Système musculosquelettique

Six semaines de probiotiques dans l'eau de boisson, deux passages en tube de contention pour mesurer la composition corporelle, un test d'agrippement de quatre-vingt-dix secondes sur une grille retournée : 30 souris âgées de 21 mois vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le jour de la mise à mort, elles reçoivent un antidouleur sous la peau puis, trente minutes plus tard, un mélange d'anesthésiques dans l'abdomen avant un prélèvement sanguin, et sont tuées dans la foulée. Aucune n'est gardée vivante, les tissus étant collectés puis stockés pour des questions à venir. Le porteur justifie l'effectif par quinze souris par groupe et annonce que "cette procédure utilisera 45 animaux", quand le projet en déclare 30.

Objectifs

Le but du projet est d’étudier la capacité de probiotiques (bactéries non pathogènes) à transmettre la séquence ADN d’une molécule d’intérêt aux cellules de l’intestin de souris âgées, puis la capacité de ces cellules à produire la molécule d’intérêt, et enfin la capacité de celle-ci à agir sur les muscles des souris âgées pour augmenter leur masse musculaire et leur force musculaire.

Bénéfices attendus

Seuls les travaux menés précédemment chez des souris obèses ont permis une première validation des capacités de la molécule d’intérêt à augmenter la masse musculaire dans un modèle animal de sarcopénie. Si les résultats de cette étude chez les souris âgées sont positifs cela permettra de confirmer ces premières données et ainsi renforcer le potentiel de cette molécule comme candidat pour la prise en charge de la sarcopénie. Un essai clinique chez la personne âgée pourra ensuite être sérieusement envisagé. Ceci constitue une avancée non négligeable dans le domaine car il n’existe à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique pour les personnes âgées atteintes de sarcopénie.

Procédures

Les 30 souris recevront des probiotiques dans l’eau de leur biberon (durée= 6 semaines). Deux analyses de la composition corporelle des 30 souris seront réalisées (souris vigiles, contention dans un tube placé dans l’appareil de mesure pendant moins de 2 minutes par souris). Une mesure de la force musculaire des 30 souris sera réalisée grâce à un test d’agrippement (souris vigiles se déplaçant librement sur une grille inversée pendant 90 secondes maximum). Avant la mise à mort, les 30 animaux recevront un antidouleur par injection sous la peau (durée=30 sec contention comprise/animal) puis trente minutes plus tard un mélange d’anesthésiques par une injection dans l’abdomen (durée=30 sec contention comprise/animal) pour effectuer un prélèvement sanguin (20 secondes). Toutes les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement (2 secondes).

Impact sur les animaux

Cette procédure entraînera des nuisances légères sur les animaux. La mesure de la composition corporelle et le test de force musculaire entraîneront un léger stress chez les animaux. Les injections d’antidouleur et d’anesthésiques nécessaires pour le prélèvement de sang final peuvent générer une douleur et un stress chez l’animal. Aucun effet néfaste lié à l’ingestion des probiotiques n’est attendu.

Devenir

Les 30 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but du projet est d’étudier la capacité des probiotiques à transmettre les séquences ADN aux cellules de l’intestin des souris, puis la capacité de ces cellules à produire la molécule d’intérêt, et enfin la capacité de celle-ci à agir sur les muscles des souris âgées. Il s’agit d’une problématique complexe impliquant une cascade d’évènements et la communication entre plusieurs organes. Aucune alternative non animale n’est disponible pour répondre à une telle problématique. Ainsi ce projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Il est important de mentionner que la molécule d’intérêt a été testée en amont sur des cellules de muscle en culture afin de valider ses propriétés.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Il est basé sur des études précédentes chez des souris injectées avec une molécule similaire. Pour observer une différence significative dans la taille des muscles, compte tenu de la variabilité et de la fragilité des muscles, il faut compter 15 souris/groupe. Cette procédure utilisera 45 animaux. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger ou pourront être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.

Raffinement

L’état général des animaux et leur comportement seront étroitement observés 3X/semaine. Les animaux seront pesés 1X/semaine. La prise alimentaire sera contrôlée 1X/semaine également. Les probiotiques seront administrés dans l’eau de boisson et non par gavage pour éviter manipulation quotidienne, stress et douleur liés au gavage. Afin de limiter le stress des animaux au cours de la mesure de la composition corporelle et du test de force musculaire, les tests seront réalisés le matin (l’après-midi l’animalerie est plus calme et les animaux sont donc beaucoup plus enclins à dormir que le matin) et les animaux seront amenés dans la salle d’expérimentation 30 minutes avant les mesures et seront immédiatement replacés dans leur cage d’hébergement dès la fin des mesures. Pour limiter encore d’avantage le stress induit par la mesure de la composition corporelle, le temps nécessaire sera laissé à chaque animal pour qu’il entre volontairement dans le tube d’analyse. Une injection d’antidouleur puis une injection d’anesthésiques seront réalisées en amont du prélèvement de sang final pour éviter toute douleur. Tous les animaux seront immédiatement mis à mort à la suite du prélèvement de sang. Surveillance des animaux, pesées et tests fonctionnels seront réalisés uniquement par deux personnes pour limiter le stress. Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les connaissances relatives aux effets des probiotiques chez la souris ainsi qu’aux effets d’une molécule similaire sur le muscle de la souris font de cette espèce un modèle de choix pour répondre à la question posée. La physiologie de la souris âgée étant proche de celle de l’Homme sur plusieurs aspects (sarcopénie, ostéoporose, ralentissement du métabolisme), utiliser la souris âgée dans ce projet permettra d’obtenir des informations importantes pour transférer la technologie chez l’Homme dans un essai clinique. L’administration des probiotiques sera réalisée chez des souris âgées de 21 mois. A ce stade, les souris présentent une sarcopénie marquée et constituent donc un modèle idéal pour étudier les effets de la molécule sur le muscle et la force musculaire et évaluer son potentiel à être utilisée en clinique chez des personnes âgées présentant une sarcopénie.

Pour comprendre comment une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers est régulée dans le muscle, 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Réparties en trois lots de 140, elles reçoivent une injection intramusculaire, une injection intraveineuse, ou deux injections suivies d'un transfert de gène localisé, chaque fois sous anesthésie. Le jour de la mise à mort, une mesure de contractilité musculaire de quinze minutes est pratiquée sous anesthésie, sans réveil, avant les prélèvements. Le porteur indique que les deux muscles tibialis antérieurs sont injectés chez chaque animal pour réduire l'effectif, et que toute souris montrant un signe de détérioration de sa santé est tuée immédiatement.

Objectifs

Une expansion anormale d’acides aminés dans une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers cause une maladie génétique musculaire appelée la dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD, prévalence de la pathologie 1/100 000 personnes en Europe). Le niveau de cette protéine est très bas dans le muscle mais très peu de choses sont connues concernant la régulation de cette protéine dans le muscle. Ce projet consiste à étudier sa régulation dans le muscle squelettique in vivo. Dans ce projet, nous modulerons plusieurs facteurs décrits comme régulateurs de cette protéine, afin d’étudier leurs effets sur l’expression de la protéine dans le muscle in vivo. Cette étude permettra de mieux comprendre sa régulation et d’envisager des approches thérapeutiques pour prévenir et limiter les conséquences de l'atteinte musculaire de l'OPMD.

Bénéfices attendus

L’étude de la régulation de l’expression d’une protéine mutée dans la dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD, prévalence de la pathologie 1/100 000 personnes en Europe) nous permettra de trouver des solutions pour restaurer un niveau fonctionnel suffisant de cette protéine dans les muscles atteints dans la maladie. Le bénéfice attendu est l’arrêt ou la diminution de la progression de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à trois interventions réalisées sous anesthésie. Le lot1 (140 animaux) sera soumis à une injection intramusculaire (sous anesthésie). Il s'agit d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectué sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie e et des prélèvements. Le lot2 (140 animaux) sera soumis à une injection intraveineuse (sous anesthésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectuée sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie et des prélèvements. Le lot3 (140 animaux) sera soumis à deux injections intramusculaires (sous anesthésie), suivi par un transfert de gène localisé dans le muscle (sous anesthésie et sous analgésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectuée sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie et des prélèvements.

Impact sur les animaux

Dans notre projet, nous injectons des AAV (virus adéno-associés) en intramusculaire (dans le muscle tibialis anterior) et en systémique (dans la veine de la queue) et nous réalisons un transfert de gène localisé dans le muscle. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants: effets sur les variables physiologiques (température, tension, oxygénation) pendant l'anesthésie. Après la mesure de la contractilité du muscle squelettique réalisée sous anesthésie/analgésie (durée d'environ 15 minutes), les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'anesthésie générale afin d'éviter tout effet indésirable ou douleur.

Devenir

Tous les animaux des procédures sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. L’analyse des muscles injectés et des autres organses (foie, etc) est indispensable pour ce projet. L'euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise

Remplacement

L'expression d’une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers dans le muscle squelettique est étroitement contrôlée. Les modèles de culture in vitro disponibles ne permettent pas de récapituler la complexité présente in vivo et ne permettent pas d’arriver à une maturation comparable à celle in vivo justifiant le choix d’utilisant la souris comme modèle

Réduction

Chaque groupe sera constitué de 10 animaux pour obtenir des résultats statistiques. Dans le respect de la règle des 3R, une première série d’ expériences sera réalisée sur 5 souris. Le nombre sera incrémenté exclusivement si besoin. En outre, afin de réduire le nombre de souris utilisées (dans le respect de la règle des 3R) pour chaque souris nous injecterons le muscle Tibialis Anterior de la patte gauche et de la patte droite. Au maximum un total de 420 souris seront utilisées dans ce projet. Des études préliminaires ont montré la faisabilité de cette approche (il n’y a pas d’interférence expérimentale entre l’injection de deux Tibialis Anterior). Afin de comparer les groupes de sujets, nous réaliserons une analyse statistique.

Raffinement

Pour le raffinement, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Suite à l’acte chirurgical, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour les injections en intramusculaire et en systémique, les souris sont anesthésiées. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire et de compréhension des mécanismes physiopathologique du muscle squelettique. Nous utiliserons des souris d’âge adulte (8-40 semaines) : cela nous permettra d’analyser les changements de la régulation de notre protéine d’intérêt en modulant des protéines décrites dans la littérature comme ses régulatrices, dans un environnement contrôle adulte.

7 010 souris immunodéficientes ou dystrophiques vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte infligé est une biopsie de la queue, pratiquée une fois sur l'animal juvénile pour vérifier son génotype, avec une douleur brève et un risque d'infection au point de prélèvement que le porteur reconnaît. Ce projet ne produit par lui-même aucune connaissance, il sert à élever et à trier des lignées destinées à d'autres protocoles, le porteur affirmant que ces souris sans défense immunitaire sont "indispensables" pour tester des cellules humaines sans immunosuppression. La grande majorité des animaux part vers d'autres projets d'expérimentation, ceux du mauvais génotype et les anciens reproducteurs étant tués.

Objectifs

Nous travaillons avec quatre lignées de souris à phénotype dommageable où une biopsie sear nécessaire afin de génotyper les animaux : une lignée de souris immunodéficiente (sans défense immunitaire), deux lignées de souris immunodéficientes et dystrophiques et une lignée de souris dystrophiques. Nous nous intéressons au muscle squelettique et nos recherches sont orientées à comprendre la régénération musculaire, essentiellement chez l’homme. Les souris immunodéficientes et les immunodéficientes avec dystrophies sont essentielles puisqu'elles nous permettent de tester in vivo le comportement de cellules humaines, murines ou même des vecteurs viraux sans adopter un traitement d’immunosuppression de l’animal. La lignée de souris dystrophique est elle essentielle pour pouvoir étudier la régénération musculaire dans sa globalité en condition pathologique et pour pouvoir mettre au point des stratégies thérapeutiques. L’objectif est donc la génération de lots de souris immunodéficientes et dystrophiques du bon génotype indispensables pour mener à bien nos projets de recherche.

Bénéfices attendus

Les souris générées dans ce projet (souris immunodéficientes et dystrophiques) permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur la régénération musculaire dans les dystrophies musculaire chez l’homme, des maladies qui touchent le muscle et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. La régénération musculaire est un processus qui est altéré notamment dans la dystrophie musculaire de Duchenne (la dystrophie la plus fréquente des maladies neuromusculaires chez l’enfant qui affecte l’ensemble des muscles du corps et qui touche un garçon sur 3500 nés) et dans la dystrophie musculaire des ceintures (un groupe de maladies neuromusculaires qui touchent les muscles situés dans la région scapulaire et pelvienne)

Procédures

Nous élèverons différentes lignées mutines à phénotype dommageable (immunodéficientes et/ou dystrophiques) pour lesquels un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour le génotypage (biopsie) pourraient induire une douleur légère et de courte durée chez l'animal. Il peut également avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Si un phénotype se déclare, les animaux pourront avoir un risque d'infection accrue ou bien une attente musculaire légère pouvant induire une mobilité réduite (suivant le modèle animal).

Devenir

La grande majorité des animaux seront transférés pour expérimentation et affectés à d’autres demandes d’expérimentation animale (utilisation continue). Plusieurs projets sont déjà en cours, d’autres sont en cours d’écriture pour soumission au comité d’éthique et d’autres encore le seront dans l’avenir. Les animaux du mauvais génotype et les anciens reproducteurs seront euthanasiés.

Remplacement

Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaire participant à la régénération musculaire et à la mise en place des pathologies musculaires. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier tous ces aspects.

Réduction

Les souris générées dans ce projet seront transférées pour expérimentation dans d’autres procédures expérimentales où le nombre des souris sera attentivement étudié et réduit au maximum utilisant par exemple des tests statistiques adéquats, des méthodes de calcul de la taille des groups (7010 animaux estimés pour 5 ans). Le choix attentif de ces éléments permettra de réduire aussi le nombre de souris à générer dans cette demande d’autorisation. En outre, le nombre d'accouplement en cours sera régulièrement réévalué en fonction des besoins des projets.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Pour éviter l'apparition du phénotype des animaux, ils sont maintenus sous un statut sanitaire stricte en conditions stériles, tout le matériel est stérilisé par autoclavage (enrichissement, cages) et l'eau est osmosée. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire et de compréhension des mécanismes physiopathologique du muscle squelettique. Des animaux immunodéficientes sont indispensables pour pouvoir tester in vivo le comportement de cellules humaines ou des vecteurs viraux sans adopter un régime d’immunosuppression de l’animale. Les animaux dans cette procédure genotypés entre 7 et 14 jour de vie puis utilisés à l’âge adulte pour constituer des accouplements. Les animaux générés dans cette procédure et impliquée dans d’autres procédures seront utilisés à l’âge adulte.

Pour mesurer la durée du cycle de remplacement des dents pharyngiennes lors d'un passage à une alimentation dure, 65 cichlidés Astatoreochromis alluaudi vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est anesthésié par balnéation puis reçoit une injection de marqueur dans l'abdomen, l'ensemble durant une dizaine de minutes, avant d'être tué en fin de projet pour que ses mâchoires soient prélevées et coupées. Les individus qui développent ensuite une hydropisie, des écailles hérissées ou un trouble de la vessie natatoire sont mis à mort par surdose d'anesthésique. Le porteur justifie le choix de cette espèce du lac Victoria par le fait qu'elle est la seule à avoir déjà fait l'objet d'études documentant cette plasticité dentaire, ce qui la rend selon lui "absolument unique" pour le projet.

Objectifs

Le but du projet est de déterminer la durée du cyle de remplacement des dents pharyngiennes chez une espèce de poissons de la famille des Cichlidés mangeur d'escargots non obligatoire afin de mieux comprendre la plasticité dentaire et élaborer des modèles de plasticité dentaire. Cette espèce possède un profil alimentaire varié. Comme beaucoup d'espèce elle possède une machoire pharygienne abritant des dents de différentes formes. En fonction de son alimentation, les dents sont remplacées et la forme des nouvelles dents change. Une alimentation constitué d'aliments durs entraine l'apparition de plus de dents en forme de molaire par exemple. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. Au cours d'un précédent projet, nous avons pu évaluer avec succès la durée du cycle de remplacement lors d'une prise alimentaire standard. Dans la présente demande, nous souhaitons afiner les résultats obtenus en réalisant une étude pour étudier le cycle de remplacement dentaire lors d'une transition alimentaire vers une alimentation dure contenant des escargots.

Bénéfices attendus

Afin d'explorer les mécanismes sous-jacents à la plasticité des modèles numériques de la réponse d’un bourgeon dentaire aux forces mécaniques liées à l’alimentation. Ce projet permettra en particulier de déterminer si le cycle de remplacement des bourgeons dentaires est modifié lors d'une transition d'une alimentation constituée essentiellement d'aliments mous vers une alimentation contenant des aliments durs. Ce projet aura des implications importantes pour notre compréhension du rôle de l'alimentation dans la mise en place des dents. Il permettra l'établissement de modèles numériques permettant d'étudier le développement dentaire.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés individuellement par balnéation et recevront une unique injection dans l'abdomen afin d'injecter un produit qui marquera les dents et permettra de suivre les dents qui n'ont pas été remplacées et de déterminer la longueur du cycle de remplacement des dents. L'intervention durera une dizaine de minutes en incluant l'anesthésie, l'injection et le reveil.

Impact sur les animaux

Faibles. Le projet implique de réaliser, en début de protocole, des injections dans l'abdomen qui peuvent présenter dans de rares cas des séquelles. Une vigilance particulière sera donc apportée lors de la récupération des animaux après ces injections. Après ces injections, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation (hydropisie, écailles hérissées). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou de détresse seront mis à mort par surdose d'anesthésique. Pour le reste du projet, les animaux sont conservés en groupe sociaux et nourris suivant des régimes alimentaires différenciés mais équivalents à ceux qu'ils adoptent dans le milieu naturel. Les animaux présentant des signes de stress seront isolés. Un intérêt particulier sera porté sur les animaux présentant des signes de refus alimentaires ou d'amaigrissement. Ces animaux seront sortis de l'expérimentation.

Devenir

L'analyse de la forme des dents nécessite de prélever les mâchoires des animaux et de réaliser des coupes qui seront analysées au microscope. Ceci nécessite donc la mise à mort de l'ensemble des animaux utilisés dans le projet.

Remplacement

Des approches numériques existent pour l'étude du développement dentaire malheureusement elles ne sont adaptées qu'aux mammifères. Nous souhaitons développer des modèles numériques équivalents mais qui soient adaptés aux espèces que nous étudions. Pour développer ces modèles, il est nécessaire de poursuivre des études in vivo pour fournir les données nécessaires à leur élaboration. Une fois établis, ces modèles pourront être utiliser pour étudier le développement dentaire d'autres espèces de vertébrés.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour fournir analyse statistique satisfaisante Un approche statisitique sera utilisée pour mettre en évidence d'éventuelles différences de longueur de cycle entre les dents positionnées au centre et celles positionnées en périphérie de la machoire en fonction du régime alimentaire suivi. Tous les tests du projet seront initiés en même temps ce qui permet de mutualiser les contrôles d'injections et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires de 10 animaux.

Raffinement

L'injection dans l'abdomen en début de protocole sera réalisée sous anesthésie et les poissons seront placés dans des bacs de réveil et surveillés lors de leur sortie d'anesthésie. Par ailleurs, les Astatoreochromis sont maintenus en groupes sociaux dans des bacs qui leur permettent d'exprimer leurs comportements naturels. Afin de favoriser le bien-être des animaux, les aquariums disposent d'un substrat (sable) qui permettent aux animaux d'exprimer leur comportement fouisseur. De même, afin de limiter les possibilités d'agression par les individus dominants, de nombreuses cachettes (gouttières renversées, pots en terre) sont mises à disposition des animaux. Les animaux disposent d'une alimentation variée proche de celle de leur milieu naturel. Autant les régimes alimentaires à base de nourriture molle que ceux à base d'escargots correspondent à des régimes alimentaires que les animaux adoptent dans leurs biotopes d'origine. Les animaux nourris d'escargots reçoivent en plus au minimum un repas constitué d'aliments variés pour éviter tout risque de dénutrition ou de carence. Les animaux sont observés quotidiennement en semaine et les animaux malades ou stressés sont isolés et placés dans un environnement différent. Après l'injection dans l'abdomen, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation au site de l'injection. Les signes de déséquilibres seront observés après l'injection (gonflement, écailles hérissées), ainsi que les signes pouvant indiquer une atteinte de la vessie natatoire (flottabilité positive ou négative). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou d'atteinte à la vessie natatoire seront mis à mort par une surdose d'anesthésique en balnéation.

Choix des espèces

En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; chasseur d'escargot non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire incorporant des escargots entiers provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet. 65 animaux seront utilisés d'une longueur standard de 6 à 8 cm (soit agés environ d'un an). A cet âge, l'injection dans l'abdomen est devient simple à réaliser et les machoires restent de taille raisonnable pour réaliser l'acquisition des données d'imagerie.

Une biopsie d'oreille au sevrage est le seul geste décrit, alors que les souris de cette nouvelle lignée perdent progressivement leur masse musculaire jusqu'à un éventuel changement de démarche vers douze mois. 276 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever les muscles et les observer en imagerie cellulaire. Le projet porte sur la réparation de l'ADN dans les cellules musculaires au cours du vieillissement, avec des analyses fixées à deux, six et douze mois. Le porteur annonce n'attendre aucun signe de stress ni de souffrance aux âges retenus, tout en prévoyant des pesées deux à trois fois par semaine et des prises de température rectale jusqu'à l'atteinte des points limites.

Objectifs

Au cours du vieillissement, les lésions dans l'ADN s'accumulent et vont être responsables de l'augmentation du risque de mutations génétiques, de dysfonctionnements cellulaires, ainsi que de diverses maladies liées à l'âge telles que le cancer, les maladies neurodégénératives et d'autres conditions de santé associées au vieillissement. Les mécanismes de réparation de l’ADN sont encore très peu connus et investigués dans les cellules du muscle squelettique. L’objectif de ce projet est d’avoir une meilleure compréhension de ces mécanismes de réparation de l'ADN dans les cellules musculaires au cours du vieillissement à travers un nouveau modèle murin. Pour l'ensemble de ce projet, un maximum de 276 souris seront nécessaires.

Bénéfices attendus

Ce nouveau modèle murin sera pour l’heure un modèle unique pour pouvoir étudier des aspects encore peu explorés de certaines voies de réparation de l'ADN dans le muscle squelettique, et permettre une meilleure compréhension de protéines structurantes de l'ADN dans des conditions normales et pathologiques, et de déterminer leur implication dans ces mécanismes de réparation à l’ADN pour à plus long terme envisager de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.

Procédures

Une petite biopsie d’oreille (=1mm) sera réalisée au moment du sevrage pour pouvoir effectuer l’identification génétique de chacune des souris. Le temps du geste par animaux et < 1min.

Impact sur les animaux

La perte de la protéine d'interêt ne devrait pas générer d’effet indésirable avant plusieurs mois. D’après nos études précédentes, le modèle ne devrait pas présenter d’atteinte de points limites sur les points de cinétique définis. Notre étude sera placée à 2, 6 et 12 mois. Les effets attendus sont une perte lente et progressive de la masse musculaire qui entrainera petit à petit une perte de poids et qui pourra très progressivement emmener à un éventuel changement dans la démarche des souris vers l’age de 12 mois. D’après notre expérience au laboratoire sur le modèle de vieillissement prématurés nous ne nous attendons pas à avoir des signes de stress, de souffrance ou de comportement anormal aux ages définis. Cependant une surveillance sera mise en place et adaptée tout au long du protocole afin de détecter tout signe de souffrance qui entrerait alors dans un point limite.

Devenir

Mise à mort afin de collecter les muscles pour analyses approfondies d'imagerie cellulaire.

Remplacement

Des cellules seront isolées et immortalisées à partir des animaux homozygotes de la nouvelle lignée murine afin de réaliser des expériences sur cellule quand cela est possible. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas une étude au-delà de quelques jours ce qui n’est donc pas suffisant pour observer certains phénotypes, mécanismes ou encore l’effet de certains traitements. De plus la ½ vie des protéines d'intérêts dans des cellules musculaires est très longue, réduisant l’apparition et le niveau des phénotypes observables par rapport à la durée de vie de cellules en culture et augmentant l’hétérogénéité des résultats, voir l'absence de conclusion. D’autre part, le modèle murin reste l’unique moyen pour étudier fonctionnellement le muscle dans son entité au cours du vieillissement et pour évaluer les mécanismes impliquées dans de telles voies de signalisation.

Réduction

Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal mais suffisant pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le maximum de données pouvant être généré à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une collaboration avec un laboratoire spécialiste des mécanismes de réparation de l’ADN sur tissu permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les effectifs d’animaux par groupe sont adaptés à chaque groupe. Des tests de comparaisons de moyennes ou de rang seront utilisés pour comparer deux groupes. Le personnel est formé à ces analyses. Les animaux seront traités par petite cohorte ce qui permettra si les résultats statistiques le permettent d’utiliser moins de souris. Dans la mesure du possible, les autres muscles seront collectés pour des études parallèles afin d’exploiter au maximum chacune des souris pour des études parallèles.

Raffinement

Une surveillance régulière et progressive des animaux sera réalisée par l’expérimentateur pour détecter les signes cliniques et/ou physiques précoces du phénotype. Les animaux seront pesés une fois par mois jusqu’à 11 mois, puis toutes les semaines jusqu’à la détection d’un phénotype. Enfin, ils seront pesés 2 à 3 fois par semaine jusqu’à l’atteinte des points limites. En même temps que les pesées, une prise de température rectale sera mesurée et permettra de détecter de manière précoce et concomitante à la pesée toute altération de l’état général de la souris. À l'aide de ces deux paramètres, les premiers signes d’un phénotype et d’un vieillissement pourront être détectés précocement et une observation et une vigilance plus accrues des cages concernées seront alors mises en place. Au cours de ces surveillances, nous porterons également nos observations sur le comportement social et la capacité de la souris à se déplacer correctement. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront alors mis à mort immédiatement en cas de signes de souffrance et leurs tissus collectés. Les animaux seront toujours à plusieurs par cage afin de maintenir l’aspect social et chaque cage sera dotée d’un environnement enrichi. Si toutefois des souris devaient se retrouver seules dans la cage, il est prévu d’apporter un enrichissement renforcé et adapté, comme par exemple avec l’ajout de dômes en carton pour veiller au bien-être de la souris.

Choix des espèces

Malgré des différences entre la symptomatologie chez les souris et les hommes, le modèle murin est extrêmement utile pour les études mécanistiques, physiopathologiques et la mise au point de traitements thérapeutique. Plus spécifiquement, le muscle, que ce soit en termes de structure, de fonctionnement et de pathologie est extrêmement proche de celui de l’Homme. Le modèle murin se révèle donc être un système idéal et indispensable pour étudier le rôle de gènes sur le plan moléculaire, cellulaire, tissulaire et fonctionnel au sein d’une entité. Pour répondre à notre problématique, des souris agées de 2 à 9 mois seront utilisées pour la reproduction dans une première procédure. Passé cet âge les souris deviennent trop âgées. Elles seront euthanasiées à l’issue de cette procédure. A cet age le phénotype dommageable ne devrait pas être survenu. Toutefois les souris seront attentivement surveillées. Dans une 2ème procédure, des souris contrôles et mutantes seront utilisées à l’age de 2 mois, 6 mois et 12 mois afin de pouvoir évaluer l’importance de la signalisation de réparation de l’ADN dans le muscle, l’implication de notre protéine d’intérêt dans cette signalisation et le tout au cours du vieillissement.

Pour vérifier si la mutation d'un gène repérée dans deux familles de personnes scoliotiques déforme la colonne vertébrale, trois lignées de poissons-zèbres mutants sont créées. 780 poissons-zèbres vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, répartis sur trois générations par lignée. Chacun subit sous anesthésie un prélèvement de quelques millimètres de nageoire caudale pour identifier sa mutation, et 180 d'entre eux passent trois séances de micro-scanner à huit, douze et seize semaines, avec un transport pouvant durer trente minutes avant chaque séance. Les 600 autres sont tués dès la lignée stabilisée, et les 180 restants après la dernière imagerie, le retour à l'aquarium principal étant exclu pour raison sanitaire.

Objectifs

La scoliose, dite idiopathique, qui touche près de 3% des sujets selon les régions géographiques, comporte une composante génétique. Cependant, les modalités exactes de transmission ne sont pas clairement établies. L’hypothèse sous-tenant le projet « scoliose et génétique » est que s’il existe des gènes de prédisposition à la scoliose « idiopathique », une analyse génétique poussée de familles scoliotiques présélectionnées par leur arbre généalogique permettra de détecter de nouvelles mutations spécifiquement associées à la pathologie par comparaison entre patients atteints et apparentés « sains ». Cette analyse a permis de découvrir une mutation d’un gène codant une protéine impliquée dans la transcription de l’ADN chez plusieurs personnes atteintes de scoliose idiopathique dans deux familles indépendantes. Chez le poisson-zèbre, il existe trois gènes qui pourraient être l’homologue de ce gène chez l’homme. Nous allons donc inactiver ces trois gènes indépendamment afin de générer trois lignées de mutants poissons-zèbres. Les mutants poissons-zèbres ainsi générés seront par la suite analysés cliniquement par l’imagerie afin de vérifier l’absence ou la présence de scoliose chez ces animaux. De ce fait, nous souhaitons utiliser le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le rôle fonctionnel de cette protéine, et son implication dans la physiopathologie de la scoliose idiopathique. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est la validation du gène exploré dans la genèse de la scoliose idiopathique. Cette hypothèse serait renforcée par le développement de scolioses chez les mutants ainsi créés. La validation de ce variant permettrait d’avancer dans la compréhension de la genèse des scolioses idiopathiques (physiopathologie) et éventuellement à long terme d’avancer dans la prédiction de progression des courbures scoliotiques découvertes. En effet, la progression de l’identification des mécanismes génétiques causaux à la scoliose dite « idiopathique » permettrait de pouvoir proposer aux patients chez qui une scoliose est découverte un séquençage exomique précoce de manière à avoir une meilleure connaissance du risque et donc d’adapter le traitement des patients (agressivité du traitement orthopédique par corset, nécessité de chirurgie correctrice).

Procédures

EU1 : Afin d’identifier le type de mutation porté par les poissons, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale sera réalisé sous anesthésie générale afin de minimiser la souffrance des animaux. Un seul prélèvement de quelques millimètre sera effectué par animal, la manipulation dure 1-2 minutes. Cette intervention n’entraîne pas de séquelles impactant la nage ou les capacités d’alimentation. EU2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (UE1) jusqu’au laboratoire d’imagerie (EU2) pour la réalisation d’une imagerie micro-scanner à 8,12 et 16 semaines de vie. La durée est de 30 minutes maximum par trajet. L’analyse par imagerie micro-scanner, anesthésie incluse aura une durée totale de 3 à 4 minutes. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Concernant la création d’une lignée mutante, le phénotype (Ensemble des caractères apparents d'un individu) attendu causerait éventuellement une déformation de la colonne vertébrale, il ne devrait pas y avoir d’impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter (classe légère). L’inactivation d’un gène codant pour une protéine qui est impliquée dans la synthèse des neurotransmetteurs pourrait entrainer des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance et leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer, bien qu’ils puissent être de taille plus petite ou avoir un axe corporel incurvé ou déformé. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique est une petite plaie de quelques millimètres suivie ensuite d’un processus cicatriciel, indolore et capable de se regénérer en quelques jours. Le transport jusqu’au lieu du scanner ainsi que la réalisation des imageries peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin de maintenir les poissons immobiles, ce qui peut entrainer un risque anesthésique. Les animaux sont placés en quarantaine jusqu’à la fin du protocole d’imagerie puis euthanasiés afin d’éviter toute contamination par d’éventuels pathogènes de l’aquarium principal.

Devenir

Nous générons au total 780 animaux, 180 animaux porteurs d’une mutation des gènes cibles seront conservés à l’animalerie. Les autres animaux (soit 600 animaux) seront euthanasiés une fois la génération d’une lignée de mutation de troisième génération, stable sur le plan génétique soit établie. Ces 180 animaux seront euthanasiés après la procédure d’imagerie micro-scanner, un retour de quarantaine au système principal de l'animalerie étant impossible par sécurité sanitaire.

Remplacement

Les études sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la colonne vertébrale en entier et de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de leur forme longitudinale, permettant une torsion axiale de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) sont un modèle de choix pour l’étude des scolioses.

Réduction

Nous n’avons pas de résultats préliminaires nécessaires pour effectuer des tests statistiques. Les expériences sont réalisées sur des poissons juvéniles puis adultes. Nous limitons le nombre minimal au maintien d’une lignée, dont 20 poissons/aquarium. Nous élèverons 20 poissons pour la première génération (F0), puis 120 poissons (homozygotes, hétérozygotes et les sauvages à identifier) pour la deuxième generation (F1), 120 poissons (homozygotes et hétérozygotes à identifier) pour la troisième génération (F2). Nous avons besoin de 3 générations, de ce fait nous aurons au total 260 individus (20 F0 + 120 F1 + 120 F2) pour chaque lignée. Nous aurons 780 (260 x 3) individus pour les trois lignées de mutants (3 gènes homologues à celui de l’Homme chez le poisson-zèbre). La population adulte de poissons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées. Concernant la réalisation des scanners : nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Ce nombre permettra d’effectuer des analyses statistiques comparatives ainsi qu’une analyse de variabilité inter-observateurs avec une puissance suffisante (score kappa de Fleis attendu : >0.8 ; alpha

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux une densité de 20 poissons/aquarium de 3.5L sera appliquée. Nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse. L’alimentation sera composée d’aliments secs et de proies vivantes adaptés au stade développemental des poissons-zèbre afin de leur permettre d’exprimer leur comportement naturel de prédateur. Les animaux ne seront jamais hébergés seuls. Dans le cas de l’identification d’un poisson-zèbre exprimant notre mutation d’intérêt, alors nous mettrons en place un enrichissement social en introduisant dans l’aquarium d’autres congénères. Les poissons présentant des anomalies qui les empêcheraient d'appréhender leur milieu normalement seront euthanasiés. De même pour préserver l'ensemble des poissons hébergés et le maintien d'un certain statut sanitaire, une limite d'âge de 18 mois est appliqué pour éviter la propagation d’infections par des animaux vieillissants. Les manipulations nécessitant une immobilisation et les prélèvements de nageoire caudal, seront conduites sur animaux anesthésiés. Nous surveillerons les animaux après le prélèvement de la nageoire caudale pour vérifier qu’il n’y ait pas de saignement et que dans les jours qui suivent la régénération de la plaie se met en place. Dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une mise à mort.

Choix des espèces

Le modèle poisson-zèbre partage 71% de son génome avec celui de l’homme et celui-ci est facilement modifiable par des techniques de biologie moléculaire. De plus, son élevage et sa reproduction sont rapides et aisés. Dans le cas de notre étude sur la scoliose qui est une déformation en trois dimensions de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont de mauvais modèles d’étude car la présence d’appui sur les pattes avant leur permet de compenser et d’empêcher l’évolutivité d’une telle déformation. Les poissons-zèbres cependant constituent un bon modèle pour ces déformations vertébrales, leur colonne vertébrale comportant de grandes similarités avec l’espèce humaine : une structure vertébrale longitudinale, constituée d’éléments osseux mobiles et de disques intervertébraux, organisée en 4 segments. L’analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par micro scanner chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études précédentes. Nous analyserons les images issues du scanner micro-CT avec un logiciel dédié. Grâce à ces images, nous mesurerons les courbures de la colonne vertébrale des mutants par comparaison avec celle de poissons sauvages. Les animaux seront étudiés du point de vue phénotypique (apparition de scoliose) à 3 points cinétiques à 8, 12 et 16 semaines, qui correspondent respectivement à une période de forte croissance, au stade juvénile (parallèle avec l’aggravation pubertaire des scolioses humaines) et une analyse finale au stade adulte. Ceci permettra de suivre l’évolution de la scoliose dans le temps lors de sa phase de constitution puis une analyse finale à l’âge adulte