Système musculosquelettique

1 224 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des injections intraveineuses d'un vecteur AAV et des prélèvements sanguins répétés à la veine mandibulaire ou caudale toutes les trois semaines jusqu'à l'euthanasie, pour tester une seconde administration de thérapie génique contre la myopathie myotubulaire. Le porteur indique que les mâles malades développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leur déplacement et leur accès à la nourriture, et que tous les animaux sont euthanasiés pour prélever leurs tissus. Il affirme que le recours aux animaux est "indispensable" car les modèles cellulaires ne reproduisent pas la perte de force musculaire, et retient le rat pour sa réponse immunitaire jugée proche de celle de l'humain.

Objectifs

Il n’existe aucun traitement disponible pour la myopathie myotubulaire lié au chromosome X, une maladie congénitale sévère affectant les garçons et entrainant la mort prématurée avant un an. Cette maladie est due à des mutations dans le gène MTM1, codant pour la myotubularine. Sa déficience implique une diminution de la taille des muscles et une faiblesse musculaire généralisées entrainant une faiblesse respiratoire. Dans un essai clinique en cours, un vecteur AAV (dérivé d’un virus associé à un adénovirus), utilisé comme transporteur pour introduire le gène MTM1 dans les muscles des patients, est injecté par voie intraveineuse. L’espérance de vie étant faible, les patients doivent être traités dans les premiers mois voire premières années de vie. Leurs muscles vont alors se développer avec de nouvelles cellules qui n’auront pas été traitées par l’AAV. Il y a un risque de dilution de la protéine MTM1 et donc de diminution de l’efficacité de la thérapie dans le temps. Pour des raisons immunitaires, il n’est pas possible actuellement de réinjecter le même vecteur de thérapie génique. Récemment, nous avons identifié un nouveau vecteur AAV qui ne génère pas la même réponse immune que les AAV couramment utilisés pour traiter les maladies neuromusculaires en préclinique et clinique. Ce vecteur pourrait donc être utilisé pour une réinjection. Dans ce projet, nous testerons cette réinjection dans un modèle de rat de la myopathie myotubulaire qui reproduit avec fidélité les caractéristiques pathologiques que l’on retrouve chez l’Homme. Plusieurs associations de vecteurs AAV seront testées avec une première injection d’un vecteur dès l’apparition des premiers symptômes, puis une deuxième injection avec un autre vecteur à un stade plus tardif. Nous étudierons la réponse des anticorps et des cellules immunitaires suite à la première et à la deuxième injection. Nous évaluerons également la plus-value d’une ré-administration du gène MTM1 par rapport à une seule injection, dans le contexte d’une perte d’efficacité d’un premier traitement chez des rats malades de la myopathie myotubulaire.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait de proposer une solution à la perte d’efficacité d’un traitement dans le temps. En effet, la meilleure combinaison de deux vecteurs AAV permettrait de traiter les patients à un âge précoce avec un premier vecteur, et de réadministrer ce traitement avec un autre vecteur à un âge plus tardif si nécessaire, à l’adolescence par exemple. De plus, les bénéfices attendues dans ce projet pourraient s’étendre à d’autres pathologies neuromusculaires telles que la myopathie de Duchenne ou toute autre myopathie ou dystrophie touchant les muscles dans les premières années de vie. Si toutefois cette étude ne permettait pas de mettre en avant les bénéfices d’une ré-administration, ce travail permettrait de mieux comprendre les réponses immunes (production d’anticorps) générées par le vecteur nouvellement identifié, et proposer peut-être des alternatives pour réduire l’activation de ces anticorps qui empêchent l’efficacité d’une ré-injection d’AAV.

Procédures

Analyse sur animaux vivants anesthésiés avec injection intraveineuse: environ 20min par rats, 1 fois. Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés: environ 5 min par rats, 4 fois. Injections intraveineuses du traitement : environ 1 min par rat, 2 fois. Injection d’anesthésiques : environ 1min, 2 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine myotubularine. Les mâles malades développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les vecteurs AAVs seront appliqués par injection intraveineuse (qui provoquent une douleur légère). Le sang, environ 500µL, sera prélevé à partir de la veine mandibulaire ou caudale en fonction du poids, à partir de 6 semaines, toutes les 3 semaines jusqu’à l’euthanasie. L’analyse de l’efficacité de la deuxième injection se fera en partie après injections de deux anesthésiques et les rats recevront une injection intra-péritonéale d’un produit nécessaire à l’analyse. Les animaux seront euthanasiés par surdosage de deux anesthésiques en intra-péritonéale.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever des tissus qui nous permettront de démontrer l’efficacité des traitements (état du muscle, présence de la protéine dans le muscle, non toxicité sur certains organes…).

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour faire des preuves de concepts thérapeutiques, car les modèles cellulaires de la maladie ne permettent pas d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle (perte de force non mesurable sur des modèles cellulaires, pas de remplacement possible), et ne permettent pas non plus d’étudier la répartition d’un vecteur dans les différents organes et la réponse immunitaire générée par celui-ci. A l’opposé, le modèle de rat qui sera utilisé dans ce projet reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’Homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des tissus, la distribution du vecteur dans les différents organes et muscles, et la réponse immunitaire. A noter que la réponse des cellules immunitaires et la production d’anticorps suite au traitement avec un vecteur AAV est plus similaire à l’Homme chez le rat que chez la souris d’où l’utilisation de ce modèle plutôt que le modèle souris.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre les animaux traités à deux reprises et ceux traités une seule fois. Pour l’ensemble du projet, des groupes d’animaux servant de contrôles sont nécessaires (animal non traité, animal traité une seule fois); les actes exercés sur ces groupes ont été déterminés de façon à ce que certains groupes contrôles puissent servir de contrôle à différentes étapes du projet, ce qui réduit le nombre d’animaux total. De plus, si au cours de l’étude, certaines associations de vecteurs ne permettent pas d’obtenir un bénéfice suite à la deuxième injection, certains contrôles ou certaines étapes ne seront pas réalisés avec ces vecteurs. De même, si aucune association de vecteurs ne permet une ré-administration efficace à la première étape, le projet ne poursuivra pas.

Raffinement

Des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 3 fois par semaine en plus de l’observation quotidienne des animaux. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis. En cas de dégradation de l’état général de l’animal, des soins seront administrés : désinfection locale, pansement de plaies cutanées, soins dentaires (la coupe des dents peut s’avérer nécessaire s’ils ne peuvent pas ronger) et oculaires ou euthanasie sont parfois nécessaires. Des conditions d'hébergement particulières leur seront appliquées afin de garantir leur survie dans de bonnes conditions. Les animaux malades recevront un aliment spécifique, plus riche en nutriments, hydratant et posé au sol pour pallier aux éventuels problèmes moteurs. Les rats étant des animaux sociaux, un rat ne sera jamais seul dans sa cage. En cours de protocole, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésiant gazeux.

Choix des espèces

Les rats ont été choisis comme animaux modèles pour trois raisons : 1) La réponse immune cellulaire que l’on souhaite observer est plus similaire à l’Homme chez le rat que chez la souris d’où l’utilisation de cette espèce plutôt que l’espèce murine. Par exemple, les lymphocytes T ne vont pas interagir de la même façon avec l’antigène (antigène de l’AAV par exemple) entre le rat et la souris, alors qu’il y a peu de différence entre l’Homme et le rat. 2) Ces animaux peuvent être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène d’intérêt. Un modèle de rat de la myopathie myotubulaire a été caractérisé et reproduit avec fidélité les signes cliniques caractéristiques de la maladie humaine, ce qui permet d’évaluer l’efficacité thérapeutique des traitements. 3) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. Les rats mâles seront utilisés entre 3 et 4 semaines pour qu’ils soient sevrés et euthanasiés à 15 semaines. Les symptômes de la maladie apparaissent dès la troisième semaine de vie chez les rats Mtm1-KO, la première injection d’AAV vise à corriger en partie les symptômes de la myopathie myotubulaire : les animaux mâles porteurs de la mutation seront donc utilisés après l’apparition des premiers symptômes, en s’assurant que les points limites ne soient pas atteints.

129 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent chaque jour, pendant dix à trente jours, des bactéries dans le creux de la joue ou des injections sous la peau, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour vérifier si des analogues d'un facteur de croissance augmentent la taille des muscles. Le porteur rappelle que le facteur d'origine favorise le développement de tumeurs du foie et affirme que ses analogues en seraient dépourvus. Il conclut qu'aucune alternative non animale ne peut répondre à cette question et prévoit d'arrêter le projet si les analogues n'agissent pas sur des cellules en culture.

Objectifs

Le facteur X est un facteur de croissance décrit pour son rôle dans le métabolisme et reconnu pour son abilité à lutter contre la sarcopénie. La sarcopénie est une perte progressive de la masse et de la force musculaire liée au vieillissement et/ou à la maladie. C’est un facteur de risque pour la santé des sujets atteints puisque le degré de la sarcopénie est lié à la mortalité. Il n’existe actuellement aucun traitement efficace contre la sarcopénie. Dans ce contexte, le facteur X apparaît comme une solution prometteuse. Cependant, deux inconvénients sont liés à son utilisation. Premièrement, sur le long terme, il favorise le développement de tumeurs du foie. Deuxièment, il requiert d’être administré par injections. Ces deux inconvénients altèrent son potentiel comme outil thérapeutique. Récemment, des équipes ont développé des analogues de ce facteur X. Ces analogues ne sont plus capables de favoriser le développement des tumeurs mais conservent les propriétés de régulation du métabolisme. Un des objectifs de ce projet est donc de montrer que ces analogues ont également conservé la capacité à lutter contre la sarcopénie en augmentant la taille des muscles chez la souris. L’autre objectif du projet est de développer une méthode innovante d’administration des analogues du facteur X afin d’éviter les injections. Pour cela, des bactéries probiotiques (bactéries non pathogènes) contenant la séquence d’ADN du facteur X ou de ses analogues seront préparées puis données par voie orale aux souris afin que les cellules de leur intestin produisent elles-mêmes le facteur X et ses analogues. En résumé, les objectifs de ce projet sont (1) de montrer que l’ingestion de bactéries probiotiques contenant les séquences ADN est bien suivie de la production du facteur X et de ses analogues par l’intestin de la souris et (2) que les analogues une fois produits sont ensuite bien capables d’augmenter la taille des muscles comme cela est le cas lorsque le facteur X est injecté.

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices pourront être tirés de ce projet. Premièrement, aucune équipe à ce jour n’a vérifié que les analogues possédaient toujours la capacité d’augmenter la taille des muscles. Les résultats permettront donc de faire progresser la connaissance. De plus, s’il est mis en évidence que les analogues sont capables d’augmenter la taille des muscles cela permettra de faire émerger deux nouvelles molécules candidates pour la prise en charge de la sarcopénie, avancée non négligeable puisqu’il n’existe à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique. Enfin, les résultats pourront également permettre de valider une nouvelle approche d’administration des analogues du facteur X via les bactéries probiotiques, méthode moins invasive et bien plus physiologique que les injections.

Procédures

54 souris recevront des bactéries dans le creux de la joue : souris vigiles, une seule administration dans le creux de la joue par jour pendant 10, 20 ou 30 jours selon les groupes. La durée de l’administration (contention comprise) est de 30 secondes maximum par animal. 15 souris recevront des injections sous la peau du facteur X : souris vigiles, une seule injection par jour, pendant 10, 20 ou 30 jours. La durée de l’injection (contention comprise) est de 20 secondes maximum par animal. 60 souris recevront des bactéries par administration dans le creux de la joue : souris vigiles, une seule administration par jour pendant 10, 20 ou 30 jours. La durée de l’administration (contention comprise) est de 30 secondes maximum par animal. A l’issue des procédures, toutes les souris (maximum 129 au total) seront profondément anesthésiées par une injection dans l’abdomen (une fois 15 secondes contention comprise par animal) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).

Impact sur les animaux

Ce projet devrait entraîner des nuisances légères à modérées sur les animaux. Une contention quotidienne des animaux sera nécessaire pour réaliser l’administration des bactéries dans le creux de la joue. Cela peut générer un léger stress chez l’animal le temps de la manipulation. Pour les animaux recevant le facteur par injection, une contention quotidienne sera nécessaire pour réaliser l’injection au niveau du flanc sous la peau. La contention peut générer un léger stress chez l’animal le temps de la manipulation. Les injections répétées quotidiennement sur plusieurs jours peuvent conduire à une légère douleur au niveau des sites d’injection. Il est important de noter qu’au cours de protocoles similaires réalisés avec le facteur X, il n’a pas été observé de comportements anormaux traduisant une souffrance, une douleur ou une anxiété des animaux. Aucun effet néfaste des formes analogues du facteur X n’est attendu. De plus, les effets pro-tumoraux du facteur se déploient à l’issue de traitements bien plus longs que 30 jours. Aucun phénotype dommageable n’est donc attendu.

Devenir

Les 129 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la capacité des probiotiques données par voie orale à transmettre les séquences ADN aux cellules de l’intestin des souris, puis la capacité de ces cellules à produire le facteur X et ses analogues, et enfin la capacité de ces molécules à agir sur les muscles. Il s’agit d’une problématique scientifique complexe impliquant une cascade d’évènements et la communication entre plusieurs organes. Aucune alternative non animale n’est disponible pour répondre à une telle problématique. Ainsi ce projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, il est important de mentionner que les analogues sont testés en amont sur des cellules en culture afin de valider leurs propriétés. En toute cohérence avec les règles d’éthique animale, si l’un des analogues ne montrait aucune efficacité sur les cellules, il ne serait pas testé dans le modèle animal. Si aucun des deux analogues ne montrent des effets positifs sur les cellules en culture alors aucune étude animale ne sera réalisée, le projet sera stoppé.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Il est basé sur des études précédentes chez des souris injectées avec le facteur X. Un effectif de 5 animaux/groupe (sauf dans les groupes contrôles où 3 animaux suffisent) est suffisant pour mesurer la production du facteur X et des analogues. Si tous les analogues sont testés (fonction des données recueillies sur les cellules) cette procédure utilisera au maximum 54 animaux. Ensuite, pour observer une différence significative dans la taille des muscles, compte tenu de la variabilité et de la fragilité des muscles prélevés, il faut compter 15 souris/groupe. Si tous les analogues sont testés (fonction des données recueillies sur les cellules) cette procédure utilisera au maximum 75 animaux. Ainsi, le nombre d’animaux s’élèvera à 129 au maximum. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger suite l’analyse des muslces ou pourront être partager avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances, les animaux seront surveillés tous les jours par la personne qui réalisera les injections et les administrations de bactéries. Les animaux seront pesés tous les 5 jours pour surveiller leur croissance. Les bactéries seront administrées dans le creux de la joue et non par gavage pour limiter tout stress ou blessures qui pourraient être liés aux gavages. Les injections seront réalisées en alternant les sites afin d’éviter tout inconfort ou douleur au niveau du point d’injection. Les volumes d’injection et de solution de bactéries ont été réduits au maximum. Les animaux seront profondément anesthésiés avant le prélèvement sanguin terminal. Les gestes techniques seront réalisés par une personne expérimentée (toujours la même) afin de limiter la durée des gestes et le stress de l’animal. Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces ont été définis afin de mettre à mort tout animal le nécessitant. Lors de précédents protocoles utilisant ce facteur X ou l’administration dans le creux de la joue de bactéries, aucun mal-être n’a été observé.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier les effets des facteurs de croissance sur les muscles. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’Homme et permet d’étudier la production du facteur X (et de ses analogues) par les cellules de l’intestin ainsi que leurs effets sur la taille des muscles. Des souris âgées de 4 semaines seront utilisées. A cet âge là, les muscles sont en pleine croissance et les effets du facteur X sur leur taille sont importants, plus robustes et plus faciles à mettre en évidence que chez la souris adulte.

156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 48 d'entre elles et modéré pour 108. Modèles génétiques de la maladie de Pompe, elles reçoivent six injections sur trois mois, avec un risque de forte réaction allergique dans un à deux cas sur cinq, et sont soumises à des tests neuromusculaires et à un exercice physique imposé quatre jours par semaine, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet cherche à comprendre pourquoi un traitement enzymatique perd en efficacité sur les muscles. Le porteur affirme que l'animal est le seul organisme vivant permettant de tester ensemble le traitement et l'exercice.

Objectifs

La maladie de Pompe est une maladie génétique due à une mauvaise expression d'un gène codant une enzyme, la GAA, qui affecte les cellules du cœur, des muscles des membres et du cerveau. L’apport d’une GAA artificielle permet de rétablir le fonctionnement des cellules cardiaques mais n’a que peu d’effet à long terme sur les muscles des membres des patients. Le but de notre projet est de mieux comprendre pourquoi l’efficacité de ce traitement s’estompe au cours du temps. Avec des compétences complémentaires (médecins neurologues, vétérinaires et biologistes) et des approches variées qui s’intéresseront à l’enzyme, au modèle murin de la maladie comme à la santé des patients, nous proposons de mieux expliquer les mécanismes de la maladie afin d’identifier de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Les données obtenues permettront de mieux connaître les mécanismes de résistance au traitement de l'atteinte musculaire chez les patients traités. La mise en place d’une approche multidisciplinaire composée de neurologues, vétérinaires et biologistes produira des informations clés pour comprendre les bases moléculaires et cellulaires qui sont à l'origine de i) l'efficacité thérapeutique variable sur les muscles des patients, ii) le déficit de réparation des muscles affectés par la maladie et iii) le bénéfice de l’exercice physique sur la fonction musculaire. Les résultats scientifiques obtenus seront d’importance pour définir de nouvelles approches thérapeutiques pour la maladie de Pompe, et pourraient être exploités pour la prise en charge d'autres maladies du muscle.

Procédures

- 2 injections à faire l'une après l'autre d'abord dans l'abdomen puis dans la veine de la queue tous les 15 jours pendant 3 mois soit 6 injections par animal pour les groupes considérés - des test fonctionnels pour évaluer la fonction neuromusculaire et la force du muscle des souris et un exercice physique d’endurance 4 jours/semaine pendant 3 mois. - 1 prélèvement sanguin à la fin de l'étude sous anesthésie juste avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

L’utilisation de la molécule du traitement pouvant provoquer chez la souris une forte réaction allergique dans 20 à 25% des cas, les injections seront systématiquement précédées de l'injection d’une molécule anti-allergique 15 à 30 min avant l'administration du traitement. Dans les fenêtres d'expérimentation considérées 1 et 4 mois (groupe 1) et 4 et 7 mois (groupe 2), il n'est attendu aucun signe clinique liée à la maladie de Pompe.

Devenir

Toutes les souris de l’étude seront euthanasiées afin de réaliser des prélèvements d'organes pour analyse post-mortem.

Remplacement

Le remplacement des animaux ne sera pas possible dans cette étude car l’objet est ici précisément de tester l’effet de deux facteurs, le traitement et l'exercice physique - dans le but de déterminer leurs effets sur la maladie. L’animal est le seul organisme vivant le permettant.

Réduction

L’évaluation du nombre de souris à inclure dans ce protocole est basée sur l'expérience tirée des précédentes études du laboratoire de caractérisation du modèle murin de la maladie (application notamment de tests fonctionnels en suivi longitudinal) et de thérapie génique au cours desquelles nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Par ailleurs, du fait de la mortalité rapportée dans la littérature suite à l'injection intraveineuse de Myozyme® à l'origine d'une forte réaction allergique, tous les animaux soumis au traitement feront l'objet d'une injection préventive d'un anti-histaminique. Sur les recommandations de deux experts de la maladie de Pompe, trois animaux ont été ajoutés pour les groupes 5 et 6 de chacune des 2 cohortes pour anticiper une possible mortalité et conserver des effectifs statistiquement valides.

Raffinement

1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec enrichissement du milieu (tunnels en plexiglass, frisottis de papier, hamac, ...) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). L’état général et le poids sont les principaux éléments surveillés chaque jour par le personnel animalier pour estimer une éventuelle gêne ou douleur liées à la procédure. 3) l'instauration de points limites pertinents (cf annexe II) avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) une réactivité accrue du personnel animalieravec mise en place d’une grille d'évaluation de la douleur dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie si nécessaire)

Choix des espèces

Le projet s'inscrit dans un contexte de maladie de Pompe (glycogénose de type 2) et la souris modèle de la maladie de fond génétique C57BL/6 x 129/Sv est le modèle murin de la maladie internationalement utilisé. Le projet comportera 2 groupes de souris mâles : 1 groupe de souris âgées d'1 mois et 1 groupe de souris âgées de 4 mois. Les souris seront suivies pendant 3 mois avant d’être euthanasiées (soit à l'âge de 4 mois pour le groupe 1 et à l'âge de 7 mois pour le second groupe). Ce choix a été fait en fonction des précédents résultats du laboratoire qui montrent une altération de la réparation des muscles chez les souris Pompe âgées de 4 mois tandis que les souris Pompe âgées d'un mois conservent leur capacité de réparation musculaire.

465 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 285 d'entre elles et modérés pour 180. Ces souris portent une mutation reproduisant une myopathie humaine rare et subissent des tests répétés de force et d'activité locomotrice, un test de saignement, des injections intraveineuses d'un vecteur de thérapie génique, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie terminale avant mise à mort pour prélever les muscles. Les bénéfices annoncés, une première "preuve de concept" transposable aux patients, restent au conditionnel. Le porteur affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité musculaire ni les effets sur l'ensemble de l'organisme.

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible. Nous avons l’intention d'inverser les symptomes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des injections intramusculaires de souris TAM/STRMK et déterminé un effet positif sur la fonction musculaire. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche sous une forme systémique, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.

Bénéfices attendus

Il est attendu que cette étude apportera la première preuve de concept pour un traitement efficace de TAM/STRMK. En effet, nos résultats préliminaires ont montré un effet bénéfique suite à l'administration du traitement dans le muscle, et il reste à démontrer que cette approche est également efficace par injection systémique et capable d’améliorer les phénotypes des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os. De manière importante, la thérapie est conservée entre la souris et l’homme et pourra être utilisée chez les patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.

Procédures

Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant à partir de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportament permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportament permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répeté 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésion vasculaire. Il sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Le test pour l'obtention du sang sera répeté 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections intraveineuses seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les souris sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problemes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, démontrant que notre modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie. Pour la deuxième lignée de souris, une caractérisation complète sera bientôt effectuée pour confirmer un phénotype dommageable. Les tests de comportament peuvent induire du stress sur l'animal. Ces tests dureront le moins de temps possible pour que les tests soient significatifs, de sorte que l'animal souffre le moins possible.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la présence d'une poche de lait seront évalués tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environment sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué.

Choix des espèces

Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces évoluant plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.