Système musculosquelettique

360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par amputation de phalanges, subissent des prélèvements de sang à la veine temporale, des injections et des mesures de force musculaire, pour tester une thérapie génique et une thérapie pharmacologique contre une myopathie rare. Les souris des procédures thérapeutiques sont tuées pour l'analyse histologique des muscles, tandis que la lignée d'élevage est gardée vivante pour des projets ultérieurs. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "essentiel" et la souris "indispensable", les modèles cellulaires ne reflétant pas selon lui un tissu vivant.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires (CNM) sont des maladies rares avec un fort impact sur la qualité et la durée de vie. Les CNM se caractérisent par une faiblesse des muscles volontaires (= muscles squelettiques). Les patients montrent des retards moteurs ou n’apprennent jamais à marcher, et ils ont des restrictions respiratoires. Notre projet vise à : -Comprendre les étapes du développement de la maladie afin d’identifier des biomarqueurs qui serviront à diagnostiquer cette maladie à un stade précoce à partir d’une simple prise de sang, et à évaluer l’efficacité d’un traitement en comparant la valeur de ces marqueurs avec des sujets sains. -Tester une approche thérapeutique génique en injectant des petites molécules qui seront injectées avant et après l’apparition des premiers signes afin de pouvoir évaluer l’efficacité du traitement d’anticiper (= empêcher le début de la maladie) et d’invertir la maladie (= guérir les souris déjà malades). -Tester une approche thérapeutique pharmacologique en injectant des composés chimiques avant et après l’apparition des signes de la maladie pour évaluer leur potentiel d’anticiper et d’invertir la maladie. Suite aux injections des molécules et composés chimiques, nous évaluerons la force et la structure musculaire des souris afin de pouvoir quantifier l’efficacité des traitements.

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir de nouvelles connaissances sur les voies cellulaires impliquées dans le développement des CNM, et ainsi permettre de valider des biomarqueurs circulants (= dans le sang) permettant l’évaluation de l’efficacité d’un traitement. En outre, nous allons tester deux nouvelles approches thérapeutiques sur un modèle souris de CNM : une approche de thérapie génique et une approche de thérapie pharmacologique. Les résultats sont d’un grand intérêt médical et pourraient conduire à des essais cliniques dans l’objectif de traiter les patients CNM.

Procédures

Nous prévoyons les interventions suivantes : 1) Identification de souris par amputation de phalanges - une fois entre 7 et 10 jours - durée 2 minutes. 2) Prélèvement sanguin à partir de la veine temporale - durée 2 minutes. 3) Injection de petites molécules - durée 2 minutes. 4) Injection de composés pharmacologiques - durée 2 minutes. 5) Mesures de force musculaire - durée 20 minutes

Impact sur les animaux

Les souris CNM présentent une faiblesse musculaire modérée sans impact majeur sur la qualité et la durée de vie. Les approches thérapeutiques par molécules ou composés pharmacologiques visent à augmenter la force musculaire des animaux. Il est néanmoins possible que les traitements aient des effets secondaires indésirables. L'identification, de même que les injections a visées thérapeutiques ou d'anesthésiants pour la mesure de force musculaire peuvent engendrer un stress ou une douleur temporaire chez l'animal.

Devenir

Procédure maintien de la lignée : les souris seront gardées pour des projets ultérieurs. Procédure thérapie génique et pharmacologique : les souris seront soumises à des test de force musculaire puis mis à mort pour des analyses histologiques des muscles.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les voies cellulaires impliquées dans le développement de la myopathie centronucléaire (CNM) et à évaluer l’effet d’approches thérapeutiques sur la fonction musculaire. Pour ces raisons, un modèle animal est essentiel et nous ne pouvons avoir recours à des modèles cellulaires (qui ne reflètent pas un tissu vivant). Les connaissances du système musculaire sont très développées chez la souris, qui représente de ce fait un modèle approprié et indispensable pour étudier la CNM et établir des approches thérapeutiques qui pourraient être transférées aux patients dans l’avenir.

Réduction

Pour l’étude transcriptomique (étude des voies cellulaires), nous prévoyons d’utiliser 6 souris par groupe (souris malades et souris saines), et pour les approches thérapeutiques un nombre de 8 par groupe pour la thérapie génique et la thérapie pharmacologique. Ces nombres ont été calculés pour s’assurer que l’étude soit statistiquement et scientifiquement valable, et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées chez les mêmes souris lors des traitements par approche génique ou pharmacologie, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, dans des cages ventilées et enrichies (barreaux à ronger, matériel de nidification), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera vérifié quotidiennement afin de détecter des signes des souffrance à l’aide d’une grille de suivi adaptée. Cette grille de score prend en compte les points des catégories suivants : 1) L'aspect général de l'animal (hérissement des poils, yeux clos, flancs creusés, perte de poids …) : 2) Le comportement / la mobilité́ de l'animal (mobilité́, prostration, dos voûté, isolement par rapport aux autres animaux). Ce suivi sera réalisé de manière journalière sur toute souris traitée par approche thérapeutique et sur les souris CNM non traitées à partir du sevrage et jusqu’à la mise à mort pour expérimentation.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et courant dans le domaine des myopathies. Son système musculaire est bien étudié et de nombreuses techniques d’analyse sont établies afin de mener à bien les analyses. La dissection des muscles pour les études transcriptomiques se fera à l’âge de 7 semaines afin de pouvoir analyser la régulation des gènes musculaires et de comparer les données avec d’autres résultats obtenus préalablement sur d’autres modèles souris de la maladie au même âge. Pour évaluer l’efficacité des approches thérapeutiques géniques (molécules) et pharmacologiques (composés chimiques), nous allons traiter les souris avant et après l’apparition des signes de la maladie, soit à 4 et à 8 semaines.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Différents vecteurs viraux dérivés de l'AAV9 leur sont injectés, dès le premier jour de vie pour une partie, par voie abdominale, intraveineuse ou derrière l'œil, avec un suivi hebdomadaire par bioluminescence. Le porteur reconnaît que l'injection derrière l'œil peut provoquer un gonflement de l'œil, une proptose ou une cécité, et que les anesthésies prolongées peuvent causer des troubles cognitifs. Il compare l'efficacité de ces vecteurs pour la thérapie génique musculaire et juge le recours à l'"organisme entier" nécessaire.

Objectifs

Les vecteurs viraux sont des outils largement utilisés en thérapie génique. Parmi eux, les virus adéno-associés (AAV) présentent de nombreux avantages comparés aux autres vecteurs car ils ne sont pas pathogènes chez l’Homme et présentent une faible immunogénicité ainsi qu’une grande stabilité génétique. Il existe plusieurs sérotypes d’AAV dont l’AAV9 présentant un tropisme pour les muscles. Une des limites de l’utilisation des AAV en tant que vecteur est le manque de spécificité. D'autres AAV dérivés de l'AAV9 décrit dans différentes publications présenteraient une augmentation de la spécificité musculaire en vitro et en in vivo. L’objectif du projet est donc de pouvoir comparer l'efficacité des différents dérivés de l'AAV9 avec l'AAV9 ainsi qu'entre eux chez la souris et par la suite de sélectionner celui qui montrera la meilleure optimisation de l’efficacité et la spécificité dans le muscle tout en limitant celle dans les autres organes. Le but final est d’améliorer la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques du système musculaire.

Bénéfices attendus

L’identification du meilleur sérotype d’AAV ciblant le plus spécifiquement les muscles et moins les autres organes permettra une meilleure efficacité des thérapies géniques applicables aux maladies musculaires.

Procédures

La cohorte « injections intrapéritonéales » seront soumises aux procédures suivantes : -Injection intrapéritonéale unique au premier jour post-natal, 1 minute par animal -Injection sous cutanée (1minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte « injections intraveineuses » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intraveineuse (1 minute) unique par la veine caudale chez la souris éveillée -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte "injections rétro-orbitales" seront soumises aux procédures suivantes :- Injection rétro-orbitale (1 minute) unique chez la souris sous anesthésie -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence

Impact sur les animaux

L’injection peut provoquer chez l’animal un stress dû à l’acte, ainsi qu’une perte de poids. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur transitoire chez l’animal. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal. L’injection rétro-orbitale peut provoquer l'apparition de gonflement oculaire au site d'injection, une proptose ou encore une cécité. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal.

Devenir

Notre projet nécessite la collection d’organes pour l’analyse au niveau histologique et moléculaire

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires car celles-ci ne permettent pas l’étude de l’impact de l’AAV sur un organisme entier. En effet seul le modèle animal pourra nous permettre l’étude de la bio distribution d’un produit injecté. De plus, le modèle murin est physiologiquement assez proche de l’Homme, ce qui va nous permettre une étude représentative de l’efficacité et de la spécificité des différents vecteurs viraux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur le nombre de virus et de doses à tester par âge. Ce nombre a été basée sur de précédentes études similaires et permet d’assurer une robustesse statistique nécessaire à l’interprétation des résultats. L’expérience de bioluminescence, qui est une expérience permettant de visualiser la localisation du virus dans l'animal, nous permet d’avoir un suivi hebdomadaire de l'expression du virus chez la souris, ce qui nous évite la création de plusieurs groupes de souris à différents âges.

Raffinement

Une alimentation enrichie en plus de l’alimentation inscrit dans l’agrément de l’EU sera mis en place si une perte de poids (inférieure à 22 grammes) est observée suite à l’injection des virus. Les animaux seront surveillés chaque semaine jusqu’à leur mise à mort. Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. De l’ocrygel sera appliqué dans l'ensemble des procédures expérimentales pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les point limites seront déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement, réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration de l’efficacité et de la spécificité du vecteur viral, nous avons besoin d'effectuer des expériences in vivo sur modèle animal. Des projets similaires sur ce modèle animal ont déjà été publié, l’utilisation de ce modèle s’inscrit donc dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale utilisera des souris dès le premier jour de naissance. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intraveineuse utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. A partir de la modification, La cohorte RO à P1 utilisera des souris dès le premier jour postnatal. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte RO à 6w utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. Le groupe de 10 souris pour l'apprentissage du geste RO à P1 utilisera des souris à P1.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour tester une lignée porteuse d'une mutation proche de celle des patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires. Elles subissent des tests de force et de locomotion répétés chaque semaine, un test de saignement pour évaluer la coagulation et des injections de traitement, avant une mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur présente la plupart des tests comme non invasifs tout en décrivant du stress et des douleurs liées aux injections. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité musculaire ni les effets sur un organisme entier, s'agissant d'une maladie multisystémique.

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM), associée au syndrome de Stormorken (STRMK) est une maladie touchant notamment les muscles, la coagulation sanguine et la peau. Cette myopathie peut être causée par différentes mutations génétiques, et il manque encore des modèles adaptées pour étudier la maladie et la traiter. Ce projet vise donc à étudier une nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Si les principaux signes de patients sont trouvés chez les souris, cette lignée serait confirmée comme un modèle approprié pour le TAM/STRMK. Ce modèle permettra de mieux comprendre le syndrome TAM/STRMK, en fonction de la mutation. En plus, dans ce projet, nous mettrons également en œuvre une stratégie thérapeutique visant à prévenir et à inverser la maladie dans le modèle murin en ciblant un acteur clé de la cause de la maladie.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra d’approfondir notre connaissance des causes et du fonctionnement de la maladie. De plus, avoir en notre possession des modèles TAM/STRMK nous permettra de trouver la thérapie la plus appropriée, en fonction de la cause génétique spécifique. Enfin, cette étude présente un intérêt pour un éventail plus large de maladies comme la dystrophie de Duchenne ou la pancréatite aiguë.

Procédures

Des tests de comportement seront réalisés une fois par semaine sur les souris vivantes, à partir de 1 mois (cohorte 1) ou 4 mois (cohorte 2) et jusqu'à 4 mois (cohorte 1) ou 8 mois (cohorte 2) d'âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test permettant de mesurer la force musculaire des pattes de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement, utilisé pour évaluer la coagulation sanguin, sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. Le test de production de force du muscle durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera euthanasié. Le test pour l'obtention du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections pour administrer le traitement prendront environ 2 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Le nouveau modèle peut avoir un impact indésirable sur l'animal. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. De plus, les injections administrées pour le traitement peuvent causer de la douleur à l'animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Dans le cadre de notre expérimentation, nous employons des tests phénotypiques non invasifs, ce qui signifie que nous n'occasionnons aucun préjudice aux animaux que nous étudions. Cette approche nous permet d'effectuer un suivi longitudinal en répétant les expériences sur les mêmes individus au fil du temps. En ce qui concerne les analyses moléculaires et histologiques, elles seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui évite de constituer un groupe d'animaux pour chaque point du suivi sur la durée. . Nous cherchons également à réduire au minimum le nombre d'animaux afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nos recherches antérieures ont montré que l'utilisation d'un maximum de 15 souris par groupe est nécessaire pour mener à bien une étude concluante. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysées avec des statistiques adaptés.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 h jour/nuit sera imposé. Les animaux recevront de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l’aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo ce qui limite le développement de la douleur. Afin de diminuer le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour le temps de saignement et les prélèvements sanguins, l'animal sera anesthésié. Ainsi, pour les mesures de force musculaire, l’animal sera anesthésié avec un mélange de produits anesthésiants et analgésiants permettant d’éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L’animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure afin de maintenir la température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de souffrance de l'animal, nous mettrons en place des mesures pour minimiser son inconfort et sa douleur. Nous utiliserons une grille de scoring pour évaluer le niveau de douleur observé chez l'animal. Si nous constatons un niveau de douleur élevé, nous prendrons les mesures appropriées pour soulager la douleur et assurer le bien-être de l'animal. La grille de scoring nous permettra de surveiller attentivement l'état de l'animal et d'adapter les interventions nécessaires pour réduire toute souffrance.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris afin de mieux comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes suite à une modification génétique, ainsi que pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Cette approche globale de l'organisme revêt une importance particulière dans le cadre de notre étude sur le TAM/STRMK, une maladie multisystémique. Ayant précédemment étudié le TAM/STRMK dans un autre modèle murin de la maladie, nous souhaitons approfondir nos connaissances en utilisant cette nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Les souris utilisées seront étudiées à l'âge adulte, après 4 semaines jusqu'à 8 mois (pour la caractérisation de l'animal), et après 4 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement).

570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous la peau un système diffusant un corticoïde pendant cinq mois, puis des prélèvements de sang et d'urine chaque semaine, des injections sous-cutanées et intramusculaires deux fois par semaine, des gavages quotidiens et des radios, provoquant traumatismes et inflammations aux sites d'implantation. L'objet est d'évaluer un traitement contre la fragilité osseuse induite par les corticoïdes. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" en affirmant qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité du traitement étudié à résorber les atteintes osseuses qui surviennent lors d’une corticothérapie chronique (La corticothérapie est un traitement à base de corticoïdes, des médicaments aux propriétés anti-inflammatoires). En effet, des études de pharmacovigilance ont montré qu’une fragilisation osseuse est induite lors d’une corticothérapie et est caractérisée par une réduction de la minéralisation osseuse, altération de l’architecture et de la densité minérale de l’os. De plus, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques agissant sur le métabolisme osseux, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet afin d’évaluer sur l’animal la capacité d’un traitement à éviter l’apparition d’atteintes osseuses, comme de caractériser les effets indésirables que pourrait entrainer le composé thérapeutique étudié. Cette étude permettra de définir les types de lésions osseuses (ostéoporose) qui sont observées lors de la corticothérapie, de proposer des schémas thérapeutiques d’administration adaptés afin de réduire et/ou abolir ses potentiels effets délétères, et de caractériser la capacité du traitement à stopper le développement des lésions osseuses. .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesureront à plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra de générer des informations sur la potentielle toxicité osseuse du traitement étudié. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications physiologiques osseuses chez les animaux après application du traitement. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Une implantation sous-cutanée de système de diffusion continue de corticoïde est prévue pour chaque animal. Cette procédure durera environ 20 min et se fera sur animal anesthésié. Le système de diffusion restera en place pour une période maximum de 5 mois. Des prélèvements sanguins et urinaires sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. Des injections sous-cutanées sont prévues 2x/semaine sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque injection durera moins de 1 min. Des injections intra-musculaires sont prévues 2x/semaine sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque injection durera moins de 2 min. Des gavages se feront sur animal vigile 1x/jour sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque gavage durera moins de 5 min. Des radios sont prévues 2x/mois sur animal anesthésié. Chaque radio durera moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’implantation du système de type ALZET (dispositif de diffustion de molécules en continu). Cette procédure étant douloureuse à court terme, une anesthésie, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’injection du traitement. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le traitement et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser le composé et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés/principes actifs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs, 12 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique, sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité et de ceux obtenus entre chaque protocole de ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion altérée, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera pris en charge.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents traitements seront utilisés.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections abdominales déclenchant la mutation d'une myopathie génétique, subissent une perte de force et de poids, puis des tests de force et de course répétés pendant douze semaines et des injections d'agents thérapeutiques, avant le prélèvement de leurs muscles. L'objet est d'identifier des candidats médicaments pour une myopathie à cores sans traitement curatif. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal vivant ne permet d'évaluer la force musculaire et son évolution sous traitement.

Objectifs

Les myopathies à cores sont des maladies génétiques rares sans aucun traitement curatif actuellement. Elles sont caractérisées par la présence de zones anormales, appelées "cores", à l’intérieur des fibres musculaires, et sont souvent liées à des mutations génétiques bien identifiées dont une en particulier sur laquelle est basée ce projet. Il en résulte que la fibre musculaire est moins performante car sa structure est modifiée. Chez l'Homme, la diminution de la force musculaire se manifeste dès la naissance pour les cas sévères ou plus tardivement. Les mécanismes conduisant au développement de la pathologie ont été identifiés grâce à des altérations observées sur les cellules musculaires de souris en culture et sur un modèle de souris précédemment développé et reproduisant une grande partie des problèmes musculaires rencontrés chez les patients. Ces mécanismes constituent des pistes thérapeutiques potentielles. Pour la plupart de ces pistes, des modulateurs ont été décrits et présentent donc un intérêt thérapeutique. Pour chacune de ces pistes candidates, nous avons retenu un ou plusieurs agents capables de corriger les altérations observées in vitro. Le présent projet propose d'évaluer leur potentiel in vivo en suivant l'évolution de la force musculaire chez des souris modèle génétique de la myopathie à cores. Ainsi, l'objectif de notre étude est d'identifier des candidats médicaments ayant la capacité de redonner de la force musculaire à des patients atteints de myopathie à cores afin d'améliorer leur espérance et leur qualité de vie.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre étude est d'identifier des candidats médicaments ayant la capacité de redonner de la force musculaire à des patients atteints de myopathies.

Procédures

1- injection dans l'abdomen de l'agent chimique permettant l'induction de la mutation: 1 fois par jour pendant 5 jours; durée moins de 30 secondes. 2- test de comportement pour la mesure de la force: entrainement et réalisation du test : 1 fois par semaine, 12 semaines, durée moins de 5 minutes par test. 3- Test de course: entrainement et réalisation du test tous les 15 jours, pendant 12 semaines, durée moins de 30 minutes par test. 4- injection de l'agent thérapeutique par différentes voies, une fois par semaine; durée moins de 30 secondes pour l'injection dans l'abdomen, jusqu'à 5 min anesthésie comprise pour l'injection dans le muscle. Ces injections n’auront pas lieu si le traitement dans l’eau de boisson ou dans les croquettes est possible.

Impact sur les animaux

1- Une souffrance légère liée à la répétition des injections est à envisager ainsi que les risques de formation d’un hématome au site d'injection. 2- La perte de la force musculaire et la perte de poids liées au modèle de la myopathie. 3- l'injection dans le muscle peut engendrer une douleur au site d'injection, elle se réalisera sous anesthésie gazeuse. 4- une perte de poids ou autres effets secondaires actuellement imprévisibles des candidats médicaments

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever les muscles et réaliser des analyses moléculaires

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'agents et donc le nombre d'animaux vivants utilisés, un grand nombre de candidats médicaments seront testés sur des cellules musculaires in vitro. Les candidats médicaments les plus efficaces seront testés chez les animaux. Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation de la force musculaire d'une myopathie génétique et d'en suivre l'évolution au cours d'un traitement thérapeutique.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'agents et donc de réduire le nombre d'animaux vivants utilisés, les candidats médicaments sont auparavant testés sur des cellules musculaires en culture. Seuls les plus efficaces seront testés chez les animaux. Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de répétitions des expériences sont déterminés à l'aide de tests statistiques appropriés tout en optimisant l'interprétation statistique des informations recueillies. Aussi souvent que possible, afin de limiter le nombre d'animaux, un seul groupe controle sera utilisé en parallèle de deux groupes traités simultanément.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du premier février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Les injections dans l'abdomen sont réalisées à l'aide d'aiguilles fines et changées pour chaque animal afin de limiter l'apparition d'hématome suite aux injections répétées, le site d'injection (droit ou gauche) est changé chaque jour. Les injections intra musculaires se réaliseront sous anesthésie. De la nourriture gélifiée et appétente est donnée lors de la perte de poids liée à la fonte musculaire observée chez les animaux modèles de la myopathie. Les tests de comportement sont réalisés après une période d'entrainement permettant de limiter le stress de la nouveauté. Enfin, une grille de cotation adaptée au modèle souris de la myopathie à cores centraux est établie et permet d'identifier et d'utiliser des points limites précoces et adaptés et de définir les critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Le projet utilisera une souche de souris permettant de modéliser les altérations musculaires observées chez des patients atteints de myopathie à cores. Il est nécessaire que le développement musculaire se déroule normalement avant d'induire la mutation dans ce modèle. Ainsi les animaux seront étudiés dès l'âge de 8 semaines, car les fibres musculaires sont matures à partir de ce moment là.

652 souris du modèle mdx de la myopathie de Duchenne vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'ocytocine ou de prednisolone trois jours par semaine pendant cinq semaines à cinq mois, puis passent une batterie de tests comportementaux nommés, labyrinthe en croix surélevé, test clair-obscur, open-field, interaction sociale et contention. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des injections et justifie le recours à l'animal par l'interaction entre plusieurs organes. L'ocytocine étant déjà approuvée par la FDA, le porteur présente son passage en clinique comme facilité, au conditionnel.

Objectifs

En l'absence de traitement, la corticothérapie est le seul traitement palliatif actuellement utilisé pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le corticothérapie (prédnisolone) présente des avantages modestes sur le maintien de la force musculaire et présente également des effets secondaires indésirables comme le développement de l'anxiété, de la dépression et paradoxalement d'une faiblesse musculaire, sur le long terme. L'ocytocine (OT) est connue pour ses effets bénéfiques sur la fonction cardiaque, la régénération musculaire et dans le comportement social. En utilisant le modèle murin mdx, modèle classique de la maladie de Duchenne, le projet évaluera si la combinaison de l'OT avec la corticothérapie peut améliorer la fonction musculaire squelettique, cardiaque ainsi que le comportement social.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont que l'OT seule ou en combinaison avec la prédisone/prédnisolone pourrait constituer un traitement dans la maladie de Duchenne. En effet, les résultats obtenus fourniront des indications sur l'intérêt de combiner les 2 traitements, notamment sur le niveau d'OT des souris traitées dans les différentes conditions. Étant donné que l'OT est un médicament approuvé par la U.S. Food and Drug Administration (FDA), la faisabilité d'une application clinique rapide est forte.

Procédures

Les animaux seront injectés 3 jours par semaine avec de l'OT ou de la prédnisolone. Le traitement durera soit 5 semaines soit 5 mois selon les groupes. Des évaluations fonctionnelles non invasives de la force musculaire (newtonmètre), de la fonction cardiaque (échocardiographie) et respiratoire (plésthysmographie) seront réalisées. Une série de tests comportementaux sera réalisée une fois après 5 semaines de traitement et après 6 mois de traitement. Les tests sont les suivants : Les délais entre tests sont de 24h, avec la succession suivante : 1. Plus maze (durée 5 min) 2. Clair/obscur (durée 5 min) 3. Open-field (durée 15 min) 4. Interaction sociale (durée 5 min) 5. Réponse à un stress léger par contention (durée 5-6 min)

Impact sur les animaux

Il n'y a pas de nuisance ou d'effet indésirable attendus suite à l'injection d'ocytocine ou de prednisolone. Néanmoins, les animaux seront surveillés pour évaluer une possible réaction inflammatoire au site d'injection. Le stress, dû à des contentions répétées des animaux, sera également surveillé. Les animaux impliqués dans les tests d'évaluations musculaire fonctionnelles et comportementales(tests d'anxiété et d' interaction sociales) sont dans des situations soit non anxiogènes ou très peu, n’impliquant pas de stress ou inconfort majeur, cependant, les animaux seront surveillés quotidiennement.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour le prélevement des tissus (muscles, coeur et cerveau) pour des analyses biochimiques et histologiques post-mortem.

Remplacement

Le but du projet est d'explorer le rôle de l'OT thérapeutique dans la maladie de Duchenne. Dans ce contexte, afin de déceler les processus physio-pathologiques impliqués, il est nécessaire d'utiliser des animaux car les mécanismes de dégénérescence musculaire impliquent l'intéraction entre plusieurs types cellulaires et organes différents. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiopathologiques et ne serait donc pas pertinent pour la mise au point d'un traitement thérapeutique.

Réduction

Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, nous avons calculé la taille de chaque groupe d'échantillon nécessaire pour une analyse statistique.

Raffinement

Les animaux d'une même fratrie sont regroupés dans une cage. Les cages sont enrichies avec un tunnel et une maison en carton. Nous utilisons une grille de suivie et des points limites ont été déterminés en fonction des paramètres observés pour évaluer la souffrance, la détresse et l’inconfort des animaux. Selon les procédures la surveillance est effectuée par les animaliers et/ou par deux chercheurs statutaires ayant suivi la formation Expérimentation Animale. Les animaux sont observés et pesés trois fois par semaine avant chaque injection. S'il apparait que les animaux ont des difficultés pour se nourrir une supplémentation avec du dietgel , nourriture et eau au sol sera envisagé.

Choix des espèces

La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieurs (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiopathologique. De plus, la souris mdx est le modèle le plus reconnu pour étudier la maladie de Duchenne. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 6 semaines, âge où la dégénérescence musculaire reste très faible et permet ainsi d'évaluer le potentiel thérapeutique de molécules sur une période de traitement allant de 6 semaines à 5-6 mois, période où la dégénérescence musculaire cardiaque apparaît.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés subissent une amputation de la première phalange pour génotypage, puis les animaux reçoivent des injections de tamoxifène et une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle, dont on étudie ensuite la régénération sous glucocorticoïdes. Le porteur affirme que le recours à un "organisme entier" est nécessaire parce que cellules immunitaires et hormones interviennent dans la régénération, et indique n'attendre aucun effet secondaire majeur. Les bénéfices thérapeutiques évoqués restent une compréhension des mécanismes, sans application décrite à court terme.

Objectifs

Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.

Procédures

Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Tatouage et biopsie sont alors non douloureux. La phalangéctomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. La phalangéctomie et le tatouage sont des techniques d'identification utilisées depuis plusieurs décénies dans le laboratoire et ne présentent pas d'effets secondaires majeurs. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 15 semaines pour éviter les variations causées par la puberté. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Dans un premier temps, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3 et 5 jours après injection de la cardiotoxine. Puis, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la régénération musculaire et les mécanismes anti-inflammatoire en analysant les animaux à 7, 14, 28 et 60 jours après l’injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine, constituant ainsi le jour 0. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée constitutive ne nécessitant pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée constitutive.