souris, une patte est injectée avec la toxine pour créer la lésion musculaire et la patte controlatérale est injectée avec le même volume de sérum physiologique (contrôle). L'utilisation systématique de la patte controlatérale en tant que contrôle permet ainsi de réduire par 2 le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Pendant l’injection intra-musculaire, les animaux sont anesthésiés et placés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Un traitement analgésique est administré dès l'injection de la toxine. Un gel oculaire est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement des yeux. L'injection de la toxine dans un seul muscle tibial antérieur permet de mieux identifier les problèmes de locomotion associés à la lésion du muscle et permettra une meilleure prise en charge par un traitement analgésique associé à la mise à disposition de nourriture et d’eau gélifiée directement dans le fond de la cage. Des points limites précoces ont été définis, une grille de score a été établie avec les actions à mener pour limiter au maximum la douleur de l’animal. Toutes les souris d'une même cage seront anesthésiées et injectées le même jour afin de maintenir le groupe social.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle de choix dans l'étude du développement musculaire du fait de la parenté génétique et d'un développement embryonnaire proche des autres mammifères dont celui de l'homme. En effet, la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’Homme. De plus, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement musculaire et la régénération musculaire sont similaires entre la souris et l’Homme. Dans cette étude, nous utilisons des souris adultes aux environs des 8 semaines où la croissance musculaire s'est achevée.

Une perte de 20 pour cent du poids en une semaine met fin au protocole. 54 souris porteuses d'une mutation du gène de la titine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la mutation provoquant chez elles faiblesse musculaire et troubles respiratoires ou cardiaques. Elles passent une vingtaine de minutes sous anesthésie gazeuse pour une mesure de pression artérielle et un test respiratoire, puis une trentaine de minutes sous anesthésie générale pour un test de force, à l'âge d'un an. La cohorte de quarante animaux sera tuée pour prélever organes et tissus, et le porteur précise que les animaux qui les ont engendrés le seront aussi, la lignée n'étant pas maintenue.

Objectifs

Au cours de ce projet, nous allons caractériser un modèle souris qui développe une myopathie avec des problèmes respiratoires graves. Cette myopathie représente 65% des cas mondiaux de myopaythies héréditaires avec insuffisance respiratoire précoce. L’étude de ce modèle souris permettra de mieux comprendre les causes de la maladie et pourra ainsi servir pour des essais de traitement de la maladie.

Bénéfices attendus

L étude de ce nouveau modèle de souris myopathe nous permettra de mieux comprendre cette maladie et en particulier d 'étudier l 'importance de l 'activité respiratoire et cardiaque. Toutes ces nouvelles connaissances nous permettront d 'envisager de nouveaux traitements mieux ciblés qui seront d 'un grand bénéfice pour les patients atteints de cette myopathie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse d' une vingtaine de minutes dans un premier temps et à une mesure de la pression artérielle (phénotypage cardiaque) puis à un test respiratoire (plethysmographe). Ensuite ils subiront une anesthésie générale d 'une trentaine de minutes pour le test de la force musculaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle animal, les mâles et les femelles sont affectés avec une sévérité modérée (faiblesse musculaire, problèmes respiratoires et /ou cardiaques) ce qui peut générer un inconfort. Tous les animaux expérimentaux seront isolés temporairement ce qui peut générer un stress. L’induction de l’anesthésie nécessite la contention de l’animal peut générer un stress et/ou un inconfort. L’injection d’anesthésique peut induire une douleur ou un inconfort.

Devenir

Après la mesure de la force musculaire , les animaux de la cohorte (40) seront euthanasiés en vue de prélèvements d 'organes et de différents tissus. Les animaux ayant servi à la production de la cohorte seront également euthanasiés ( pas de maintien de la lignée).

Remplacement

Pour caractériser cette maladie ( myopaythie héréditaire avec insuffisance respiratoire précoce) et évaluer l’impact de cette mutation, nous souhaitons étudier le modéle souris porteur de cette mutation. Ce modèle étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et les conséquences de cette mutation. D’autre part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, respiratoire et cardiaque seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développerait pas et le bénéfice de la force musculaire, la fonction respiratoire et cardiaque ne pourraient pas être mesurées (REMPLACEMENT).

Réduction

Plusieurs tests seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en générant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests cardiaques et respiratoires, peu invasifs, offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en utilisant les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. Nos connaissances sur ces modèles animaux mutants et les études réalisées auparavant montrent que 10 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante et statistiquement valable. Nous prévoyons 54 animaux pour cette étude (REDUCTION).

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des faiblesses musculaires modérées apparaissaient, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage (interaction sociale). Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage pour faciliter l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration ou problèmes de déplacements. Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés et pesés une fois par semaine; une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Afin de diminuer le stress lié à aux diférents tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.(RAFFINEMENT).

Choix des espèces

La souris est une des seules espèces assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir un modèle de HMERF, une pathologie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherches dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe, ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec d'autres études et de mieux comprendre le pathomécanisme de cette maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier la fonction cardiaque, la fonction respiratoire et la fonction musculaire. Pour caractériser le phénotype de ces souris, les animaux seront étudiés à l âge d 'un an, ce qui correspond environ à la moité de la vie d 'une souris, sachant que chez l homme la pathologie se déclare vers 35/40 ans (envion demi- vie également)