Système musculosquelettique

Pour tester si une supplémentation nutritionnelle et l'exercice volontaire renforcent l'effet d'une immunothérapie anticancéreuse, 84 souris mâles de cinquante semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour un prélèvement de sang et de tissus. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la veine de la queue, puis un anticorps anti-PD1 dans le péritoine tous les quatre jours pendant trente jours, avec une imagerie hebdomadaire sous anesthésie. Les tests mesurent la force par traction sur un dynamomètre, l'animal étant tiré par la queue, la vitesse maximale de course sur tapis roulant jusqu'à l'épuisement, et l'équilibre sur un cylindre rotatif. Le porteur signale que la tumorisation pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, une léthargie et une agressivité accrue, et prévoit la mise à mort dès trois points limites notables ou un point limite sévère.

Objectifs

L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire. Afin de répondre à cet objectif, le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs (un principal et un second pour la réalisation d'imagerie optique in vivo)

Bénéfices attendus

Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.

Procédures

Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection I.V dans la veine de la queue. Le suivi du volume tumoral sera réalisé par imagerie de biolomuminescence à raison d'un examen par semaine sur une durée 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’halothane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura leiru en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutesLe passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implantation (J0) puis à J15 et J30 post-implantation. Pour ce projet, l'ensemble des procédures se déroulera dans l'EU.1. Seule les acquisitions d'imagerie de bioluminescence seront réalisées au sein de l'EU.2.

Impact sur les animaux

La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6 dans des cages T4 (55cm x 33cm, soit 1815cm2, et 19cm de hauteur sous grille). Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes 1 et 2. Afin de réaliser les imageries optique dans l'EU.2 les animaux seront transportés dans des cages à filtres dans un véhicule dédié. Le transport dure moins de 5min d'un site à l'autre. A leur arrivée, les animaux seront hébergés au calme dans une armoire ventilée.

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.

Gavées de prednisone tous les jours pendant un mois ou injectées à la dexaméthasone trois jours de suite, sans anesthésie ni analgésique, 960 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses moléculaires et histologiques. Trois semaines de nourriture médicamenteuse puis cinq jours d'injections intrapéritonéales servent d'abord à désactiver dans leur muscle deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes. Un test d'agrippement, réalisé une seule fois en trois essais, mesure ce qu'il reste de force musculaire. Le porteur écrit qu'aucun effet secondaire majeur n'avait été observé lors d'études comparables, tout en prévoyant d'exclure les souris ayant perdu plus de 20 % de leur poids en une semaine et en signalant que le gavage répété peut causer des fausses routes et une irritation de la gorge.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés (mutés) dans le muscle squelettique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs (ci-après EU1 et 2 par souci de simplicité). Les animaux seront produits et élevés dans l'EU1. La mutation sera induite dans l'EU1 ou dans l'EU2 s'il s'avère que le personnel de l'EU1 n'est pas disponible. Les autres traitements seront réalisés dans l'EU2 afin que nous puissions suivre l’évolution des animaux. En effet, notre équipe travaille sur ces modèles depuis de nombreuses années et peut ainsi anticiper les dommages occasionnés. Par ailleurs, les animaux seront déjà présents dans l'EU2, à laquelle les membres de l'équipe ont accès, afin d’effectuer des tests d'agrippement, évitant ainsi un nouveau stress généré par le transfert. S’il s’avère que les membres de l’équipe ne sont pas disponibles, les traitements pourront être réalisés dans l'EU1 afin de ne pas gâcher de groupe.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en triplicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues de traitement ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant lors d’études comparables. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Les traitements aux glucocorticoïdes durant de longue période peuvent entrainer une fonte musculaire, c’est pourquoi nous prendrons soin d’exclure les animaux ayant perdu plus de 20% de leur poids corporel en une semaine. De plus, le gavage répété peut conduire à des fausses routes et une irritation de la gorge pouvant impacter la prise alimentaire que nos pesées régulières nous permettrons d’observer rapidement. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.

Modifiées pour que le récepteur des glucocorticoïdes puisse être désactivé dans leurs cellules souches musculaires, 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le génotypage passe par un tatouage au doigt ou l'amputation de la première phalange, sur des souriceaux de 7 à 10 jours. Suivent cinq injections de tamoxifène, une injection de cardiotoxine qui lèse le muscle, puis selon les groupes de la dexaméthasone en intrapéritonéal ou un gavage quotidien de prednisone pendant deux fois sept jours, le porteur précisant qu'aucune anesthésie ni aucun analgésique n'est prévu. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses moléculaires et histologiques, celles qui perdent plus de 20 % de leur poids en une semaine étant sorties de l'étude et tuées.

Objectifs

Les muscles représentent plus de 40 % de la masse corporelle et permettent le maintien de la posture et le déplacement. Suite à une lésion, le muscle squelettique adulte est capable de se régénérer à partir des cellules satellites, des cellules souches localisées à la périphérie des fibres musculaires. Ce processus prend environ un mois à l'issue duquel les muscles sont régénérés et le pool de cellules satellites disponible pour une éventuelle nouvelle lésion est rétabli. Bien que les cellules satellites possèdent un grand potentiel en médecine régénérative, les mécanismes régulant leur prolifération et leur différentiation sont encore mal caractérisés. Les glucocorticoïdes, comme la prednisone, sont des anti-inflammatoires prescrits dans le cas de maladies chroniques telles que l’asthme ou l’arthrite rhumatoïde. Cependant, des traitements prolongés avec ces composés peuvent induire une perte de la masse musculaire, posant un sévère problème clinique, en particulier chez les personnes âgées. Les glucocorticoïdes exercent leurs actions via leur récepteur, le récepteur des glucocorticoïdes (GR), qui va contrôler l’expression de gènes cibles. Des études in vitro montrent que les glucocorticoïdes promeuvent la différenciation cellulaire. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la régénération musculaire en jouant sur la différenciation des cellules satellites. Pour ce faire, nous invaliderons sélectivement GR dans les cellules satellites avant d'induire une lésion à la cardiotoxine, et nous déterminerons si un traitement avec un agoniste du récepteur des glucocorticoïdes permet une amélioration ou au contraire une aggravation des dommages musculaires.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces procédures permettra de déterminer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes dans le processus de régénération musculaire.

Procédures

Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance. L'ensemble des animaux subiront 5 injections au tamoxifène pour induire la mutation par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec / souris), ainsi qu'une injection de cardiotoxine pour induire une lésion musculaire (30 sec / souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre l'impact d'un traitement aigü aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire sera en plus injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre l'impact d'un traitement chronique aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire sera quant à lui traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 2 fois 7 jours.

Impact sur les animaux

L’injection de tamoxifène peut très rarement causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. L'injection de cardiotoxine engendrera une douleur au niveau du muscle lésé. Le gavage peut conduire à des fausses routes et les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Dans les deux cas, les animaux seront sortis de l'étude et mis à mort. La phalangectomie effectuée pour le génotypage peut engendrer une douleur légère et de courte durée.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris et la cinétique de régénération sont similaires à celles de l'Homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle CreERT2 et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'extraction d'ARN et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux. De plus, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test de Student ou d'une ANOVA au risque de se tromper de 5%.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène, de cardiotoxine et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage et son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L’injection de dexaméthasone et le gavage à la prednisone ne sont en général pas problématiques pour l'animal. Néanmoins, s’ils sont mal effectués et entrainent des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. Le projet s’intéresse au rôle de GR dans la régénération musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc traités au tamoxifène entre 7 et 11 semaines afin d'effectuer les expériences sur des animaux adultes. Ils seront ensuite analysés un mois ou un an après afin de déterminer le rôle des glucocorticoïdes chez les souris jeunes et âgées.

324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale ou un gavage chaque jour pendant cinq jours, puis une injection de toxine ou de chlorure de baryum dans le muscle de la patte, qui le paralyse le temps que dure l'effet. Le projet cherche à comprendre comment un dysfonctionnement des mitochondries perturbe la régénération du muscle, avec en ligne de mire les dystrophies musculaires et la sarcopénie. Le porteur qualifie sa propre étude de "menée de manière éthique" et affirme utiliser "judicieusement des modèles animaux" avec des "stratégies d'intervention humaines".

Objectifs

L’ensemble du projet vise à apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur la mise en place des muscles squelettiques au cours du développement, de la régénération musculaire et des pathologies. Nous souhaitons comprendre comment les mitochondries sont impliqués dans le développement de muscles des membres. Ces études sont essentielles pour comprendre l’origine des maladies qui touchent le muscle squelettique, appelées dystrophies musculaires, ainsi que la sarcopénie. Pour cette étude, il est essentiel de recourir à des modèles murins génétiquement modifiés qui i) nous permettent de marquer et suivre spécifiquement leur devenir ou éliminer des cellules d’intérêts pour comprendre leur origine et leur fonction et ii) nous permettent d’altérer les fonctions mitochondriales. Le deuxième aspect que nous étudions est le développement du muscle post-natal et sa capacité à régénérer après une blessure ou dans des cas de dystrophies musculaires. Ces processus font intervenir des cellules souches adultes. Les cellules souches ont la propriété de générer des cellules différenciées (les myofibres) qui assurent la fonction contractile du muscle, et de s’auto-renouveler afin d’assurer leur maintenance. La compréhension du fonctionnement normal des cellules souches est nécessaire pour définir l’origine de leur dysfonctionnement dans les pathologies musculaires ou le vieillissement. Notre étude vise à comprendre les propriétés des cellules souches musculaires, les myofibres et les populations interstitielles des muscles des membres. Pour cela, il est essentiel d’utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées qui nous permettent d’identifier et d’isoler les cellules souches musculaires, les myofibres et les populations mutantes afin de les étudier aux niveaux cellulaires, moléculaires et fonctionnels. Si certaines expériences d’analyse peuvent être établies in vitro, d’autres doivent impérativement être réalisées in vivo car aucun système in vitro ne permet à ce jour de reproduire fidèlement les conditions naturelles et complexes d’un tissu.

Bénéfices attendus

Cette recherche s'efforce d'explorer la relation complexe entre la dysfonction mitochondriale, les cellules souches adultes et les fibres musculaires, en mettant particulièrement l'accent sur les implications pour la sarcopénie et la dysfonction musculaire. En comprenant les mécanismes moléculaires impliqués, cette étude vise à élucider comment les dommages mitochondriaux contribuent à la dégénérescence et à la régénération du muscle squelettique. La compréhension de ces processus complexes offre d'énormes perspectives pour faire progresser les stratégies thérapeutiques ciblant des conditions telles que la sarcopénie et les maladies musculaires génétiques, visant finalement à améliorer la qualité de vie des personnes concernées. Les avantages potentiels vont au-delà de l'amélioration des pathologies liées aux muscles, car les connaissances acquises grâce à cette recherche pourraient avoir des implications plus larges pour atténuer la fragilité liée à l'âge, réduire le risque de chutes et de fractures, et améliorer l'homéostasie générale du muscle squelettique. Menée de manière éthique, cette étude utilise judicieusement des modèles animaux, mettant en œuvre une surveillance rigoureuse, des statistiques prédictives et des stratégies d'intervention humaines, garantissant que les connaissances acquises contribuent de manière éthique et efficace à la compréhension plus large de la communauté scientifique de la dysfonction mitochondriale dans le contexte des cellules souches adultes et des fibres musculaires. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’apporter des informations nouvelles sur les bases moléculaires qui contrôlent la prédisposition des muscles aux pathologies musculaires et de ce fait, des informations essentielles pour les thérapies à développer.

Procédures

- La procédure comporte essentiellement des injections intrapéritonéales ou intramusculaires. - La procédure comporte en général une injection intrapéritonéale (quelques secondes) ou un gavage (de l’ordre d’une minute) chaque jour, pendant 5 jours, avec optionnellement 4 injections intrapéritonéales supplémentaires avant mise à mort (1 injection/jour) et d’une injection intramusculaire (quelques secondes) sous anesthésie. - La procédure dure au maximum 1 mois

Impact sur les animaux

Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement en des injections intrapéritonéales ou intramusculaires sur quelques jours. La piqure d'aiguille pour injection de toxine ou chlorure de baryum entraine une douleur légère de courte durée. Les effets indésirables attendus est une boiterie transitoire de courte durée (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, selon les critères énoncés pour la procédure, à la fin de des expériences, pour collecter les tissus nécessaires à nos travaux de recherche.

Remplacement

La formation et la régénération des muscles squelettiques impliquent une multitude de réponses et d’interactions cellulaires entre les progéniteurs/cellules souches musculaires et leur environnement au sein d’une ultrastructure tridimensionnelle complexe. L’environnement ou la niche, est composé de multiples facteurs comme une matrice extracellulaire tridimensionnelle et des types cellulaires interstitiels variés. Les cultures in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité de ces interactions. Néanmoins, l’approche in vitro pour les stratégies d’analyses moléculaires sera mise en place toutes les fois où cela sera possible afin de limiter le recours à l’animal en utilisant des lignées cellulaires ou des cellules primaires amplifiées in vitro.

Réduction

Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique, par des biostatisticiens.

Raffinement

Un suivi régulier des animaux inclus dans le projet selon leur état général de santé est prévu. L’effet local de l’injection de toxines peut être une paralysie transitoire du muscle tibial antérieur injecté et donc une incapacité pour l’animal de s’appuyer sur son membre inférieur durant le temps de paralysie. Au réveil de l’anesthésie, l’animal présente une boiterie transitoire (

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est basée sur plusieurs critères : - Les souris sont des petits Mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’homme notamment au niveau des mitochondries. - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. - De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les acteurs de la régénération notamment la souris transgénique étudiée qui permet d’isoler une population pure de cellules souches musculaires. Adulte. Les animaux sont considérés comme adulte après 6 semaines et âgés à partir de 20 mois. Au-delà de 6 mois, le nombre de cellules satellites décroit chez les souris. Pour ces raisons, nous utilisons essentiellement des souris de 6 à 12 semaines.

Immunodéficientes par construction, les souris de ce projet accueillent des cellules souches humaines saines ou leucémiques sans les rejeter. 19 959 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est transportée, irradiée jusqu'à quatre-vingt-deux secondes, injectée par voie intraveineuse, prélevée au sang une fois par semaine et ponctionnée dans la moelle osseuse du tibia sous anesthésie gazeuse. Toutes sont tuées, y compris les trios reproducteurs une fois passés leurs six mois de reproduction, et l'effectif de près de vingt mille souris tient en une phrase du porteur affirmant qu'il correspond au minimum déterminé par une approche statistique.

Objectifs

Décrire les différences génomiques (activation de gènes) entre les cellules souches humaines et les cellules issues de patients souffrant de leucémie afin d’établir des cibles thérapeutiques pour de nouveaux traitements. Découvrir de nouvelles caractéristiques au sein des cellules souches lors de leur développement durant l’hématopoïèse.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes contrôlant le développement normal et leucémogénique des cellules lymphoïdes humaines. Ce projet constitue un prérequis pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes des leucémies.

Procédures

Injection intraveineuse, 1 min par intervention. Prélèvements sanguins, 2 min par intervention une fois par semaine. Prélèvement de moelle osseuse au niveau du tibia sous anesthésie gazeuse, 5 min par intervention, transport (10min), irradiation (82 secondes maximum).

Impact sur les animaux

Le transport et l’irradiation sur site peuvent provoquer un stress transitoire durant les heures qui suivent. L’anesthésie gazeuse peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. Les injections intraveineuse et intrapéritonéale peuvent provoquer un stress transitoire. Les prélèvements sanguins et de moelle osseuse peuvent provoquer une douleur.

Devenir

L’ensemble des animaux expérimentaux et trios d'accouplement seront mis à mort à la fin de la procédure. Les animaux expérimentaux sont injectés avec des cellules humaines et leur mise à mort est indispensable pour récupérer les cellules d'intérêts. Les trios d'accouplements seront mis à mort car ils auront passé les 6 mois de reproduction. Ces animaux sont à phénotype dommageable et ne peuvent être remis en liberté.

Remplacement

Les cellules humaines étudiées (saines et leucémiques) ne peuvent être maintenues en culture. L’utilisation d’un modèle murin immunodéficient permet de les maintenir fonctionnelles et de les expandre.

Réduction

Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les animaux seront élevés au sein d’une animalerie dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité important. Les souris seront hébergées à raison de 5 animaux par cage sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler l’activité des souris, par des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification. Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement et une grille de score d’évaluation sera mise en place. Lors des prélèvements au niveau du tibia, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et sous anesthésie gazeuse et des soins analgésiques seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris utilisées ont été décrites dans la littérature scientifique comme le modèle de référence pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines, et ainsi servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Les animaux subiront une greffe de cellules humaines à l'âge adulte (6 à 8 semaines) car il s'agit de l'âge optimal pour obtenir les meilleures chances de succès de greffe

Irradiées, puis greffées avec de la moelle osseuse d'un animal déficient, 40 souris reçoivent enfin une toxine injectée dans le muscle de la patte pour y provoquer une lésion. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit une immunodépression, une fatigue générale, une mobilité réduite pendant quatre jours et une perte de poids allant jusqu'à 15 % après l'irradiation, tout en qualifiant la lésion musculaire d'"inconfort passager" après lequel la mobilité "n'apparaît pas affectée". L'effectif tient à 6 ou 7 individus par point d'analyse, pour une étude que le porteur présente lui-même comme une preuve de concept préalable à des travaux plus complets.

Objectifs

Le muscle adulte a la capacité de régénérer complètement après une lésion, grâce aux cellules souches musculaires et aux cellules de l'immunité qui jouent un rôle important dans ce processus. Une protéine a été identifiée comme un candidat important impliqué dans la fonction des cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire, ce qui a été validé par des expériences réalisées sur des cellules in vitro. La validation du rôle de cette molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire in vivo nécessite l’utilisation d’un modèle de souris présentant une inactivation de cette molécule spécifiquement dans ces cellules. Une approche économe en nombre d'animaux consiste à transplanter les cellules de la moelle osseuse d’un animal déficient pour la molécule dans des souris receveuses normales. De cette manière, seules les cellules immunitaires sont inactivées pour la molécule dans les animaux transplantés. Ensuite, une blessure musculaire est réalisée afin de pouvoir analyser les muscles de ces souris. L’objectif de cette étude est de valider la pertinence de l’inactivation spécifique de la molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire en réalisant des expériences de transplantation de moelle et de lésion musculaire sur un petit nombre d’animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude preuve de concept permettra d'identifier si la molécule est nécessaire dans les cellules de l'immunité pour la régénération musculaire. Le cas échéant, des études plus complètes seront mises en place ultérieurement afin d'en analyser le fonctionnement moléculaire. A terme, la compréhension des mécanismes permettant la régulation de l'inflammation au cours de la réparation tissulaire sera bénéfique pour améliorer les conditions de vie des patients atteints d'inflammation persistante en général, et de dystrophies musculaires en particulier

Procédures

- irradiation (1 fois 1 minute) - injection intraveineuse de moelle osseuse (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - injection sous-cutanée d'analgésique (1 fois 1 minute) - induction de blessure musculaire : injection d’un agent chimique dans le muscle situé le long du tibia (1 fois 10 minutes sous anesthésie)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues incluent le stress dû à la manipulation des animaux lors des transfert de cage et du transport et lors du déplacement dans la boite d’anesthésie lors des injections intraveineuse et intramusculaire. L'irradiation puis la transplantation provoquent une immunodépression transitoire. Ceci induit une fatigue générale chez les animaux et peut entrainer une réduction de mobilité pendant environ 4 jours, conduisant à une perte jusqu'à 15% de poids de corps 4 jours après l'irradiation, et qui est récupérée à partir du 6ème jour. L'irradiation peut également, dans de très rares cas, induire une pousse des dents. L'induction de la blessure musculaire engendre un inconfort passager chez les animaux, avec une diminution transitoire de l’activité après l’injection de la toxine (24h) bien que la mobilité des animaux n’apparaît pas affectée

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des organes

Remplacement

Les alternatives non animales ont déjà été utilisées dans ce projet. Il s'agit des expériences de co-culture cellulaire in vitro dans des modèles qui miment la régénération musculaire in vitro. Il est désormais nécessaire de valider ces résultats in vivo afin de les intégrer dans l’organisation complexe du tissu musculaire dans l’organisme.

Réduction

Le modèle mis en œuvre dans ce projet a été choisi car c’est celui qui permet de réduire le plus possible le nombre d’animaux nécessaire. Des outils statistiques ont permis de définir que 6 à 7 individus par point d’analyse, en fonction des analyses réalisées, sont suffisants pour réaliser des statistiques robustes.

Raffinement

Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Le raffinement inclut l'anesthésie lors de l'injection de la moelle osseuse, de l'induction de la blessure musculaire et lors de la mise à mort des animaux, ainsi que l'administration d'analgésique lors de la lésion musculaire. Le raffinement inclut le maintien des animaux dans des conditions sanitaires propres et une surveillance quotidienne des animaux après l'irradiation comprenant le dépôt de nourriture hydratée et de gel nourrissant directement dans la cage, une pesée tous les 2 jours, la surveillance d’une pousse des dents en plus de la surveillance de l'état général des individus. Ces mesures de raffinement sont issues de recommandations publiées issues de travaux de la communauté scientifique. Des points limites qui auront pour effet l’arrêt de la procédure ont été définis.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'Homme dans sa structure et son fonctionnement, avec les mêmes séquences de l'inflammation chez la souris et chez l'homme au cours de la régénération musculaire. Le projet s'intéressant aux mécanismes de réparation tissulaire à l'âge adulte, les souris sont utilisées à l'âge adulte, soit entre 8 et 12 semaines.

Opérées du fémur droit sous anesthésie générale, puis passées deux fois au scanner sous anesthésie gazeuse pendant trente-cinq minutes, 32 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi deux injections intrapéritonéales, cinq jours puis un jour avant leur mise à mort, et toutes sont tuées pour récupérer leurs fémurs et les analyser par histomorphométrie. Le fémur gauche de chaque animal sert de contrôle, ce que le porteur compte comme une réduction du nombre de souris utilisées. Il écrit par ailleurs que la procédure n'entraîne "ni douleur ni problème pour se déplacer" à long terme, à propos d'une chirurgie osseuse suivie d'une surveillance post-opératoire par grille de score.

Objectifs

L'ostéogénèse imparfaite de type VI est une maladie génétique dûe à des mutations sur le gène codant pour une protéine anti-angiogénique. Des études précédentes ont montré que l'injection d'un traitement ayant un effet anabolique sur la formation osseuse conduit à une surexpression de cette protéine. Notre équipe a donc cherché à trouver le lien entre l'effet de celle-ci sur la microvascularisation osseuse et la formation osseuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication de cette protéine anti-angiogénique dans la formation osseuse et particulièrement sur le processus d'ossification primaire qui conditionne le devenir de l'os adulte. Sur le long terme, cela nous permettra de mieux comprendre les processus pathologique impliqués dans l'ostéogénèse imparfaite de type VI et de proposer des traitements adaptés.

Procédures

Injection d'une substance (200ul) en intra-péritonéale x2 (5j et 1j avant mise à mort) et scanner x2 (48h après chirurgie et 1j avant mise à mort) sous anesthésie gazeuse (35min). Chirurgie au niveau du fémur droit sous anesthésie générale (10min).

Impact sur les animaux

L'injection d'une substance (200ul) en intra-péritonéale et le scanner s'effectue sous anesthésie gazeuse. On s’attend à un léger stress après les manipulations. La chirurgie se fait sous anesthésie générale. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme. Ces procédures sont donc de classe modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les fémurs afin de faire des analyses par histomorphométrie.

Remplacement

Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Compte tenu du fait que la moelle osseuse est un tissu complexe constitué de très nombreux types cellulaires, il est impossible de modéliser ces expérimentations in vitro.

Réduction

En accord avec le pourcentage des variations observées dans les mesures des paramètres biologiques et pour réaliser une étude statistique solide, nous utiliserons 8 souris/groupe. Les génotypes seront séparés en 2 groupes, eux-même divisés en 2 sous-groupes mis à mort à J14 ou J21. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés nous utiliserons le fémur gauche de chaque souris comme contrôle.

Raffinement

Les animaux seront manipulés en limitant le stress au maximum, par des personnes compétentes en expérimentation animale, un temps d’acclimatation sera prévu avant toute manipulation et une définition précise des points limites conduisant à l’arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des souris sera mise en place. Une surveillance adaptée (observation régulière des animaux et grille de scoring) sera mise en place post-chirurgie et permettra de limiter au maximum la souffrance. La chirurgie se fait sous anesthésie générale. Cette technique a déjà été utilisée dans notre laboratoire et elle est maîtrisée par un personnel compétent. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme. L'injection d'une substance (200ul) en intra-péritonéale et le scanner s'effectue sous anesthésie gazeuse. On s’attend à un léger stress après les manipulations. Ces procédures sont donc de classe modérée.

Choix des espèces

Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ce qui est impossible à faire in vitro. Nous avons, de plus, validé toutes nos mesures chez des souris et le travail sera effectué chez des souris dont le gène codant pour notre molécule d'intérêt a été invalidé. Ce mutant chez la souris est une souche robuste sur laquelle des études ont déjà été faites, c’est donc actuellement le meilleur modèle. Nous souhaitons étudier un processus d'ossification primaire, il est donc plus simple et plus rapide de le reproduire chez un animal adulte avec un os mature plutôt que de l'étudier chez un souriceau. La procédure se fait donc chez des souris de 2 mois. Des souris mâles et femelles seront utilisées car on ne s'attends pas à de différence entre les sexes au niveau de l'étude de ce processus.