Système musculosquelettique

264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit cinq injections intrapéritonéales, subit une incision de 2,5 cm dans le muscle de la patte et un prélèvement de 100 mg créant une perte musculaire d'environ 20%, avant qu'un hydrogel expérimental ne soit déposé dans la plaie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut se substituer aux animaux et qu'un modèle physiologique est "nécessaire" pour valider la preuve de concept. Les retombées annoncées pour des personnes blessées, militaires et accidentés, restent renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant de caractériser les hydrogels sur la cicatrisation.

Objectifs

L’ingénierie tissulaire se base sur l’utilisation de biomatériaux reproduisant la matrice extracellulaire native en fournissant un support aux cellules et à la formation de nouveaux tissus. Les biomatériaux peuvent orienter les phénotypes cellulaires et guider la régénération de tissus fonctionnels à travers des propriétés mécaniques modulables. Ils sont donc de plus en plus étudiés comme nouvelle stratégie de régénération des tissus et organes lésés. Parmi ces biomatériaux, les hydrogels, sont des réseaux tridimensionnels de polymères hydrophiles. Leurs capacités d’hydratation et leurs propriétés mécaniques ajustables en font des biomatériaux attractifs. Si l’utilisation potentielle d’hydrogels comme supports de la régénération musculaire est étudiée de façon croissante, des difficultés persistent en regard de la qualité et fonctionnalité du tissu formé. De fait, peu d’études montrent l’obtention d’un muscle fonctionnel – permettant la contraction – suite à une plaie volumétrique. La régénération du muscle est basée sur la prolifération et la différentiation de cellules souches musculaire qui une fois activées par l’inflammation liée à la création de la plaie, peuvent coloniser la plaie et reconstruire les fibres musculaires endommagées. La bonne cicatrisation repose sur une coordination efficace de tous les acteurs cellulaires impliqués afin de retrouver l’homéostasie du tissu. Les plaies profondes graves entraînant une perte musculaire volumétrique significative provoque donc une altération fonctionnelle permanente et handicapante. Les conséquences pour les personnes affectées (militaires, accidentés, victimes) sont très importantes et il n’existe actuellement aucune solution clinique permettant de restaurer la fonctionnalité des tissus lésés. C’est dans ce contexte que ce projet s’intéresse à la régénération structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique en cas de lésion en utilisant des hydrogels injectable et poreux innovants.

Bénéfices attendus

Cette approche permettra d’identifier des biomatériaux à utiliser à des fins biomédicales. Une fois implantés au niveau du tissu musculaire lésé, nous déterminerons si ces hydrogels sont capables de mimer l’environnement cellulaire, améliorant ainsi la réparation fonctionnelle des tissus et organes, en particulier le tissu musculaire.

Procédures

5 injections intrapéritonéales (traitement anti-douleur et anesthésie), sous anesthésie; incision de 2.5 cm dans le muscle qui loge le tibia et prelevement de 100mg de muscle et enfin traiter cette plaie à l'aide des hydrogels à tester.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation réalisée pourra entraîner des douleurs localisées au niveau de la zone d’implantation et une plaie volumétrique d’environ 20% pourra potentiellement créer dans un 1er temps (la 1ere semaine) une gêne pour marcher/se déplacer. Les dommages de types lésions musculaires sont souvent accompagnés d’une inflammation passagère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser la zone d'implantation de l’hydrogel.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour la réalisation de ce projet car la régénération du muscle repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et les systèmes immunitaires et vasculaires ainsi que sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de la biocompatibilité des hydrogels pour les cellules musculaires ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle physiologique complexe est nécessaire pour permettre d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Réduction

Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 7 rats par groupe et par temps est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Elle constitue en soi une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée. La présence dans les 2 premiers bras de la procédure d'étapes d'évaluations décisionnelles engageant la poursuite de la procédure, nous permettra aussi de réduire le plus possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Avant le début de chaque procédure, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement pendant 1 semaine suivant la procédure expérimentale. La mise en place d’une grille de score (incluant la mobilité de l’animal, sa prostration ainsi que son niveau d’interaction sociale) et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée au moins 4 fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal et du poids corporel deux fois par semaine Une attention particulière sera portée au comportement moteur, l’activité, l’accès à la nourriture et à l’eau et à l’intégrité du pansement. Suite à la procédure de chirurgie, les animaux seront surveillés régulièrement (4 fois par semaine) afin d’identifier l’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou un stress néfaste. Les fils de suture non résorbables seront retirés au bout de trois semaines tandis que l’intégrité du pansement sera monitorée à chaque observation. Si un animal a retiré son pansement, la plaie sera désinfectée et un nouveau pansement mis en place. Les cages seront enrichies avec de la nourriture humide au cours de la première semaine post-opératoire, pour prendre en compte les difficultés éventuelles de mobilité. Leur ajout sera constamment ré-évalué au cours de la surveillance dans les semaines suivantes. De même, des analgésiques locaux seront appliqués aux abords de la plaie chirurgicale juste avant la suture et en cas de signe de douleur et/ou si le pansement a été retiré (lidocaïne 5mg/kg, 1-2 ml).

Choix des espèces

Etude basée sur un modèle de perte volumétrique musculaire standardisée chez le rat [1]. De plus, pour cette étude, il est nécessaire d’avoir un muscle permettant la mise en place d’un défaut pouvant accueillir un volume d’au moins 100µL pour que le système d’injection soit opérant (tests déjà réalisés sur rats mis à mort pour la standardisation de la procédure). [1]X. Wu, B. T. Corona, X. Chen, and T. J. Walters, “A Standardized Rat Model of Volumetric Muscle Loss Injury for the Development of Tissue Engineering Therapies,” Biores. Open Access, vol. 1, no. 6, pp. 280–290, 2012. L’objectif du travail étant d’observer l’effet de biomatériaux dans les processus de cicatrisation, les rats utilisés dans le cadre de ce protocole seront âgés de 2 mois (Jeunes adultes) en début de protocole. Sexuellement mature pour les males (65-110jours) Sprague Dawley or Wistar (ceux qui sont préconisés pour aspect chirurgicaux). Les temps d’implantations ont été choisis pour caractérisation du tissu à 3 moments clés de la cicatrisation : - 3 semaines : fin de l’inflammation aigue et différentiation des cellules satellites en cours - 6 semaines : possibilité de quantification du nombre de fibres musculaires au sein de l’hydrogel - 3 mois : Validation du bon remodelage de la plaie.

64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose quatre biomatériaux sous la peau par chirurgie, avec un suivi au microscanner toutes les deux semaines pendant deux mois, pour tester un nouveau support destiné à la régénération osseuse. Le porteur n'attend comme seul effet indésirable qu'une réaction inflammatoire qu'il juge "peu probable". Le résumé décrit le réveil des rats après l'opération sans indiquer leur sort final, que le tableau du RNT classe pourtant comme une mise à mort, cohérente avec l'analyse des implants.

Objectifs

La consolidation des pertes de substance osseuses lors des reconstructions osseuses représente un problème majeur dans les domaines de la chirurgie orthopédique, de la traumatologie et de la chirurgie maxillo-faciale. Ces troubles peuvent nécessiter l’utilisation d’une greffe osseuse afin d'obtenir une consolidation osseuse. Bien que la greffe osseuse soit toujours considérée comme la référence pour les reconstructions osseuses, elle est associée à un taux important de complication au niveau du site de prelevement de la greffe. En outre, les quantités d'os disponibles pour un seul patient sont limitées. Par conséquent, les substituts osseux ayant une composition aussi proche que possible de celle de l'os natif offrent des alternatives intéressantes. Parmi eux, l'allogreffe ainsi que les céramiques représentent les substituts osseux les plus utilisés. Outre la greffe osseuse ou les substituts osseux, l'un des moyens les plus efficaces pour améliorer la formation et la reconstruction osseuses est la thérapie protéique, qui consiste en l'application locale de facteurs de croissance favorisant la production osseuse, tels que les protéines morphogéniques osseuses (BMP). Actuellement, la BMP-2 et la BMP-7 sont utilisées en pratique clinique et ont donné des résultats prometteurs. Ces BMP ont besoin d’un support afin d’être déposé sur le site chirurgical. Les supports utilisés aujourd’hui sont des éponges ou des pâtes de collagène. Néanmoins, la BMP a une faible faible affinité pour le collagène, ce qui nécessite des doses très importantes de BMP entrainant un risque de complication plus important et un coût beaucoup plus élevés. Dès lors, afin d'augmenter les applications cliniques de la BMP, il est indispensable de disposer de différents types de supports présentant une forte affinité pour le BMP. Le but de cette étude, est l’étude d’un nouveau support pour la BMP.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre de montrer que le film réticulé avec et sans BMP2 est biocompatible et n'est pas à l'origine de phénomènes locaux ou systémiques néfastes pour la santé du receveur et d'autre part que les tissus du receveur ne sont pas susceptibles d'altérer le matériau au détriment de ses qualités intrinsèques ou au risque de générer des produits de dégradation toxiques. Cette étude servira donc à prouver l'absence vraisemblable d'effet délétère du film et de la BMP2, et d'autre part, accumuler des données prédictives du comportement in vivo du matériau.

Procédures

1 seule procédure sera réalisée sur les 64 rats : - Mise en place de 4 implants en sous cutanés (4 incisions). Fermeture de la plaie à l’aide d’un surjet intradermique avec un monofilament 4-0 (polyglecaprone 25). L’intervention durera 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les seules nuisances ou effets indésirables de cette étude sur les animaux seraient une réaction inflammatoire anormale ce qui semble peu probable au vu des tests préalables.

Devenir

A l’issue de l’intervention chirurgicale d’implantation, les rats seront reveillés dans une cage à induction chauffée et seront ensuite remis avec ses congénères une fois réveillé.

Remplacement

De nombreux modèles in vitro ont été mis en place pour étudier la dégradation d’un matériel. Cependant, les interactions matériel-hôtes sont importantes et nécessitent une étude in vivo. Les données manquantes sur les propriétés anti-inflammatoires, sur la biocompatibilité et la dégradation de matériel ne peuvent être menées que sur l’animal entier vivant : la réaction inflammatoire et hémodynamique sont des processus vivants et dynamiques, mettant en jeu des mécanismes complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro. Lorsque les mécanismes biologiques entrent en jeu dans le processus inflammatoire de dégradation, on ne peut vérifier la biocompatibilité que dans un organisme vivant.

Réduction

Des études in vitro ont été menée au préalable afin de sélectionner les formulations d’implants les plus intéressantes à tester in vivo pour réduire au maximum le nombre de tests et le nombre d’animaux. De plus des études bibliographiques ont été menées afin de choisir au mieux le modèle animal et le matériaux contrôles. Afin de réduire le nombre d’animaux, les mêmes animaux seront utilisés pour l’étude de biocompatibilité et l’étude de biodégradation du film.

Raffinement

64 rats seront inclus dans l’étude. Tout le projet sera conduit dans des locaux agrées, avec du personnel dédié et expérimenté. Un protocole précis de prémédication, d’analgésie, d’anesthésie est mis en place. Les rats auront une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant l’implantation. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnée, avec eau et alimentation ad libitum, dans des conditions de température et d’hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. L’injection d’hydrogel sera réalisé sous anesthésie générale avec analgésie préopératoire et post-opératoire par un vétérinaire. Les animaux seront observés quotidiennement : état général, alimentation, abreuvement, nettoyage, respiration, morbidité et mortalité. En cas d’animal considéré comme anormal, la personne en charge des observations : -manipulera l’animal pour confirmer ou infirmer cet état -Toutes anomalies cliniques seront signalées au vétérinaire pour un examen clinique complet si nécessaire. La douleur et le bien-être sont évalués selon des paramètres précis. En cas de signe de douleur importante, des antalgiques seront administrés jusqu’à disparition des signes. Si une souffrance et/ou une détresse de l’animal est mise en évidence, des mesures seront directement mise en place : fin de la procédure, traitement afin de soulager la souffrance. Les animaux seront hébergés en cage collective, dans un milieu enrichi avec des maisonnettes, de la paille, du coton et des bois à ronger. Différents enrichissements seront proposés en alternance pour introduire de la nouveauté.

Choix des espèces

Le rat est un modèle couramment utilisé pour évaluer l'inflammation et pour étudier le délai de dégradation et l'effet de différentes modalités de traitement. L’évaluation de la dégradation au contact du tissu hôte est primordial dans l’étude des biomatériaux. Cette évaluation a été traditionnellement réalisée dans des modèles d'implantations sous-cutanées, intrapéritonéales et intramusculaires chez les rongeurs (souris et rats). Les modèles murins sous-cutanés, intramusculaires et intrapéritonéaux sont des outils utiles pour évaluer l'effet des médiateurs anti-inflammatoires et inflammatoires. Quelle que soit l'application finale prévue des biomatériaux, les modèles d'implantation sous-cutanée et intramusculaire offrent des informations sur l'effet direct du biomatériau au niveau du site d'implantation. L'application clinique finale étant une implantation osseuse, l'implantation sous cutanée est choisie. Les implants seront insérés dans le tissu sous cutané de rats adultes, conformément aux dispositions de la norme ISO 10993-2. Pour plusieurs de ces raisons, nous avons choisi d'utiliser des rats comme modèle pour réaliser l'étude de dégradation et de biocompatibilité du film enrichi en BMP-2.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de nanoparticules d'ARN messager par voie intraveineuse ou intramusculaire, suivies d'une imagerie de bioluminescence, pour optimiser des formulations vaccinales. Le porteur indique n'attendre d'autre douleur que celle liée à l'aiguille et suivre les animaux par une grille de points limites. Il affirme que des études sur "l'animal entier" restent nécessaires et qu'aucune méthode de remplacement fiable n'est disponible.

Objectifs

Les différents vaccins contre le COVID ont montré que la technologie de vaccination ARNm permet une réponse rapide à un nouveau pathogène. Ces vaccins (Moderna, Pfizer, Curevac) sont administrés sous forme de nanoparticules lipidiques (LNP) par voie intramusculaire et induisent une réponse immune protectrice. De nombreux essais cliniques utilisent des vaccins LNP ARNm avec des résultats prometeurs contr ede nombreux cancers solides. De plus, de bons résultats précliniques ont été démontrés pour la régénération tissulaire après administration locale d'ARNm codant des gènes de morphogénèse. Notre projet vise donc à optimiser à la fois la séquence des ARNm et leur mode de délivrance pour maximiser leur expression in vivo. Ce projet vise à mettre au point des vaccins à base de nanoparticules d’ARNm en testant différents types de nanoparticules et différentes séquences ARNm développés au laboratoire. Le projet comporte deux étapes: une première étape d'injection des complexes ARNm et une deuxième étape d'injection du substrat et d'imagerie non-invasive de bioluminescence. Les applications thérapeutiques sont la vaccination anticancéreuse et la régénération tissulaire. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous allons évaluer différentes formulations de LNP et séquences d’ARNm pour maximiser l’expression de l’ARNm après injection intraveineuse ou intramusculaire chez la souris. L’expression des ARNm sera évaluée par imagerie non-invasive de bioluminescence. Nos travaux seront menés dans le respect de la règle des 3R : l’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Des expériences in cellulo ont montré que les nanoparticules de types LNP sont capables de transfecter des cellules musculaires ou des cellules dendritiques avec l’ARNm. Les travaux chez le modèle animal sont dans la continuité de ces résultats.

Procédures

aucun prélèvement ni chirurgie ne sont prévus

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l'injection des formulations, mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille. Nous prendrons en compte la douleur générée par les injections intramusculaires. Nous suivrons les animaux avec une grille de scoring présentant des points limites prédictifs liés à la douleur et à la désiorientation.

Devenir

les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure

Remplacement

L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.

Réduction

Réduction: l’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

les méthodes utilisées seront mises en œuvre par du personnel formé (niveau chirurgie) et les points limites sont validés par le comité éthique local. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive chez la souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

204 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur inocule dans le tibia une bactérie Gram-négatif multirésistante, puis on leur administre des antibiotiques deux à trois fois par jour pendant sept jours avant une mise à mort à J24 pour disséquer la patte infectée. Le porteur indique que l'ostéomyélite provoque une douleur justifiant un traitement antalgique dès l'inoculation. Il affirme que ces modèles apportent des données "indispensables" et vise notamment à appuyer l'autorisation de mise sur le marché de l'antibiotique Ceftazidime-avibactam.

Objectifs

Dans ce travail nous évaluerons l’efficacité des antibiotiques seuls et en association dans un modèle d’infection ostéo-articulaire à bacilles Gram-négatif (BGN), bactéries de plus en plus fréquemment en cause en pathologie humaine. Ce modèle permettra d’évaluer l’histoire naturelle des ostéomyélites à BGN résistants aux antibiotiques (infections à germes multi résistants de plus en plus fréquemment rencontrées en raison de l’augmentation importante de la résistance aux antibiotiques dans le monde), et l’efficacité des traitements, ce qui n’a jamais été abordé dans ce type d’infection complexe. Trouver le meilleur traitement efficace, permettra en modèle chez l’homme de débuter de façon empirique un traitement antibiotique optimal avec la plus grande chance de succès thérapeutique pour une infection réputée difficile à traiter.

Bénéfices attendus

Les modèles expérimentaux apportent des informations indispensables pour l’utilisation optimale des antibiotiques et le traitement des infections bactériennes chez l’homme. Les modèles expérimentaux sont particulièrement utiles pour évaluer l’impact d’un mécanisme de résistance sur l’activité d’une antibiothérapie en termes d’effet bactéricide et de sélection de mutants résistants. Les données expérimentales peuvent, par ailleurs, servir de base aux recommandations de traitement des sociétés savantes, notamment quand les données cliniques manquent comme c’est le cas pour les ostéomyélites à bactéries Gram négatif (BGN). Notre travail sur l’antibiotique Ceftazidime-avibactam permettra également de donner des données solides pour l’approbation de son indication dans le traitement de l’ostéomyélite (AMM).

Procédures

Pour tous les animaux, inoculation localement dans le tibia d’une souche de bactérie type BGN multi-résistant sous cédation par Ketamine/Xylazine durant 30 minutes par animal, 1 jour donné. Pour tous les animaux, réalisation d’un prélèvement de 0,3 ml de sang après désinfection cutanée, à partir de la veine marginale de l’oreille à J1 et J24 pour la réalisation d’hémoculture sur animaux vigiles. Injection antibiotique sur animaux vigiles durant 7 jours 2 à 3 fois par jour en injection SC ou 1 fois en IM selon l’antibiotique pour tous les an

Impact sur les animaux

L’osteomyélite induite du tibia génère une douleur qui justifie un traitement antalgique dès l’innoculation initiale. Des signes neurologiques, des difficultés respiratoires pourraient être observés en cas d'extension de l'infection depuis le tibia. Des diarrhées sont possibles en lien avec l'administration d'antibotiques.

Devenir

Pour tous les animaux, mise à mort de tous les animaux par injection létale (de pentobarbital) puis dissection de la pate entière infectée de chaque lapin en fin de traitement (à J24).

Remplacement

Les modèles expérimentaux apportent des informations indispensables pour une utilisation optimale des antibiotiques et le traitement des infections bactériennes complexes. Les modèles expérimentaux sont particulièrement utiles pour évaluer l’impact d’un mécanisme de résistance sur l’activité d’une antibiothérapie en termes d’effet bactéricide et de sélection de mutants résistants. Les données expérimentales peuvent, par ailleurs, servir de base aux recommandations de traitement des sociétés savantes, notamment quand les données cliniques manquent comme c’est le cas pour les ostéomyélites à bactéries Gram négatif (BGN), en particulier BGN multirésistants.

Réduction

Douze animaux sont utilisés dans chaque groupe de traitement. Onze animaux par groupes permettent de mettre en évidence une différence de 50% entre les groupes avec une puissance de 80% et un risque de première espèce a de 5%, tout en considérant le risque de décès prématuré, soit 12 lapins dans chaque groupe. Ce nombre est le nombre minimal pour pouvoir interpréter les résultats, compte tenu de la variabilité inter-individuelle. Une analyse statistique non paramétrique par tests Mann-Whitney et Kruskal–Wallis, déjà utilisée dans nos travaux antérieurs compte-tenu du faible effectif (n

Raffinement

- La surveillance est particulièrement renforcée dans les 24 heures suivant l’inoculation de la bactérie où l’animal peut-être transitoirement géné par la procédure. - De notre expérience cette expérimentation est bien vécue par les animaux avec de façon exceptionnelle de rares animaux qui peuvent présenter une douleur résiduelle au niveau de la pate infectée. En effet, la procédure antalgique permet de couvrir largement la période douloureuse et permet une phase longue d’observation avant la suite de la procédure avec un délai entre l’expérimentation (inoculation) et la mise en place du traitement antibiotique 14 jours plus tard.

Choix des espèces

Le modèle d’infection sur prothèse ou d’ostéomyélite chez le lapin est facile à réaliser et il mime de façon très proche l’infection humaine. Ce modèle a déjà été évalué dans de multiples études, et dans nos travaux antérieurs déjà publiés. Jeunes adultes (12 à 14 semaines pour des raisons de croissance osseuse)

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles subissent une chirurgie de 25 minutes avec incision de la peau et exposition répétée du muscle au froid, sur chaque patte antérieure, avant d'être tuées pour prélèvements. Le porteur étudie le rôle de la protéine PARP3 dans la régénération musculaire, à partir de résultats déjà obtenus in vitro. Il présente la validation in vivo chez la souris comme nécessaire et renvoie les molécules thérapeutiques au 'plus long terme'.

Objectifs

Le projet concerne l’étude de PARP3 (i.e Poly(ADP-ribose) polymérase 3), une protéine qui joue un rôle déterminant dans la réparation des cassures dans l’ADN. Des expériences réalisées avec des modèles cellulaires révèlent un rôle important de cette protéine dans la différenciation de cellules souches musculaires en myotubes, un évênement clé de la régénération musculaire qui permet de réparer un muscle endommagé. Les objectifs du projet sont de vérifier ce rôle in vivo chez la souris.

Bénéfices attendus

La régénération musculaire est altérée dans plusieurs pathologies musculaires comme la dystrophie musculaire. De plus chez un sujet sain, la capacité de régénération musculaire diminue au cours du vieillissement. Notre projet qui vise à comprendre comment la protéine PARP3 intervient dans la régénération musculaire, va permettre à plus long terme de concevoir des molécules thérapeutiques agissant sur PARP3 pour activer la régénération musculaire.

Procédures

Les souris anesthésiées sont soumises à une procédure chirurgicale qui implique une incision de la peau du Tibialis antérieur, une exposition répétées du muscle squelettique au froid (3X). La plaie est ensuite suturée avec une colle chirurgicale. Au total, les animaux subissent une chirurgie d’une durée de 25 minutes qui est réalisée sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

La procédure mise en oeuvre conduit à une plaie suturée sur chaque patte antérieure de l’animal qui cicatrise en moins de 24h. Une nécrose du tissu musculaire ne peut pas être écartée mais est un évênement rare.

Devenir

Les souris sont mises à mort après la chirurgie pour prélèvements.

Remplacement

Des expériences préliminaires réalisées in vitro avec des modèles cellulaires ont permis d’identifier une protéine appelée PARP3 dans la régénération musculaire. La validation de ces résultats nécessite des approches in vivo chez la souris. La procédure que nous proposons est classiquement utilisée dans le domaine.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux nécessaire à ces approches in vivo a été très précisément réfléchi. Les questions in vivo entreprises dans ce projet reposent sur des données in vitro déjà bien caractérisées. Il ne s’agit donc pas d’une étude exploratoire chez la souris mais de la validation in vivo d’un résultat existant. Le nombre d’animaux indiqué est calculé sur la base d’une validation statistique. Pour réduire le nombre d’animaux, des groupes de 6 souris seront utilisées pour chaque condition expérimentale permettant des études statistiques précises. Nous effectuerons d’abord une première série d’expériences (1 replicat) et analyserons toutes les données avant de réaliser le 2ième replicat. Celui-ci ne sera réalisé que si des résultats pertinents sont observés avec le premier replicat.

Raffinement

La procédure est réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux peuvent être maintenus en groupe et un enrichissement des cages est mis en place (papier kleenex pour nidification, bâtonnets de bois, rouleau en carton). Des points limites précoces et sur le temps de la procédure ont été définis, une grille de score a été établie avec des actions à mener permettant de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus pertinent pour ce projet en raison des similitudes décrites dans la littérature entre les pathologies musculaires de la souris et celles de l’homme. De plus, ce projet repose sur l’utilisation de souris déficientes en PARP3 générées au laboratoire. Des jeunes adultes (6-8 sem) et souris âgées (12/18 mois) sont utilisées pour évaluer l'impact du vieillissement.

28 rats vont être utilisés, tous tués à cinquante-six jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une section chirurgicale du ligament croisé du genou provoque une arthrose, puis huit injections de cannabidiol sont faites dans l'articulation, la douleur ne pouvant être soulagée par anti-inflammatoires sous peine de fausser le modèle. L'objet est de tester si le cannabidiol freine les lésions arthrosiques, dans le contexte d'une consommation croissante par les patients. Le porteur affirme qu'aucune méthode in silico ne reproduit ces lésions et juge le modèle rat "indispensable".

Objectifs

L'arthrose est la maladie articulaire la plus répandue. Actuellement en France, 10 millions de personnes souffrent de cette pathologie. L'arthrose est une maladie complexe et sevère qui altère fortement la qualité de vie des patients. Elle se caractérise par une destruction du cartilage qui s'étend à toutes les structures de l'articulation, notamment à l'os et au tissu synovial. À ce jour, il n'existe que des traitements qui visent à soulager la douleur. Face aux douleurs liées à l'arthrose, de plus en plus de patients consomment ou sont tentés de consommer soit du cannabis ou des cannabinoïdes. Plusieurs études cliniques sont en cours concernant la consommation des cannabinoïdes dans les douleurs liées à l'arthrose notamment au Canada et aux États-Unis. En revanche, malgré le nombre important de produits qui apparaissent sur le marché avec différents modes d'administration, leur potentielle efficacité sur les lésions du cartilage n'est pas encore évaluée. Seules des études in vitro ont montré que le système endocannabinoïde est capable de jouer un rôle dans l'arthrose et que les récepteurs aux endocannabinoïdes sont exprimés au sein de l'articulation (cartilage et membrane synoviale). Dans une nécessité d'améliorer les données in vivo sur le rôle des cannabinoïdes dans l'arthrose et leur potentielle utilisation dans le traitement des lésions arthrosiques, nous souhaitons donc étudier l'impact du cannabidiol sur le cartilage sain et sur les lésions du cartilage observées au cours de l'arthrose chez le rat mais également sur le degré d'inflammation de la membrane synoviale. Pour l'exploration de cette nouvelle piste thérapeutique, nous souhaitons injecter directement du cannabidiol dans l'articulation afin de cibler les lésions articulaires et de limiter par ailleurs la diffusion dans l'organisme, chez des rats ayant subi une section du ligament croisé antérieur. La section du ligament croisé antérieur chez le rat est un modèle d'arthrose très utilisé puisqu'il présente les mêmes signes cliniques que ceux observés dans l'arthrose humaine.

Bénéfices attendus

L'arthrose du genou (OA) est un problème majeur de santé publique à travers le monde. Des études basées sur la population révèlent que l'arthrose symptomatique du genou est présente dans 20 à 30% de la population âgée de plus de 65 ans et sa prévalence augmente en partie à cause du vieillissement de la population. En ciblant le système endocannabinoïde dans la pathologie arthrosique, l'injection intra-articulaire de cannabidiol pourrait donc permettre de soulager les patients mais également de retarder l'évolution des lésions arthrosiques, évitant ou retardant la mise en place d'une prothèse (seule technique thérapeutique efficace pour le moment).

Procédures

Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale à J0 d'une durée d'environ 20 minutes qui sera réalisée sous anesthésie gazeuse générale. Pour minimiser la douleur post-opératoire, les rats seront traités par un antidouleur une heure avant l'intervention chirugicale. Durant cette procédure chirurgicale, la section du ligament croisé le ligament croisé antérieur sera sectionné afin d'induire une arhrose expérimentale par instabilité. La section sera vérifiée par un mouvement sépcifique de genou (présence d'un tiroir). Le plan musculaire et le plan cutané seront ensuite suturés. Les rats seront ensuite placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Ils seront ensuite replacés dans leur cage par groupe de 3 ou 4. Ils seront également surveillés de façon assidue pendant les 48 heures qui suivent l'opération. Tous les animaux subiront ensuite 8 injections intra-articulaires à J3, J7, J14, J21, J28, J35, J42 et J49 de CBD après l'opération chirurgicale d'une durée de moins d'une minute chacune. Les injections intra-articulaires réalisées sous anesthésie générale d'excipient ou de CBD dont la compositon et la dose ont été choisies sur la base de la littérature (dose antalgique chez le rat), n'induisent pas de douleur "post-injection".

Impact sur les animaux

Ce modèle d'arthrose expérimentale par section du ligament croisé est un modèle très connu et parfaitement maïtrisé par les personnes en charge de la réalisation des procédures expérimentales et tout particulièrement en termes de douleur. La douleur engendrée ne peut cependant pas être prise en charge par des anti-inflammatoires car ces molécules auraient une influence sur l'inflammation et l'apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans notre modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont donc une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale suite à la chirurgie puis liée au développement de la pathologie arthrosique. Enfin la dernière nuisance considérée comme légère concerne les anesthésies gazeuses à l’isoflurane hebdomadaires pour la réalisation des 8 injections intra- articulaires. La dose de CDB utilisée est la dose antalgique décrite dans la littérature et n'engendre donc aucune douleur.

Devenir

À la fin de l'étude, les rats seront mis à mort selon la méthode réglementaire, 56 jours après l'induction du modèle d'arthrose expérimentale. Chaque genou (droit et gauche) sera prélevé afin de réaliser les études macroscopiques, histologiques et immunohistologiques pour évaluer les lésions articulaires et osseuse à l'aide de scores quantitatifs en comparaison avec le cartilage natif du genou controlateral. La membrane synoviale sera également prélevée pour l'analyse du degré d'inflammation en histologie, en immunohistochimie.

Remplacement

Face à la consommation absolument non cadrée de cannabidiol par les personnes souffrant d'arthrose et afin d'étudier l'impact de la prise de molécules sur les tissus abarticulaires et de tester également leur efficacité dans le traitement de l'arthrose (atteintes des tissus cartilagineux et degré d'inflammation de la membrane synoviale), des études pré-cliniques sont requises pour évaluer l'impact de cette substance sur les tissus et sur l'évolution des lésions. Il n'existe pas de méthode "in silico" permettant de remplacer un organisme vivant pour obtenir un modèle de lésions diffuses qui reproduit les lésions arthrosiques observées chez l'homme. En effet, ce modèle animal est indispensable pour évaluer l'impact de la prise de ce produit dans un modèle d'arthrose expérimentale chez le rat.

Réduction

Dans un souci d'éthique, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum et est nécessaire et suffisant pour les études statistiques. De plus, seul le côté droit sera opéré de façon à préserver le genou gauche comme témoin. Tous les scores histologiques seront réalisés en double aveugle avec moins de 5% d'erreurs entre les deux observateurs expérimentés.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 3 ou 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce, en accord avec la législation envigueur, au sein de notre animalerie conventionnelle. De plus, plusieurs éléments plaident en faveur d'une expérimentation en milieu conventionnel en plus de l'expérience historique que nous avons sur ce modèle depuis plus d'une vingtaine d'années, puisque l'envirionnement microbien (microbiote) est particulièrement susceptible d'être impliqué dans le developpement de maladies inflammatoires et/ou dégénératives de l'articulation. L'enrichissement se fera par un tunnel dans la cage et la distribution quotidienne de quelques céréales sucrées. Cet enrichissement ne modifie en rien notre étude et apporte une distraction non négligeable à l'animal et renforce également positivement la relation expérimentateur-animal. Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Ce modèle d’arthrose expérimentale par section du ligament croisé antérieur est un modèle bien connu et maîtrisé au laboratoire en termes de douleur. par ailleurs, une antalgie peropératoire par buprénorphine (0,05 mg/kg) sera réalisée. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-érection, cachexie), pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure a 20% sur 3 jours étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l’animal.

Choix des espèces

Le rat est couramment utilisé dans l'arthrose et ce modèle dit mécanique reste une alternative à l'utilisation du chien. Les animaux seront livrés à l'animalerie à l'âge de 6 semaines et auront une semaine d'acclimatation. Ils seront opérés à l'âge de 7 semaines pour être en accord avec la littérature. La mise à mort sera ensuite réalisée en fin d'expérimentation 56 jours après l'intervention chirurgicale pour réaliser des explorations macroscopiques, histologiques et immunohistochimiques des lésions arthrosiques et déterminer le degré d'inflammation de la membrane synoviale.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'un anti-inflammatoire et d'un inducteur de mutation, sont soumises à des tests d'effort sur tapis roulant jusqu'à l'épuisement et à des périodes d'isolement en cage métabolique pouvant provoquer perte de poids et détresse, pour étudier la fonte musculaire liée aux traitements anti-inflammatoires et au vieillissement. Le porteur reconnaît que l'isolement est stressant mais le juge obligatoire pour mesurer l'activité de chaque souris. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut créer des fibres musculaires adultes et conclut que l'étude ne peut être conduite qu'in vivo.

Objectifs

Le projet se propose de mettre en évidence les mécanismes cellulaires impliqués dans les pertes de masse et de fonctions musculaires induites par les traitements aux antiinflammatoires et le vieillissement ainsi que les mécanismes de protection induit par l’activité physique (endurance et résistance). Le muscle squelettique est composé de fibres à contraction lente, peu fortes et résistantes à la fatigue et des fibres de types rapide, très forte et très fatigables. Basés sur la littérature nous faisons l’hypothèse que : i) les fibres rapides sont plus sensibles à l’atrophie et résistantes à l’hypertrophie , ii) que la sédentarité est un facteur aggravant la perte de masse musculaire, iii) inversement, l’entraînement d’endurance protégerait le muscle de la perte de masse musculairet et favoriserait l’hypertrophie , iiii) une souris génétiquement modifiée qui possède des caractéristiques de souris entraînées va être moins vulnérable face à la perte de masse musculaire et plus sensible à l’hypertrophie induite par les efforts de force et de résistance. Nous proposons ensuite de décrire les mécanismes moléculaires . Nous étudierons également l’effet de l’activité et de la sédentarité exacerbée sur l’atrophie des fibres rapides et la mort des neurones moteurs au cours de la perte de masse musculaire liée à l'âge.

Bénéfices attendus

Ce projet aura pour but de mettre en évidence les mécanismes mis en jeu dans la prévention du déconditionnement musculaire induit par un traitement anti-inflammatoire très utilisé chez l’homme. En effet il est connu que le déconditionnement musculaire peut être un facteur d’aggravation de certaines pathologies, ainsi la compréhension des mécanismes de déconditionnement musculaire est de nos jours d’un intérêt socio-économique très important. C'est la raison pour laquelle ce projet est financé en partie par L'Assication Française contre les myopathies. D’autres parts ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes expliquant la mort spécifique des fibres musculaire de type II (permettant les contractions rapides) lors du vieillissement.

Procédures

Les souris subiront les injections de l'inducteur de la mutation génétique et de l'antiinflammatoire. Une contention courte sera effectuée lors de la mise en évidence du rapport de masse maigre/masse grasse par IRM. Les animaux seront soumis à un isolement durant leur entraînement et lors de l’analyse métabolique. L'analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Les animaux seront monitorés et pesés: 3 fois/ semaine (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition corporelle analysée (3 minutes/animal) de manière non invasive 1 fois au début de l'individualisation puis à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances vont être : le test de capacités fonctionnelles sur les tapis et l’isolement dans les cages métaboliques qui pourraient engendrer du stress chez les animaux, l’injection intra-péritonéale de l'anti-inflammatoire. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables de l’isolement peuvent être: la perte de poids et la détresse. Les effets indésirables du traitement avec l'anti-inflammatoire sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement à l'antiinflammatoire qui sera arrèté si un changement important de comportement est observé. Les animaux seront soumis à un isolement. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélèvement n'auront lieu sur animal vigile.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences dans un modèle de souris où un gène d’intérêt pour le contrôle génétique de l'expression des différents types de fibres musculaires a été invalidé. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibre musculaire. En effet aucun modèle in vitro à ce jour peut créer des fibres musculaires adultes compte tenu que la formations fibres sont dépendantes des autres cellules de l'organiqme.

Réduction

Les tests statistiques utilisés dans ce projet seront choisis afin de mettre en évidence les effets de l'activité par rapport à la sédentarité ou bien les effets de la modification génétique du type de fibres afin de contrer les effets des anti-inflammatoires. Ensuite chacun des sous groupes seront comparés deux à deux. Les différences seront considérées comme significatives pour une valeur de p

Raffinement

Les animaux isolés en cages métaboliques ou durant la période de 8 semaines d'entraînement auront pour enrichissement la présence de roues dans les cages. L'isolement est obligatoire pour notre expérience car nous devons être sûrs de mesurer l'activité de chaque souris. La période de familiarisation au tapis de course permettra réduire le stress des animaux lors des tests. Lors de l'exercice les souris seront en permanence sous la surveillance de l'expérimentateur qui arrêtera le tapis lorsque la souris se laisse emporter par le tapis trois fois de suite et ne peut plus le remonter. Le tapis sera arrêter si la souris semble gênée dans sa course et qu'elle semble s'être blessée à la patte. Par expérience avec ce tapis de course nous n'avons jamais vu de blessure, cependant dans le cas où cela arriverait elle sera soignée avec de la bétadine et recommencera le test une fois la blessure cicatrisée ou bien retirée du protocole. La déxaméthasone induit une perte de masse musculaire et donc une perte de poids qui est l'effet escompté. Les souris seront réunies par cages de 4 après l'activité pour le traitement à l'anti-inflammatoire afin de ne plus subir l'isolement car il n'est plus nécessaire pour ces expériences. L’enrichissement consistera à placer des nids végétaux, des maisonnettes et bâtonnets à ronger dans les cages. Le comportement général des animaux sera suivi.

Choix des espèces

L’atrophie musculaire induite par les antiinflammatoires et l'adaptation à l'exercice d'endurance (présentes chez l’homme) sont bien démontrées dans le modèle souris. La souris modifiée génétiquement , choisie pour cette étude, est connue pour mimer naturellement en partie les caractéristiques musculaires liées à un entraînement d'endurance. Leur utilisation nous permettra de mieux comprendre les effets de l'activité physique sur la réponse aux traitements aux antiinflammatoires. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. En effet, il a été démontré que chez la souris la structure musculaire adulte est observée dans les 7 à 8 semaines après la naissance. D'autre part, des souris âgées (24 mois) seront utilisées dans un deuxième temps. Il a été montré qu’à cet âge les mécanismes induisant le dysfonctionnement musculaire.