Système musculosquelettique
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Rôle d’Atg7 dans le renouvellement des noyaux musculaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Un mois de doxycycline dans l'eau de boisson, pour éteindre un gène dans les fibres musculaires : 42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend de cette délétion un déclin progressif de la fonction musculaire, sans mort prématurée ni dystrophie, et prévoit une échelle de douleur de 0 à 3 pouvant conduire à une mise à mort anticipée. La question posée relève de la biologie fondamentale, savoir si les cellules musculaires éliminent leurs noyaux par autophagie, les retombées sur les maladies musculaires et le vieillissement étant annoncées comme un impact futur. Il compte 42 souris privées du gène et 42 témoins, soit 84 animaux, quand l'effectif déclaré est de 42.
Objectifs
Dans nos cellules, les organites ne sont pas permanents et subissent des dommages constants. Ces dommages déclenchent un mécanisme de nettoyage appelé autophagie, qui permet à la cellule d'éliminer les éléments endommagés. Contrairement aux autres organites, la plupart des cellules n'ont qu'un seul noyau, qui n'est donc pas considéré comme jetable. Cependant, les cellules musculaires squelettiques ont la particularité d'avoir des centaines de noyaux, ce qui pourrait faire du noyau un organite jetable. Nos recherches antérieures ont en effet montré que les cellules musculaires éliminent constamment les noyaux préexistants. Cependant, le mécanisme à l'origine de ce processus reste inconnu. Dans ce projet, nous explorons la possibilité que l'autophagie soit impliquée en suivant les noyaux marqués dans les fibres musculaires grâce à des outils génétiques développé chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet apporteront un éclairage totalement nouveau sur la façon dont nous concevons l'homéostasie du tissu musculaire. Elles auront à leur tour un impact important sur la compréhension des maladies musculaires et du vieillissement, où de nombreux noyaux musculaires aberrants s'accumulent.
Procédures
Administration de doxycycline par voie orale dans l’eau de boisson pendant 1 mois pour induire la délétion de notre gène d’intérêt dans les myofibres.
Impact sur les animaux
La doxycycline est un antibiotique largement utilisé et son administration n'entraîne aucune gêne. La conséquence de son administration est le marquage des noyaux musculaires qui n'induit pas, non plus, de gêne. La perte de notre gène d'intérêt dans les myofibres a été signalée, dans une autre étude, comme provoquant une gêne modérée : les souris ne meurent pas prématurément et ne développent pas de dystrophie, mais elles présentent un déclin progressif de la fonction musculaire au fil du temps. Cette gêne modérée ne sera présente que chez les animaux délété du gène d'intérêt dans les myofibres après induction par la doxycycline soit 42 animaux. Les 42 animaux contrôles ne sont pas impactés, ils ne subiront aucune gêne.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons, post mortem, tous les tissus musculaires pertinents de tous les animaux à la fin de la procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Notre projet porte sur la dynamique cellulaire et nécessite donc la présence de plusieurs structures cellulaires complexes. Il est important de noter qu'il n'existe actuellement aucun modèle de culture cellulaire permettant d'éliminer les noyaux musculaires préexistants (nous n'avons obtenu que récemment des données montrant que cela peut se produire chez les animaux dans notre propre équipe). Nous ne connaissons aucune méthode pour induire l'élimination des noyaux des cellules musculaires cultivées, ce que nous devrons comprendre en utilisant des modèles de souris. Enfin, nous souhaitons souligner les limites des cellules musculaires différenciées in vitro. Ces cellules sont extrêmement immatures et incomplètes car elles manquent de nombreuses caractéristiques des cellules musculaires matures : par exemple, absence de jonction muscle-neurone, absence de jonction muscle-tendon, absence de sarcomères matures, noyaux ne se déplaçant pas vers la périphérie de la cellule et se regroupant plutôt au centre de la cellule, etc. Si un chercheur étudie des mécanismes impliquant des événements de différenciation très précoces (par exemple, la sortie du cycle cellulaire, l'expression de gènes de différenciation précoce, la fusion musculaire, etc. ), les modèles in vitro existants peuvent s'avérer utiles. Cependant, pour toute question scientifique concernant des cellules musculaires entièrement matures et leurs structures (comme les nôtres), ces modèles de culture ne peuvent malheureusement pas remplacer les modèles animaux. Les modifications génétiques que nous utilisons ne sont possibles que chez la souris. Elles nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées.
Réduction
Notre étude du renouvellement des noyaux musculaires dans le temps reprend des points temporaux déjà établis dans des études précédentes. De plus nous collecterons tous les tissus musculaires pertinents de chaque souris, ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées. La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 groupes. Il a été déterminé que le nombre optimal de souris par groupe pour ce projet est de 7 femelles et 7 males afin d'obtenir une différence statistiquement significative.
Raffinement
Au cours de notre projet nous attendons un déclin progressif de la fonction musculaire au fil du temps chez les animaux délété pour notre gène d’intérêt dans les myofibres. Ce déclin sera très modéré néanmoins tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère (exemple : inconfort léger au niveau d’un membre type légère boiterie), dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente (exemple : douleur manifeste d’un membre entrainant un problème de déplacement), dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense (exemple : paralysie des membres), dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Les souris seront surveillées régulièrement. Le suivi de nos souris comprend une observation visuelle du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés). Si des souris devaient présenter des difficultés à se déplacer et donc des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage.
Choix des espèces
Nous utilisons des outils génétiques pour le suivi des noyaux musculaires, qui sont établis dans des modèles de souris. La lignée de souris permettant la délétion de notre gène d’intérêt, et donc de la protéine, après croisement avec une lignée exprimant la protéine Cre recombinase est également établie. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. Comme notre projet se concentre sur la régulation de la dynamique cellulaire dans les muscles matures, nous devons utiliser des souris dont le développement est terminé. Nous utiliserons donc des animaux adultes, mâles et femelles, âgés d’au moins 10 semaines.
Etude des médiateurs de la communication os-muscle et de l’influence du système nerveux sympathique dans un modèle de perte osseuse par immobilisation chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une injection de toxine botulique dans le quadriceps paralyse la patte de chaque souris, une paralysie dont le porteur indique lui-même que la mobilité ne revient qu'après cinquante-six jours et la masse osseuse après quatre-vingt-dix. 312 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus léger, une partie recevant en plus une injection intrapéritonéale quotidienne pendant vingt et un jours. Le porteur décrit une "légère boiterie" qui n'empêche pas l'animal de se nourrir, et affirme que la procédure "n'est pas douloureuse", l'analgésie n'étant appliquée que "si nécessaire". Toutes sont tuées entre le premier et le quatre-vingt-dixième jour, sous anesthésie, pour un prélèvement de sang par ponction intracardiaque et la collecte des os et des muscles.
Objectifs
L’ostéoporose est caractérisée par une fragilité osseuse et donc un risque accru des fractures. L’ostéoporose d’immobilisation résulte d’une diminution de contraintes mécaniques sur le squelette. La perte osseuse consécutive est associée à une fonte musculaire du fait de la relation étroite entre le muscle squelettique et l’os. Notre équipe a développé un modèle d’ostéoporose d’immobilisation par paralysie localisée à la toxine botulique (BTX) chez le rat. Ce modèle, reproductible chez la souris, a été utilisé pour caractériser la perte osseuse liée à l’immobilisation, étudier les interactions musculo-squelettiques et tester l’efficacité de molécules thérapeutiques ciblant l’os et/ou le muscle. Ce modèle ne nécessite aucune procédure chirurgicale par rapport aux méthodes classiques de dénervation. Une anesthésie à l’isoflurane suffit pour effectuer l’injection dans le muscle à paralyser. Après l’injection dans le quadriceps fémoral, l’animal présente en 2 à 3 jours une légère boiterie mais peut se mouvoir et accéder à la nourriture et l’eau. L’absence de chirurgie évite le biais lié au traumatisme chirurgical qui augmente la résorption osseuse. Nous avons étudié la cinétique de la perte osseuse chez la souris : des modifications du profil d’expression des gènes du remodelage osseux ont été observées dès 7 jours avec une perte osseuse maximale entre 21 et 28 jours dans le fémur et le tibia. Au niveau musculaire, l’effet de la BTX est mesurable dès 7 jours et la fonte musculaire est maximale à 21 jours. De plus, le muscle recouvre un niveau normal de mobilité après 56 jours, avant le recouvrement d’une masse osseuse normale après 90 jours. Ces résultats confortent l’hypothèse que le muscle est impliqué dans la restauration osseuse et le modèle BTX est adapté pour étudier les molécules impliquées dans ce processus.
Bénéfices attendus
Les prinicpaux bénéfices attendus du projet sont d'une part d'identifier des marqueurs clés des tissus muculaires et osseux impliqués dans la communication os-muscle. Cela permettra de déceler des molécules candidates de l'os et/ou du muscle pour à plus long terme mieux comprende la fragilité osseuse et la prévenir plus efficacement en tenant compte des deux entités anatomiques os et muscle. D'autre par, les bénéfices attendus sont également une meilleure cmprehesion du rôle du système nerveux symopathique dans la communication os-muscle et son implication dans la fragilité osseuse liée à l'immobilisation.
Procédures
Chaque animal recevra une injection intra-musculaire de toxine botulique (excepté les animaux contrôles) sous anesthésie légère (5 minutes par souris). La mise à mort aura lieu à différents temps de 0 à 90 jours sous anesthésie générale afin de collecter du sang par la voie intracardiaque (15 minutes par souris). Cette dernière intervention sera sans réveil pour l’animal. Une partie des animaux qui auront reçu une injection de toxine botulique par la voie intra-musculaire recevront également un traitement par la voie intrapéritonéale tous les jours pendant 21 jours (sur animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Le modèle d'immobilisation localisée par injection intramusculaire de toxine botulique est un modèle bien décrit au laboratoire et utilisé depuis de nombreuses années par notre équipe. La paralyisie localisée induite par la toxine botulique induit une boîterie légère du côté immobilisée mais qui n'empêche pas l'animal de se nourrir ni de s'hydrater. L’administration quotidienne de traitements par injection intrapéritonéale peut induire un stress et une douleur légère qui sera minimisée par un faible volume injecté par jour.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour les analyses biomécaniques, histologiques et moléculares sur les échantillons osseux et/ou musculaires.
Remplacement
Les études des interactions os-muscle ne peuvent être réalisées que chez l’animal car elles nécessitent d’isoler des pièces entières du squelette soumises aux contraintes mécaniques de même que les muscles qui leur sont rattachés. Dans ce projet, le facteur mécanique est au premier plan et seule une étude animale permet de reproduire la perte osseuse, la fonte musculaire et les effets sur l’os et le muscle de molécules bloquant ou activant une des voies de communication du système nerveux autonome sympathique.
Réduction
L'effectif de chaque lot est celui minimal pour obtenir des informations valides et des tests statistiques performants. D'autre part, le modèle de paralysie sur un seul membre, outre le fait de s'affranchir d'une technique chirurgicale, permet qu'un même animal soit son propre témoin (côté paralysé versus côté non paralysé) et ainsi d'éviter des lots supplémentaires témoins.
Raffinement
Le raffinement sera appliqué en effectuant l'administration intramusculaire de toxine botulique sous anesthésie générale. Cette procédure n'étant pas douloureuse, une analgésie légère sera appliquée si nécessaire. La gestion du bien-être animal sera assurée par un hébergement des animaux selon les standards prévus par la réglementation, en groupe sociaux, dans un environnement adapté et enrichi. Les animaux seront surveillés tous les jours et seront pesés une fois par semaine. Une liste de points limites adaptés et une grille d’évaluation de la sévérité des réactions non-désirées préalablement établies permettra de s’assurer du bien-être des animaux. Un arbre décisionnel en lien avec les points limites adaptés et la grille d’évaluation des réactions non désirées permettra de disposer de critères préétablis pour un placement sous surveillance accrue et un arrêt des souffrances pour l’animal le cas échéant.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal reconnu pour l’évaluation de la perte osseuse reflétant les différents types d’ostéoporose humaine comme l’ostéoporose de l’immobilisation. De plus, la souris est l’espèce la plus adaptée à l’étude de l’expression des gènes à partir d’échantillons d’os. Nous avons également développé et validé depuis plus de 10 ans tous les outils technologiques nécessaires à l'étude de la qualité osseuse dans des modèles murins. Enfin, les temps d’étude choisis dans le projet ont été déterminés à partir de nos études précédentes dans le modèle de perte osseuse par immobilisation chez la souris. Le projet utilisera des animaux adultes (âge > 15 semaines) afin de mettre en évidence les modifications du tissu osseux mature induites par injection de BTX.
Un complément en acides gras furanique peut-il prévenir ou ralentir la fonte musculaire observée dans le cadre de pathologies cancéreuses? EU2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une greffe de cellules cancéreuses dans le pancréas, puis une cachexie qu'il faut laisser s'installer pour l'étudier : c'est ce que subissent les 220 souris du volet EU2/2 de ce protocole, 60 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 120 modéré et 40 sévère. Elles reçoivent le lipide testé par sonde de gavage, huilée pour faciliter l'introduction, et passent en RMN tous les deux jours. Le porteur ramène pourtant les nuisances attendues au stress des manipulations et à une irritation de l'œsophage, quand la fonte musculaire induite est l'objet même de l'étude. Toutes sont tuées en fin de procédure, muscles, sang, organes et tumeurs prélevés pour analyse.
Objectifs
Des études précliniques indiquent qu’un lipide spécifique augmente la masse musculaire. Ce lipide appartient à une famille de lipides synthétisés par des plantes et des bactéries, présents dans le poisson, les produits laitiers et les fruits et légumes. Nos études sur des cellules musculaires montrent que ces lipides stimulent la synthèse des protéines. De plus, nous avons mis en évidence, que l’ajout de ce lipide dans l’alimentation est suffisant pour induire une augmentation de la masse musculaire chez des souris normales ou chez des souris obèses. Ces résultats soulignent que ce lipide pourrait avoir des effets bénéfiques en prévenant ou en ralentissant le développement de fonte musculaire lors de cancers. L'objectif principal de ce projet de recherche est d'étudier si une supplémentation avec ce lipide est capable de contrer ou de ralentir l'apparition de la fonte musculaire dans 2 modèles animaux de cancers touchant le colon et le pancréas. Ce projet fait appel à l'expertise de deux établissements : le premier pour la l'induction des tumeurs chez les animaux, le second pour leur analyse métabolique et musculaire.
Bénéfices attendus
La preuve de concept que ce lipide peut diminuer la fonte musculaire dans le cadre de cancers chez l'animal est une étape indispensable avant d’envisager des essais cliniques chez l’Homme. En cas de résultats positifs, ces lipides seront destinés à devenir un complément ou additif alimentaire en santé humaine.
Procédures
Dans l'établissement EU 1/2 la moitié des animaux subiront une administration sous-cutanée unique (30 secondes, animaux vigiles), l'autre moitié subira une procédure chirurgicale (15 min, sur animaux anesthésiés avec injection préalable d'analgésique). Ensuite les animaux seront transportés (moins de 15 minutes en voiture) dans l'établissement EU 2/2 pour y être analysés comme décrit ci-dessous. Les lipides seront administrés par voie orale 5 jours sur 7 pendant 2 à 3 semaines selon les lots d’animaux. L'administration orale prend moins d'1 minute par souris. Une pesée des animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées tous les 2 jours à l'aide d'un appareil RMN (Résonnance magnétique) qui permet d’obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent 2 minutes par souris et sont réalisées sur des animaux vigiles pendant la durée des procédures (1 semaine, 3 semaines ou 4 à 5 semaines).
Impact sur les animaux
La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera principalement liée à la greffe, au développement de tumeurs et à l’induction de la fonte musculaire (cachexie). Les animaux pourront ressentir du stress et avoir une irritation de l’œsophage liée à l’administration orale (5j/7, de 1 à 3 semaines selon les lots), et du stress lors des mesures du poids des animaux et de la mesure de la composition corporelle (tous les deux jours pendant 3 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure. Les muscles, le sang, les organes et les tumeurs seront prélevés pour plus d'analyses.
Remplacement
Notre projet porte sur le syndrome de cachexie qui se définit comme une perte accélérée de muscle et de gras, provoquée par une diminution des apports nutritionnels, des changements énergétiques et métaboliques. Préalablement aux études que nous proposons, nous avons démontré in vitro que les acides gras furaniques (FuFAs) avaient un effet non seulement sur des cellules musculaires saines en culture mais aussi sur organisme entier (souris saines ou obèses), en impactant la régulation du métabolisme. Afin d’envisager l’utilisation chez l’Homme des FuFAs en tant que complément ou additif alimentaire pour prévenir ou ralentir le développement de la sarcopénie, nous souhaitons à présent étudier ces molécules dans un modèle murin de cachexie cancéreuse. En effet, ce syndrome ne peut être étudié et de nouvelles thérapies évaluées que dans le contexte d’un organisme suffisamment complexe, tel que celui du rongeur en première intention.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d'animaux minimal néccessaire pour avoir des résultats statistiques fiables. Notre projet sera réalisé en 3 étapes. Si la première étape n'est pas concluante, nous ne réaliserons pas les deux autres. Le nombre d'animaux utilisé sera donc uniquement de 80 au lieu des 220 prévus.
Raffinement
Pour l'implantation des cellules cancéreuses dans le pancréas, les animaux seront anesthésiés et sous analgésique pendant et après la chirurgie. Pour le transport de courte durée (inférieure à 15 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée dans l'EU 273 les souris seront mises en cages traditionnelles. Elles seront hébergées par 2 jusqu'à la fin de l’étude dans des cages avec une roue d’activité leur permettant d'avoir une activité spontanée, avec pour enrichissement des copeaux et un tunnel en plexiglass rouge. Le tunnel sert à la fois au déplacement des animaux et à l’habituation pour le test de composition corporelle. Pour l’administration orale, la sonde de gavage sera enduite d’huile végétale pour faciliter l’introduction. Nous utiliserons une grille de suivi de l'état de santé des animaux et appliquerons les décisions définies préalablement pour soulager la souffrance des animaux. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les modèles de greffe de cellules cancéreuses sur souris que nous avons choisi sont couramment utilisés pour induire une perte de poids et fonte musculaire (cachéxie) similaire à celle observée dans le cadre des cancers du colon ou pancréas. Ce sont donc de bons modèles pour tester les nouvelles thérapies. Les souris étudiées seront des souris jeunes adultes de 10 semaines ayant atteint un poids suffisant, qui permet d'observer une phase de cachéxie sans atteindre les points limites de perte de poids trop rapidement. Elles seront suivies entre 4 et 6 semaines.
Un complément en acides gras furanique peut-il prévenir ou ralentir la fonte musculaire observée dans le cadre de pathologies cancéreuses? EU1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Un gavage cinq jours sur sept pendant deux à trois semaines, une pesée et un passage en RMN tous les deux jours : 220 souris porteuses de tumeurs du côlon ou du pancréas vont être utilisées, 60 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 120 modéré et 40 sévère. Toutes sont tuées, muscles, sang, organes et tumeurs prélevés. Il s'agit de tester si un acide gras furanique ralentit la fonte musculaire provoquée par le cancer, le porteur présentant cette preuve de concept chez la souris comme une étape "indispensable" avant des essais chez l'être humain. Le choix du modèle repose sur des greffes de cellules cancéreuses réputées induire une cachexie comparable à celle des patients, chez des souris de dix semaines suivies quatre à six semaines.
Objectifs
Des études précliniques indiquent qu’un lipide spécifique augmente la masse musculaire. Ce lipide appartient à une famille de lipides synthétisés par des plantes et des bactéries, présents dans le poisson, les produits laitiers et les fruits et légumes. Nos études sur des cellules musculaires montrent que ces lipides stimulent la synthèse des protéines. De plus, nous avons mis en évidence, que l’ajout de ce lipide dans l’alimentation est suffisant pour induire une augmentation de la masse musculaire chez des souris normales ou chez des souris obèses. Ces résultats soulignent que ce lipide pourrait avoir des effets bénéfiques en prévenant ou en ralentissant le développement de fonte musculaire lors de cancers. L'objectif principal de ce projet de recherche est d'étudier si une supplémentation avec ce lipide est capable de contrer ou de ralentir l'apparition de la fonte musculaire dans 2 modèles animaux de cancers touchant le colon et le pancréas. Ce projet fait appel à l'expertise de deux établissements : le premier pour l'induction des tumeurs chez les animaux, le second pour leur analyse métabolique et musculaire.
Bénéfices attendus
La preuve de concept que ce lipide peut diminuer la fonte musculaire dans le cadre de cancers chez l'animal est une étape indispensable avant d’envisager des essais cliniques chez l’Homme. En cas de résultats positifs, ces lipides seront destinés à devenir un complément ou additif alimentaire en santé humaine.
Procédures
Dans l'établissement EU 1/2 la moitié des animaux subiront une administration sous-cutanée unique (30 secondes, animaux vigiles), l'autre moitié subira une procédure chirurgicale (15 min, sur animaux anesthésiés avec injection préalable d'analgésique). Ensuite les animaux seront transportés (moins de 15 minutes en voiture) dans l'établissement EU 2/2 pour y être analysés comme décrit ci-dessous. Les lipides seront administrés par voie orale 5 jours sur 7 pendant 2 à 3 semaines selon les lots d’animaux. L'administration orale prend moins d'1 minute par souris. Une pesée des animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées tous les 2 jours à l'aide d'un appareil RMN (Résonnance magnétique) qui permet d’obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent 2 minutes par souris et sont réalisées sur des animaux vigiles pendant la durée des procédures (1 semaine, 3 semaines ou 4 à 5 semaines).
Impact sur les animaux
La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera principalement liée à la greffe, au développement de tumeurs et à l’induction de la fonte musculaire (cachexie). Les animaux pourront ressentir du stress et avoir une irritation de l’œsophage liée à l’administration orale (5j/7, de 1 à 3 semaines selon les lots), et du stress lors des mesures du poids des animaux et de la mesure de la composition corporelle (tous les deux jours pendant 3 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure. Les muscles, le sang, les organes et les tumeurs seront prélevés pour plus d'analyses.
Remplacement
Notre projet porte sur le syndrome de cachexie qui se définit comme une perte accélérée de muscle et de gras, provoquée par une diminution des apports nutritionnels, des changements énergétiques et métaboliques. Préalablement aux études que nous proposons, nous avons démontré in vitro que les acides gras furaniques (FuFAs) avaient un effet non seulement sur des cellules musculaires saines en culture mais aussi sur organisme entier (souris saines ou obèses), en impactant la régulation du métabolisme. Afin d’envisager l’utilisation chez l’Homme des FuFAs en tant que complément ou additif alimentaire pour prévenir ou ralentir le développement de la sarcopénie, nous souhaitons à présent étudier ces molécules dans un modèle murin de cachexie cancéreuse. En effet, ce syndrome ne peut être étudié et de nouvelles thérapies évaluées que dans le contexte d’un organisme suffisamment complexe, tel que celui du rongeur en première intention.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d'animaux minimal néccessaire pour avoir des résultats statistiques fiables. Notre projet sera réalisé en 3 étapes. Si la première étape n'est pas concluante, nous ne réaliserons pas les deux autres. Le nombre d'animaux utilisé sera donc uniquement de 80 au lieu des 220 prévus.
Raffinement
Pour l'implantation des cellules cancéreuses dans le pancréas, les animaux seront anesthésiés et sous analgésique pendant et après la chirurgie. Pour le transport de courte durée (inférieure à 15 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée, les souris seront mises en cage traditionnelle. Elles seront hébergées par 2 jusqu'à la fin de l’étude dans des cages avec une roue d’activité leur permettant d'avoir une activité spontanée, avec pour enrichissement des copeaux et un tunnel en plexiglass rouge. Le tunnel sert à la fois au déplacement des animaux et à l’habituation pour le test de composition corporelle. Pour l’administration orale, la sonde de gavage sera enduite d’huile végétale pour faciliter l’introduction. Nous utiliserons une grille de suivi de l'état de santé des animaux et appliquerons les décisions définies préalablement pour soulager la souffrance des animaux. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les modèles de greffe de cellules cancéreuses sur souris que nous avons choisi sont couramment utilisés pour induire une perte de poids et fonte musculaire (cachéxie) similaire à celle observée dans le cadre des cancers du colon ou pancréas. Ce sont donc de bons modèles pour tester les nouvelles thérapies. Les souris étudiées seront des souris jeunes adultes de 10 semaines ayant atteint un poids suffisant, qui permet d'observer une phase de cachéxie sans atteindre les points limites de perte de poids trop rapidement. Elles seront suivies entre 4 et 6 semaines.
Étude de la réponse immunitaire dans un modèle d’infection articulaire à Staphylococcus aureus sur matériel étranger
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Un biomatériel est implanté dans une articulation du membre postérieur de souris pour y installer une infection à Staphylococcus aureus, avec douleurs et gêne à la marche pendant trois à cinq jours. 59 souris sont utilisées, 53 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 6 sous anesthésie sans réveil, toutes tuées pour prélèvement du fémur droit. Le projet vise à comprendre comment s'installe une infection sur prothèse articulaire, complication qui touche environ 1 % des personnes opérées. La description des procédures se limite pourtant à "une seule procédure chirurgicale d'implantation de biomatériel" de trente minutes, alors que la liste des effets attendus va jusqu'à la bactériémie et à la mort prématurée de l'animal.
Objectifs
Mieux comprendre la physiopathologie du processus d’infection ostéo-articulaire tant sur le plan infectiologique que sur le plan du système immunitaire afin de proposer dans un second temps des stratégies innovantes de prévention, diagnostic et thérapeutiques. Les infections des prothèses (matériel étranger) articulaires sont de sérieuses complications qui surviennent chez environ 1% des personnes ayant bénéficié d’une chirurgie de prothèse d’articulation. Elles entraînent des problèmes de santé importants et coûtent cher à traiter, principalement en raison de leur nature chronique difficile à éliminer. De plus, avec le vieillissement de la population, ces infections deviennent de plus en plus fréquentes. Pour mieux les combattre, il est crucial de comprendre les mécanismes qui les sous-tendent, notamment la persistance des bactéries, leur résistance aux traitements et la perte osseuse associée. La recherche dans ce domaine est complexe en raison des interactions multiples entre les bactéries, l’os, les matériaux prothétiques et les cellules du système immunitaire. Il n’est pas possible d'étudier ces interactions en temps réel dans des cellules in vitro, dans des modèles ex vivo ou dans des études cliniques chez l’homme car l'environnement local joue un rôle crucial dans le développement de ces infections et il faut du temps pour confirmer la guérison, des rechutes pouvant survenir plusieurs années après le traitement initial. À ce jour, notre compréhension de la perte osseuse, de l'impact du microbiome local et des réponses immunitaires dans le contexte des infections de prothèses articulaires demeure limitée. Pourtant, développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives efficaces dépend de notre capacité à élucider ces mécanismes complexes. Ce projet va permettre de comprendre les mécanismes qui permettent la mise en place et l’évolution d’une infection sur prothèse articulaire.
Bénéfices attendus
Comprendre l'interaction entre la réponse immunitaire, la formation de biofilm et la perte osseuse impliquée dans la physiopathologie de l’infection de prothèse Générer des hypothèses pour aider à identifier les facteurs influençant le pronostic fonctionnel dans les infections de prothèse chez l’animal afin de les transposer chez homme L’utilisation de ce modèle est génératrice d’hypothèses physiopathologiques concernant les infections subaigues et chroniques de prothèse chez l’homme en vue du développement de nouvelles approches préventive, diagnostique et thérapeutique par des techniques innovantes.
Procédures
Certains animaux sont soumis à une seule procédure chirurgicale d’implantation de biomatériel sous anesthésie générale. Durée prévisible 30 minutes.
Impact sur les animaux
Douleurs du membre postérieur, gène à la marche transitoire pendant 3 à 5 jours, stress lié à la manipulation, douleur de l’introduction de l’aiguille pour l’induction de l’anesthésie, écoulement au niveau de la cicatrice, inflammation de la cicatrice, Possibles mais peu attendus : fièvre, risque d’infection disséminée (bactériémie), mort prématurée de l’animal avant la date prévue de la mise à mort
Devenir
A la fin de l’expérimentation tous les animaux sont mise à mort pour réaliser les prélèvements d’os (fémur droit).
Remplacement
Il n’existe pas de modèle non animal permettant d’étudier la physiopathologie de l’infection de prothèse articulaire, en raison de la complexité du microenvironnement infectieux sur matériel et des interactions entre hôte et pathogène spécifique qui s’exercent sur l’os, le biomatériel et le biofilm bactérien. En effet, l’étude de la mise en place et de l’évolution d’une infection sur un os vivant, vascularisé avec un matériel en place et du biofilm en constitution et engageant un dialogue constant avec le système immunitaire ne peut pas se mimer dans un modèle in silico ou in vitro sur des cellules cultivées ou des fragments osseux. Par ailleurs, l’étude des tissus ex vivo chez l’homme ne permet pas d’analyser en profondeur la physiopathologie pas de l’infection de prothèse articulaire et la mise en place des mécanismes responsables de la chronicisation des infections et de la perte osseuse en raison d’une part de l’hétérogénéité clinique et microbiologique des infections de prothèse articulaire et de la pauvre qualité des prélèvements réalisés lors de chirurgie de lavage ou reprise de prothèse articulaire infectée. De plus, l’utilisation d’un modèle invertébré n’est pas envisageable pour modéliser une infection osseuse sur prothèse car ceux-ci ne disposent pas du système osseux ni immunitaire permettant les analyses nécessaires (cytométrie de flux, histologie) à la compréhension de la physiopathologie de l’infection osseuse sur matériel chez l’homme. De la même manière, l’utilisation d’un modèle d’animaux aquatiques (amphibiens ou poissons) n’est pas envisageable pour modéliser une infection osseuse sur prothèse car ceux-ci ne disposent pas d’un système osseux articulaire ni immunitaire suffisamment proche à l’homme pour permettre une modélisation adéquate.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé pour être le minimum requis pour obtenir des données scientifiquement exploitables en se fondant sur l’étude de la littérature dans les modèles d’infection de prothèse articulaire murin et les données préliminaires du projet PROTHEE Pilote réalisé sur des prélèvements d’os et de membrane chez des patients humains avec des infections de prothèse. Soit un total de 59 animaux. Le calcul des animaux a été réalisé afin d’avoir un nombre représentatif d’animaux dans chaque groupe avec des prélèvements pour l'étude des cellules de l'os d’une part (une partie des animaux) et des prélèvements pour l'étude des bactéries.
Raffinement
Le milieu de vie des animaux sera enrichi par la présence de tube de carton et de matériel pour la confection de nids (coton et igloo), ainsi que par des buchettes en bois à ronger Les souris sont hébergées 6 animaux par cage dans une animalerie spécialisée. Afin de réduire la souffrance animale, les douleurs et l'inflammation après le geste chirurgical le protocole prévoit une administration de médicaments antidouleurs jusqu’à la fin de l’expérimentation. Les animaux seront examinés quotidiennement (matin et après-midi) pour la recherche de points limites nécessitant des actions correctives. Nous avons défini les points limites suivants permettant de noter un score associé aux actions correctives suivantes : 0 Pas d’action 1 Adaptation des pellets , changement / ajout de nourriture pour les animaux au besoin 2 Enrichissement du milieu par ajout d’une structure en plastique (maison ou cube) et de matériel de nidation (serpentin en coton ou lamelles de carton) 3-4 Administration d'antidouleurs >5 Mise à mort Ces points limites et actions correctives sont regroupés en Annexe (Tableaux 1 et 2). Enfin, nous utilisons le plus petit inoculum bactérien possible pour s’assurer que l’impact sur la qualité de vie de l’animal soit minimal et n’entraine pas d’infection disséminée ni de fièvre.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour sa capacité à représenter une alternative représentative et validée d’infection de prothèse [Bernthal et al. PloSOne 2010], et est un des modèles les mieux documentés pour l’analyse de la réponse immunitaire. 12 semaines, il s’agit du stade de développement habituellement utilisé dans la littérature, à cet âge le système immunitaire est suffisamment développé pour être considéré comme mature. [ Bernthal et al. PLoS One 2010; Marriott et al. Bone. 2005; Sokhi et al. J Bone Miner Res. 2022; Prabhakara et al. Infect Immun. 2011; Yang et al. J Bone Joint Surg Am. 2015; Thompson et al. J Bone Joint Surg Am. 2017; Masters et al. PLoS Pathog 2020]
Étude des propriétés nucléaire dans la physiologie du muscle squelettique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris utilisées portent une invalidation génétique conditionnelle d'un gène musculaire, activée par cinq administrations orales de tamoxifène. Elles sont 420, dont 84 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 168 modéré et 168 sévère, toutes tuées à l'issue. 168 reçoivent une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle de la patte, et toutes passent une épreuve de course d'environ une heure trente d'endurance ainsi qu'une mesure de force par électrostimulation sous anesthésie. Le cumul de l'électrostimulation et de la course peut induire un stress et de la douleur, reconnaît le porteur, et la mise à mort sert à prélever les muscles pour des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Objectifs
Près de la moitié de la masse du corps humain est composé de muscles striés squelettiques. Ceux-ci sont composés de milliers de cellules géantes (les fibres musculaires), pouvant atteindre des 10aines de centimètre de long. Nos travaux ont montré que l’intégrité fonctionnelle des fibres musculaires est contrôlée par le positionnement des noyaux le long de la fibre. Les travaux de notre équipe ont permis l’identification d’une protéine impliquée dans le positionnement des noyaux dans les fibres musculaires formées in vitro. Notre étude cherchera à quantifier l’impact de l’absence de cette protéine dans les fibres musculaires sur (1) la fonctionnalité musculaire et (2) au cours de la régénération musculaire chez des souris jeunes et âgées grâce à un modèle de souris invalidé pour notre gène d’intérêt spécifiquement dans les fibres musculaires. A terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels la mécano-transduction nucléaire contrôle la physiologie du tissu musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise la compréhension du contrôle de la fonctionnalité du muscle squelettique dependant d'une protéine nucléaire, qui conditionne les performances musculaires. Les résultats qui découleront de ce projet nous permettront de comprendre le rôle de notre protéine d'interêt dans le tissu musculaire mais également lors de la régénération musculaire. A terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels le noyau contrôle la physiologie du tissu musculaire et d’identifier ainsi une nouvelle cible thérapeutique dans les maladies musculaires associées.
Procédures
- une injection intramusculaire dans le muscle releveur de la patte sera réalisée sur certains animaux (168/420). Elle dure moins de 5 secondes et sera réalisée sur animaux anesthésiés. Deux injections d’analgésique (anti-douleur) seront également réalisées avant et après la lésion musculaire. - administration par voie oral de souris avec un mélange d'huile de maïs contenant du tamoxifène ; il dure moins de 20 secondes et est répété 5 fois (108/420). - Épreuves de course, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la vitesse maximale aérobie environ 30 min, l’endurance environ 1h30 (toutes les souris). - Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale, 1 fois dans leur vie : chaque intervention durera au maximum 30 minutes. Deux injections d’analgésique (anti-douleur) seront également réalisées avant et après mesure de force (toutes les souris).
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé n’ont pas montré de problèmes détectables sur le comportement, l’activité et ou la prise de poids des souris. L’administration de tamoxifène dans les souris par voie oral pourra causer une douleur légère et brève aux animaux. Aucune faiblesse musculaire, reflétée par des problèmes de locomotion ou activité ne sont observables suite à cette procédure. L’injection de cardiotoxine dans le Tibialis Anterior entraine la destruction du tissu musculaire. Suite à cette injection, le processus de régénération musculaire va se mettre en place instantanément après la blessure et entrainer une régénération complète du muscle en moins de 7 jours. L’injection étant localisée sur un seul des muscles composant la patte, les conséquences fonctionnelles sur la locomotion de la souris sont limitées et ne sont présentes que pendant les premières 24h. En effet, après le réveil, les souris circulent normalement dans la cage. Certaines présentent parfois une rétractation des pattes traitées, qui disparaît en quelques heures, sans modification de la mobilité ni signe de souffrance. Dans tous les cas elles accèdent à la nourriture et à la boisson sans difficulté apparente. Les animaux sont surveillés quotidiennement. En cas de toute anomalie visible locale (gonflement anormal de la patte, infection au niveau du point d’injection, non utilisation de la patte, hémorragie visible) ou générale (prostration de l'animal, démangeaison, lésion, poil hirsute etc..), de mobilité réduite ou d'inconfort visible, l'animal est mis à mort. Des nuisances modérées sont attendues du fait d’un cumul d’actes (électrostimulation et course sur tapis) qui peuvent induire un stress et de la douleur chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Des études in vitro à partir de cellules primaires murines permettant la formation de myotubes et de myofibres ont été réalisées en présence ou en absence de notre protéine d'interêt. Cette méthode nous a permis de mettre en évidence ses premiers rôles dans la formation des fibres et l’homéostasie musculaire. Il est désormais nécessaire d’utiliser un nouveau modèle murin in vivo afin de confirmer nos résultats précédents. En effet, l’homéostasie musculaire regroupe plusieurs mécanismes complexes d’interaction entre différents acteurs que nous ne pouvons reproduire dans notre système de culture de cellules primaires in vitro précédemment utilisé. De plus, la régénération musculaire repose sur un ensemble d’interactions complexes entre les tissus lésés, le système immunitaire et vasculaire ainsi que sur la coordination efficace de nombreux types cellulaires.
Réduction
Grâce à nos connaissances accumulées sur les tests d’effort chez les souris et les études ex vivo réalisées, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possible, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. La taille de l’échantillon (7 souris pour chaque analyse et 12 pour les tests fonctionnel (course, force) a été déterminée par des outils d' analyses statistiques. Pour la mesure de force, nous utilisons un dispositif expérimental utilisable in vivo qui permet de réaliser des protocoles de mesure de force musculaire de manière longitudinale sur les mêmes animaux sur l’ensemble du protocole (force, course, force). Cette innovation réduit également la variabilité expérimentale inter-animale.
Raffinement
Avant le début de chacune des procédures, les animaux suivront une période d’acclimatation à leur environnement d’au moins 1 semaine, nécessaire à l’adaptation de leur comportement et à la réduction du stress. La procédure 2 consiste en une injection intramusculaire simple. C’est la procédure la moins invasive et douloureuse pour étudier la régénération musculaire, ne nécessitant aucune chirurgie. Un analgésique sera administré aux animaux avant le début de cette procédure et l’injection de cardiotoxine sera réalisée sous anesthésie dans le but de réduire au maximum un état de stress et de souffrance chez les animaux. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition : coton et cabanes. Comme la locomotion des animaux sera limitée pendant les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutées au sein des cages pour leur permettre une alimentation et hydratation constante. De l’eau en gel sera également ajoutée au sein des cages. L’analgésie sera poursuivie les jours suivants autant que de besoin. Une analgésie avant et après le test de mesure de force musculaire sera également effectuée. Enfin, pour chaque procédure, des points limites ont éte établis, prenant en compte des critères refletant la souffrance des animaux et permettant ainsi de mettre fin précocément à la procédure.
Choix des espèces
La composition et le fonctionnement du tissu musculaire murin est proche de celui de l’être humain, faisant du modèle murin un modèle pertinent pour l’analyse de gènes impliqués dans l’homéostasie cellulaire. De plus, les modèles transgéniques proposés dans cette étude sont conditionnels et l’un d’eux est inductible, permettant la délétion de notre gène d’intérêt dans un type cellulaire spécifique et à un moment voulu. Des souris jeunes, âgées de 8 à 12 semaines (2 mois) et de 12 mois seront utilisées. Entre 8 et 12 semaines, les souris ont fini leur croissance et atteignent l’âge adulte dit « mature », ce qui permet d’observer la régénération et les performances physiques dans un contexte de muscle squelettique adulte jeune. Un deuxième temps à 12 mois est utilisé car nos données montrent qu’après 12 mois, une nouvelle voie de signalisation contrôle le fonctionnement musculaire en lien avec le postionnement nucléaire.
Etude longitudinale par IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) in vivo de l’effet d’une supplémentation en phosphate sur l’ostéodystrophie dans un modèle de souris d’insuffisance rénale par néphrectomie.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Ablation des deux tiers d'un rein, puis ablation complète du second une semaine plus tard : 173 souris subissent cette double néphrectomie, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles passent ensuite dans un imageur à résonance magnétique à 22, 26, 28 et 32 semaines, avec un prélèvement sanguin après chaque séance, pour suivre la dégradation osseuse qui accompagne l'insuffisance rénale et tester l'effet d'un régime enrichi en phosphate. Le porteur écrit ne pas prévoir d'analgésique pour l'imagerie, celle-ci n'étant pas douloureuse, et juge négligeable le risque d'infection des incisions chirurgicales. Il indique dans le même temps que le taux de survenue des effets secondaires de ce modèle, hypertension et modifications de la production d'urine comprises, n'est pas mentionné dans les publications.
Objectifs
Nous proposons donc de réaliser une étude prospective longitudinale dans un modèle murin afin d’étudier les corrélations entre plusieurs techniques d’évaluation osseuse - de la biologie à l’imagerie IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et SRM (Spectrsocopie par Résonance Magnétique) hautes résolutions- in vivo. L’objectif principal sera de rechercher la meilleure combinaison de marqueurs, biologiques, imagerie, corrélés entre eux et comparée au gold standard (l’histologie) afin de caractériser le TMO MRC (trouble du métabolisme minéral et osseux de la maladie rénale chronique) en suivant son évolution au cours de la dégradation de la fonction rénale chez la souris, pour se rapprocher des stades 3 à 5 définis chez l’Homme. Le deuxième objectif est d’évaluer l’impact du régime phosphaté sur les marqueurs du remodelage osseux. En effet il a été montré depuis longtemps que le phosphate joue un rôle important dans la minéralisation osseuse. A long terme l’objectif clinique est une meilleure prise en charge thérapeutique des insuffisants rénaux afin de contrôler au mieux la dystrophie osseuse qui est une complication importante de leur maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure prise en charge thérapeutique des insuffisants rénaux afin de contrôler au mieux la dystrophie osseuse qui est une complication importante de leur maladie.
Procédures
Les souris seront soumises deux chirurgies (néphrectomie 5/6eme) : Ablation des 2/3 d'un rein et ablation complète du second rein 1 semaine plus tard. Les souris passeront dans le spectromètre imageur IRM/SRM avant chirurgie (à 22 semaines) et toutes les 4 semaines après (à 26, 28 et 32 semaines). Des prélèvements de sang seront réalisés après chaque IRM/SRM
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à la chirurgie néphrectomie de l’insuffisance rénale et feront l'objet de points limites. La fonction rénale de la souris sera réduite. Comme toute chirurgie, il peut y avoir un risque d’infection au niveau des incisions. Même si ce risque est négligeable vu que la chirurgie sera réalisée dans une salle dédiée à l’expérimentation animale avec des mesures d’asepsie. Dans ce modèle il peut être observé parfois une hypertension ainsi que des modifications de la production d’urine et du métabolisme des protéines. Dans les publications le taux de survenue des effets secondaires n’est pas mentionné. L’injection ntraveineuse (IV) des agents de contraste ne provoque pas de douleur supérieure à celle d'une piqure d'aiguille . Pas d’effets indésirables liés à l’IRM qui est une technique d’imagerie totalement non invasive et atraumatique. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse (isoflurane à 1.5%) pendant toute la durée des acquisitions IRM. Leur rythme respiratoire est surveillé tout au long de l'imagerie par un ballonet placé sous la cage thoracique. De plus la souris est placée sur un petit tapis chauffant pour maintenir sa température corporelle à 37,4°C.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin des acquisitons IRM/SRM à chaque stade pour l'étude par stade et au dernier stade (36 semaines) pour l'étude longitudinale. La mise à mort est faite pour des études post mortem.
Remplacement
L’ostéodystrophie osseuse ne peut être étudiée autrement que sur un système vivant car elle est une des conséquences de l’insuffisance rénale. Cette pathologie osseuse ne peut être induite sur cellules. Dans la bibliographie il existe plusieurs modèles d’insuffisance rénale ou transgénique mais aucun mais ils n’entraînent pas forcément une ostéodystrophie qui se maintient au cours du temps (pas de remodelage osseux).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi du développement de l’ostéodystrophie ainsi que la SRM permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Ce projet nécessitera 173 souris.
Raffinement
PPendant toute la durée de l’expérimentation, les souris sont hébergées en portoir ventilé. Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Pendant les actes d’imagerie les souris sont sous anesthésie à l’isoflurane. Pas d’analgésique puisque l’IRM n’est pas douloureuse. L’hypothermie est évitée puisque les souris sont placées sur un tapis chauffant (circulation d’eau chaude). Pour la chirurgie, une analgésie préopératoire sera réalisée par injection sous cutanée La souris sera alors anesthésiée à l'isoflurane. En post opératoire, afin d’éviter les douleurs post-opératoires, des injections sous cutanées d'antalgique seront réalisées. Pour la nuit une gelée àd'analgésique sera réalisée.
Choix des espèces
Le modèle d’insuffisance rénale peut être réalisé sur souris ou sur rat. Nous avons choisi la souris pour deux raisons : 1) nous nous sommes appuyés le modèle souris déjà publié et validé (Shobeiri N., Am J Nephrol 31(6), 471-481, 2010) 2) et 2) Notre spectromètre imageur IRM 7T possède tout le matériel optimisé pour réaliser les études chez la souris.
Etude de l’effet thérapeutique des MSC métaboliquement standardisées et de leur suivi post-injection intra articulaire dans un modèle murin de l’arthrose.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Tester si des cellules souches au métabolisme standardisé freinent la dégradation du cartilage suppose d'abord de détruire ce cartilage. 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses radiologiques et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux injections de collagénase sont pratiquées dans le genou droit à deux jours d'intervalle sous anesthésie gazeuse, puis une injection de cellules une semaine plus tard. L'arthrose ainsi provoquée peut plonger les souris dans la prostration, les isoler de leurs congénères et leur faire cesser le toilettage social, un signe clinique déclenchant des croquettes humidifiées, deux un analgésique, trois la mise à mort.
Objectifs
L’arthrose (OA) est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50 % de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble des tissus de l’articulation et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’OA est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements palliatifs non spécifiques existent et ne permettent pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’OA. Dans ce contexte, les cellules souches adultes et leur potentiel thérapeutique ont été largement étudiés. Des études pré-cliniques et cliniques ont montré des résultats prometteurs. Cependant, des inconvénients majeurs ont été mis en évidence, la fuite des cellules du site d’injection, leur faible viabilité après l’injection et la variabilité de l’efficacité des cellules en fonction des donneurs. Les travaux de nos collaborateurs ont montré que le métabolisme des cellules joue un rôle primordial pour leurs propriétés thérapeutiques. L’un des objectifs du projet est de standardiser le métabolisme des cellules afin de maximiser leurs propriétés thérapeutiques et rendre plus reproductible les résultats obtenus avec différents donneurs de cellules. L’objectif de ce projet vise à montrer l’effet immunosuppresseur des cellules traitées quel que soit le donneur de cellules dans un contexte arthrosique et de suivre le devenir des cellules injectées. Les données recueillies permettront d’envisager une étude chez un plus gros animal que la souris. Selon les résultats obtenus, nous envisagerons ensuite d'encapsuler les cellules traitées dans un hydrogel afin de les protéger d’une fuite du site d’injection et de la mort cellulaire afin de prolonger leur effet thérapeutique.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints d’arthrose (OA) est à ce jour peu efficace et, compte-tenu de l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le traitement de l’OA représente un enjeu économique et social majeur. Ce projet permettra de mettre en évidence l’importance du statut métabolique des cellules souches mésenchymateuses (MSC) in vivo pour le traitement de l’OA et de suivre le devenir des MSC injectées dans l’articulation. Ces travaux pourront, à long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques pour des essais cliniques chez le chien (animal présentant naturellement de l’OA comparable à l’Homme) puis chez l’Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux injections intra-articulaires de 5 µL de la molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage ou d'une solution saline pour les groupes « contrôle » dans le genou droit à deux jours d’intervalle. Puis, une semaine après, une partie des animaux recevront une injection de 8 µL de cellules dans ce même genou pour étudier leur effet thérapeutique. Ces injections dureront quelques secondes par animal et seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure.
Impact sur les animaux
Lors du développement de l’arthrose (OA), de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration (état dans lequel l’animal est inactif, immobile et en repli sur lui-même), s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Une infection pourrait intervenir au niveau du point d’injection de la collagénase puis des cellules. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué tel qu’un changement mineur, une boiterie, une mobilité réduite, …) seront attentivement observés afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.
Remplacement
L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial. L’ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d’une pathologie comme dans le cas de l’arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour lesquelles il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives et reproductibles entre les groupes. De précédentes études ont été réalisées pour le suivi de cellules marquées notamment après injection sous la peau. Ainsi nous n’utiliserons pas d’animaux pour la mise au point technique de la détection des cellules marquées. De plus, des études in vitro ont permis d’optimiser le protocole de standardisation des cellules souches adultes afin de limiter le nombre de groupes de souris lors de la procédure d’expérimentation animale.
Raffinement
De façon générale, un suivi quotidien par un personnel impliqué dans la procédure pendant la première semaine post-injection puis hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable = visite 3 fois / semaine, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage ; 2 signes notables = administration de analgésique ; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite) = euthanasie. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux (une fois tous les 10 jours). Le reste du temps, les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec de l’enrichissement du type frisottis et d’un dôme. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Pour le cas particulier des injections, les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure et sont suivies quotidiennement pendant les 3 premiers jours post-injection.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose (OA), plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autre part, elle permet la constitution de groupes d’animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques pertinents et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré la faisabilité du modèle et qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation permettant d’obtenir des résultants pertinents et reproductibles. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose (OA) est possible et documentée dans la littérature.
Caractérisation des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de l’ostéopathie induite par le méthotrexate (MTX) : évaluation des conséquences osseuses chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Tuées à la fin du projet pour que leurs os soient prélevés et leur microarchitecture analysée, 20 souris C57BL/6J vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit huit injections intrapéritonéales, une par semaine pendant huit semaines, de méthotrexate ou de solution saline. Le porteur affirme qu'aux doses employées la molécule n'est pas connue pour provoquer de toxicité et que les effets osseux attendus restent microarchitecturaux, sans fracture ni douleur, tout en présentant ce travail comme exploratoire. Il indique qu'un modèle in vivo semble "indispensable" pour évaluer les toxicités associées au sein d'un organisme vivant, alors que des modèles in vitro tournent en parallèle.
Objectifs
Préciser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de l’ostéopathie induite par le méthotrexate (MTX). Pour cela, ce travail a comme objectif d’évaluer les conséquences osseuses de l’injection de méthotrexate dans des modèles murins.
Bénéfices attendus
Les cas rapportés d’ostéopathie au MTX se multiplient ces dernières années. Ce travail a pour but d’avancer dans la compréhension de l’ostéopathie liée au MTX, afin de mieux identifier les sujets ou situations à risque et de proposer une thérapeutique adaptée. Les résultats viendront à l’appui de l’exploration clinique de la pathologie (recueil des cas français et européen).
Procédures
Un groupe traité par le méthotrexate par injection intra-péritonéale une fois par semaine pendant 8 semaines (3mg/kg) et un groupe qui reçoit une injection de solution saline (le véhicule) chez les souris contrôles. Injection intra-péritonéale de quelques secondes. Réalisation d’une injection toutes les semaines pendant 8 semaines, soit 8 injections.
Impact sur les animaux
Les souris des deux groupes vont bénéficier d’une injection intrapéritonéale toutes les semaines pendant 8 semaines, soit 8 injections. L’injection sera d’un volume de 200 µl afin de limiter au maximum les douleurs au point d’injection. Par ailleurs, aux doses utilisées dans ce protocole, le méthotrexate n’est pas connu pour induire de toxicité, pulmonaire ou hépatique. Au niveau osseux, ce travail est exploratoire mais les premières analyses sur d’anciens projets ne semblent pas entrainer de conséquences à type de fracture, plutôt des conséquences microarchitecturales, non responsables de fracture ou de douleurs osseuses.
Devenir
Impossibilité́ d’évaluation de la microarchitecture osseuse et des conséquences du traitement par méthotrexate par des mesures moins invasives. Nécessité d’une mise à mort à la fin du projet pour évaluation de la microarchitecture des prélèvements osseux.
Remplacement
Le projet scientifique porté intègre des modèles in vitro réalisés en parallèle, permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaire dans le cadre de ce projet. Pour autant, l’analyse de la microarchitecture osseuse et des conséquences du traitement par méthotrexate rend nécessaire l’utilisation de modèle in vivo. En effet, la toxicité osseuse induite par le méthotrexate semble avoir un effet dose mais aussi un effet dans le temps. De plus, l’utilisation d’un modèle in vivo semble indispensable pour évaluer les éventuelles toxicités associées au sein d’un organisme vivant, plus attendues avec ce traitement, comme la toxicité hépatique.
Réduction
Comme évoqué précédemment, le nombre d’animaux est réduit dans ce projet par l’utilisation de modèles in vitro en parallèle. La cohorte constituée de 20 souris sera répartie en 2 groupes expérimentaux (10 animaux/groupe) afin de caractériser les effets du méthotrexate sur la micro-architecture osseuse. La taille de l’échantillonnage de chaque groupe a été définie à partir d’un test statistique en considérant une variation de la moyenne de 7% (± 2%) de la fraction volumique de l’os tibial BV/TV (témoin de la densité osseuse) entre les 2 différents groupes comme significative (seuil de significativité à 0,05 et une puissance statistique fixée à 0,80). Ce chiffre doit correspondre à un échantillonnage de n=9/groupe. Nous gardons ainsi un animal de marge par groupe avec un n=10 pour prévenir un éventuel état de santé anormal pour un animal.
Raffinement
L'équipe appliquera un ensemble de démarches pour réduire au maximum le stress et la souffrance des souris utilisées dans ce projet. Les animaux seront hébergés dans des cages collectives (3 souris/cage), et enrichies avec de jouets et un tunnel. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire fait ressortir les signes visibles de douleur et d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procèderons à la sortie la souris du protocole par euthanasie.
Choix des espèces
La souris C57BL/6J répond tout à fait au questionnement soulevé par ce projet, car elle réprésente un bon modèle d’analyse dans les analyses de microarchitecture osseuse et permettra de comparer nos résultats avec les travaux de la littérature scientifique sur le sujet. Age de 8 semaines, afin de disposer d’une croissance du tissu osseux complète sans avoir des souris ayant débutées un vieillissement trop important. Cet âge permet ainsi de ne pas évaluer l’effet du méthotrexate sur la croissance et de limiter les effets du vieillissement sur le tissu osseux.
Entretien de lignées de souris avec une dystrophie musculaire
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris de cet élevage portent une dystrophie musculaire, une faiblesse et une dégénérescence progressives des muscles qui peuvent apparaître à partir de vingt mois. 1 015 vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, sans autre intervention que le développement spontané de la maladie. Le porteur reconnaît qu'une atteinte musculaire peut réduire leur mobilité et provoquer une douleur qu'il qualifie de modérée, alors que le projet est déclaré en souffrance légère. La plupart de ces souris seront transférées vers d'autres projets d'expérimentation, en "utilisation continue", les anciens reproducteurs étant tués quand leur fertilité baisse.
Objectifs
Des souris à phénotype dommageable sont nécessaires pour réaliser des projets de recherche : ces souris sont dystrophiques. Les dystrophies musculaires sont un groupe de maladies génétiques qui provoquent une faiblesse progressive et une perte de masse musculaire. Les recherches ciblent le muscle squelettique et en particulier la régénération musculaire. La lignée de souris dystrophique est essentielle pour pouvoir étudier la régénération musculaire dans sa globalité en condition pathologique et pour pouvoir mettre au point des stratégies thérapeutiques. L’objectif est donc la génération de lots de souris dystrophiques indispensables pour mener à bien les projets de recherche.
Bénéfices attendus
Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur la régénération musculaire dans les dystrophies musculaires chez l’homme, des maladies qui touchent le muscle et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. La régénération musculaire est un processus qui est altéré notamment dans la dystrophie musculaire de Duchenne (la dystrophie la plus fréquente des maladies neuromusculaires chez l’enfant qui affecte l’ensemble des muscles du corps et qui touche un garçon sur 3500 nés) et dans la dystrophie musculaire des ceintures (un groupe de maladies neuromusculaires qui touchent les muscles situés dans la région scapulaire et pelvienne).
Procédures
Les animaux peuvent développer un phénotype dommageable avec dystrophie musculaire, c'est à dire, une faiblesse et une dégénérescence progressive des muscles (à partir de 20 mois de vie). Il n'y aura pas d’autre intervention que le développement spontané du phénotype.
Impact sur les animaux
Si un phénotype se déclare, les animaux pourront avoir une atteinte musculaire légère pouvant induire une mobilité réduite et une douleur modérée.
Devenir
La grande majorité des animaux sera transférée pour expérimentation et affectée à d’autres demandes d’expérimentation animale (utilisation continue). Plusieurs projets sont déjà en cours, d’autres sont en cours d’écriture pour soumission au comité d’éthique et d’autres encore le seront dans l’avenir. Lorsqu'ils ne seront plus en mesure de contribuer efficacement à la reproduction en raison de leur âge avancé ou d'une fertilité réduite, les anciens reproducteurs seront euthanasiés.
Remplacement
Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires participant à la régénération musculaire et à la mise en place des pathologies musculaires. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier tous ces aspects.
Réduction
Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre de couples afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés. 1015 animaux maximum seront utilisés dans ce projet d'élevage sur une durée de 5 ans.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les animaux sont maintenus sous un statut sanitaire (exempte de pathogènes et d'opportunistes), tout le matériel est stérilisé par autoclavage (enrichissement, cages) et l'eau est osmosée. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Si un phénotype est observé, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.
Choix des espèces
Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire est la souris. Des animaux dystrophiques sont indispensables pour étudier le muscle in vivo dans un système pathologique. En élevage, les animaux seront en reproduction entre 2 et 12 mois de vie, pour favoriser la reproduction. Pour les projets, les animaux seront utilisés entre 2 et 18 mois de vie pour étudier la dystrophie musculaire.
Mise en place des vaisseaux sanguins et de l’hématopoïèse chez la souris au cours du développement embryonnaire et chez l’adulte
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Pour suivre l'origine des cellules souches du sang depuis l'embryon jusqu'à l'âge adulte, 440 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 380 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes reçoivent deux injections intrapéritonéales à 24 heures d'intervalle, vigiles et contenues, avant d'être tuées aux stades voulus pour prélever les embryons. D'autres subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie de vingt minutes, puis sont tuées pour récupérer fémur, rate et thymus. Le produit injecté peut rendre la mise bas difficile, et le porteur indique alors que la mère sera tuée et les embryons collectés.
Objectifs
Le projet consiste à étudier l’origine et la mise en place du système sanguin (vaisseaux et sang), et en particulier des cellules souches hématopoïétiques (CSH), au cours du développement embryonnaire, foetal, ainsi que son déploiement dans la moelle osseuse après la naissance. Cette approche nécessite l’utilisation de 2 types de souris transgéniques capables de marquer (par une protéine fluorescente) de façon indélébile certaines cellules embryonnaires cibles qui sont à l’origine des cellules des vaisseaux sanguins de l’embryon et suivre leur devenir. L’ensemble des connaissances acquises au cours de cette étude visent à mieux comprendre l’origine et la génération des CSH à partir des cellules des vaisseaux sanguins dérivés de cellules embryonnaires. Cette étude permettra de dégager des mécanismes de production des CSH et de les transposer à des systèmes de culture in vitro à des fins thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Il est critique de bien comprendre comment les cellules souches hématopoïétiques se forment au cours du développement normal. En effet, ces cellules sont d’une très grande importance en clinique car elles sont utilisées pour transplanter des patients atteints de maladie du sang. Bien connaitre leur mode de formation nous permettra de manipuler ces cellules à façon, par exemple de les générer en culture a des fins de transplantations. Dans cette étude nous voulons démontrer que certaines cellules endothéliales issues de cellules mésodermiques sont capables de générer des cellules souches hématopoïétiques sous certaines conditions (selon leur origine, leur localisation [foie foetal, moelle osseuse…]). Déterminer quels sont ces facteurs (origine cellulaire, contact avec d’autres cellules au cours du développement et en condition homéostatique) et caractériser (au niveau moléculaire) les étapes de formations des cellules souches hématopoïétiques nous permettra de manipuler cesdernières à des fins cliniques.
Procédures
Une partie des souris subiront une injection par voie intra-péritonéale 2 fois à 24h d'intervalle, les animaux seront vigiles au moment de l'injection, la contention et l'injection durent moins d'une minute. Ils seront ensuite euthanasiés aux différents stades requis pour le projet. Une autre partie sera anesthésiée pour effectuer un prélèvement de sang avant d'être euthanasiée. L'endormissement dure environ 20 minutes, le prélèvement sanguin 30 secondes.
Impact sur les animaux
Pour induire la recombinaison, les souris gestantes recevront à un stade précis une injection intrapéritonéale entrainant un stress lors de la contention et une douleur légère de courte durée au moment de l’introduction de l’aiguille. Le produit peut entrainer une difficulté de mise bas, ce qui peut entrainer une douleur à la femelle. Dans certains cas, nous serons amenés à faire des prélèvements sanguins (uniquement chez le jeune adulte/adulte) sous anesthésie générale avant euthanasie. Cette anesthésie peut induire un léger stress et dans de rare cas peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire
Devenir
Les femelles gestantes seront euthanasiées aux stades définis par le protocole expérimental afin d'analyser les embryons par des expériences immunohistologiques et de cytométrie en flux. Les souris ayant subi un prélèvement sanguin, seront euthanasiées afin de récupérer les organes hématopoïétiques (fémur, rate et thymus) pour analyse.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe aucun système de remplacement (autre que le modèle murin) permettant de suivre comment certaines cellules de l’embryon s’organisent pour former un organe ou un système biologique chez l’adulte. Pour notre étude, il nous est nécessaire d’utiliser des souris modifiées génétiquement afin de suivre le devenir de cellules spécifiques depuis le développement de l’embryon jusqu’au stade adulte pour comprendre en détail comment les vaisseaux sanguins et le sang se mettent en place
Réduction
Pour cette étude nous utiliserons 440 animaux. Nous utilisons des animaux transgéniques homozygotes ce qui nous permet de nous assurer que tous les embryons de la portée ont le même génotype et peuvent donc tous être analysés, ce qui réduit le nombre de femelles gestantes à induire. Le nombre de souris utilisées a été calculé au mieux pour limiter au maximum le nombre d'animaux tout en permettant d'avoir des analyses statistiquement correctes. Pour cela nous utiliserons des tests quantitatifs de comparaison de 2 échantillons indépendants.
Raffinement
Les souris sont placées dans des cages adaptées à leur nombre, ces cages seront enrichies par du matériel de nidification (sizzle-dri kraft). La nourriture et l'eau de boisson sont fournis ad libidum. Les cages des mâles isolés servant aux accouplements contrôlés seront enrichies en buchettes en bois. Les femelles gestantes qui auront été injectées seront observées quotidiennement selon l'évaluation des expressions faciales. Les souris pour lesquelles nous souhaitons une mise bas seront surveillées 2 fois par jour à l'approche du terme, si elle s'avère trop difficile la mère sera euthanasiée et les embryons collectés. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie générale (comportant une valence analgésique) avant euthanasie. Le projet comportera la mise en place de points limites définis.
Choix des espèces
A l’heure actuelle, il n’existe aucun système de remplacement (autre que le modèle murin) permettant de suivre comment certaines cellules de l’embryon s’organisent pour former un organe ou un système biologique chez l’adulte. Pour notre étude, il nous est nécessaire d’utiliser des souris modifiées génétiquement afin de suivre le devenir de cellules spécifiques depuis le développement de l’embryon jusqu’au stade adulte pour comprendre en détail comment les vaisseaux sanguins et le sang se mettent en place. Pour cela des femelles gestantes seront utilisées pour collecter les embryons à différents stades de développement, ce qui nous permettra d’étudier la mise en place des vaisseaux sanguins et du sang au cours du temps. Des souris jeunes adultes (6 semaines) et adultes (4mois) seront également analysées pour vérifier comment les cellules se maintiennent au cours du temps ou s'il y a un remodelage post-natal
Etude préclinique de correcteurs de mutations non sens dans un modèle murin porteurs d’une mutation non sens dans le gène codant pour la dystrophine
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 500 souris porteuses d'une mutation du gène de la dystrophine vont être utilisées, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse moléculaire. Elles sont gavées chaque jour pendant trente jours au maximum, opérées sous anesthésie générale pour la pose d'une pompe osmotique sous la peau du dos, ou piquées dans le muscle, puis évaluées sur leur force en courant dans une roue d'effort et en résistant à l'agrippement. L'objectif déclaré est de valider des molécules corrigeant les mutations non-sens, étape préclinique avant un éventuel essai chez l'humain dans la myopathie de Duchenne. Le porteur écrit veiller à ne pas porter atteinte aux "libertés individuelles" des souris, et décrit le gavage comme "a priori indolore puisque très souvent la souris positionne elle-même la sonde dans sa gorge".
Objectifs
Le projet vise à valider l'utilisation de petites molécules pour corriger des mutations non-sens dans différents modèles de maladies génétiques dont la myopathie de Duchenne. Une validation in vivo sur le petit animal de molécules avec un intérêt thérapeutique potentiel est nécessaire dans une étude préclinique avant de pouvoir envisager une étape d’essai clinique éventuelle.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier des molécules correctrices de mutations non-sens capables d'agir dans un organisme complexe comme la souris. Ce projet fait donc partie d'un développement pré-clinique d'éventuels futurs médicaments pour des personnes atteintes d'une maladie génétique comme la myopathie de Duchenne. L'étude préclinique de ce type de molécule et en particulier l'analyse chez le petit animal est une étape obligatoire avant de pouvoir éventuellement tester ces molécules chez l'Homme.
Procédures
Les animaux seront exposés à des molécules candidats médicament par trois voies qui seront testées successivement si la précédente ne conduit pas à la restauration de l'expression et de la fonction du gène DMD. Ces voies seront le gavage qui sera effectué quotidiennement pendant maximum 30 jours, l'exposition sous cutanée suite à une procédure chirurgicale conduisant à la pose d'une pompe osmotique qui se déroule sous anesthésie générale et qui n'est réalisé qu'une seule fois pour un animal donné. La troisème voie d'exposition qui sera explorée est l'injection intra-musculaire qui sera réalisée sous anesthésie. Toutes ces voies d'exposition s'accompagneront d'une mesure de la force musculaire (course dans une roue d'effort et résistance à l'aggripement).
Impact sur les animaux
Ce projet a pour but de valider l’utilisation de nouvelles molécules comme éventuel candidat médicament. Bien que des tests de toxicité auront été effectués au préalable sur culture cellulaire, l’effet de ces molécules sur un organisme entier doit être évalué. Pour cela, nous veillerons à ce que ces molécules ne portent pas atteinte aux libertés individuelles de l’animal définies comme étant l’absence de faim, de soif et de malnutrition, l’absence de peur et de détresse, l’absence de stress physique et/ou thermique, l’absence de douleur, de lésions et de maladie ainsi que la liberté d'expression d'un comportement normal de son espèce. Cette observation servira à détecter une nuisance sur du long terme d'exposition à la molécule étudiée. Concernant les procédures qui seront utilisées : 1) le gavage : il s'agit d'un geste rapide a priori indolore puisque très souvent la souris positionne elle-même la sonde dans sa gorge, et qui n'entraine aucune atteinte aux libertés individuelles de l'animal. Il s'agit d'une procédure légère 2) la pompe osmotique : la pose de la pompe se fait sous anesthésie générale puis la gestion de la douleur post-opératoire par l'utilisation d'analgésique. Les autres libertés individuelles ne seront pas affectées par la procédure car la pompe est placée sous la peau dans le dos n'impactant pas le déplacement de l'animal et donc son alimentation par exemple. Cette procédure est classée modérée 3) l'injection intra-musculaire se fera sur animal endormi à l'isoflurane supprimant ainsi tout stress lié à cette procédure qui est rapide et dont la douleur correspond à une piqure d'aiguille. Il s'agit d'une procédure modérée.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de procéder à une analyse moléculaire de l'expression du gène DMD codant pour la dystrophine.
Remplacement
Ce projet est en conformité avec les exigences de remplacement puisque l'étude in vivo sur des modèles animaux est indispensable avant le passage éventuel de molécules à visée thérapeutique vers des essais cliniques.
Réduction
Le projet est conforme aux exigences de réduction puisqu'une phase exploratoire avec un nombre réduit d'animaux par lot (lot de 5) sera effectuée afin d'identifier la voie d'exposition, la concentration et la cinétique d'action de la molécule étudiée et ce afin d'abaisser au minimum le nombre d'animaux qui seront ensuite utilisés pour la démonstration de l'efficacité d'action de la molécule in vivo. Ce nombre sera de 40 ce qui correspondra à deux séries d'expériences avec 10 animaux par condition (avec et sans la molécule). La répétition de l'expérience est nécessaire pour s'affranchir d'un éventuel effet biaisé lié à la préparation de la molécule, au lot d'animaux ou à un stress survenu pendant l'expérience. Le nombre de 10 animaux par condition et par série afin de pouvoir réaliser ensuite un test statistique utilisé dans les expériences permettant d'évaluer l'efficacité d'un traitement.
Raffinement
Enfin, concernant le raffinement, l'expérience sera toujours menée de façon à prévenir ou à réduire au maximum toute souffrance. Ainsi, la voie d'exposition efficace la moins invasive sera privilégiée (le gavage par rapport à la pose d'une pompe osmotique par exemple) et une anesthésie sera effectuée lorsque cela est compatible avec l'expérience.
Choix des espèces
La souris présente l'avantage d'avoir un mécanisme de reconnaissance des codons stop prématurés semblables à celui de l'Homme (mécanisme de nonsense-mediated mRNA decay (NMD). La souris à un cycle de vie compatible avec le test in vivo sur plusieurs semaines de molécules à visées thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage et jusqu'à 5 mois après la naissance car c'est pendant cette fenêtre de temps que nous pouvons observer le mieux l'expression de la dystrophine.