Système musculosquelettique
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Oestradiol et déconditionnement musculaire chez la souris KI-Dnm2
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Porteuses d'une mutation du gène de la dynamine qui reproduit une myopathie humaine, 300 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié dans des procédures d'un niveau sévère. Les femelles subissent une ovariectomie, l'implantation sous la peau de pastilles d'œstradiol, des prises de sang et une mesure invasive de force musculaire, les mâles recevant deux implantations à quinze jours d'intervalle. Le porteur affirme que cette myopathie n'est associée ni à une souffrance de l'animal ni à une altération de sa mobilité, alors que 150 souris sont déclarées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées au terme de chaque procédure pour prélever leurs tissus et leur sang.
Objectifs
La myopathie centronucléaire autosomale dominante (MCN-AD) est principalement due à la mutation du gène dynamine. Le modèle murin de cette pathologie exprime à l’état hétérozygote la mutation la plus fréquemment retrouvée chez l’homme. Elle présente un retard de croissance musculaire et une perte de force musculaire entre 4 et 8 semaines d’âge. De façon intéressante, nos données préliminaires suggèrent l'existence d'une différence d'évolution de la maladie entre les mâles et les femelles. Par ailleurs, des éléments bibliographiques indiquent que les œstrogène, hormones feminines, s exercent un effet bénéfique sur la synthèse de protéines du muscle et procurent une résistance à la fatigue musculaire. Dans ce contexte, notre hypothèse générale est que les œstrogènes confèrent un effet protecteur aux souris femelles face au développement de la myopathie. L'objectif de ce projet consistera donc à vérifier si les œstrogènes procurent un effet protecteur dans l'évolution de la myopathie centronucléaire et comment transposer cet avantage aux souris males.
Bénéfices attendus
En déterminant le rôle protecteur potentiel des oestrogènes lors de la mise en place des symptomes de la myopathie centronucléaire ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de ce déconditionnement, et de proposer des stratégies d'intervention basées sur l'utilisation de modulateurs de l'activité du récepteur aux oestrogènes.
Procédures
Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris femelles, les souris femelles seront soumises aux interventions suivantes: ovariectomie (durée totale 15 min), implantation sous-cutanée de pastilles (diamètre 3,5 mm, épaisseur 2 mm) contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (45 min), prélèvements tissulaires (15 min). Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris mâles, les souris mâles seront soumises aux interventions suivantes: 2 implantations à 15 jours d'intervalle sous-cutanée de pastilles contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min x 2 ), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (45 min), prélèvements tissulaires (15 min).
Impact sur les animaux
La procédure d'ovariectomie et d'implantation sous cutanée de la pastille sont susceptibles d’engendrer des douleurs post-chirurgicales chez les souris. La mesure de force musculaire de part son invasivité peut générer des douleurs imperceptibles chez l'animal du fait de la profondeur de l'anesthésie. Nuissances en lien avec les prélèvement sanguins : les prélèvements au bout de la queue seront réalisée sous anesthésie générale gazeuse. A l'issue de cette prise de sang, les souris seront injectées avec un mélange kétamine et xylazine en vue de la réalisation d'une procédure de prélèvements tissulaires sans réveil Aucune nuisance n'est donc attendue compte tenu de l'état de l'animal au moment du prélèvement et du volume prélevé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de façon réglementaire et éthique au terme de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires et sanguins.
Remplacement
L’atteinte de la masse et de la fonction musculaire associé à la myopathie centronucléaire autosomale dominante est un processus multifactoriel sollicitant de nombreux tissus, le muscle bien évidement, mais aussi le système neuroendocrinien (axe gonadotrope). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal, à savoir la force musculaire, à l'aide d'un outil statistique prenant en compte les données de la littérature pour anticiper sur la variabilité des résultats dans notre projet. Pris en semble, ces prévisions indiquent que 14 animaux par groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 15 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront inclus qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 14 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats.
Raffinement
L'hébergement des animaux leur permet d'avoir accès à un enrichissement (dômes et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés par 2 à 4 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids, apparition de signes évocateurs de souffrance) à partir de l'âge de 3 semaines. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 6 heures après la réalisation des procédures, puis toutes les 24H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
La totalité des données dans le domaine du déconditionnement musculaire associé à la MCN-AD et l'ensemble des techniques utilisées ont été développés chez la souris. Nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des déjà publiées ou acquises au laboratoire. La myopathie centronucléaire autosomale dominante (MCN-AD) est une myopathie modérée qui n'est pas associé à une souffrance de l'animal, ni à une altération de leur mobilité ou de leur comportement. Leur durée de vie, leur fertilité et leur vieillissement sont dans la norme des souris sauvages. Le phéntoype de la souris reste modérée tout au long de sa vie etdans les conditions d'hébergement que nous lui proposons. Il n'y a pas de détérioration majeur de son état physiologique au delà de la mise en place du phéntoytpe au cours de la croissance post-natale. Aucune donnée de la littérature ne suggère une agravation de son phénotype quelques soient les conditions d'hébergement ou expérimentales. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 4 semaines. La fin de procédure aura lieu a l'âge de 8 semaines. En effet les symptômes apparaissant entre l'âge de 4 et 8 semaines, un traitement pendant cette période permettra de vérifier l'efficacité de thérapie basée sur l’utilisation de substances hormonales.
Un lipide mineur extrait de l’hévéa est-il capable de réduire la fragilité associée au vieillissement?
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Quatre séries de courses sur tapis roulant, chacune comptant vingt minutes de mesure de vitesse maximale puis trente à quarante-cinq minutes d'endurance, s'ajoutent à quatre séries de tests de force de préhension et de motricité. 80 souris âgées de 18 à 26 mois vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour collecter les tissus. S'y ajoutent une IRM mensuelle et 48 heures d'isolement en cage métabolique. Le porteur écrit que l'animal reste libre de cesser de courir quand il veut, et attend du projet un complément alimentaire enrichi en lipides mineurs extraits de l'hévéa contre la sarcopénie et l'arthrose.
Objectifs
Le vieillissement conduit au développement de pathologies chroniques telles que la sarcopénie (diminution de la masse et de la force musculaire) ou l’arthrose. La limitation de l'activité physique associée à ces pathologies peut créer un cercle vicieux de réduction des niveaux d'activité qui amplifie ces pathologies et plus largement le bien être des personnes. Des travaux in vitro ont montré que des lipides mineurs présents dans le poisson, les produits laitiers et les fruits et légumes, possèdent des effets antioxydants et anti-inflammatoires. De premières études pré-cliniques sur cellules musculaires et chez la souris saine ou obèse indiquent que ces lipides mineurs augmentent la masse musculaire, améliorent la santé, et auraient des effets anti-vieillissement sur les cellules. Ce projet vise à explorer in vivo chez la souris âgée, les effets de lipides mineurs pour lutter contre les troubles musculo-articulaires induit par le vieillissement et améliorer la mobilité et le bien-être.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à démontrer dans un modèle pré-clinique qu’une supplémentation chronique en lipides mineurs permet de ralentir ou limiter les pertes de fonctions musculosquelettiques induites par le vieillissement. Le développement de compléments alimentaires ou d’aliments enrichis en lipides mineurs pourrait permettre de maintenir les fonctions musculosquelettiques fonctionnelles du sujet âgé retardant ainsi l’apparition de la sarcopénie et de l’arthrose. Ce défi est un enjeu majeur de santé publique en raison notamment des coûts grandissant de ces deux pathologies pour notre système de santé.
Procédures
Pour tous les animaux : Prélevement sanguin à la queue (site recommandé pour les rongeurs) sur animaux vigiles (3 fois, 10s). Tests de motricité (4 séries, pour chaque série 3 répétitions de 5min espacées de 40min de repos) Tests de force de préhension (4 séries, pour chaque série 3 répétitions de 10s) Tests de course sur tapis roulant (4 séries, pour chaque série 20 minutes pour le calcul de la vitesse maximale et 30 à 45 min d’endurance). Mesure de la composition corporelle par IRM (résonance magnétique, tous les mois, 2 minutes) Cages métaboliques individuelles (1 fois en fin d’étude, pendant 48h)
Impact sur les animaux
Nous attendons une perte de poids naturelle liée au vieillissement des animaux. La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera lié à la fatigue physique durant l’heure suivant les tests de force, de motricité et d’endurance (grip test, rotarod, tapis roulant) qui seront réalisés en début, milieu (deux fois à 2 mois d’intervalle) et fin d’étude, et du stress lors de la mesure de la composition corporelle (par IRM, résonance magnétique, tous les mois, 2 minutes) et lors de l’isolement pendant 48h lors du test en cages métaboliques individuelles. Les animaux ressentiront une légère douleur lors des prélèvement d’une goutte de sang pour la mesure de la glycémie (taux de sucre dans le sang, 3 prélèvements, 10s).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus qui permettront des analyses cellulaires et moléculaires pour prouver l’effet bénéfique des lipides testés.
Remplacement
Les lipides mineurs que nous allons étudier sont destinés à devenir un complément ou additif alimentaire pour prévenir ou ralentir le développement de la sarcopénie et de l’arthrose chez l'Homme. Il est donc nécessaire de les tester dans l'alimentation plus particulièrement chez un modèle animal.
Réduction
Considérant qu’il s’agit d’une étude chez des souris agées pour laquelle nous attendons une mortalité naturelle en cours d’étude, nous avons calculé notre nombre d'animaux par groupe au plus juste pour permettre l'analyse statistique des résultats.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, avec pour enrichissement un carré de coton (nids de ouate), un tunnel plexi rouge. Le tunnel permet le transfert des animaux pour le change mais aussi leur permet de s’habituer au test de composition corporelle puisqu’ils sont insérés dans un tunnel de contention identique. Nous rajouterons un igloo en carton si les animaux n’arrivent plus à construire leur nid avec la ouate. Si de l’agressivité apparait entre 2 mâles il est prévu de les séparer en insérant une plaque de plexiglass dans la cage ce qui permettra le maintien des contacts visuels/olfactifs et auditifs. Le bien-être des animaux sera évalué à l’aide du test de construction du nid et par une observation approfondie tous les mois selon une grille spécifique. Pour les tests d'activité physique et de motricité, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit. Pour les tests de course, l’animal est libre de cesser de courir quand il veut. Enfin, le lipide que nous souhaitons tester sera directement intégré dans la nourriture.
Choix des espèces
Les lipides mineurs que nous allons étudier sont destinés à devenir un complément ou additif alimentaire pour prévenir ou ralentir le développement de la fonte musculaire et l’arthrose au cours du vieillissement chez l'Homme. Il est donc nécessaire de les tester dans l'alimentation plus particulièrement chez un modèle animal. De plus les précedentes études réalisées au laboratoire et conduites sur des souris ont démontré la pertinence de ce modèle. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 18 mois ce qui est considéré comme des animaux âgés (équivalent à 56 ans chez l'Homme), et ce pendant 8 mois. Au terme de l’étude les animaux auront 26 mois (plus de 70 ans chez l'homme).
Mise en place et formation du personnel pour des nouvelles techniques in vivo sur le modèle murin contribuant à l’avancée de la recherche sur les maladies neuromusculaires.
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- Système nerveux
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Former des techniciens à trois examens fonctionnels et caler les protocoles : 64 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit les trois actes, une exploration respiratoire de 22 minutes, une échographie musculaire de 30 à 60 minutes sous anesthésie générale, puis une mesure de la force de flexion du pied sous anesthésie, avec des aiguilles de stimulation plantées dans le muscle. Le porteur signale des réveils spontanés possibles, des détresses respiratoires pendant l'anesthésie et des douleurs post-opératoires liées aux piqûres. Il présente l'opération comme un moyen de réduire "considérablement" le nombre d'animaux dans les projets à venir, et précise que ces 64 souris étaient de toute façon promises à la mort, leur génotype ne servant aucun projet.
Objectifs
L’objectif de cette demande a pour but de développer nouvelles techniques in vivo chez la souris contribuant à l'avancée de la recherche sur les maladies neuromusculaires et de former les applicateurs. La mise en place de ces études permettra d’ajouter de nouvelles évaluations et ainsi proposer aux équipes de recherche des projets plus complets. Les différents actes réalisés seront l’échographie de muscles squelettiques, l'évaluation de la fonction respiratoire et de la force générée lors d’une flexion du pied. La technique d’élastographie par échographie permet de mesurer l'élasticité des différents tissus dans un muscle d'intérêt. Cette technique, nécessitant seulement une anesthésie générale, a pour but d’observer le développement des différents tissus composant le muscle dans les modèles murins de maladies neuromusculaires. Cet examen peut être réalisé plusieurs fois permettant un suivi régulier sur un même lot expérimental. Le nombre d’animaux inclut dans les projets scientifiques sera considérablement réduit et favorisera l’obtention de meilleurs résultats en éliminant la variabilité inter-individuelle. Le pléthysmographe est une exploration fonctionnelle respiratoire. Elle mesure l’ensemble des volumes gazeux pulmonaires. Cela indiquera également la contribution du diaphragme dans le système respiratoire. Cet examen est rapide, indolore et non invasif pour l’animal. L’évaluation de la force générée lors d’une flexion plantaire consiste à mettre en évidence les défauts de contractilité musculaire. Elle se déroule sous anesthésie générale accompagnée d’un analgésique et n’est pas terminale. Ces évaluations pourront être répétées sur un même lot expérimental permettant un suivi régulier de l’évolution des symptômes de la maladie neuromusculaire. Cette technique permettra de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés dans les projets scientifiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette demande a pour but de développer de nouvelles techniques in vivo contribuant à l'avancée de la recherche sur les maladies neuromusculaires et de former les applicateurs. La réalisation de cette étude pilote peut s'avérer très utile pour la détermination précise des points limites, et pour la formation complète des techniciens. Cette étude utilisant un nombre restreint d'animaux peut aider à déterminer la durée de l’acte et la fréquence des observations nécessaires des lots dans les futurs projets expérimentaux. Ce projet de formation, préliminaire aux études des équipes de recherche peut également donner une indication de la variance des réponses entre les groupes de traitement, laquelle peut être alors utilisée pour estimer plus précisément la taille appropriée des groupes des projets expérimentaux. De plus, mener une expérience pilote offre l'occasion de se familiariser avec les signes et symptômes attendus et de conseiller au mieux les concepteurs de projets par la suite.
Procédures
La totalité des animaux inclus dans ce projet seront soumis aux trois techniques d'études fonctionnelles décrites : - L'évaluation de la fonction respiratoire sera réalisée 1 seule fois par animal et durera approximativement 22 minutes. - Une échographie de muscles squelettiques réalisée également 1 seule fois par animal. L'examen durera 30 à 60 minutes et se réalise sous anesthésie générale. - L'évaluation de la force musculaire lors d'une flexion plantaire sera le dernier test effectué 1 seule fois par animal. Il nécessite l'anesthésie des animaux et l'ajout d'un anti-douleur. Il dure environ 15 à 20 minutes. Ces trois actes consitant à analyser trois paramètres physiologiques permettront d'évaluer l'efficacité d'un nouveau traîtement thérapeutique, de caractériser un nouveau modèle murin de maladies neuromusculaires. Ces équipements modernes sont similaires à ceux utilisés chez l'homme et vont permettre la réalisation d'étude complète et abouties. Le nombre d'animaux inclut dans les projet expérimentaux s'appliquant à la recherche des maladies neuromusculaires se verra considérablement réduit.
Impact sur les animaux
Lors de la pléthysmographie, seul le stress peut survenir pendant l’acte dû à la manipulation des animaux. Pendant une échographie, le réveil spontané d’un animal peut être attendu ainsi qu’une détresse respiratoire lors de l’anesthésie. Lors de l'évaluation de la force générée lors d'une flexion plantaire, les nuisances tels qu’un réveil spontané, une détresse respiratoire, des douleurs post-opératoires dues aux piqûres des aiguilles de stimulation et à la contraction involontaire appliquée peuvent être attendus. Durant la semaine de stabulation suivant l’échographie, le stress et l’inconfort dû au réveil après l’anesthésie générale est à prévoir.
Devenir
Les animaux utilisés dans cette procédure étaient initialement voués à l'euthanasie dû à un génotype sans intérêt pour les projets scientifiques. Ils seront donc euthanasiés à la fin de cette procédure.
Remplacement
Ces techniques qui permettent une analyse fonctionnelle de la physiologie animale suite à des traitements thérapeutiques ne peuvent être remplacées actuellement par des méthodes alternatives ou in vitro. Tous les projets nécessitant l'utilisation de ces techniques pour évaluer les nouveaux traitements thérapeutiques en cour de test utilisent les modèles murins qui restent une source unique et indispensable permatant l'évaluation d'une amélioration histologique et fonctionnelle induite par les traitement testés. Les modèles de culture in vitro disponibles ne permettent pas de récapituler la complexité physiologique in vivo. Cette étude permettra d’inclure au sein d’un même projet un ensemble de techniques qui amènera à la réalisation d’une recherche plus complète et aboutie.
Réduction
Cette étude pilote utilise un nombre d’animaux restreint et donnera une meilleure estimation du nombre nécessaire d’animaux dans la réalisation de ces actes au sein des projets expérimentaux. Les souris utilisées seront celles issues de la reproduction de lignées et qui étaient vouées à l'euthanasie à cause de leur mauvais génotype (sans phénotype dommageable). 10 animaux par sexe pour les groupes "jeunes" et "adultes" et 12 animaux par sexe pour le groupe "agées" sont nécessaires pour maitriser parfaitement les techniques, déterminer la taille des cohortes appropriées, la fréquence des observations nécessaires à l’établissement d’un point limite. Ce nombre est également suffisant pour déterminer la variance des réponses entre les futurs groupes de traitement. Aucun test statistique ne sera utilisé pour cette étude. Le nombre total des animaux s'inscrivant dans ce projet est de 64.
Raffinement
L’ensemble des animaux sera hébergé en pièce de stabulation dans des portoirs ventilés. Ces pièces sont équipées de cycle jour/nuit permettant un cycle de réveil et de sommeil constant et sain pour l’animal. Ils auront accès à de la nourriture et de l’eau (système d’abreuvement automatique) à volonté. Les zootechniciens de l’animalerie s’occuperont du nettoyage de la litière une fois par semaine et mettra dans chaque cage de l’enrichissement (maisonnettes et lanières de papier kraft (nid)). La température et l’hygrométrie seront contrôlés quotidiennement. Les animaux sélectionnés seront au minimum 2 et maximum 5 par cage. Aucun animal isolé ne sera choisi pour ce projet. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long du projet en suivant la grille de scoring. Afin d’éviter le stress lors de la pléthysmographie, une séance d’entrainement est prévue deux jours avant. Suite aux 30 minutes d’anesthésie pendant l’échographie, seul un stress de réveil peut être ressenti par l’animal. Une semaine de stabulation sera appliquée afin de l’éviter au maximum. Si des douleurs légères post-opératoires (selon grille de scoring) sont observées après l'évaluation de la force de la flexion plantaire, une injection sous-cutanée d’analgésique sera réalisée.
Choix des espèces
La souris est le modèle commun le plus utilisé par les équipes de recherche, de l'animalerie expérimentale, œuvrant pour la recherche sur les maladies neuromusculaires. Les trois stades de développement chez les souris (jeunes/adultes/vieilles) ont été choisis afin d’expérimenter en fonction de la taille et du poids changeant des animaux, de comprendre les différents résultats obtenus pour chaque lot et de préciser les points limites pouvant être modifié avec l’âge.
Ventricule droit et insuffisance cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
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Pendant le test d'effort, les rats reçoivent des chocs électriques, l'épreuve étant arrêtée au bout de trois chocs en trente secondes ou de cinq chocs en une minute. 210 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection unique déclenche chez eux une insuffisance cardiaque droite qui peut entraîner leur mort, puis un traitement est initié quatre semaines plus tard pendant dix ou soixante jours, avec IRM et échocardiographie sous anesthésie, mesure de la fonction rénale, test d'effort sur animal vigile, et enfin un cathétérisme cardiaque de vingt minutes sans réveil dont le porteur indique que l'animal peut mourir pendant l'examen. Les rats perdant plus de 15 % de leur poids sont tués, et le porteur retient de jeunes adultes de 200 à 220 grammes pour leur "meilleure résistance à la toxicité de la molécule".
Objectifs
Malgré des améliorations thérapeutiques majeures sur les 30 dernières années, l’insuffisance cardiaque (IC) reste associée à une mortalité et un taux de réhospitalisation à 1 an élevés. Les traitements actuellement disponibles sont efficaces pour améliorer la fonction ventriculaire gauche. Aucune thérapeutique n’a démontré son efficacité pour améliorer la fonction ventriculaire droite dans l’IC. Les gliflozines (ou SGLT2 inhibiteurs) sont des traitements qui ont récemment prouvé leur efficacité, administré seul ou en association avec des traitements classique de l’IC, pour réduire la mortalité cardiovasculaire et/ou le risque d’hospitalisation pour IC. L’effet sur la fonction ventriculaire droite de cette classe thérapeutique n’a jamais été étudié. Étant donné les mécanismes d’action connus de cette classe thérapeutique, nous faisons l’hypothèse que les gliflozines ont un effet bénéfique sur la fonction ventriculaire droite dans l’IC. En utilisant un modèle expérimental de dysfonction ventriculaire droite chez le rat, nous allons étudier si les gliflozines sont capables d’améliorer celle-ci et déterminer les mécanismes impliqués. Cela permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués avec l’objectif de développer de nouvelles stratégies pharmacologiques pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients IC.
Bénéfices attendus
Le modèle utilisé et le design expérimental nous permettra d’étudier l’aggravation de la dysfonction ventriculaire droite ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la progression de la dysfonction ventriculaire droite afin d’identifier/d’évaluer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les Rat Wistar subiront une injection unique d'une molécule qui entraine une dysfonction du ventrciule droit au J1 de l'étude. Puis 4 groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 10 jours de traitement et 4 autre groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 60 jours de traitement .Chaque injection de traitement serais de quelques secondes par animal. L'analyse des effets fonctionnels (IRM et échocardiographie cardiaque) qui sera effectuée sous anesthésie pour une durée de 10 minutes/rat. La fonction rénale sera évaluée sous anesthésie gazeuse 10 minutes/rat maximum pour l'injection du traceur fluorescent suivie d'un test à l'effort qui sera effectué sur les animaux vigiles. Le protocole invasif (cathétérisme cardiaque) sera réalise sur des animaux profondément anesthésiés et sera sans réveil(durée 20 minutes / rats ).
Impact sur les animaux
Les procédures sont classées modère . L'injection de la molécule entrainera potentiellement une dysfonction du ventrciule droit .Les deux procédures mènent à une insuffisance cardiaque. qui peut entraine le décès de l'animal. Les naissances des tests d'effort sont une fatigue de l'animal qui est évalué par des chocs électriques, mais tout cela est prise en compte avec une fiche procédure qui d'écrit les points limite du test. Arrêt du test à l'effort au bout de 3 chocs électriques en 30 secondes ou de 5 chocs électrique en 1 minute. On replace l'animal dans sa cage une fois le test fini ou les points limite définie dans le protocole dépasser. Pour le cathétérisme cardiaque, l'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir les pressions volume au niveau du coeur du rat, chaque animal sera mise à mort à la fin du test. Il se peut que l'animal décède lors du test ce cathétérisme cardiaque.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque série d’expérimentations suite au cathétérisme cardiaque pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant, l’utilisation des animaux est rendue nécessaire, car il n’existe pas à ce jour de modèle d’IC in vitro et encore moins de modèle d’IC droite in vitro. Les études fonctionnelles in vivo de notre projet ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro à cause de la complexité de la pathogenèse de l’IC droite. En effet, des études dans notre modèle animal sont nécessaires pour comprendre les altérations globales cardiaques lors du développement de l’IC droite et son traitement (altérations simultanées des lymphatiques, des cellules immunitaires, des fibroblastes et du métabolisme des cardiomyocytes, modifications progressives de l’hémodynamique ventriculaire gauche et droite). Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque droite par échocardiographie, IRM, de la fonction rénale, de la capacité d'exercice. A la phase terminale nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats (n=24 par groupe) nécessaires afin de détecter une différence de 10%. Des résultats historiques obtenues lors des expériences précédemment effectuées dans le laboratoire ont démontré qu’un nombre de 24 animaux par groupe sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie/IRM. Il faut souligner que l’analyse répétée en échocardiographie ou en IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Concernant l’induction de l’IC droite, un suivi de la survie post-administration dune sera mis en place afin d’affiner et donc de limiter le nombre d'animaux par groupe.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel, Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C , hydrométrie à 55% et luminosité à 100 lux avec une durée de cycle de lumière normal soit 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera observée avant le début des protocoles. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA . Les rats perdant plus de 15 % de leur poids seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les expériences in vivo, ne peuvent pas être remplacées par des études in-vitro, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques sur un modèle intégré. Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles. Chaque animal est identifié de façon individuelle par une puce d’identification Les rats mâles Wistar jeunes adultes (200-220 g) seront utilisés pour induire l’IC droite. Cet âge est justifié par la meilleure résistance des animaux à la toxicité de la molécule, permettant de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés.
Etude de la régénération musculaire dans des dystrophies musculaires par xénogreffe de biopsies humaines dans une souris immunodéficiente 1/2
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris employées sont immunodéficientes, condition qui les rend vulnérables à la moindre infection et sans laquelle elles rejetteraient le muscle humain qu'on leur greffe. 390 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une greffe chirurgicale de trente minutes sous anesthésie, une semaine de récupération, un transport routier d'une heure vers un second établissement, puis jusqu'à seize séances de résonance magnétique sous anesthésie générale en un an, chacune pouvant durer deux heures. Toutes sont tuées en fin de projet pour que le muscle greffé et les autres organes soient analysés.
Objectifs
Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Nous nous intéressons aux dystrophies musculaires, un groupe hétérogène de maladies génétiques touchant le muscle squelettique. Dans ce projet nous allons greffer des fragments de muscle humain ou des muscles 3D générés in vitro à partir de cellules humaines pour étudier la régénération musculaire chez l’homme. Notre objectif est de comprendre comment elle se déroule et comment elle peut être perturbée dans le cas des maladies touchant le muscle squelettique. Un autre objectif de notre projet est de tester la régénération musculaire in vivo d’un muscle 3D d’origine humaine.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre comment la régénération musculaire se déroule dans le muscle squelettique humain, sain et malade (caractérisé par une dégénérescence et une faiblesse musculaire). Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension de la régénération musculaire chez l’homme et le développement de nouvelles thérapies visant améliorer la régénération musculaire chez l’homme
Procédures
Les animaux sont immunodéficients et sont donc plus sensibles aux infections. Les animaux seront soumis à une greffe musculaire, une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et analgésie d’une durée de 30 minutes. Après une période de récupération d’une semaine, les animaux seront transférés en voite double emballage avec enrichissement, croquette et hydrogel dans un second établissement par un transport de 1h par un transporteur agréé en véhicule climatisé . Après un temps d'acclimatation de 7 jours, les animaux seront soumis à des analyses par résonance magnétique nucléaire (RMN) réalisées sous anesthésie générale d'une durée maximale de 120 minutes (16 répétitions sur 1 an). A l’issue de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des différents prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Dans notre projet, nous greffons des biopsies musculaires humaines ou des muscles 3D générés avec des cellules humaines chez la souris. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants : effets sur le fonctionnement normal du corps pendant l'anesthésie (hypothermie, hypotension, hypoxie). Les analyses tissulaires réalisées par résonance magnétique nucléaire peuvent induire un stress de courte durée. Le phénotype dommageable de la lignée se traduit par une immunodéficience qui implique un risque accru aux infections. Le transport entre les différents établissement peuvent générer du stress.
Devenir
Ce projet implique 390 souris en total. Ces animaux seront euthanasiés en fin de projet pour l’analyse indispensable des muscles greffés et des autres organes (foie, etc) est indispensable.
Remplacement
Nous travaillons sur la régénération musculaire chez l’homme. Les études réalisées in vitro et en culture ne donnent qu’une vision partielle du comportement des cellules musculaires humaines lors de la régénération musculaire et elles ne peuvent pas recréer in vitro la complexité observée in vivo avec l’ensemble des acteurs cellulaires qui y participent.
Réduction
390 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).
Choix des espèces
La xénogreffe des muscles humain dans des animaux immunodéficients est indispensable pour pouvoir tester le comportement in vivo du tissu musculaire humain. Nous utiliserons des souris entre 2 et 3 mois d'âge. A ce stade, les souris sont déjà adultes (l’effet de la croissance pourrais affecter les résultats) et elles ont une taille facilitant la chirurgie)
Rôle du récepteur des glucocorticoïdes et de son co-régulateur Lsd1 dans l’atrophie musculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Une souris qui perd plus de 20 % de son poids en une semaine est tuée par dislocation cervicale. 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Toutes reçoivent du tamoxifène cinq jours de suite, puis selon le groupe une injection de dexaméthasone, un gavage quotidien de prednisone pendant un mois, ou un jeûne de vingt-quatre à quarante-huit heures dont le porteur reconnaît qu'il peut "fortement affaiblir les animaux" et faire fondre jusqu'à 30 % de leur muscle. L'enjeu déclaré est de comprendre pourquoi les corticoïdes prescrits aux patients provoquent une atrophie musculaire, effet secondaire connu de longue date.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) ont différents effets chez les mammifères, contribuant au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les agonistes synthétiques, par ex. la prednisone et la dexaméthasone (Dex) sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme, et certaines myopathies. Néanmoins, l'utilisation chronique de ces composés peut entraîner d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose, ou une atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont médiés par le récepteur des glucocorticoïdes (GR), un membre de la superfamille des récepteurs nucléaires. Dans le modèle classique, GR lié à une hormone est convoyé dans le noyau, où il se lie à ses éléments de réponse sur l'ADN de manière coopérative avec d'autres protéines appelées des corégulateurs. De plus en plus de preuves indiquent une spécificité tissulaire de ces corégulateurs. Lsd1 est un corégulateur qui interagit avec un autre membre des récepteurs nucléaires, le récepteur aux androgènes, dans les cellules cancéreuses de la prostate humaine. Nos données préliminaires montrent que Lsd1 interagit avec GR dans le muscle squelettique et que les niveaux de Lsd1 augmentent lors de la fonte musculaire induite par les glucocorticoïdes. De plus, les souris dépourvues de Lsd1 dans les myofibres ne parviennent pas à induire l’expression des gènes impliqués dans la protéolyse en réponse à la mise à jeun, ce qui indique que Lsd1 pourrait agir comme un coactivateur de GR pour favoriser le catabolisme musculaire. L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de Lsd1 dans les fibres musculaires adultes dans des conditions physiologiques et dans l'atrophie musculaire induite par les glucocorticoïdes soit par des traitements avec des composés analogues, soit par la mise à jeun.
Bénéfices attendus
Contrôler l'activité des GR en modulant celle des co-régulateurs tels que Lsd1 ouvrirait de nouvelles perspectives pour réduire les effets indésirables induits par les glucocorticoïdes.
Procédures
L'ensemble des animaux sera injecté au Tamoxifène par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous servira à étudier le rôle de Lsd1 dans le muscle sain subira ensuite une mesure de poids (30 sec/ souris), de glycémie (1 min/ souris), ainsi qu'un test de tolérance au glucose (IPGTT) et un test de tolérance à l’insuline (IPIST) (180 min au total / souris) par prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale. Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 4 ne subira pas di'ntervention en dehors de l'injection au Tamoxifène mais sera mis à jeun de 24 à 48h. Amendement: Le groupe 5 sera traité avec un inhibiteur de Lsd1 ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 3 jours, puis la moitié des animaux sera mise à jeun 48h.
Impact sur les animaux
L’injection de tamoxifène, de glucose, d'insuline et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. La mise à jeun sur 24 - 48h pourra fortement affaiblir les animaux. L'injection d'insuline pourra éventuellement provoquer une hypoglycémie. Le gavage peut conduire à des fausses routes. L'incision au niveau de la queue pour les mesures de glycémie n'est pas douloureuse mais peut entrainer un inconfort chez l'animal. La présence de sang dans la cage peut générer un comportement agressif et ses congénères. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Il en va de même avec la mise à jeun pour laquelle la fonte musculaire peut atteindre 30%, pouvant de ce fait impacter la mobilité des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque PE pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes (mise à jeun) et synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris est similaire à celle de l'homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le personnel qui effectuera les gestes techniques est formé et compétent. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l’animal vigile. Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement sacrifié par dislocation cervicale. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, une euthanasie par dislocation cérébrale sera réalisée. Une seule injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et son co-régulateur Lsd1 dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc injectés au tamoxifène ou gavés avec l'inhibiteur entre 7 et 11 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection. Pour les études métaboliques, les animaux seront mis à mort à deux temps : (i) à 15 semaines, âge auquel le muscle utilise essentiellement des acides gras pour produire de l'énergie, (ii) à 30 semaines, âge auquel le muscle squelettique utilise principalement des sucres.
Mise au point d’une stratégie de restriction intermittente en méthionine pour prévenir le développement de l’obésité.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Enfermées seules en cage pendant vingt-six semaines au maximum pour que leur prise alimentaire soit mesurée, 3 360 souris subissent des prises de sang à la mandibule ou à la queue, jusqu'à trois en quatre semaines, et pour certaines une biopsie de tissu adipeux. Elles sont toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, l'isolement prolongé et un jeûne pouvant atteindre seize heures constituant l'essentiel des atteintes. Le projet cherche à mettre au point une restriction intermittente en méthionine à base de protéines végétales, transposable à l'humain pour prévenir l'obésité. Le porteur écrit que ces régimes "ne doivent pas entraîner de nuisance", tout en indiquant qu'il n'est pas exclu que les souris réduisent fortement leur consommation pour des raisons de goût ou de digestibilité.
Objectifs
L’utilisation de différents types de restrictions nutritionnelles comme stratégie de nutrition préventive fait l’objet d’études depuis de nombreuses années. Il a été montré, chez la souris, qu’une restriction en méthionine, un acide aminé indispensable (AAI), était efficace pour prévenir l’obésité et le diabète de type 2. Chez l’Homme, une étude menée chez des sujets obèses montre qu’une semaine de restriction en méthionine présente des effets bénéfiques sur la régulation d’acteurs majeurs du métabolisme tels que FGF21 (Fibroblast Growth Factor 21). Le FGF21 est une hormone qui joue un rôle central dans la régulation du métabolisme. Dans le contexte de la restriction en méthionine, l’augmentation de l’expression du gène codant pour la protéine FGF21 est sous la dépendance de la protéine ATF4. Si la restriction peut être gérée par l’organisme sur le court terme, elle s’avère délétère si elle est trop importante. En conséquence, l’application à l’Homme de la restriction en méthionine n’est pas sans poser des problèmes. D’autant que ces régimes de restrictions reposent sur l’utilisation d’acides aminés libres qui rencontrerait une faible acceptabilité chez l’Homme du fait de leurs propriétés organoleptiques. Nous proposons de développer une stratégie de restriction en méthionine qui soit transférable à l’Homme. Il s’agira de résoudre les problématiques de l’utilisation des acides aminés libres dans les régimes et de la restriction continue. Il s’avère que certaines protéines végétales présentent un faible contenu en méthionine. Des données obtenues (non publiées) au sein de l’équipe montrent chez la souris que la consommation sur un repas de ce type de protéines entraine une augmentation de l’expression de gènes cibles d’ATF4 dont FGF21. De plus, une étude récente a démontré chez la souris que la consommation intermittente d’un régime à base d’acides aminés libres restreint en méthionine entrainait une sécrétion de FGF21 et une amélioration de paramètres métaboliques. Afin d’appliquer la restriction en méthionine à l’Homme, nous souhaitons développer chez la souris une stratégie de restriction intermittente utilisant une source de protéine végétale et tester son efficacité dans un modèle d’obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à poser les bases d’une stratégie de nutrition préventive reposant sur la consommation de sources de protéines végétales qui soit transposable à l’homme. L’originalité de ce projet est de tirer parti de la composition déséquilibrée en AAI des protéines végétales. Ce concept d’un effet santé bénéfique des protéines végétales de par leur composition déséquilibrée n’a jamais été évalué. Les résultats obtenus à la fois chez les femelles et les mâles permettront 1) De faire la preuve de concept qu’une restriction intermittente en méthionine via la consommation de protéines végétales peut reproduire les effets d’une restriction continue en méthionine dans la prévention de l’obésité. L’objectif sera par la suite de tester cette stratégie dans des modèles animaux plus représentatifs du contexte dans lequel une telle stratégie pourrait être envisagée chez l’Homme. En effet, ce type de stratégie nutritionnelle s’adresserait à des individus présentant une prédisposition/sensibilité au développement de l’obésité. 2) De mieux caractériser chez les mammifères les effets et les mécanismes associés à la consommation d’un régime restreint en méthionine dans un contexte physiologique (régime contenant des protéines et non des acides aminés libres). Ces données permettront d’établir des pistes de recherche quant à des effets bénéfiques de la restriction en méthionine via la consommation de protéines végétales autres que la prévention de l’obésité. 3) D’identifier de nouveaux marqueurs de la restriction en méthionine associés à ses effets bénéfiques dans la prévention de l’obésité. De telles données seront précieuses pour étudier chez l’Homme ce concept de restriction intermittente en méthionine.
Procédures
L'ensemble des souris seront mises en cage individuelle, la durée maximale d'isolement sera de 26 semaines (habituation et expérimentation). Elles subiront toutes des prises de sang en sous mandibulaire, la durée de prélèvement sera de moins d’une minute. Des souris subiront des prélèvements de sang à la queue qui dureront chacun moins d’une minute. Certaines de ces souris subiront également une biopsie de tissu adipeux périgonadal qui durera environ 2 minutes. Le nombre de prélèvements sera dépendant de la durée des expérimentations, ce paramètre sera défini en cours de projet en fonction des différents paramètres métaboliques et physiologiques. Plusieurs prélèvements sanguins sur animal vigil pourront être réalisés (3 maximum sur une période de 4 semaines) un maximum de 7,5% du volume total sanguin de la souris sera prélevé avec un intervalle minimum d'une semaine entre chaque prélèvement. Le coté pour la prise de sang en sous mandibulaire sera alterné à chaque prélèvement.
Impact sur les animaux
Les nuisances que les interventions vont entrainer sont les suivantes : (1) douleur au point de piqûre d’aiguille, (2) jeûne de 16h maximum et (3) hébergement individuel pendant la durée des expériences pour les 3 procédures. Pour les expériences réalisées, les souris doivent être hébergées en cages individuelles pour éviter les interactions afin de pouvoir mesurer précisément la prise alimentaire. Les régimes de restriction à base de protéine végétales ne doivent pas entrainer de nuisance, il n'est pas exclu que pour des raisons de qualités organoleptiques ou de digestibilité les souris diminuent fortement leur consommation d'un tel régime.
Devenir
Les analyses pratiquées dans ce projet telles que la mesure de l'expression des gènes au niveau de différents organes nécessitent la mise à mort de l'ensemble des souris.
Remplacement
Ce projet consiste à développer une approche nutritionnelle de restriction en méthionine basée sur l'utilisation de protéine végétales dans un but de prévenir le développement de l'obésité. Il n’existe pas de modèle alternatif aux animaux pour réaliser ce projet. Ces travaux nécessitent également des analyses invasives (prélèvement d'organes). Il est donc indispensable d'avoir recours à l'expérimentation animale pour pourvoir mener à bien ce projet.
Réduction
Sur la base d’études précédentes, nous prévoyons un nombre d’animaux égal à 10 par groupe qui est nécessaire et suffisant pour obtenir la puissance statistique requise pour l’exploitation de nos données. Les données seront analysées statistiquement par ANOVA et/ou test de Student (traité vs témoin).
Raffinement
Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis, notamment dû à leur isolement en cages individuelles. Des traitements analgésiques seront appliqués aux souris subissant une biopsie. Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis, notamment dû à leur isolement en cages individuelles. Pour limiter l’isolement, des cages transparentes avec grilles mais ouvertes seront utilisées et seront disposées côte à côte pour permettre une interaction sociale (odeurs, vocalises…), des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition (tube plastique rouge et/ou bille métallique). Les points limites pour permettre de limiter la douleur à son minimum, sans remettre en cause les résultats du projet, sont : une perte de poids supérieur à 20% du poids initial, un arrêt de l’alimentation pendant plus de 2 jours ou un signe de souffrance (prostration, poil hérissé et toutes modifications comportementales traduisant une souffrance). Des anesthésies à l'Isoflurane ou Zoletil/Xylasine seront réalisés lors des biopsies durant une procédure ou des prélèvements d’organes à l’issue des procédures
Choix des espèces
Ce projet propose de développer une nouvelle stratégie de restriction en méthionine. Jusqu’à présent la très grande majorité des études visant à caractériser les effets bénéfiques de la restriction en méthionine sur le métabolisme ont été réalisées chez les rongeurs. Ces derniers sont les modèles les plus adaptés dans les études abordant des problématiques de nutrition et de métabolisme à visée humaine et nécessitant un nombre important d'animaux. Le choix de la souris se justifie notamment par l'utilisation d'un modèle transgénique dans cette étude (GCN2 KO). Les souris seront utilisées au stade adulte. L'objectif de ce projet est de développer à terme une stratégie nutritionnelle de restriction chez l'Homme. En l'état actuel des connaissances les stratégies de restrictions nutritionnelles sont envisageables principalement chez l'adulte et non chez l'individu en croissance.
Développement d’un implant pour restaurer la préhension chez la personne tétraplégique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Une intervention de huit à dix heures sous anesthésie, sans jamais de réveil, attend dix des cochons du projet. Huit autres subissent une chirurgie d'implantation de quatre heures, puis quatre séances d'anesthésie de six heures à raison d'une par semaine, avec un prélèvement de sang hebdomadaire, avant d'être tués pour l'analyse des nerfs stimulés. 18 cochons au total vont être utilisés, dix dans des procédures conduites sous anesthésie sans réveil et huit dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour valider un implant de stimulation nerveuse destiné à restaurer la préhension chez des personnes tétraplégiques et à obtenir son marquage CE. Le porteur retient le cochon pour le diamètre de ses nerfs, l'épaisseur et l'absence de poils de sa peau et la proximité de son système immunitaire, après avoir mené un essai clinique de 28 jours sur quatre personnes tétraplégiques et des manipulations sur cadavre humain.
Objectifs
Notre projet contribue au développement d'un dispositif médical implanté de stimulation des nerfs périphériques (SNP), qui permettra de restaurer les fonctions du poignet et des doigts chez les personnes tétraplégiques. Nos objectifs sont les suivants : i) Aider à développer et valider un implant complet en vue de sa première implantation permanente, en analysant les risques biologiques et en validant le bon fonctionnement de l'implant avant les essais sur les humains. La finalité est d'obtenir le marquage CE du dispositif médical, ii) Permettre d'améliorer les mouvements obtenus en développant une méthode de réglage fin des paramètres de stimulation pour préparer le premier essai chez l'homme, iii) Explorer une approche complémentaire en testant l'efficacité d'une combinaison de la stimulations (nerfs périphériques et moelle épinière) pour obtenir à la fois un retour fonctionnel direct et améliorer progressivement les mouvements.
Bénéfices attendus
La perte bilatérale des fonctions des bras et des mains après une lésion complète de la moelle épinière cervicale a un impact considérable sur la capacité des personnes à vivre de manière indépendante. Au-delà des drames humains que cela représente, le handicap fait également peser un poids non négligeable sur le système de santé. Grâce au développement d’un dispositif innovant, notre projet pourrait permettre la restauration - a minima partielle - des fonctions du poignet et des doigts au quotidien chez ces patients. Pour cela il est nécessaire de valider et tester l’ensemble du système implanté dans sa version définitive avant la première implantation pérenne chez l’homme (essai clinique planifié fin 2025/début 2026). En développant des stratégies de traitement du signal, de modélisation et d'informatique, il sera aussi possible de permettre le réglage des paramètres de stimulation en temps réel afin d’affiner au maximum les mouvements évoqués. La stimulation du nerf périphérique étant pensée comme une solution générique, l’élaboration de tels algorithmes pourrait ouvrir la voie au développement de nouvelles solutions neuroprosthétiques ciblant un grand nombre d’applications cliniques (réhabilitation des membres supérieurs et inférieurs, dysfonctionnements uro-génitaux etc.). De même, bien que la stimulation du nerf périphérique et la stimulation de la moelle épinière n'aient jamais été testées conjointement, elles semblent complémentaires. En effet, combiner une récupération fonctionnelle immédiate (via la stimulation du nerf périphérique implantée) avec un renforcement durable de la plasticité neuronale (via la stimulation de la moelle épinière) devrait améliorer progressivement les mouvements et restaurer un plus grand nombre de fonctions (comme boire, manger, etc.) chez les personnes tétraplégiques. Enfin, la recherche et l’innovation dans le domaine du dispositif médical implantable étant peu répandues en France, ces expérimentations s’inscrivent dans une volonté de contribuer à la réindustrialisation d’un secteur stratégique de haute technologie, en pleine expansion et peu délocalisable.
Procédures
Deux procédures expérimentales sont planifiées dans le cadre de ce protocole. La première est une procédure sans réveil d'une durée de 8 à 10h , et qui prévoit 10 animaux. Une intervention chirurgicale permettra l'implantation d'électrodes autour du nerf périphérique, puis des tests de stimulation du nerf périphérique et de la moelle épinière seront réalisés, tandis que le prélèvement d’une portion de nerf sera réalisé pour analyse histologique après l'euthanasie des animaux. La deuxième procédure (classée modérée) consiste en une expérimentation chronique qui sera réalisée sur une période de 31 à 33 jours sur 8 animaux. Dans un premier temps une intervention chirurgicale (4h maximum) permettra d'implanter le dispositif de stimulation dans des conditions propres identiques à la chirurgie humaine, et comprenant la pose des électrodes sur les nerfs, et la réalisation d’une poche sous cutanée pour loger le boitier de l’implant. Suite à cette première intervention, les animaux seront anesthésiés une fois par semaine (pour un total de 4 sessions de 6h00 maximum) pour tester le fonctionnement de l’implant en chronique en limitant le stress de l’animal. Ces sessions s’accompagneront de prélèvements sanguins à raison d’un prélèvement par semaine (2 tubes) pour analyse. Le dernier jour de cette procédure, des tests et explorations plus poussées (équivalentes à celles réalisées lors de la procédure sans réveil) seront réalisés, ainsi que l'euthanasie de l'animall, l’explantation du dispositif et de prélèvements des tissus environnants les différentes composantes de l’implant – incluant les portions de nerf périphérique stimulées – pour analyses anatomopathologiques.
Impact sur les animaux
Seule la procédure chronique pourra entraîner des nuisances chez les animaux, conséquences directes du protocole d’implantation et dans une moindre mesure du protocole de suivi chronique (sessions de stimulation du nerf périphérique et de la moelle épinière en transcutanée). Suite au protocole d’implantation : douleurs légères et difficultés posturales associées, inconfort transitoire lors de la phase de réveil, pose de pansement et courte période de privation des congénères sur 24 heures pour prévenir le risque infectieux tout en limitant l’inconfort de l’animal. Au cours du suivi chronique : inconfort transitoire (quelques heures) lors de la phase de réveil des animaux suite à la sédation (équilibre précaire, perte d’appétit, activité réduite) et phase de récupération de 24h avec perte de vivacité à prévoir, courbatures musculaires légères et transitoires (maximum une journée) liées à la sollicitation des muscles par la stimulation, rougeurs de la peau suite à la stimulation de la moelle épinière en transcutané (risque limité car stimulation pratiquée et très bien acceptée en routine chez l’homme). Pour chacune des procédures, le protocole anesthésique est conçu pour fournir une anesthésie et une analgésie suffisantes à la réalisation des expérimentations sans induire de stress ni de sensation de douleur chez l’animal.
Devenir
Nos procédures expérimentales incluent le prélèvement de tissus pour analyses histologiques, ce qui est sont incompatible avec la survie des animaux. L’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures expérimentales.
Remplacement
Avant la mise en place de ces phases expérimentales, plusieurs mesures de remplacement ont d’ores et déjà été mises en œuvre : modélisation informatique de la stimulation du nerf périphérique, mise en œuvre d’une série d’investigations cliniques chez l’homme, essai clinique de 28 jours sur 4 individus tétraplégiques (électrodes implantées couplées à un stimulateur en externe). Dernièrement, des manipulations sur cadavre humain ont été réalisées pour affiner la procédure chirurgicale chez l’homme et valider le design du dispositif (surtout la partie implantée). Enfin, avant la mise en oeuvre de nos procédures in vivo, des manipulations sur carcasse de cochon sont prévues pour développer l’approche chirurgicale la plus fidèle possible aux conditions retrouvées chez l’homme mais également pour valider le lieu d’implantation et affiner le protocole histologique. Des test ex-vivo de l’ensemble des éléments de l’implant et de la chaîne d’acquisition des signaux biologiques ont aussi été réalisés. Néanmoins, le recours à l’expérimentation sur un modèle vivant de gros animal demeure nécessaire afin d’évaluer la conformité réglementaire du dispositif implantable (MDR 2017/745).
Réduction
A la suite de discussion avec des statisticiens, nous prévoyons ainsi d’allouer 10 animaux à la procédure aiguë (à fort caractère exploratoire) et 8 animaux à la procédure chronique afin d’atteindre le seuil de reproductibilité statistique. Nous avons également réfléchi à l'optimisation des animaux utilisés. En effet,en plus des animaux engagés dans la procédure aiguë, le protocole terminal prévu à la fin de la procédure chronique sera calqué sur les expérimentations courtes afin de répéter les mesures et de collecter un maximum de données, augmentant ainsi la pertinence statistique des résultats. Les sessions de suivi chronique, réalisées une fois par semaine pour un total de 4 sessions par animal, permettront de solliciter régulièrement l’implant (stimulation des nerfs) et fourniront une quantité conséquente de données attestant de la fiabilité du dispositif. Enfin 3 objectifs distincts mais complémentaires seront poursuivis parallèlement sur les mêmes animaux tout au long des expérimentations menées dans le cadre du projet.
Raffinement
Les animaux seront inclus dans les différentes procédures par paires afin de respecter leur sociabilité et limiter leur stress. L’ensemble des procédures seront réalisées sous anesthésie générale, afin de maximiser la qualité des données en limitant une douleur et un stress aux animaux. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous la supervision de chirurgiens orthopédiques et neurochirurgiens et sera associée à la gestion de la douleur per-opératoire par des médicaments de type morphiniques, et postopératoire par l'administration d'anti-inflammatoires. De même la mise à mort sera réalisée en fin de procédure alors que les animaux seront anesthésiés. Pendant la phase post-opératoire et la période de suivi chronique, une grille de score sera utilisée pour évaluer l'état clinique des animaux, portant sur des critères d'absence d'infection en lien direct avec le modèle (cicatrice, suture…), sur des points généraux de comportement et des signes d'inconfort ou de douleur. Cette grille aidera à la prise de décision en cas d'atteinte des points limites. Un Intervalle de temps conséquent entre deux inclusions successives est prévu (2 à 4 mois) afin de tirer profit des observations/résultats précédents pour adapter le protocole si nécessaire.
Choix des espèces
4 pré-requis nous ont conduit à nous tourner vers le modèle porcin : A) Le dispositif – taille et géométrie – étant conçu pour une implantation chez l’homme, la phase de validation pré-clinique ne peut être réalisée que sur gros animal. B) Le transfert de données et d’énergie vers/en provenance de l’implant étant réalisé au moyen d’une communication radiofréquence sans fil en transcutanée, le recours à un animal présentant une peau proche de celle de l’homme (glabre et d’épaisseur comparable) est essentiel. C) L’évaluation du risque biologique, notamment les réactions de l'organisme liées à l’implant requièrent un modèle animal au système immunitaire proche. D) Les nerfs cibles (médian/radial ou sciatique) sont équipés d’électrodes dont le diamètre est défini pour l’humain. Le modèle animal choisi devra avoir des nerfs du même ordre de grandeur. Le modèle porcin remplit l’ensemble de ces critères. De plus, les caractéristiques anatomiques remarquables (diamètre des nerfs, épaisseur de la peau) permettront le test de l’implant dans des conditions proches de celles rencontrées chez l’humain. Pour la procédure courte, les animaux pèseront environ 45kg.Pour la procédure chronique, l'implantation sera réalisée sur des animaux de 25-30 kg. Nous testerons le dispositif sur une période de 31 à 33 jours sans que la croissance de l’animal ne mette en danger les composants de l’implant (e.g. tension excessive sur les câbles menant aux électrodes). De la même manière, lors de la mise en œuvre du protocole terminal à la fin de la procédure chronique, les animaux devraient atteindre un poids proche de celui des animaux utilisés dans la procédure aiguë (45 kg) permettant, le cas échéant, de fusionner les jeux de données et d’augmenter la preuve statistique.
Oestradiol et cachexie chez la souris Apc
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
300 souris Apc, qui développent une cachexie cancéreuse entre onze et quinze semaines, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la moitié et sévère pour l'autre. Les femelles subissent une ablation des ovaires de quinze minutes, puis l'implantation sous la peau d'une pastille d'œstradiol, un prélèvement de sang et une mesure de force musculaire de trente minutes qui exige une incision de la peau. Le porteur indique que l'ablation des ovaires entraîne à elle seule une perte de poids et de masse musculaire de 2 à 5 %, celle-là même que le protocole cherche à mesurer. Il conclut que "seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu", après avoir écarté tout système in vitro en une phrase.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peuvent être observées dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Nos données préliminaires obtenues dans un modèle murin de cachexie associée au cancer, la souris Apc, suggèrent l'existence d'un dimorphisme sexuel dans le développement de la cachexie, les souris âgées de 15 semaines ne faisant ni l'experience d'une perte de masse musculaire ni celle d'une perte de force musculaire. Par ailleurs, des données de la littérature indiquent que
Bénéfices attendus
En déterminant le rôle protecteur potentiel des oestrogènes face au développement de la cachexie associée au cancer, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie, et de proposer des stratégies d'intervention basés sur l'utilisation de modulateurs de l'activité du récepteur aux estrogènes.
Procédures
Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris femelles, les souris femelles seront soumises aux interventions suivantes sous anesthésie gazeuse : ovariectomie (durée totale 15 min), implantation sous-cutanée de pastilles contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min). Les prélèvements tissulaires (15 min) sont réalisés sous anesthésie chimique. Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris mâles, les souris mâles seront soumises aux interventions suivantes: implantation sous-cutanée de pastillescontenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min), prélèvements tissulaires (15 min).
Impact sur les animaux
La procédure d'ovariectomie ainsi que l'implantation de la pastille sont réalisées avec administration de brupénorphine pour limiter les suites douloureuses de l'intervention. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 6H00 après l'ovariectomie, puis toutes les 24H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Le cas échéant une ré-administration de buprénorphine pourra être effectuée. L'ovariectomie est étant elle-même à l'origine d'une légère perte de poids et de masse musculaire (de l'ordre de 2 à 5%), nous serons donc particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une courbe de suivi de masse corporelle sera effectuée en mesurant leur poids tous les 2 à 3 jours. Les mesures de forces musculaires impliquent une approche chirurgicale nécessitant une incision au niveau de la peau. Afin de limiter les souffrances des souris, une anesthésie profonde à l'isofurane sera effectuée depuis le début de l'approche chirurgicale jusqu'à l'injection d'un mélange d'anesthésique et analgésique pour réaliser les prélèvements tissulaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de façon éthique au terme de chaque procédure afin de procéder à des prélèvements tissulaires.
Remplacement
La cachexie associée au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus, le muscle bien évidement, mais aussi le système neuroendocrinien (axe gonadotrope). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.
Réduction
Nous avons avons utilisé un teste statistique en ligne afin de déterminer la taille du groupe optimale pour obtenir des résultats ayant une force statistique suffisante robuste. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 15 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront inclus qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 14 animaux par groupe nécessaire à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
Les données dans le domaine de la cachexie associé au cancer ont largement été obtenue chez la souris. Par ailleurs, l'ensemble des techniques nécessaires à la réalisation de ce projet a été développé chez la souris. En travaillant chez la souris, nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des données publiées dans le domaine et nous éviterons toute étape de mise au point préalable qu'aurait nécéssité l'utilisation d'un autre modèle animal. Par ailleurs, la cachexie associée au cancer est un processus multifactoriel systémique mettant en jeu de nombreux tissus (muscle, tissus endocriniens, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 11 semaines correspondant à un stade précachectique chez les souris mâlesApc. La fin de procédure aura lieu a l'âge de 15 semaines correspondant à une stade cachexie modérée chez les souris mâles Apc. La cachexie sé développent entre l'âge de 11 et 15 semaines, un traitement pendant cette période permettra de vérifier l'efficiacité de l'oestrogénothérapie.
Étude de la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
2 496 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 424 d'entre elles. Une toxine leur est injectée dans les muscles des deux pattes arrière sous anesthésie afin de détruire le tissu, précédée de cinq injections dans l'abdomen. Après la lésion, le porteur ajoute du paracétamol dans l'eau de boisson pendant quarante-huit heures, une mesure dont il dit lui-même avoir mesuré un "très léger bénéfice" sur l'activité volontaire des animaux. Il présente la culture cellulaire comme un préalable systématique, puis conclut que l'expérimentation reste "indispensable" pour replacer les mécanismes dans la physiologie du muscle entier.
Objectifs
Le muscle strié squelettique adulte régénère après un dommage grâce aux propriétés des cellules souches musculaires qui communiquent avec d'autres cellules comme les cellules de l'immunité, les fibroblastes et les cellules des vaisseaux. La coordination dans l'espace et dans le temps de ces interactions est essentielle pour une bonne régénération. Les mécanismes moléculaires contrôlant ces interactions sont encore mal connus. Le projet vise à étudier ces interactions cellulaires et moléculaires en induisant une lésion musculaire pour suivre la réparation du muscle chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
Les bénéfices premiers du projet sont d'apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de la régénération musculaire. Ces données seront utiles dans le futur pour comprendre les défaillances du processus de régénération dans des conditions physiologiques ou pathologiques particulières (vieillissement, myopathies, diabète, etc.)
Procédures
Les souris sont soumises à des injections intrapéritonéales (30 secondes) (5 fois) et à l’induction d’une lésion musculaire via une injection intramusculaire bilatérale de toxine (sous anesthésie) (procédure de 5 minutes) (1 fois)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues incluent: - un stress lors de la contention pour les injections intrapéritonéale - un stress lors du gavage - un stress lors du déplacement dans la boite d'anesthésie - Une diminution transitoire de l'activité spontanée après l'induction de la blessure musculaire
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des organes
Remplacement
Le laboratoire a une longue expérience des essais in vitro par la culture cellulaire. Les questions scientifiques sont d'abord validées in vitro avant d'aborder l'expérimentation animale. Celle-ci est néanmoins indispensable pour d'une part observer les mécanismes cellulaires et moléculaires ex vivo et d'autre part les intégrer dans la physiologie du tissu musculaire dans l'organisme.
Réduction
- L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. - Les deux muscles des deux pattes arrière sont utilisées afin de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés - les tissus et cellules des animaux sont réutilisés grâce à un système de banking dans le laboratoire
Raffinement
Le raffinement inclut une procédure afin de définir la meilleure voie d'administration du tamoxifène tout en conservant l'efficacité permettant l'analyse génomique. Le raffinement à la suite de l'induction de la lésion bilatérale inclut l'addition de paracétamol dans l'eau de boisson pour 48h à la suite d'une étude que nous avons menée montrant un très léger bénéfice du paracétamol sur l'activité volontaire des animaux (roue d'activité). Une anesthésie générale est réalisée pour l’induction de la lésion musculaire.
Choix des espèces
La souris a un système musculaire et un processus de régénération musculaire proches de ceux de l'homme. Les animaux utilisés sont à l'âge adulte (8-12 semaines).
Rôle du récepteur des glucocorticoïdes GR et de ses co-régulateurs SRC1 et TIF2 dans l’atrophie musculaire 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Gavées tous les jours pendant un mois avec un glucocorticoïde de synthèse, une partie des 960 souris de ce projet développe la fonte musculaire que l'étude cherche à décrire. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et incluent aussi des injections répétées dans l'abdomen et un test d'agrippement, avec un risque de fausse route et d'irritation de la gorge lié au gavage. Le porteur affirme vouloir "anticiper toute souffrance inutile" et écrit dans la même rubrique n'avoir prévu ni anesthésie ni analgésique, tous les actes se faisant sur animal vigile. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour des analyses moléculaires et histologiques, les animaux perdant plus de 20 % de leur poids en une semaine étant retirés du lot et tués avant.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés (mutés) dans le muscle squelettique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs (ci-après EU1 et 2 par souci de simplicité). Les animaux seront produits et élevés dans l'EU1. La mutation sera induite dans l'EU1 ou dans l'EU2 s'il s'avère que le personnel de l'EU1 n'est pas disponible. Les autres traitements seront réalisés dans l'EU2 afin que nous puissions suivre l’évolution des animaux. En effet, notre équipe travaille sur ces modèles depuis de nombreuses années et peut ainsi anticiper les dommages occasionnés. Par ailleurs, les animaux seront déjà présents dans l'EU2, à laquelle les membres de l'équipe ont accès, afin d’effectuer des tests d'agrippement, évitant ainsi un nouveau stress généré par le transfert. S’il s’avère que les membres de l’équipe ne sont pas disponibles, les traitements pourront être réalisés dans l'EU1 afin de ne pas gâcher de groupe.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.
Procédures
Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en triplicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues de traitement ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant lors d’études comparables. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Les traitements aux glucocorticoïdes durant de longue période peuvent entrainer une fonte musculaire, c’est pourquoi nous prendrons soin d’exclure les animaux ayant perdu plus de 20% de leur poids corporel en une semaine. De plus, le gavage répété peut conduire à des fausses routes et une irritation de la gorge pouvant impacter la prise alimentaire que nos pesées régulières nous permettrons d’observer rapidement. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.
Rôle d’une protéine embryonnaire impliquée dans l’homéostasie musculaire dans un modèle murin sain et de Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1).
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Injection dans le muscle, électrodes placées sous la peau pour mesurer l'activité des nerfs, puis mesure de la contractilité suivie de la mise à mort : 288 souris, dont 144 rendues myotoniques, subissent cette série d'actes. Le projet cherche à comprendre le rôle d'une protéine embryonnaire dans la dystrophie myotonique de type 1, maladie sans traitement. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" parce que les cultures cellulaires ne reproduisent pas le défaut de relaxation musculaire. Les trois actes se font sous anesthésie et l'ensemble reste rangé sous le seul niveau de souffrance légère.
Objectifs
Le maintien de l’intégrité musculaire a été décrit depuis longtemps comme étant dépendant de l’innervation et de l’exercice. Des études ont montré qu’une altération de l’activité électrique provoque une modification de l’expression de gènes impliqués dans l’homéostasie musculaire. Une précédente étude a permis de montrer que certaines protéines impliquées dans la contraction musculaire jouaient un rôle très important dans le maintien de la masse musculaire. Une protéine en particulier qui présente une forme embryonnaire semble réguler des facteurs importants dans le muscle squelettique sain et dans un contexte pathologique de dystrophie myotonie de type 1 (DM1). Cette maladie se caractérise par des défauts moléculaires qui ont été associés à des symptômes cliniques comme une myotonie (défaut de relaxation après une contraction) et une faiblesse musculaire. Dans ce projet, nous envisageons d’étudier les conséquences de la modulation de l’expression de cette protéine indispensable pour le maintien de la masse musculaire squelettique.
Bénéfices attendus
Comme la protéine d’intérêt est impliquée dans le maintien de la masse musculaire, nous attendons comme bénéfice à court terme, dans un muscle atteint de dystrophie myotonie de type 1 (DM1), un effet protecteur sur la physiopathologie du muscle en limitant l’atrophie musculaire notamment. A long terme, cette étude permettra d’apporter des connaissances supplémentaires sur les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la DM1. Une meilleure compréhension de cette pathologie pourrait permettre le développement de nouvelles stratégies et pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions telles que : 1/ Une injection intramusculaire (10 minutes) effectuée sous anesthésie et analgésie, 2/ Une mesure ayant pour but de mesurer l'activité électrique des nerfs et des muscles effectuée sous anesthésie et analgésique (30 minutes), 3/ Une mesure de la contractilité musculaire sous anesthésie et analgésie (25 minutes) après laquelle les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
Pour plusieurs actes, les animaux seront anesthésiés et pourront subir un stress lors de l’induction de l’anesthésie gazeuse mais aussi un stress thermique ou dans de rares cas les risques liés aux anesthésies (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc.). Suite à l’injection intramusculaire, une gêne et/ou une anomalie au niveau du site d’injection pourrait éventuellement apparaître. Lors des analyses fonctionnelles, des électrodes sont placées en sous-cutané dans le muscle d’intérêt, ce qui peut induire une gêne au réveil de l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques, et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Le but de notre projet est d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires inhérents à la pathologie DM1, dont l’une des caractéristiques cliniques principale est la myotonie. L’utilisation d’un modèle murin de la DM1 est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent pas rendent compte du défaut de relaxation musculaire caractéristique de cette pathologie. La souris myotonique est un modèle de choix, bien caractérisé, avec un phénotype connu et avec beaucoup de littérature à l'appui. Cette étude ne peut se faire que sur un modèle animal, néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 10 animaux sont nécessaires pour obtenir une analyse statistique fiable et pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. De plus, tous les muscles et une majorité des organes de la souris seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 288 souris : 144 souris contrôles, 144 souris myotoniques. La taille des effectifs sera été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Nous respecterons une période d'acclimatation de deux semaines après leur arrivée dans notre animalerie. Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante (37 degrés) ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l’euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentis chez les animaux.
Choix des espèces
Le modèle souris permet de travailler avec des cohortes de taille suffisante pour obtenir des résultats ayant une réelle validité statistique. De plus, la souris permet de combiner facilement les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. De plus, le projet portant sur l’étude de la pathologie Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1), l’usage d’un modèle de souris génétiquement modifié, bien documenté de cette pathologie est un vrai bénéfice pour le projet. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines en début de procédure et de 17 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux adultes pour ne pas observer de biais dus à la croissance.