Système musculosquelettique

Les souris de ce projet portent une mutation qui les prive de dystrophine et ont été croisées avec des lignées immunodéficientes pour qu'elles acceptent des cellules humaines sans les rejeter. 665 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une irradiation locale sous anesthésie de vingt et une minutes au maximum, une injection d'agent de régénération dans le muscle tibial antérieur, puis une injection de cellules humaines au même endroit, une partie passant en plus quarante-cinq minutes en imagerie. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer un œdème, une pelade ou des ulcérations gênant les mouvements, et justifie la mise à mort de toutes les souris un mois après la greffe par la "nécessité" de retirer entièrement les muscles injectés.

Objectifs

L’objectif du projet est de comparer l’efficacité de la greffe de différents types de cellules dans la régénération musculaire, ce qui permettra ultérieurement de choisir le meilleur candidat pour de futurs essais cliniques dans le domaine des myopathies. Ce projet répondra à des questions scientifiques et représente en même temps une recherche pré-clinique. La thérapie cellulaire est une approche thérapeutique possible de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le projet comporte deux étapes : la première consiste à mettre au point et standardiser la meilleure procédure expérimentale adaptée à nos modèles à l’aide d’études pilotes basées sur l’expérience antérieure et la bibliographie, et la seconde consiste à tester l’efficacité de différents types cellulaires. Pour faciliter le transfert à la clinique humaine, seules des cellules humaines seront utilisées, ce qui nécessitera l’utilisation d’animaux immunodéficients capables de tolérer ces greffes sans rejet immunologique. Ces animaux sont des souris modèles de la Dystrophie musculaire de Duchenne. Les explorations seront concentrées sur les muscles traités afin de classer l’efficacité des traitements étudiés. Les résultats permettront d’évaluer la faisabilité, d’affiner la logistique et d’orienter vers un projet clinique de plus grande ampleur.

Bénéfices attendus

La thérapie cellulaire est une approche thérapeutique possible des dystrophies musculaires. Sur le plan technique, une fois établi le "meilleur" candidat cellulaire il sera possible d’améliorer les paramètres de la greffe. Ces données permettront de mettre en place une nouvelle génération d’essais de thérapie cellulaire dans l’indication de la dystrophie musculaire de Duchenne, pour améliorer ou stabiliser la qualité de vie des patients. Les bénéfices de ce projet sont donc attendus dans le domaine scientifique fondamental et dans le domaine clinique. De plus, basé sur la mise en place d‘une plateforme collaborative, il bénéficiera à la communauté scientifique impliquée dans la thérapie cellulaire musculaire.

Procédures

L’ensemble des actes seront effectués sur des animaux modèles de dystrophies musculaires et immunodéficients. Une première partie des animaux servira à la mise au point de la dose d'irradiation optimale (étude pilote). Les animaux seront pesés et anesthésie afin de réaliser une irradiation à différentes doses (21 minutes maximum) suivi d’un maintien de deux semaines maximum. Une seconde partie des animaux sera utilisé pour la mise au point de la régénération musculaire (étude pilote). Les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de comparer l'efficacité de deux agents de régénération et de déterminer la dose minimale efficace, par injection localisée dans un muscle des pattes postérieures (Tibial antérieur). Cet acte est d’une durée de 5 minutes. Un traitement antalgique sera maintenu durant les 3 jours suivants l’injection correspondant à la période de maintien des animaux. Enfin, une dernière partie des animaux sera impliqués dans des actes successifs après les étapes de mises au point préalable. Les animaux seront irradiés localement sous anesthésie générale (21 minutes maximum), après 24h ils recevront une injection unique d’agent de régénération musculaire sous anesthésie et analgésie dans un muscle des pattes postérieures (Tibial antérieur) (5 minutes maximum), après 24h ils recevront une injection de cellules humaines sous anesthésie et analgésie au même site (5 minutes maximum). Si l’agent de régénération musculaire n’est pas toxique pour les cellules in vitro, une seule intervention d’injection sera réalisée le même jour. Un traitement antalgique sera maintenu durant les 3 jours suivants l’injection correspondant à la période de maintien des animaux. Une surveillance sera assurée quotidiennement. Après un mois d’observation, une partie des animaux de ce groupe seront analysés par imagerie (bioluminométrie) sous anesthésie après injection d’un agent produisant à l'émission des photons qui peuvent être quantifiés, et cet acte sera d’une durée de 45 minutes. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire après le temps de maintien défini (1 mois) en fonction des besoins pour prélèvements des muscles et leurs analyses.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés sont immunodéficients, ils peuvent donc être plus sensibles aux infections. Les animaux subiront une irradiation ce qui pourra induire une brûlure dans de rares car puis une perte progressive de masse musculaire vers 6-8mois (ce délai n'est pas atteint dans la procédure expérimentale). Certaines souches d'animaux immunodéficient sont plus sensibles à l'irradiation et pourront avoir un gonflement et un oedème de la peau, une pelade, ou des ulcérations, gênant les mouvements et pouvant générer de la douleur. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. Des injections intramusculaires seront réalisées ce qui peut engendrer une douleur de courte durée au point d'injection. La solution injectée pourra générer une inflammation dans les premiers jours et dans de rares cas une gêne de la mobilité.

Devenir

La décision d’euthanasier tous les animaux à l’issue de la procédure a été prise lors de la rédaction du projet par les concepteurs, car il est nécessaire de prélever les muscles injectés, et ceci ne peut être fait sans l'euthanasie des animaux. Les animaux ne peuvent être ré-utilisés, la procédure nécessite l’exérèse totale des muscles injectés, notamment afin d’étudier les capacités de migration des cellules injectées.

Remplacement

Le but du projet est d’évaluer la capacité régénérative musculaire de différents types de cellules pour développer une thérapie cellulaire dans l’espoir de soigner la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Au stade où les différents candidats cellulaires sont utilisés, ils ont déjà fait la preuve in vitro de leur capacité à fusionner et à former des petites fibres musculaires. Les modèles de cultures en deux dimensions ne représentent pas l’architecture musculaire ni les capacités contractiles et ne permettent pas de renseigner les déplacements des cellules injectées. Les modèles in-vitro de mini-muscle en trois dimensions qui existent ne renferment qu’un ou deux types cellulaires et aucun modèle pathologique complexe n’est encore développé. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable, car l’étude de la régénération doit prendre en compte l’environnement physiologique, les différents types cellulaires, les signaux et le micro-environnement d’un muscle qui influencent cette capacité régénérative, particulièrement dans un organisme malade. Les lignées de souris utilisées dans ce projet sont immunodéficientes et permettent la prise de greffe xénogénique (d’une espèce animale à une autre). Ainsi, le modèle peut être similaire à la DMD humaine.

Réduction

665 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études pilotes permettront d'optimiser les conditions et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Les animaux immunodéficients sont hébergés dans une pièce dédiée de statut sanitaire contrôlé, la nourriture et la litière sont irradiées et l’eau est osmosée. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris utilisée ici est un modèle classique de la dystrophie musculaire de Duchenne. Une mutation spontanée empêche l’expression de la dystrophine. Cet animal ne présente pas de signes cliniques avant un âge avancé (15-18 mois), ni de phénotype myopathique dommageable. Pour accepter les greffes de cellules humaines sans rejet immunologique, les souris ont été croisées avec des modèles immunodéficients. Ces modèles sont stabilisés et déjà existants. L’utilisation des modèles se justifie par leur différence de réactivité immunologique, et par des différences de susceptibilté à certains traitements musculaires. Les souris seront utilisées pour les greffes de cellules à l’âge de 3 à 5 mois. Dans ces modèles, un pic spontané de dégénérescence et régénération musculaire survient à l’âge de 3 à 10 semaines. Bien que la cause exacte de ce pic ne soit pas totalement élucidée, il s’agit probablement d’une mobilisation musculaire importante et nouvelle, qui coïncide avec la période du sevrage, le changement d’alimentation, l’acquisition d’une mobilité de plus en plus importante, la croissance des membres. Pour éviter les variabilités inter-animales liées à ce pic de remaniement musculaire, nous utiliserons des animaux ayant franchi ce cap, donc après l’âge de 3 mois. Par ailleurs, au-delà de 6 mois, certains animaux peuvent commencer à développer des anticorps susceptibles de permettre un rejet chronique des greffes, et c'est encore une variabilité que nous devons éviter. Les souris étant euthanasiées 1 mois après la transplantation cellulaire, soit au plus tard vers l’âge de 6 mois, nous pouvons réaliser les greffes dans une fenêtre d'âge de 3 à 5 mois.

96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à J2 ou J14 pour prélever leurs muscles. Elles reçoivent une à sept injections dans l'abdomen, dont une drogue qui détruit chimiquement leurs nerfs sympathiques, des gavages, puis une injection dans l'orbite sous anesthésie juste avant la mise à mort. Le projet cherche à savoir si le système nerveux sympathique règle le comportement des cellules souches du muscle sain, avec des retombées annoncées, à terme, pour des maladies neuromusculaires comme la dystrophie de Duchenne. Parmi les raisons du choix de la souris, le porteur cite sa petite taille, sa gestation rapide et sa "durée de vie courte compatible avec notre étude".

Objectifs

Le processus de régénération musculaire est très important pour la restauration de la fonctionnalité du tissu après une lésion. La niche des cellules souches du muscle est un environnement complexe impliquant des interactions entre les cellules interstitielles, les cellules des vaisseaux et les cellules souches. Le muscle est également un tissu innervé par le système nerveux somatique responsable de la contraction volontaire ainsi que par le système nerveux sympathique dont les neurones sensoriels sont capables de capter les contraintes mécaniques et sensitives appliquées au tissu musculaire. Tout changement dans la niche comme le vieillissement peut altérer le potentiel de régénération du muscle. Pour cette raison, il est capital d’élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires nécessaires au maintien fonctionnel de la niche. Par ailleurs, plusieurs myopathies sont causées par l'épuisement et la perte du potentiel de réparation musculaire et à une altération de l'organisation du réseau vasculaire. Le présent projet a pour objectif d’étudier l’interaction entre les nerfs sympathiques, les cellules vasculaires et les cellules souches en conditions physiologiques. Le rôle du système nerveux sympathique a récemment été décrit dans la niche des cellules souches hématopoïétiques et des cellules souches intestinales mais n'a été parfaitement étudié dans le muscle. Des observations sur des coupes de tissu musculaire ont permis d’émettre l’hypothèse que le système nerveux sympathique pourrait intervenir dans la régulation des fonctions des cellules souches musculaires via une modulation des signaux moléculaires émis par les cellules composant les microvaisseaux.

Bénéfices attendus

Nombre de pathologies du muscle sont liées à des perturbations du fonctionnement intrinsèque de la cellule souche musculaire mais également de sa niche. L'implication du système nerveux central mais surtout périphérique en tant que modulateur de la niche reste encore peu exploré. Cette étude vise à identifier un nouveau mécanisme contrôlant la quiescence des cellules souches musculaires par le système nerveux autonome sympathique via le relais des cellules des vaiseaux. En effet, la modulation de ce circuit neuro-vasculaire aura des implications significatives pour mieux comprendre le comportement des cellules souches musculaires dans les maladies neuromusculaires, comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Effectivement, l'innervation sympathique et les signaux de la niche vasculaire, sont déréglés et peuvent altérer directement la fonction des cellules souches dans la DMD. Ainsi, comprendre les mécanismes de la modulation des voies signalisation impliquées dans le dialogue nerf-muscle, ouvre potentiellement sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies neuromusculaires.

Procédures

Les drogues utilisées pour la dénervation, pour stimuler la voie de signalisation cible seront injectées par voie intrapéritonéale. La drogue inhibitrice de la voie de signalisation ciblée sera administrée par voie orale. Les anticorps inhibiteurs de la voie de signalisation ciblée et les anticorps contrôles seront injectés par voie intrapéritonéale. La molécule permettant de visualiser les vaisseaux sanguins sera administrée par voie retro-orbitale une seule fois avant la mise à mort. Toutes les autres administrations seront faites 1 jour sur deux pendant 1 à 14 jours soit 1 à 7 injections selon le jour de mise à mort (J2 ou J14). Les injections intrapéritonéales et par gavage sont rapides et durent de quelques secondes à 30 secondes pour le gavage, en respectant les volumes autorisés à injecter. L'injection par voie retro-orbitale est également assez rapide et sera effectué sous anesthésie pour éviter le stress et la douleur.

Impact sur les animaux

Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de les habituer à l’homme et éviter tout stress lors des procédures expérimentales. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleurs chez les animaux.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort pour prélèvement de leurs muscles à des fins d'analyses histologiques et moléculaires ou de mise en cultures cellulaires.

Remplacement

La niche des cellules souches du muscle squelettique est un environnement tissulaire complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires notamment avec les cellules vasculaires, les cellules inflammatoires et le systèmes nerveux moteur et sympathique. Expérimentalement, il n’est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro ou par modélisation mathématique. C’est pourquoi, l’utilisation des modèles animaux reste nécessaire à la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires intégrés à la base du fonctionnement de la niche et qui peuvent influencer la régénération musculaire. Cependant en préambule à l'étude proposée, la présence de récepteurs du système nerveux autonome a été mis en évidence in vitro sur les cellules musculaires et vasculaires, ces récepteurs permettant l'activation et/ou l'inhibition de ces cellules. Les études in vivo permettront de valider l'hypothèse de travail ainsi que les résultats obtenus in vitro.

Réduction

Pour avoir des résultats statistiquement significatifs, il faut un minimum de 6 animaux par groupe dans les différentes procédures en raison de la variabilité dans un même groupe d’animaux et afin d'avoir assez de matériel pour réaliser toutes les analyses prévues. Cela devrait également éviter d'avoir à répéter l’expérience. Par ailleurs, l'expérience du laboratoire sur les modèles animaux a permis de déterminer que l'utilisation d'une solution saline comme contrôle en injection intrapéritonéale ou en injection intramusclaire ne provoquait aucun effet secondaire ou altération sur le processus de régénération musclaire, aussi ces contrôles ne seront pas systématiquement inclus afin de limiter le nombe d'animaux utilisés. Ne seront injectées que les solutions qui n'ont jamais été utilisées et pouvant potentiellement avoir des effets sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Les animaux sont dans des cages ventilées dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères et sont uniquement séparées par sexe afin d’éviter les accouplements non contrôlés. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de papier et d’abris en carton dans les cages. Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de les habituer à l’homme et limiter tout stress lors des procédures expérimentales. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h et si cela n'est pas suffisant, une mise à mort compassionnelle sera réalisée avec approbation du vétérinaire référent. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de l’innervation sympathique sur le tissu musculaire car la dénervation chimique chez la souris est un procédé assez rapide et bien caractérisé. La souris est par ailleurs un modèle de petite taille, avec une gestation rapide et une durée de vie courte compatible avec notre étude. Les souris utilisées seront des adultes âgés de 16 semaines parce qu'à cet âge le système nerveux sympathique est mature.

Mesurer la puissance paralysante de formulations de toxine botulique, destinées au traitement de la spasticité comme à des usages cosmétiques, occupe ici 4 650 souris et 1 550 rats. Tous vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous seront tués, par prélèvement intracardiaque, le dernier jour. La toxine est injectée dans le muscle du mollet sous anesthésie, ce qui provoque une paralysie plus ou moins marquée des membres postérieurs, une perte de poids et des difficultés à atteindre la mangeoire, puis chaque animal passe dix à trente tests d'écartement des orteils sur cinq à vingt-cinq jours. Le porteur indique que des cultures de neurones humains ont été proposées comme alternative sans être validées par la communauté scientifique ni par les autorités, et conclut que l'étude ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées depuis près d’un demi-siècle dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Elles sont classiquement utilisées dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs, autant naturels que recombinants. L’objectif de cette étude est de réaliser une évaluation in vivo de l’efficacité de molécules thérapeutiques à base de neurotoxine botulique nouvellement développées ; le protocole expérimental consiste à exécuter le test du score d’abduction des orteils (DAS) chez le rongeur. La puissance d’une préparation de neurotoxine botulique (BoNT) donnée peut être évaluée régulièrement en utilisant le test DAS, qui mesure la réduction de la force musculaire des doigts de la patte après injection de BoNT dans le muscle squelettique de la patte arrière chez les rongeurs. Il est bien connu en littérature que les rats ont des sensibilités différentes aux différentes types de toxines botuliques par rapport à la souris. Selon le type de toxine étudié, il sera donc nécessaire d’utiliser l’espèce animale la plus sensible entre le rat et la souris.

Bénéfices attendus

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Ils sont classiquement utilisés dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs. Nos études vont participer à la recherche et la mise en place de ces nouvelles formulations de toxine botulique et aider dans le futur les patients atteint de ces troubles.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs test DAS (test du score d’abduction des orteils) entre 10 à 30 tests, sur une durée de 5 à 25 jours. La durée d'un test DAS est de 3 minutes. Les animaux seront soumis également à une seule injection en intra-musculaire de toxine botulique sous anesthésie. La durée de cette intervention est de 10 minutes. Et pour finir les animaux seront soumis à un seul prélèvement en intra-cardiaque, le dernier jour d'expérimentation. La durée de cette intervention est de 15 minutes.

Impact sur les animaux

À la suite de l'injection dans le muscle gastrocnémien, avec la toxine botulique, les animaux vont développer une paralysie des membres inférieures plus ou moins élevées ; les animaux risquent également de présenter une perte de poids, des poils piqués, la présence d'un excédent de porphyrine. Une difficulté à atteindre la mangeoire risque d'être présent, mais pour permettre à l'animal de se nourrir et de boire, une alimentation spécifique sera mise en place.

Devenir

Etant donné la réalisation d'un prélèvement de sang et des muscles, les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'intracardiaque.

Remplacement

A ce jour, à cause de la complexité de la structure protéique de la toxine botulique, il n’y a pas de test in silico validés pour effectuer un criblage des effets paralysant des différentes toxines botuliques et de ses dérivés. Afin de tester un grand nombre de dérivés de la toxine botulique, des modèles in vitro alternatif à l’expérimentation animale ont été proposé par le passé, en utilisant des cultures cellulaires de neurones humains. Toutefois ces modèles in vitro ne sont pas encore validés par la communauté scientifique ni par les autorités régulatoires, car ne sont pas capables de prédire exactement les effets des toxines botulique chez l’homme ou l’animal, donc l’étude ne peux se faire que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 6 à 10 animaux, étant donné la variabilité interindividuelle que nous pourrions rencontrer. Le nombre de groupes est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 5 à 31 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupes égal à 6 à 10) seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés. Pour déterminer le chiffre exact d’animaux par groupe, cela dépendra des premiers résultats des premiers animaux, le chiffre 10 ne sera pas dépassé. Nous utiliserons les tests statistiques les plus appropriés afin d'analyser nos données.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type IVC (cage individuelles ventilée pouvant contenir plusieurs animaux par cage) en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5 ou 6 par cage pour les souris et 2 ou 3 par cage pour les rats, en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos, des tunnels et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Après les intra-musculaires, quelques croquettes d'aliment seront placées dans le fond de la cage et de la pâté humide sera également donnée, au cas où les animaux n'arrivent plus à s'alimenter et la taille des tétines des biberons seront ajustées en conséquence. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la durée des anesthésies et les réveils des animaux. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, sont une technicienne en recherche et développement et un ingénieur, tous deux expérimentés et formés pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Ils observeront les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplirons quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson.

Choix des espèces

Les rongeurs sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour les études utilisant de la toxine BONT/A, dans le cadre d’amélioration de la contractibilité musculaire. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés aux problèmes de contractilité musculaire sont très bien caractérisés chez les rongeurs, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats et les souris seront utilisés, car ces espèces sont largement utilisées pour ce type d’étude (nombreuses références bibliographiques). D’autres modèles expérimentaux, notamment, le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Adultes, entre 6 et 12 semaines ; car les adultes possèdent des membres inférieurs plus gros et cela permet une meilleure visualisation de la patte et donc le résultat du DAS est plus optimal. Les animaux adultes sont aussi plus résistants face à la perte de poids et aux différents signes cliniques.

Avant toute application à une maladie, ce projet sert à valider une nouvelle lignée de souris fluorescentes comme outil de laboratoire. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les muscles de leurs pattes arrière. À dix semaines, chacune subit la section définitive du nerf sciatique d'une patte, opération de quinze minutes qui provoque une atrophie musculaire visible au bout de deux semaines, précédée au sevrage d'une biopsie de l'oreille. Le porteur affirme que l'étude ne peut être conduite que sur un "organisme entier", la communication entre motoneurone et muscle restant selon lui impossible à reproduire in vitro, tout en annonçant que des cellules issues de ces souris serviront à développer des organoïdes neuromusculaires.

Objectifs

Les cellules musculaires contiennent plusieurs centaines de noyaux. Parmi eux, 5 à 8 sont spécialisés pour maintenir la jonction neuromusculaire, qui est le lien crucial entre le nerf et le muscle. Ils sont nommés noyaux sous-synaptiques. Cette jonction est essentielle pour que les muscles fonctionnent bien, tout le long de la vie. Si cette jonction est endommagée, les muscles peuvent perdre leur connexion nerveuse et fonctionner moins bien. En raison de leur faible nombre et du manque d'outils disponibles, il est encore très difficile d'étudier la structure et la régulation des noyaux situés à la jonction neuromusculaire par rapport aux autres noyaux de la cellule. La lignée murine utilisée a pour but de suivre la fluorescence des noyaux musculaires impliqués dans le maintien de la jonction neuromusculaire. En temps normal, seuls les noyaux sous-synaptiques (5 à 8 par fibre musculaire) seront fluorescents. Si la connexion nerveuse est altérée, la fluorescence s'étendra rapidement à tous les noyaux le long de la fibre musculaire (plusieurs centaines par fibre). L’objectif de ce projet est donc de valider ce nouveau modèle murin pour isoler et étudier les noyaux sous-synaptiques des autres noyaux de la fibre musculaire, afin de comprendre comment ils régulent les fonctions musculaires en conditions normales et lors de problèmes d’innervation. A long terme, ce modèle de souris sera le premier outil pour étudier les maladies rares où l'innervation ou la communication entre le nerf et le muscle est affectée. Il permettra de visualiser et de mesurer les fibres musculaires touchées et de tester des médicaments pour prévenir ou réduire la perte d'innervation.

Bénéfices attendus

Ce modèle offrira la possibilité d’aborder les aspects encore peu explorés de la biologie cellulaire et des régulations au niveau des noyaux musculaires impliqués dans le maintien de l’innervation motrice au cours de la vie postnatale saine et pathologique. A plus long terme, la disponibilité de ce modèle de souris constituerait le premier outil pour étudier des maladies rares dans lesquelles l'innervation et/ou la neurotransmission sont compromises. Cela permettrait de visualiser et de quantifier les cellules musculaires présentant de tels défauts, mais aussi de tester facilement des médicaments visant à prévenir ou à réduire la perte d'innervation et à proposer et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Une petite biopsie d’oreille (=1mm) sera réalisée au moment du sevrage pour pouvoir effectuer l’identification génétique de chacune des souris. Le temps du geste par animaux et < 1min. Les animaux agés de 10 semaines subiront une intervention chirurgicale d’une durée de 15 minutes pour réaliser une section définitive du nerf sciatique d’une seule patte arrière. Pour cela ils recevront plusieurs injections : une sur animal vigile pour l’anesthésie générale (durée < 1 minute) et une sur animal anesthésié pour l’analgésie pré- et post-opératoire (durée

Impact sur les animaux

La petite biopsie d’oreille conduit à une douleur transitoire avec cicatrisation. Une chirurgie de dénervation de la patte postérieure gauche sera réalisée. Cette dénervation conduit à une atrophie des muscles de la patte observable à partir de 14 jours, donc à une perte de force musculaire sur le membre. Comme la souris est quadrupède, cette intervention ne l’empêche pas de se déplacer, de grimper dans la cage et de s’alimenter. La technique de dénervation définitive est une chirurgie modérément invasive et parfaitement maitrisée. Les 4 dernières injections de molécule pour exprimer la protéine fluorescente, réalisées hors anesthésie, génèreront une douleur transitoire au site d’injection (gonflement et inflammation).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation afin de collecter tous les muscles squelettiques des pattes postérieures. Ces tissus prélevés serviront pour les analyses de biologie moléculaire et d’histologie pour décrypter les acteurs moléculaires responsables du maintien du muscle.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite que sur un organisme entier car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le système complexe de communication entre les motoneurones (types de neurones qui interagit avec le muscle pour le mouvement) et le muscle. La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères. Cependant des cellules seront isolées de ce modèle pour participer au développement d’organoides neuromusculaires.

Réduction

Le nombre d’animaux minimal mais suffisant sera utilisé pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le maximum de données pouvant être générées à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. D’après l’expérience acquise au laboratoire, un effectif de n=20 animaux par point de collecte sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement fiables générés sur différents types d’analyses. Ce nombre est nécessaire car plusieurs types de prélèvements non compatibles sur la même souris sont requis et nécessitent donc de doubler les effectifs. Après obtention des résultats expérimentaux, les données seront analysées à l’aide de tests statistiques. L’ensemble des muscles des deux pattes postérieures sera collecté. La patte droite non dénervée servira de contrôle. Ainsi, l’ensemble des tissus collectés d’une même souris pourra être évalué et comparé par différentes techniques complémentaires.

Raffinement

Pendant toute la chirurgie, les animaux seront sous anesthésie générale et locale, et sur coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d’éviter tout dessèchement de l’œil. Après la chirurgie, les animaux recevront pendant 3 jours un traitement analgésique et antalgique. Pour une meilleure récupération après l’anesthésie générale, les animaux seront gardés une nuit en armoire chauffante. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau après l’intervention chirurgicale, des croquettes et de l’eau gélifiée seront déposées sur le sol de la cage. Le jour même et les 2 jours suivants la dénervation, une analgésie post-opératoire sera également appliquée afin de limiter toute douleur. Au total, pendant les 5 jours suivant l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés individuellement et quotidiennement afin de vérifier la bonne cicatrisation de la suture et d’euthanasier l’animal en cas de souffrance non jugulée, appréciée par des critères de signes cliniques, d’aspect et de comportement. Toutes les souris de la même cage seront opérées le même jour afin de maintenir le groupe social.

Choix des espèces

Malgré des différences entre de symptômes chez les souris et les hommes, le modèle murin est extrêmement utile pour les études mécanistiques, physiopathologiques et la mise au point de traitements thérapeutiques. Plus spécifiquement, le muscle, que ce soit en termes de structure, de fonctionnement et de pathologie est extrêmement proche de celui de l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’age de 2.5 mois. A cet age, la souris est adulte et la maturation du muscle est bien finalisée.

Des souris nude dépourvues de système immunitaire et des rats ZDF porteurs d'une mutation qui les rend diabétiques dès le plus jeune âge : le projet repose sur des animaux construits pour être malades. 80 souris et 208 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des hydrogels implantés sous la peau, les rats subissent une craniotomie de trente minutes avec pose d'un implant osseux, et une partie d'entre eux une thoracotomie terminale que le porteur qualifie lui-même de geste douloureux. Tous sont tués pour retirer les implants et prélever les calvarias, afin de mesurer la formation osseuse et la vascularisation autour du matériau.

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) est un problème de santé publique. On compte 537 millions de personnes diabétiques dans le monde et environ 4 millions en France. Outre plusieurs complications cliniques, les patients atteints de DT2 présentent une fragilité osseuse avec un risque accru d’ostéoporose, de fracture osseuse et d'altération de la réparation osseuse. Parallèlement à l'augmentation de la prévalence du DT2, on observe une augmentation du nombre de patients atteints de DT2 nécessitant et subissant des interventions chirurgicales orthopédiques/orofaciales, avec un taux élevé de complications et une augmentation inévitable de la charge et des coûts socio-économiques. À ce jour, la réparation osseuse dans l'environnement compromis du DT2 reste très difficile, et des recherches supplémentaires sont nécessaires pour développer des stratégies efficaces, y compris des thérapies cellulaires. Les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse par leur capacité à s’auto-renouveler et à se différencier à des cellules qui forment l’os (ostéoblastes) et /ou par des facteurs qu’ils secrètent (sécrétome et vésicules extracellulaires) et qui stimulent la formation des vaisseaux sont proposées pour réparer des défauts osseux. Cependant, le diabète caractérisé par un taux élevé de glucose dans le sang, perturbe la fonction de ces cellules et la réparation de l’os. L’utilisation de ces cellules pour réparer et l’intérêt de leur produit de sécrétions dans la réparation de l’os diabétique restent peu étudiés. L’objectif du projet répond au besoin scientifique et clinique de mieux connaitre et optimiser la réparation de l’os diabétique. Il vise à évaluer la capacité à former l’os (potentiel ostéoformateur) et des vaisseaux sanguins (potentiel angiogénique) du sécrétome et des vésicules extracellulaires de cellules stromales mésenchymateuses dans le but d’améliorer la réparation osseuse chez le rat diabétique. L'hypothèse sous-jacente au projet de recherche proposé est que cela constitue une alternative de choix à la thérapie cellulaire pour réparer l’os diabétique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en biothérapie. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes de réparation osseuse chez le diabétique de type 2. Par ailleurs, il fournira des informations sur l’effet bénéfique ou pas du sécrétome et des vésicules extracellulaires comparé à celui des cellules stromales mésenchymateuses dans la réparation de l’os diabétique. A long terme un tel projet permettra de mettre sur pieds des stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients diabétiques qui présentent des accidents du squelette avec une perte osseuse importante ou nécessitant la pose d’implants.

Procédures

Pour les souris: 1-Implantation sous cutanées (72 + 8 souris de marges) d'hydrogels ( 1X ; durée ~30 min) 2- Imagerie (24 + 8 souris de marges) micro-scanner in vivo (4X; durée 15 min) Pour les rats : 1- craniotomies avec implantation d’un hydrogel ostéoinducteur (168 rats ZDF + 10 rats ZDF imprévus et 24 rats ZL + 6 rats ZL imprévus) (1X, durée 30 min) ; 2- Imagerie (56 rats ZDF + 5 rats ZDF imprévus et 8 rats ZL + 3 rats ZL imprévus) micro-scanner in vivo (5X; durée 15 min) ; 3- Infiltration du réseau vasculaire (56 rats ZDF + 5 rats ZDF imprévus et 8 rats ZL + 3 rats ZL imprévus) par un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

L’implantation sous cutanée chez les souris nudes peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, hémorragie, stress, oedème. La chirurgie sur calvaria de rat peut également entrainer un comportement anormal causé par une hypertension intracrânienne. Ces effets indésirables seront potentiellement observés en per-opératoire et post-opératoire immédiat (jusqu’à 3 jours). Une complication éventuelle est l’infection cutanée, susceptible d’entrainer de la douleur et de la souffrance chez les animaux. Elle constitue un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). L’anesthésie chez les souris et les rats, nécessaire à l’imagerie non invasive en microscanner va également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil.

Devenir

Les souris seront toutes mises à mort et les explants retirés pour évaluer la réponse tissulaire (formation osseuse, inflammation et angiogenèse) en site sous cutané (ectopique) afin d’identifier les conditions pertinentes à tester en site osseux (orthotopique). Les rats seront tous mis à morts aux temps terminaux et les calvarias seront prélevées pour l’étude de la formation osseuse, de la vascularisation et de l’inflammation au niveau des défauts osseux. Justification de la mise à mort : prélèvement des implants pour évaluer la réponse tissulaire et la formation de l’os autour de ces implants.

Remplacement

La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel, orchestré et complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoïde, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages ostéoblastes/ cellules endothéliales par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Cependant ces modèles sont dénués de système vasculaire. Or, la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier l’apport de cellules souches et le sécrétome dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Compte tenu des écarts constatés pour les différents paramètres de la réparation osseuse étudiés par notre équipe, le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir des résultats valident en respectant le principe de réduction des 3 R est de 6 animaux /groupe /temps / type d’analyse. Pour tenir compte des éventuelles pertes lors des procédures ce chiffre est porté à 8 animaux/groupe /temps/ type d’analyse. Pour étudier le potentiel à former des vaisseaux sanguins et de l’os en sous cutané, quatre implants seront posés par animal afin de réduire le nombre total de souris nécessaire pour obtenir des groupes de 8 par condition. Par ailleurs, l’inflammation et l’angiogenèse seront étudiés sur les mêmes animaux, permettant de réduire leur nombre et de maximiser la contribution de celles-ci. Dans la même visée de réduction du nombre d’animaux, seules les conditions pertinentes (meilleur potentiel ostéoinducteur et faible inflammation) seront testées pour les procédures chez le rat. De plus, l’os de calvaria prélevé lors de la chirurgie à J0 sera utilisé comme contrôle T0. Par ailleurs, la réparation osseuse et la vascularisation seront étudiées par différentes techniques (biologiques, imagerie multimodale) au sein du même animal, permettant de maximiser la contribution scientifique de l'animal mis à mort.

Raffinement

Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans les protocoles expérimentaux. Au cours des chirurgies (avec champs et instruments stériles) un gel oculaire sera appliqué dans les yeux des animaux pour éviter leur dessèchement. Ils seront placés sur tapis chauffant pour limiter les pertes thermiques. Pour les implantations sous-cutanées, une analgésie préventive sera mise en place par injection sous cutanée (SC) 20 minutes avant la chirurgie. Les animaux seront ensuite anesthésiés par injection intra-péritonéale (IP) puis le dos sera rasé et désinfecté avec une solution antiseptique à large spectre. Une analgésie post-opératoire se fera par injection SC pendant 2 à 3 jours après l’opération. Pour les implantations intra-osseuses, une analgésie pré- et post-opératoire se fera par une injection SC ainsi qu’une antibiothérapie préventive. Après chirurgie, les animaux seront hébergés, seuls en cage jusqu’au lendemain matin dans une pièce dédiée avec température ambiante à 26° puis remis en conditions standards d’hébergement. Pour l’imagerie micro-scanner in vivo, les souris et les rats seront anesthésiés par voie gazeuse et seront surveillés jusqu’à leur réveil. À la suite des procédures chirurgicales, les expérimentateurs observeront les animaux deux fois par jour les 3 premiers jours post-opératoires puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Des critères définis et scorés au préalable sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à la procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures retenues pour les atténuer et/ou les supprimer seront appliquées si nécessaire. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée par les zootechniciens. Pour un groupe d’animaux, l’injection d’un agent de contraste intracardiaque en point terminal nécessitera une thoracotomie qui est un geste douloureux. En conséquence, les rats recevront une prémédication analgésique par injection SC avant anesthésie par voie gazeuse jusqu’à immobilité totale de l’animal puis une IP d’un anesthésique générale couplé à un analgésique.

Choix des espèces

La souris nude nRI de 9 semaines sera utilisée pour l’évaluation en dehors d’un site osseux du potentiel des cellules souches mésenchymateuses et de leurs produits de secrétions à induire la formation des vaisseaux sanguins et de l’os. Possédant un système immunitaire déficient, la souris nude est la candidate de choix pour apprécier les mécanismes d’intégration d’implant sans crainte d’une réaction de rejet immunitaire. Nous étudions le diabète de type 2 (incidence élevée chez l’Homme) pour lequel les modèles animaux proposés ne présentent pas de surmortalité, et ne requièrent pas de soins spécifiques. Afin de garantir l’homogénéité et la reproductibilité, nous avons opté pour un diabète d’origine génétique à savoir le rat ZDF (Leptr -/-) de 24 semaines, car ce modèle de diabète mime fidèlement le diabète de type 2 comme chez l’humain, depuis son mode d’installation jusqu’aux complications associées incluant les complications osseuses. De plus, nos études précédentes sur le même modèle animal ont montré qu’ils pouvaient vivre en animalerie jusqu’à un âge avancé sans nécessiter des soins particuliers et qu’ils supportaient relativement bien les procédures du protocole. Les rats Zucker LEAN (ZL) de 24 semaines ne présentent pas de mutation Leptr -/- et ne développent pas spontanément de diabète ils sont des contrôles de choix.

Jusqu'à cinq injections dans un muscle, dans l'abdomen ou dans le sang, espacées de vingt-quatre heures, et pour une partie des souris six jours de tapis de course à dix minutes par jour : 422 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines jeûnent jusqu'à douze heures et perdent du poids. Toutes sont tuées pour prélever leurs muscles et analyser les protéines des membranes qui déclenchent la contraction, structures défectueuses dans des maladies génétiques du muscle et dans le diabète de type 2. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet ce travail, les cultures de cellules musculaires n'atteignant pas selon lui un stade assez mature, et ne donne aucun élément sur le calcul qui aboutit à 422 souris.

Objectifs

Les muscles se contractent grâce à des connexions avec le cerveau via des neurones. Les signaux émis par les neurones se propagent à la surface des fibres musculaires, le long de leurs membranes, ce qui déclenche d’autres signaux au sein des fibres et entraîne leur contraction synchronisée. Les structures membranaires des fibres musculaires impliquées dans la transmission de ces signaux sont défectueuses dans certaines maladies génétiques du muscle et le diabète de type 2. Elles ont été peu étudiées et des données de la littérature suggèrent qu’elles sont impliquées dans d’autres fonctions que la contraction comme le stockage de glucose. L’objectif de ce projet est d’étudier ces structures membranaires pour mieux comprendre leur implication dans des pathologies. Les études seront réalisées avec le modèle souris qui présente un degré de similitude important avec l’humain en ce qui concerne les muscles.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de comprendre le fonctionnement et toutes les fonctions associées aux membranes des fibres musculaires impliquées dans leur contraction. C’est une étape essentielle pour connaître les défauts responsables de 2 types de maladies associées à ces structures : des maladies génétiques du muscle et le diabète de type 2, et pouvoir ensuite développer des stratégies thérapeutiques pour ces pathologies.

Procédures

Les souris seront injectées au maximum 5 fois dans un muscle, l’abdomen ou la circulation sanguine pendant moins de 30 secondes. Les injections seront séparées d’au moins 24h. Certaines de ces souris seront entraînées sur un tapis de course à raison de 10 min par jour pendant 6 jours.

Impact sur les animaux

Les effets prévus sur tous les animaux sont la douleur due aux piqûres d’aiguilles avec un faible risque d’hématome au point d’injection. Certains animaux auront une perte légère de poids corporel dû à un jeûne de 12h maximum. Le protocole d’entraînement à la course peut entraîner une fatigue passagère mais ne conduit pas à l’épuisement des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever les muscles et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, permettant la réalisation du projet. Les cultures in vitro de cellules musculaires ne se développent pas suffisamment pour atteindre un stade mature des structures étudiées. Elles ont cependant permis de faire un premier tri des réactifs pour réduire le nombre de ceux qui seront testés chez les animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé grâce à des tests statistiques afin d'obtenir des résultats standardisés et reproductibles en réduisant au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées.

Raffinement

Les injections seront réalisées à l’aide d’aiguilles fines et sous anesthésie générale pour les injections dans la circulation veineuse pour réduire la douleur de l’injection. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par un personnel formé et évalué grâce à des signes cliniques codifiant le niveau de bien-être pour intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance apparaissent, notamment par la délivrance d’anti-douleurs. Les souris qui réaliseront l’exercice de course seront entraînées les 5 jours précédents pour réduire le stress de la nouveauté.

Choix des espèces

La souris présente un degré de similitude important avec l’humain en ce qui concerne les muscles. Des animaux âgés d'au moins 2 mois seront étudiés car les muscles sont matures à cet âge.