Système musculosquelettique

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une myopathie rare, elles reçoivent dès un à trois jours de vie une injection de vecteur viral sous anesthésie par le froid, puis passent des tests de force musculaire jusqu'à douze fois et une mesure invasive de force sous anesthésie sans réveil à quatre mois, avant d'être tuées pour analyse des muscles. Le porteur indique que ces nouveau-nés peuvent souffrir d'une hypothermie non corrigée ou être rejetés par leur mère, et que la lignée développe une faiblesse musculaire progressive. Il juge "indispensable" de poursuivre chez la souris pour vérifier l'efficacité et la toxicité de la thérapie à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

La Myopathie CentroNucléaire Autosomique Dominante est une maladie rare du muscle. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine impliquée dans les processus d’entrée et de transports de vésicules dans la cellule. L'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie après administration à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs des essais de traitement de l’ensemble des muscles via une administration par voie sanguine se sont révélés infructueux y compris chez les souris d’1 mois. L’expression d’une molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral de type virus adéno-associé (AAV) est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau par des vésicules. Nos résultats antérieurs montrent que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec l’évolution de la maladie. Ainsi la maladie elle-même, semble compromettre l’administration du traitement. Le but de ce projet est d’intervenir le plus précocement possible dans le développement de la maladie (en période néonatale) afin de s’affranchir de son impact potentiel sur l’acheminent du vecteur thérapeutique et de tester différentes combinaisons de constructions de vecteur viral dans une optique d’amélioration de son administration dans ce contexte pathologique.

Bénéfices attendus

L’aboutissement de ce projet constituera une étape essentielle de l’étude préclinique de notre molécule et est nécessaire au développement de futurs traitements inexistants à ce jour pour les patients atteints de Myopathie Centronucléaire. Il participera également à la compréhension et l’optimisation des voix d’administration de ce type de molécule dans un modèle pathologique présentant une altération de la transduction virale

Procédures

Toutes les souris subiront une injection en intrapéritonéale (IP) ou dans le système sanguin d’un virus vecteur « inactivé » exprimant un gène luminescent ou un shRNA thérapeutique à l’âge de 1 ou 2 jours à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille ultrafine. Une seule injection sera réalisée par souris sous anesthésie. La durée de l’injection est d’environ 15 secondes par souris. La durée totale du geste par souris est d’environ 30 minutes incluant l’anesthésie de quelques minutes, l’injection et le réveil avec ses congénères avant d’être replacé dans la cage avec la mère. Ensuite, un premier lot de souris subira une injection intrapéritonéale (IP) d’un produit permettant de visualiser le gène luminescent à l’âge de 1 mois, 2 mois et 4 mois suivi d’un examen d’imagerie dans un appareil qui permet de lire la bioluminescence. Ce lot de souris sera anesthésié par anesthésie gazeuse au moment de l’examen qui dure quelques minutes. Ces souris seront euthanasiées à l’âge de 4 mois. Résumé des interventions subies par le lot1 : Injection d’AAV IP ou Veine temporale (J1 ou J2) -> (Injection IP de luciférine +Imagerie sous anesthésie gazeuse) *3 -> Euthanasie à 4 mois. Un second lot sera soumis à des tests de force musculaire non invasifs à partir de l’âge d’1mois. Ces évaluations sont la mesure de la force par test d’agrippement sur une grille et de maintien sur la grille après retournement. Ces 2 mesures durent environ 5 minutes par animal et seront répétées toutes les semaines entre 1 et 4 mois (soit 12 fois maximum pour chaque test). Une mesure de traction sur une barre sera réalisée à 2 reprises également pour chaque souris, 3 essais/souris avec 30 secondes entre chaque essai. Une mesure directe de la force du muscle de la patte après stimulation électrique sera réalisée chez ces souris à l’âge de 4 mois sous anesthésie générale gazeuse avec analgésie en procédure sans réveil par le personnel expert. Elle dure environ 20 mn par souris. Résumé des interventions subies par le lot 2 : Injection du vecteur viral en IP ou Veine temporal (J1 ou J2) -> Mesures non invasives de forces musculaire (hebdomadaire entre 1 et 4mois soit environ 12 fois)-> Mesure de Forces invasives sous anesthésie gazeuse puis euthanasie à 4 mois.

Impact sur les animaux

La lignée de souris modèle présente un phénotype dommageable. Les hétérozygotes développent une faiblesse et une atrophie musculaire progressive dont les premiers signes apparaissent à 1 mois et s’amplifient jusqu’à environ 8 mois avec une perte de force musculaire l’ordre de 40% par rapport à des souris sauvages. Ce phénotype est comparable à celui observé dans la myopathie humaine. Ces souris hétérozygotes sont par ailleurs viables et fertiles avec une courbe de poids comparable à des souris sauvage. Les souris homozygotes meurent dans les premières 24h après la naissance mais ne seront pas produite dans ce projet. L’élevage de la lignée pour les projets fait l’objet d’une autorisation spécifique. Les différentes procédures que vont subir les animaux (tests de forces non-invasives, contention pour les injections intrapéritonéale, préhension des animaux pour les anesthésier) entrainent un stress de l’animal. Les animaux pourraient également souffrir d’hypothermie non-reversée suite à l’anesthésie par le froid ou être rejeté par leur mère. L’utilisation des vecteurs viraux de ce projet n’entraîne pas de douleurs et aucune pathologie ni effets indésirables ne sont induits chez les animaux traités avec des ARN interférence ou les AAV. Cependant une inflammation au site d’injection pourrait survenir.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de l’approche thérapeutique par ARN interférence allèle spécifique a été démontré au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de la stratégie thérapeutique en injection ciblée dans le muscle de souris du modèle de la maladie par l’intermédiaire du vecteur viral utilisé dans le projet. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant des modifications du vecteur viral et de son contenu afin d’améliorer l’expression de la molécule thérapeutique. Il nous apparait indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier

Réduction

Des études précédentes sur nos différents projets nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés (entre 6 à 8 souris par groupes expérimentaux). Une première étude correspond à une étude pilote sur le sérotype et la voie d’administration systémique afin de réduire le nombre d’animaux utilisé pour la deuxième étude avec le vecteur exprimant la molécule thérapeutique. Les mâles et femelles sauvages et hétérozygotes seront analysés mais les comparaisons seront réalisées entre souris de même genre dans les 2 études. En effet des différences d’efficacité de transduction et de forces sont connues entre mâles et femelles. Ainsi cette étude pourra aussi permettre de révéler ou non des différences de phénotypes ou de réponse au traitement entre les sexes. Nous injecterons le nombre de portées nécessaire à obtenir au moins 8 souris de chaque génotype d’un même sexe pour les 2 études. Des analyses statistiques dédiées à l’analyse sur petit groupe seront utilisées pour une interprétation la plus fiable possible des résultats. Les constructions de la 2ème étude seront testées de manières successives et si une option s’avère parfaitement efficace les autres ne seront pas testées. Aussi, l’ensemble de ces projets nécessite au maximum l’utilisation de 720 souris (sauvages et hétérozygotes) dans les 2 études expérimentales pour les 5 ans du projet.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h/jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés 6 par cage maximum et l'isolement est évité au maximum. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Les animaux sont observés quotidiennement par l’animalier en charge de la lignée ou par les personnes en charge des protocoles. L’utilisation de vecteurs viraux de type virus adéno-associé n’entraine a priori pas de douleurs et donc de mise en place de traitement particulier pour y palier mais une surveillance renforcée sera exercée dans les jours suivants l’injection des souris. La procédure d’injection dure moins d’une minute par souris et est réalisée après anesthésie par le froid chez les nouveaux nés. L’imagerie est réalisée après anesthésie gazeuse et les mesures de forces de type Grip, Hanging et string test sont non invasives. Pour les mesures de forces invasives elles sont réalisées sous anesthésie et sans réveil. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant une lampe ou un tapis chauffant. Les animaux anesthesiés par le froid dont réchauffés progressivement dans une cage placée sur tapis chauffant. Les nouveaux nés ne sont replacés avec leur mère qu’une fois réchauffés et complètement réveillés (respiration normale et mouvements spontanés). Ils sont également frottés avec la litière de la cage maternelle afin de limiter le risque de rejet et remis tous en même temps dans la cage.Le comportement de la mère envers les petits est ensuite surveillé pendant 15 minutes puis fréquemment pendant les heures suivantes. Pour tous les projets, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour l’optimisation du traitement, car la molécule testée ici est un outil génétique qui cible spécifiquement la mutation du gène portée par ce modèle. Le modèle de souris utilisé est le plus petit modèle mammifère pour cette myopathie et est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons précédemment démontré l’innocuité et l’efficacité du vecteur viral thérapeutique utilisé dans le muscle de souris de ce modèle. A ce stade il apparait donc indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude chez la souris afin d’en optimiser l’efficacité et vérifier la toxicité à l’échelle de l’organisme entier (injection dans le système sanguin). Les souris développent un phénotype musculaire progressif dont les premiers signes apparaissent à 1 mois et s’amplifient ensuite. Nos études préliminaires montrent que le défaut qui permet le bon acheminement du vecteur thérapeutique apparait entre 1 et 2 mois et s’aggrave avec la progression de la maladie. L’objectif de ce projet thérapeutique étant d’intervenir au plus tôt dans le développement de la maladie, les souris seront injectées en période néonatale entre 1 et 3 jours de vie. Nous nous limiterons à des injections entre J1 et J3 car après la veine temporale n’est plus visible du fait de l’apparition de la pigmentation de la peau et pour l’injection intra-péritonéale il s’agit de la fenêtre permettant une diffusion optimale en systémique (perméabilité maximale). Les souris sont par la suite évaluées à 1, 2, 3 et 4 mois après l’injection 1 c’est-à-dire après le début des symptômes jusqu’à ce que la maladie soit bien développée.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de maladies neurodégénératives et neuromusculaires, elles reçoivent des injections de virus AAV, passent des tests de locomotion et de force musculaire répétés chaque mois pendant dix-huit mois, puis reçoivent une injection de pentylènetétrazole destinée à déclencher des crises d'épilepsie. Le porteur indique qu'une crise dépassant dix secondes entraîne une mise à mort immédiate et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'il est "indispensable" de disposer d'un modèle animal pour observer ces troubles à l'échelle de l'"organisme entier", hors de portée d'un modèle cellulaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier le phénotype locomoteur, la force musculaire et la survenue de crises d'épilepsie dans des souris modèles de maladies humaines neurodégénératives et neuromusculaires. Ces maladies sont dues à des anomalies de l’ADN qui entrainent une perturbation du fonctionnement des neurones et des muscles squelettiques des patients, conduisant à des altérations de leur locomotion et de leur mouvements (perte d’équilibre, tremblements, faiblesse musculaire, etc.), ainsi qu’à des crises d‘épilepsies. Nous souhaitons donc générer des modèles de souris pour ces maladies pour ainsi étudier leur phénotype locomoteur, leur force musculaire ainsi que leur susceptibilité à l’épilepsie. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de leur locomotion et de leur force musculaire, ainsi qu’un test de susceptibilité à l’épilepsie par injection d’une dose modérée de l’agent pro-convulsivant pentylènetétrazole (PTZ). La compréhension de l’effet de ces mutations sur le fonctionnement du cerveau et des muscles squelettiques nous permettra ainsi de mieux comprendre ce type de maladie chez l’homme et ainsi espérer découvrir des pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier les maladies à inclusion intranucléaire car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes neurodégénératifs, la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier des altérations de la locomotion, de la force musculaire et des troubles neurodégénératifs (ataxie, tremblements, épilepsies, etc.). Enfin, l’expression de mutation humaine et la création de modèle de maladie est très bien maitrisée chez la souris. Nous souhaitons donc analyser l’altération de la locomotion et de la force musculaire et l’apparition de troubles neurodégénératifs, notamment d’épilepsie par un test de sensibilité à l’agent pro-convulsivant pentylènetétrazole (PTZ), dans des souris porteuses des mutations responsables de pathologies neuromusculaires et/ou neurodégénératives : les maladies à inclusions intranucléaires. En conclusion, le développement et l’analyse de ces nouveaux modèles murins nous permettront de mieux comprendre les mécanismes pathologiques de ces mutations. De plus, à l’avenir ces modèles animaux seront essentiels pour tester la pertinence de pistes thérapeutique pour le traitement de ces patients.

Procédures

1 – L’injection de produits anesthésiques (xylazine/kétamine) en intrapéritonéale requiert moins d'une minute. 2 – Les injections intramusculaires ou rétro-orbitaires de constructions adénovirales (AAV) requièrent entre 30 secondes et 1 minute par animal. 3 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 18 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 2 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 4 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse par inhalation d’isoflurane (0,5 à 1,5% mélangé à de l’oxygène). Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 18 mois. 5 – L’injection du pentylenetetrazole (PTZ) en intrapéritonéale requiert moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier des maladies neurodégénératives et neuromusculaires touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal, nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices, de faiblesse musculaire et/ ou de signes neurodégénératifs (épilepsie, tremblements, etc.) chez ces souris. Toutefois, afin de limiter la douleur induite par les symptômes, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. De plus, les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait tous sous anesthésie. Enfin, concernant le test de susceptibilité à l’épilepsie, suite à l’injection d’une dose modérée de pentylènetétrazole (PTZ), des crises myocloniques, myocloniques (contractions rapides et brutales des muscles), cloniques (spasmes rythmés) ou toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur) peuvent éventuellement survenir. Toutefois, si une crise durait exceptionnellement plus de 10 secondes, l’animal serait immédiatement mis à mort pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but l'étude de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives causées par des mutations génétiques. Nous souhaitons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de ces mutations et notamment leurs effets sur la locomotion, la force musculaire et l’apparition de troubles neurodégénératifs (ataxie, tremblements, etc.) avec notamment l’apparition d’éventuelles crises épileptiques typiques de ces maladies. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces mutations à l’échelle de l’organisme entier ; des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire ces troubles de la locomotion, de la force musculaire et/ou des crises épileptiques et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de ces maladies.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents nous ont permis d’établir les doses de virus à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 10 animaux chacun permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la présence de la mutation (comparaison des souris exprimant la mutation génétique versus des souris contrôles). Compte tenu de notre projet d’analyser les conséquences de mutations responsables de plusieurs maladies à inclusions intranucléaires à la fois sur les muscles squelettiques et les neurones du système nerveux central, nous estimons que l’étude d’environ 320 animaux sur 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. De plus, afin de limiter d’éventuelles douleur induite par l’apparition de symptômes locomoteurs, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. Toutefois, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Enfin, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience stoppée.

Choix des espèces

La souris est l'animal de choix pour l'études de mutations génétiques responsables de pathologies à l’échelle de l’organisme entier. Notre objectif est d'étudier l’importance de mutations responsables de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives et plus précisément sur l’apparition d’altérations locomotrices, d’une faiblesse musculaire et/ou de crises d'épilepsies. Aucun modèle d’expérimentation in vitro ou cellulaire ne peut mimer ou refléter toute la complexité de ces mécanismes biologiques. Nous allons étudier le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet les mutations que nous étudions s’expriment vers l’âge de deux mois, donc des souris sevrée et adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois suivie par un test de sensibilité au pentylènetétrazole (PTZ). Ce protocole a été choisi d’après l’étude de la littérature et afin de reproduire l’aspect progressif et neurodégénératif des maladies étudiées.

504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique et de démence fronto-temporale par mutation de la protéine FUS, elles reçoivent des gavages et passent des tests moteurs et cognitifs répétés à quatre, huit, douze et seize mois, puis un examen des muscles sous anesthésie en fin de procédure. Le porteur indique que le gavage peut provoquer des fausses routes suivies d'une mise à mort immédiate, et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité comportementale et structurelle du système nerveux nécessaire à l'étude.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence fronto temporale (DFT) sont deux maladies neurodégénératives incurables encore mal comprises à ce jour. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime ces maladies en reproduisant la mutation d’une protéine mutée (la protéine FUS) chez les patients. Après avoir valider notre nouveau modèle (objectif 1), nous voulons analyser l’effet de la mutation de FUS aussi bien sur la perte des neurones dans le temps (objectif 2) que son impact à l’échelle comportementale (objectif 3)..

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, un seul traitement est proposé aux patients atteints de SLA. Il s’agit du Riluzole, dont l’efficacité est très faible puisqu’il ne permet d’augmenter la durée de vie des patients que de quelques mois. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes en œuvre dans le développement et la progression de la SLA et de la DFT afin d’élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient aider à la mise en place de nouveaux traitements.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure d’administration par gavage à raison d’un gavage par jour, d’une durée maximale de 1 minute, durant une période de 5 jours. Les animaux suivront des tests moteurs (3 session de 3 minutes maximum, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes) et des tests cognitifs. Le premier test dure 5 minutes, le second est composé de 4 sessions 5 minutes (entrecoupées de 8 minutes). Un troisième test est réalisé sur une période de 4 jours consécutifs, à raison de 4 essais par jour (durant maximum 1 minute chacun). Un quatrième sera réalisé sur une nuit et enfin le cinquième, sur une période de 5 jours, à raison d’un essai unique de 10 minutes par jour. Nous réaliserons ces différents tests de manière successive, en respectant des pauses d’un moins un jour entre chacun aux âges de 4 mois, 8 mois, 12 mois et 16 mois. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris endormies afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement par gavage mais aussi des signes de stress liés à la contention obligatoire pour réaliser ce geste de gavage. Nous pourrions également observer un léger stress causé par la passation des tests comportementaux. Nous avons mis en place des points précis et spécifique à chacun de ses risques pour sortir les animaux de la procédure en cas de besoin. Ainsi, après l’administration par gavage du traitement, nous réaliserons une évaluation scorée de l’état de la souris en remplissant la grille présentée en annexe 7. Nous évaluerons les items suivants (+ 1 point / - 1 point) : Prise/perte de poids, poils propres/sales, interaction/isolement, déplacement/prostration, respiration normale/sifflement. Si la somme des points est comprise entre 3 et 5, la souris sera replacée dans sa cage sans surveillance particulière, si la somme est comprise entre 1 et 3 points, nous demanderons un avis vétérinaire, si la somme est inférieure à 1, la souris sera mise à mort. En cas de fausse route, l’animal sera mis à mort immédiatement.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures car nous avons besoin d’étudier les tissus prélevés afin d’étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer si le changement de la localisation de la protéine FUS dans la cellule (qui sort du noyau pour aller dans le cytoplasme chez les patients souffrant de SLA et de DFT) entraine 1) une perte des neurones dans le temps et 2) des troubles cognitifs et moteurs. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui récapitule à la fois la complexité comportementale (des comportementaux sociaux, des processus cognitifs) mais aussi celle structurelle du système nerveux (les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central) que l’on retrouve chez les patients atteints de ces maladies. Les modèles cellulaires ne nous permettraient de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les études sur les muscles sur les mêmes animaux que ceux prévus pour réaliser les expériences histologiques et moléculaires. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude afin de valider les groupes expérimentaux et potentiellement réduite le nombre de groupes contrôles que nous utiliserons. Si cette étude pilote est validée sur ces deux aspects, nous pourrons réduire de plus de la moitié les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (début de l’expérience à 2 moi et fin prévue à 17 mois) car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles. Nous avons décidé d’étudier aussi bien les femelles que les mâles car les deux maladies qui nous intéressent touchent de la même manière les hommes et les femmes.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent des injections intraveineuses et intracrâniennes de molécules, puis passent chaque mois pendant dix-huit mois une batterie de tests locomoteurs (rotarod, grip test, marche sur planche à trous, open field) et une mesure de force musculaire sous anesthésie. L'objectif est de tester la correction de la faiblesse musculaire, aucun traitement n'existant pour cette maladie. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de disposer d'un modèle animal car aucun système cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA, ou maladie de Charcot), pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine une perte des neurone moteurs, aboutissant in fine à un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette mort neuronale, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de cette maladie, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype neuromusculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la correction de la neurodégénérescence, de la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour cette maladie neurodégénérative.

Procédures

1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 - Les injections en sous cutané, notamment d’agents analgésiques, requièrent moins d'une minute. 3 – Une injection intraveineuse de virus adéno associé (AAV) requiert entre 30 secondes et 1 minute par animal. 4 - Une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique requiert entre 5 et 7 minutes par animal. 5 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 18 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 10 à 15 jours selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 6 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 10 à 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 18 mois. En conclusion, chaque animal recevra à l’âge de deux mois une injection intraveineuse rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse (entre 30 secondes et une minute), puis trois semaines plus tard une injection sous cutanée d’un analgésique et une injection intrapéritonéale d’anesthésiques suivie d’une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique (d’une durée de 5 à 7 minutes). Un mois après cette injection intra-crâniale, le phénotype de cet animal sera suivi par une batterie de tests locomoteurs non invasifs (rotarod, grip test, bar test puis rotarod) répartis sur 10 à 15 jours, puis deux semaines après le dernier test, nous effectuerons une mesure de leur force musculaire sous anesthésie gazeuse en 4 à 8 minutes. Ces tests locomoteurs et mesure de force seront répétées environ chaque mois sur une période de 18 mois.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier une maladie neurodégénérative et neuromusculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal ; nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et/ou d’une faiblesse musculaire chez ces souris. Il est à noter que les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie. Concernant le nombre d’animaux étudié, des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique. Ainsi, compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et une molécule contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et un contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de diminuer le stress et la douleur liées à la mesure de la force musculaire par stimulation électrique et aux injections intraveineuses et intracérébrales ; ces procédures expérimentales se font toutes sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement (akinésie, prostration, paralysie), réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Enfin, nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie que nous étudions touche les adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.

700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modifiés génétiquement dès l'embryon pour exprimer des mutations cancéreuses, ils sont suivis jusqu'à douze mois et anesthésiés chaque mois pour détecter des tumeurs internes par fluorescence, afin d'étudier l'origine cellulaire de cancers du muscle de l'enfant. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer des troubles de la nage, une léthargie, des œdèmes et une incapacité à se nourrir, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les cellules en culture ne modélisent pas l'apparition des tumeurs et que le poisson zèbre partage 80 % de ces programmes génétiques avec l'humain.

Objectifs

Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant 15 ans. Malgré des essais cliniques, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet vise à déterminer si les cancers du muscle fréquemment observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non pas seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules. Cette question est importante, car on sait que la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. In vitro, il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés, fréquemment retrouvés chez les patients atteints par ces cancers, dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il est maintenant nécessaire de vérifier à l’aide du modèle de poisson que lorsque ces mutations sont introduites dans ces cellules neuronales, elles conduisent bien à la formation de tumeurs. L’objectif de ce projet est de pouvoir déterminer si des cellules neuronales constituent l’une des cellules d’origine des cancers du muscle chez l’enfant lorsqu’elles expriment des mutations fréquemment retrouvées dans ces pathologies. Or, on sait que la réponse aux traitements peut varier en fonction de la cellule d’origine du cancer. Le poisson est un modèle de vertébré particulièrement utile pour l’étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et de très bons outils sont disponibles pour reproduire les altérations génétiques trouvées des patients dans les cellules de poissons. Pour tester l’hypothèse d’une origine neuronale de certains cancers du muscle chez l’enfant, ces mutations seront introduites dans des embryons de poissons. Ensuite, un suivi attentif de la formation de tumeurs sera réalisé sur une durée 12 mois maximum. Le nombre de poisson a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’origine des cancers des muscles chez les enfants. Cette étape est indispensable pour adapter la prise en charge thérapeutique des jeunes patients, car la cellule d’origine des cancers impacte la réponse aux traitements.

Procédures

Pour les poissons zèbres de 5 jours à 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 3, 2 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 24. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 3. Pour les poissons zèbres de plus de 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 5 poissons, 1 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 15 minutes. Nombre maximal : 36. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 9.

Impact sur les animaux

La fréquence d'observation a été définie de manière à anticiper la détection des tumeurs tout en réduisant le malêtre animal associé à leur manipulation répétée. L'observation attentive des poissons nécessite leur transfert transitoire dans un autre bac (par groupe de 3 ou 5 poissons suivant leur âge). Les poissons seront également légèrement anesthésiés (Tricaïne methasulfonate tamponnée à pH7, 100mg/L) une fois par mois pour permettre d'observer par fluorescence, d'eventuelles tumeurs interne aux poissons. Chez les patients, aucun symptôme majeur n'est observé dans les premiers stades de la maladie en dehors de l'apparition d'une masse préférentiellement proche des muscles. De fait, certains animaux peuvent présenter des signes de malêtre dus au développement de ces tumeurs. Les signes les plus précoces comprennent des modifications de la nage, une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau, une respiration accélérée passagère ou une apathie. Les animaux qui présentent un ou plusieurs de ces signes cliniques seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 48h. En absence d’amélioration des signes mal-être listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. La présence de tumeur, le hérissement des écailles, la présence d’oedèmes, une léthargie (immobilité au fond de l’aquarium) prolongée ou une incapacité à se nourrir constituent des points limites nécessitant une mise à mort immédiate.

Devenir

En cas de mal-être, les poissons zèbres seront mis à mort. Dans le cas d'apparition de tumeurs, afin de récupérer les tumeurs, et permettre leur analyse, les poissons seront mis à mort. A la fin de la procédure (soit à 1 an maximum), les poissons seront mis à mort pour prévenir la survenu d'éventuelle altération tardive du à la procédure.

Remplacement

Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer expérimentalement les conséquences des modifications génétiques impliqués dans les maladies humaines telles que le cancer. Les cellules cancéreuses humaines en culture sont très utiles pour comprendre les mécanismes moléculaires en place lorsque le cancer est déjà établi. En revanche, elles ne représentent pas la complexité des comportements cellulaires là où la tumeur est établie, l’interaction avec les tissus sains et le reste de l’organisme. Les cellules cancéreuses en culture ne peuvent pas modéliser les étapes permettant l’apparition et l’évolution temporelle des tumeurs.

Réduction

Dans un but de réduction et en accord avec la littérature scientifique, la taille de chaque groupe a été calculée pour obtenir des résultats significtifs tout en incluant le minimum d'individus dans cette étude. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la significativité des résultas. De plus, l’analyse des caractéristiques biologiques des tumeurs sera réalisée sur le même groupe que la mesure du taux d’incidence des tumeurs. Dans la mesure du possible, nous essaierons de grouper au maximum les manipulations génétiques de manière à mettre en commun les groupes témoins et réduire ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Nous réaliserons en priorité le modèle transitoire (350 poissons) puis nous développerons le système constitutif (350 poissons) si besoin, et en cas d’échec du premier modèle (soit un maximum de 700 poissons).

Raffinement

Tout signe de mal-être des animaux potentiellement dus au développement de tumeurs pourront être prévenus par une surveillance attentive des poissons à la recherche de signes ou de changements de comportement généralement associés à une maladie par l’application de critères d’arrêt définis.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un bon organisme modèle pour l'étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et nous disposons de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines spécifiquement dans certains types de cellules dans les poissons adultes. D'autres espèces d'animaux pourraient être envisagées comme alternative au poisson zèbre, tels que Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, mais ce sont des invertébrés dont de nombreux organes diffèrent considérablement de l’Homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il est un vertébré moins évolué et parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique pour tester l'influence de gènes particuliers sur le développement tumoral. Les micro-injections de vecteurs ADN seront réalisées dans des embryons au stade d’une cellule. L’étude de la survenue des tumeurs primaires sera faite dans des poissons juvéniles ou adultes (âge compris entre 4 et 52 semaines) en fonction de la vitesse d’apparition des tumeurs.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une section définitive du nerf sciatique d'une patte sous anesthésie, qui provoque une atrophie et une perte de force du membre, pour étudier la régulation des connexions entre le cerveau et le muscle. Le porteur décrit une chirurgie modérément invasive et affirme que la souris peut continuer à se déplacer sur ses quatre pattes. Il conclut que l'étude ne peut être conduite que sur un "organisme entier", aucun modèle in vitro ne reproduisant la communication entre motoneurones et muscle.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment est régulée la maintenance des connections cerveau-muscle. Le muscle squelettique est le plus grand organe du corps humain, il représente 40 à 50% du poids corporel. Il est essentiel pour la mise en mouvement du squelette, le maintien de la posture, la respiration, la thermogenèse et la régulation du métabolisme des lipides et des glucides. Cette capacité à bouger et à respirer nécessite une communication entre le cerveau et le muscle. Elle a lieu via des synapses hautement spécialisées qui contrôlent la contraction musculaire. Un dysfonctionnement de ces connections est la cause de faiblesse musculaire, d’atrophie musculaire voir de paralysie et est impliqué dans plusieurs pathologies telles que les myasthénies ou la sclérose latérale amyotrophique. Comprendre comment est régulé la formation et la maintenance de ces synapses est donc d’un grand intérêt.

Bénéfices attendus

Des dysfonctionnements de connections verceau-muscle sont observées dans différentes maladies neuromusculaires. L’apport de connaissances fondamentales est un prérequis pour comprendre la physiopathologie des maladies neuromusculaires et permettre le développement de thérapie à plus long terme.

Procédures

Les animaux subiront deux injections : une sur animal vigile pour l’anesthésie générale (durée une minute) et une sur animal anesthésié pour l’analgésie per et post-opératoire (durée une minute). Les animaux subiront une intervention chirurgicale d’une durée de 15 minutes pour réaliser une section définitive du nerf sciatique d’une seule patte. En de douleur post-opératoire, les animaux pourront recevoir une autre injection pour l’analgésie (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

Une chirurgie de dénervation de la patte postérieure gauche sera réalisée. Cette dénervation conduit à une atrophie des muscles de la patte observable à partir de 14 jours, donc à une perte de force musculaire sur le membre. Comme la souris est quadrupède, cette intervention ne l’empêche pas de se déplacer, de grimper dans la cage et de s’alimenter. La technique de dénervation définitive est une chirurgie modérément invasive et parfaitement maitrisée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation afin de collecter tous les muscles squelettiques des pattes postérieures. Ces tissus prélevés serviront pour les analyses de biologie moléculaire et d’histologie pour décrypter les acteurs moléculaires responsables de l'homéostasie musculaire.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite que sur un organisme entier car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le système complexe de communication entre les motoneurones et le muscle. La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères.

Réduction

Un effectif de n=20 animaux par point de collecte sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Après obtention des résultats expérimentaux, les données seront analysées à l’aide d’un test statistique non paramétrique. L’ensemble des muscles des deux pattes postérieures seront collectés. La patte droite non dénervée servira de contrôle contralatéral.

Raffinement

Pendant toute la chirurgie, les animaux seront sous anesthésie générale et locale, coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d’éviter tout dessèchement de l’œil. Après la chirurgie les animaux recevront pendant 3 jours un traitement analgésique et antalgique. Pour une meilleure récupération après l’anesthésie générale, les animaux seront stabulés une nuit en armoire chauffante. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et l’eau derrière l’intervention chirurgicale, des croquettes et de l’eau gélifiée seront déposés sur le sol de la cage. Pendant les 5 jours suivant l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés individuellement quotidiennement afin de vérifier la bonne cicatrisation de la suture, et de traiter la douleur avec des antalgiques adaptés en cas de besoin ou d’euthanasier l’animal en cas de souffrance non jugulée, appréciée par des critères de signes cliniques, d’aspect et de comportement. Toutes les souris de la même cage seront opérées le même jour afin de maintenir le groupe social.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d’animaux génétiquement modifiés conduisant à l’obtention de modèle dans lequel un ou plusieurs gènes peuvent être rendus non fonctionnels. De plus, le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet donc des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles. Les souris seront utilisées à l’âge adulte mature entre 12 et 13 mois car le laboratoire étudie les mécanismes régulant l'homéostasie musculaire. L’âge de 12 mois représente à peu près le milieu de la vie pour une souris.