Système musculosquelettique

1392 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Leigh, une maladie mitochondriale mortelle, elles développent une perte de poids, un retard de croissance puis une faiblesse musculaire et des difficultés respiratoires avant d'être tuées à des âges définis pour prélever leurs organes. Le porteur présente cette première étude comparative de deux modèles murins comme une source de connaissances sur une maladie sans traitement. Il affirme que les lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire les mécanismes d'adaptation de l'organisme entier.

Objectifs

Les maladies mitochondriales sont des maladies causées par des mutations du génome des mitochondries, les centrales énergétiques des cellules, ou du génome nucléaire, et à l’issue souvent fatale. Elles peuvent se manifester à tout âge et se présentent comme des maladies qui affectent généralement les muscles et le cerveau. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre ces maladies à ce jour, en raison d'une compréhension insuffisante des mécanismes sous-jacents. Des mécanismes complexes impliquant une réponse au stress lié aux déficits des mitochondries sont de plus en plus suspectés d’être impliqués dans ces pathologies. Le syndrome de Leigh représente la maladie mitochondriale pédiatrique la plus courante. C'est une maladie mortelle affectant à la fois le cerveau et les nerfs. Elle est causée par des mutations de plus de 75 gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial. Ce projet, financé par l’Association Française contre les Myopathies, vise à caractériser de manière exhaustive les mécanismes de réponse précoce au stress induits dans les organes par un dysfonctionnement des mitochondries, en comparant différents modèles de souris du syndrome de Leigh. Ceci devrait permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes physiopathologiques du syndrome de Leigh, afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Il s'agit de la première étude comparative métabolomique de 2 modèles murins du syndrome de Leigh, et qui, de ce fait, devrait apporter des connaissances importantes sur cette pathologie qui ne dispose d'aucun traitement à l'heure actuelle. Elle pourrait nous aider à identifier des cibles thérapeutiques concrêtes et jusqu'à aujourd'hui non suspectées.

Procédures

Les animaux ne vont pas subir d'intervention puisqu'ils seront euthanasiés dès qu'ils atteignent l'âge requis pour un prélèvement d'organes post-mortem (7 jours, 14 jours, 21 jours, 28 jours, 35 jours et 42 jours).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (à respectivement 4 et 3 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir qui vont à terme résulter en phénotype de faiblesse musculaire, avec difficultés respiratoires peu avant le décès (vers 8 et 7 semaines respectivement).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, car nous réalisons uniquement des prélèvements d'organes post-mortem à différents âges d'analyse.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les échantillons tissulaires destinés à la protéomique et la transcriptomique. Pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, nos expériences solides de ces méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental pour la métabolomique.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son génome est très similaire à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, l'utilisation de deux modèles du syndrome de Leigh, qui présentent des atteintes mitochondriales différentes , permettra de mieux comprendre la pathogenèse de cette maladie. Les souris seront utilisés à divers stades post-naissance, de 7 jours à 42 jours, afin de déceler les changements rapides qui s'opèrent lorsque le syndrome de Leigh se développe chez ces animaux.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de néphrectomie des cinq sixièmes, en deux temps, leur induit une insuffisance rénale chronique, suivie de quinze semaines de régime plus ou moins riche en phosphate, de passages en cage métabolique et de prélèvements de sang. Le porteur reconnaît que la chirurgie, le changement de régime et les prélèvements sont sources de douleur, et prévoit une analgésie post-opératoire. Il affirme que "seul un modèle in vivo" permet d'étudier les liens entre os, rein, intestin et aorte dans le métabolisme du phosphate.

Objectifs

La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l'insuffisance rénale chronique à cause du développement de calcifications vasculaires. En effet, le défaut de fonctionnement des reins entraine des taux élevés de phosphate circulant dans l’organisme. Nous souhaitons évaluer l’impact de la réduction de l’entrée du phosphate (=absorption) dans l’organisme sur le niveau de phosphate circulant lors de la pathologie de l’insuffisance rénale chronique et sur les complications vasculaires. Nous avons récemment découvert que des souris possédant une extinction génique de la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de phosphate réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce paramètre dans le développement des complications vasculaires au cours de l’insuffisance rénale chronique. Ce projet implique des souris contrôles et d’autres modifiées pour la BSP qui subiront une chirurgie de néphro-réduction (procédure visant à induire l’insuffisance rénale chronique). Elles recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 15 semaines avant mise à mort et prélèvements des tissus pour étudier l'impact du défaut d'absorption intestinale sur le niveau de phosphate circulant des souris malades et le développement des calcifications vasculaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous permettront d’étudier si la réduction de l’absorption intestinale du phosphate via la voie paracellulaire permet de normaliser les taux circulants de phosphate et donc d’empêcher le développement de calcifications vasculaires en condition de maladie rénale chronique.

Procédures

Certains animaux seront soumis à une chirurgie de néphro reduction des 5 /6 (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux sham auront également deux chirurgies de même durée, avec des actes mimant la néphrectomie. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures. La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (avec respect du délai d'administration - délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 15 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 23 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. En cours de protocole, une goutte de sang sera prélevée sur les animaux anesthésiés via la veine caudale. 6 et 2 jours avant la fin du protocole, les animaux recevront une injection de tétracycline (marqueur de formation osseuse). A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang va être réaliser (sur des animaux anesthésiés), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique, pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire, le passage en cage métabolique, la prise de sang et les injections.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort. L’enjeu du projet est d’étudier le développement des calcifications vasculaires donc l’arche aortique sera prélevée. De plus, d’autres organes comme le cœur, les os et le rein seront prélevés. Le sang sera également collecté en vue d’observer la modification du métabolisme du phosphate et les marqueurs de dysfonctionnement rénal.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la relation entre l’os (lieu d’expression de la BSP), le rein (insuffisance rénale chronique) et l’intestin (absorption du phosphate) et l’arche aortique (développement de calcifications vasculaires). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

Avant cette étude, une étude pilote a été réalisée. Cette dernière nous a permis de déterminer le sexe des animaux utilisés dans cette étude, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés. L’étude pilote a indiqué que nos animaux supportaient très bien la néphrectomie (2 décès sur 47 souris). Avec un risque d’erreur de type I choisi de 5% et une puissance souhaitée d’environ 60% ; il faut inclure au moins 10 animaux par groupe. Les données de littératures sur des animaux C57Bl6 indiquent un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie. De ce fait et prenant en compte les possibles décès des animaux suite à la chirurgie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique jugée robuste. Cela est en accord avec les résultats de notre étude pilote. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux, et cette évaluation sera effectuée régulièrement. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de cette procédure, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie. Concernant les injections de tétracycline en fin de protocole, elles seront effectuées par un expérimentateur habilité et formé. Les animaux seront habitués à la contention 48h avant les injections pour diminuer leur stress et également pour vérifier que la contention ne génère pas de douleur au niveau des cicatrices, bien que les cicatrices soient loin de la zone d’injection. Le prélèvement de sang sera réalisé sur animal anesthésié, la mise à mort sera rapide et sans douleur via l’injection d’un produit euthanasiant.

Choix des espèces

L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). Nous disposons au laboratoire des souris déficientes en BSP. L’étude est menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après huit semaines de traitement par une molécule dans l'eau de boisson, elles reçoivent une injection de notexine, un venin, dans un muscle de la patte, ce qui provoque une blessure musculaire et une boiterie. Le porteur indique administrer un analgésique et présente cette étude comme le prolongement fonctionnel de travaux antérieurs sur la régénération musculaire. Les souris sont tuées quatorze jours après la blessure pour analyser le muscle isolé.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser d'un point de vue fonctionnel (fonction contractile) les effets d'une molécule d'intérêt, le X309, sur la régénération musculaire après blessure musculaire chez un animal sain.

Bénéfices attendus

Des études antérieures ont montré, d'un point de vue moléculaire et histologique, les effets bénéfiques du X309 sur la prolifération de cellules souches et sur la régénération musculaire après blessure chez un animal sain. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer l'impact fonctionnel de ces effets sur les capacités contractiles du muscle isolé. Ainsi, la mise en évidence potentielle d'un gain de fonction, associée à l'amélioration moléculaire et histologique du tissu musculaire, renforcera l'intérêt thérapeutique de cette molécule dans le cas de dégénérescence musculaire.

Procédures

Les souris seront placées sous traitement X309 par eau de boisson à partir de 6 semaines d'âge jusqu'à 14 semaines d'âge soit 8 semaines de traitement. A 12 semaines d'âge, tous les animaux de cette étude seront soumis à une injection de notexine dans le muscle tibialis anterior de la patte postérieure gauche, à l'origine d'une blessure musculaire. Cette opération sera effectuée une seule fois par animal, l'intervention dure en moyenne 10 minutes, et sera effectuée sous anethésie gazeuse (isoflurane) et après une injection d'antalgique (Buprénorphine).

Impact sur les animaux

Ce modèle de lésion musculaire suite à l'injection intramusculaire de notexine est reconnue sans toxicité systémique. Néanmoins, la blessure musculaire peut entrainer de l'inconfort, avec une perte de fonction du muscle engendrant une boiterie.

Devenir

L'exploration des propriétés contractiles sur muscle isolé, 14 jours après l'induction de la blessure musculaire, nécessite l'euthanasie préalable des animaux.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle alternatif non animal pour évaluer les effets délétères d'une lésion musculaire sur la fonction contractile d'un muscle isolé et donc les bénéfices éventuels de traitement pharmacologique sur ces atteintes. Aussi, le modèle de lésion musculaire induite chez les rongeurs par injection intramusculaire de notexine est bien documenté dans la littérature scientifique et est un modèle d'étude reconnu.

Réduction

Le nombre d’animaux estimé dans ce protocole est suffisant pour justifier d’une pertinence scientifique, et est réduit au maximum tout en tenant compte de la validité statistique, des contraintes du modèle et des approches expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon la règlementation en vigueur. Le modèle de lésion musculaire suite à l'injection intramusculaire de notexine est reconnu sans toxicité systémique. cependant, la blessure musculaire peut entrainer une douleur et de l'inconfort, avec une perte de fonction du muscle engendrant une boiterie. Aussi, un antalgique (buprénorphine) sera administré par voie intra-péritonéale avant l'injection de notexine. Dans les jours suivants l'opération, les animaux seront également observés 2 fois par jour, et si un inconfort est observé une nouvelle injection de buprénorphine sera effectuée. Des granulés de nourriture seront également disposés dans la cage pour éviter aux souris d'avoir à s'accrocher aux grilles, afin de limiter aux maximum les conséquences de la perte de fonction musculair

Choix des espèces

le modèle de lésion musculaire induite chez les souris par injection intramusculaire de notexine est bien documenté dans la littérature scientifique et est un modèle d'étude reconnu. Les animaux seront traitées de 6 semaines d'âge à 14 semaines d'âge, et la lésion musculaire par injection de notexine sera induite à 12 semaines d'âge. Ce projet a pour objectif de compléter une étude ayant mis en évidence les effets du X309 sur la régénation musculaire d'un point de vue histologique et moléculaire. Le modèle animal, la durée du traitement, les stades de lésion et d'exploration sont donc identiques à ceux de cette précédente étude.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intramusculaires ou intraveineuses de formulations d'ARN messager, puis une injection intrapéritonéale d'un substrat luminescent avant plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer six nanoparticules lipidiques et trois structures d'ARNm destinées à des vaccins anticancer et à la régénération tissulaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement fiable n'est disponible et que le recours à l'animal est "indispensable" pour tenir compte des interactions avec l'"organisme". Les souris sont tuées à la fin pour quantifier l'ARN dans les organes.

Objectifs

Le projet consiste en l'augmentation de l'efficacité de la vaccination anticancer par ARN et dans l’augmentation de l’efficacité de nos stratégies de régénération tissulaire à base d’ARNm. Nous voulons comparer différentes formulations et différentes structures d’ARNm. Les fins thérapeutiques sont la vaccination ARNm et la régénération tissulaire. Il n'existe pas de système permettant de modéliser l'interaction croisée des formulations d’ARNm de différentes structures avec l’organisme. De tels résultats ne peuvent pas être obtenus par des expériences in cellulo. C’est pour cette raison que l’utilisation de modèle animaux est indispensable pour évaluer l’impact des différentes formulations et structures d’ARNm sur la traduction des ARNm in vivo. Dans ce projet, nous allons tester des LNP :6 types de nanoparticules lipidiques (LNP) ainsi que 3 différentes structures d’ARNm pour maximiser l’expression de l’ARNm in vivo. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner pour chaque formulation la structure d’ARNm entraînant la plus forte expression in vivo après injection intramusculaire ou intraveineuse.

Procédures

Les souris vont recevoir des injections intramusculaires ou intraveineuses de formulations ARNm. Les souris recevront par voie intrapéritonéale le substrat de la luciférase avant imagerie à 6h, 24h et 48h. Les souris seront anesthésiées sous isofluorane (2%) durant les injections intramusculaire ou intraveineuse des formulations ainsi que durant l'injection intrapéritonéale du substrat de la luciférase.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille. Nous prendrons en compte la douleur générée ar les injections intramusculaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour quantifier l'ARNm dans les organes où le signal a été détecté.

Remplacement

L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.

Réduction

l’effectif des souris mis en oeuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux

Raffinement

les méthodes utilisées seront mises en oeuvre par du personnel formé (niveau chirurgie) et les points limites sont validés par le comité éthique local. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive chez la souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrose leur est induite par injections de collagénase dans le genou, suivies de l'injection d'agents dits sénothérapeutiques et de deux prélèvements sanguins à la queue, avant la mise à mort pour prélever l'articulation. Le porteur indique que l'injection de collagénase peut provoquer une douleur au genou, et attend des bénéfices à long terme, aucun traitement n'existant à ce jour contre l'arthrose. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la sénescence cellulaire dans l'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

Comme évoqué précédemment, l’arthrose est la maladie la plus répandue en rhumatologie. Elle consiste en une dégradation progressive du cartilage. Aucun traitement n’est disponible. Il a été montré, dans une récente étude in vitro et in vivo, chez la souris ou sur des prélèvements de patients, que la sénescence cellulaire s’accumule dans le cartilage arthrosique. Cette découverte a permis de proposer une nouvelle approche thérapeutique de l’arthrose en ciblant les cellules sénescentes par injection d’agents dits séno-thérapeutiques. Nous proposons ainsi, dans ce projet, de : 1- établir la présence de cellules sénescentes dans un modèle d’arthrose induite à la collagénase chez les souris jeunes et âgées; 2- de valider l’effet sur la sénescence induite par l’arthrose d’agents séno-thérapeutiques (molécules, anticorps ou cellules) que nous avons identifié au cours d’études in vitro dans le laboratoire.

Bénéfices attendus

Nous attendons des bénéfices à long terme, le but étant de retarder et/ou éliminer l’accumulation des cellules sénescentes articulaires qui entrainent le développement de l’arthrose.

Procédures

Procédures chirurgicales : injection intra-articulaire (2 fois avec la collagénase et 1 fois avec la molécule sénothérapeutique), le temps d'une injection + Prélévement caudal 2 fois.

Impact sur les animaux

L’injection de la collagénase en intra-articulaire peut induire une douleur au niveau du genou.

Devenir

A la fin du projet, les souris seront sacrifiées pour permettre le prélevement de l'articulation du genou.

Remplacement

L’analyse du rôle de la senescence cellulaire et de son traitement sur un modèle d'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n’est donc pas possible de prévoir une méthode substitutive pour répondre à la question scientifique de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé en tenant compte des pertes éventuelles lors des protocoles et en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrose chez la souris et de mise en évidence d'effet significatif sur les paramètres histologiques mesurés en fin d'expérience.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Les injections intraarticulaires se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter au maximum la souffrance et l'angoisse infligé aux animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Le modèle murin d'arthrose induite à la collagénase présente l’avantage de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’Homme, c'est-à-dire chez le sujet jeune après le trauma articulaire ou chez le sujet âgé par une arthrose spontanée. Les animaux seront utilisés à 2 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à l’arthrose induite. Chez les souris de 18 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à une arthrose spontanée et naturelle. Sur les 2 modèles (jeunes et âgées), on va étudier l’effet de l’élimination de ces cellules sénescentes par des injections articulaires d’agents séno-thérapeutiques

361 rongeurs, 280 souris et 81 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs du défaut génétique de la maladie de stockage du glycogène de type III, ils reçoivent une injection unique d'un vecteur de thérapie génique à doses croissantes, quatre anesthésies générales, des prélèvements sanguins répétés et des tests de force musculaire, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de déterminer la dose efficace de cette thérapie génique en développement non clinique, en vue d'une future application chez l'humain. Le porteur affirme que le ciblage simultané de trois tissus n'est pas réalisable in vitro et que les deux espèces sont nécessaires, seul le rat reproduisant l'atteinte cardiaque.

Objectifs

La maladie de stockage du glycogène de type III (ou GSD III pour glycogen storage disease III) est une maladie génétique héréditaire rare causée par des mutations dans le gène AGL (pour amyloglucosidase glucanotransférase) qui fabrique l’enzyme débranchante du glycogène nommée GDE. Cette enzyme joue un rôle essentiel dans la transformation du glycogène, molécule de stockage composée de successions de glucose, en unité élémentaire de glucose dans les muscles et le foie. Dans la pathologie, le glycogène non décomposé s’accumule dans les muscles squelettiques et cardiaque et dans le foie, altérant leurs fonctions. L'apparition de la maladie commence dès la petite enfance et comprend l'hypoglycémie, l'hyperlipidémie (excès de graisses dans le sang) et l’élévation des taux sanguins d'enzymes hépatiques causée par la mort des cellules du foie. Au niveau du foie, les symptômes tardifs peuvent inclure une hépatomégalie (foie anormalement gros), reflétant une affection chronique (cirrhose) et, parfois, des tumeurs hépatiques non cancéreuses. Des maladies du cœur peuvent apparaitre. Les fonctions immunitaires sont altérées. Certaines personnes sont de petite taille. Aucun traitement curatif n'existe à ce jour. Notre étude vise à définir la dose efficace d’un traitement de thérapie génique ayant pour but de réintroduire un gène fonctionnel fabriquant la GDE dans les cellules hépatiques et musculaires. Un vecteur recombinant dérivé d’un virus portant le gène AGL fonctionnel sera injecté à doses croissantes dans des modèles de souris et de rats porteurs du défaut du gène agl et l'effet de la thérapie génique sera évalué au cours du temps au niveau des fonctions musculaires, cardiaques et hépatiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris et les rats porteurs du défaut du gène agl devraient permettre de stabiliser ou de diminuer l'accumulation de glycogène au niveau du foie et des muscles squelettiques et cardiaques, ce qui devrait entrainer une régénération des tissus, une amélioration de la masse et de la force musculaire et une amélioration de la fonction cardiaque. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace du traitement sur tous les organes cibles afin d'envisager, dans un second temps, une application clinique pour le traitement de la GSDIII par thérapie génique.

Procédures

Les souris et les rats recevront tous une injection intraveineuse unique de vecteur thérapeutique en début de protocole : chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Pour réaliser l’ensemble des tests et prélèvements, les souris et les rats recevront 4 anesthésies générales par voie intrapéritonéale. Chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures de test fonctionnels de suspension et de test d'agrippement et trois mesures de l'activité électrique musculaire espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques. Les rats subiront 3 mesures d’électrocardiogramme et d’échocardiogramme. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les rats subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats seront euthanasiés après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des périodes de jeûne contrôlé de 4 heures avant les prélèvements sanguins, ce qui pourraient entrainer une sensation de faim, de stress et une hypoglycémie. Ils seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention pour les injections intraveineuses, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation fonctionnelle seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil en cas de surdosage. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un petit morceau de queue ou d’oreille (acte réalisé pour l’identification des animaux), au moment des injections intraveineuses du produit thérapeutique, des injections intra-péritonéales d’anesthésique, des injections sous-cutanées d’analgésique, ainsi qu’un moment des prélèvements de sang par voie sous-mandibulaire. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par la pose d’électrodes transcutanés au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire réalisés sur animal éveillé, notamment si un animal présente des blessures aux griffes ou aux pattes au moment du test. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.

Devenir

P1 et P2: Euthanasie. P3: toutes les souris hétérozygotes seront euthanasiées, toutes les souris homozygotes seront utilisées dans la procédure 1, une partie des souris wild-type sera utilisée dans la procédure 1 (14 souris) et le reste des souris wild-type sera euthanasié (56 souris).

Remplacement

Le projet consiste à mesurer l'effet thérapeutique du transfert génétique du gène agl au niveau du foie, du cœur et des différents muscles squelettiques: ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler trois tissus simultanément in vitro et d’étudier la biodistribution relative de notre molécule thérapeutique entre les différents organes cibles. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une amélioration de la fonction musculaire dans les 2 modèles murins utilisés (souris et rats). Ces calculs permettent de prévoir un effectif de 7 souris et de 8 rats par groupe et par sexe, les deux sexes devant être inclus dans les études de recherche de dose thérapeutique afin de prendre en compte une éventuelle variabilité des effets liée au sexe (soit 14 et 16 individus par groupe pour les souris et les rats, respectivement). Pour les études réalisées sur les souris, 4 doses seront testées en parallèles d’un témoin non traité et d’un groupe de référence d’animaux en bonne santé, et 3 doses seront utilisées pour les études réalisées sur les rats avec les mêmes groupes témoins, soit un total de 84 souris et de 80 rats pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les souris et les rats étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les animaux recevront une injection unique du traitement par veine caudale, et subiront 3 prélèvements de sang au cours des 4 mois du protocole (un avant le traitement et un tous les deux mois). Ces prélèvements seront réalisés au niveau d'une veine du museau sur animaux vigiles maintenus en contention (souris) ou sous anesthésie gazeuse (rats). Les animaux subiront également un prélèvement de sang d’un volume plus important au moment de l’euthanasie, par prélèvement au niveau du sinus rétro-orbital, sous anesthésie générale. Au cours du protocole, tous les animaux seront soumis à différents tests fonctionnels permettant de mesurer l’effet du traitement au niveau des muscles squelettiques (souris et rat) et du cœur (rats seulement). Les tests douloureux seront réalisés soit sous anesthésie gazeuse, soit sous anesthésie générale et un antalgique fort sera administré par voie sous cutanée avant de le réaliser. Le même antalgique sera également administré pendant les 48 heures qui suivront la fin de certains tests. Tous les tests fonctionnels seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur les pathologies génétiques. Le modèle de souris de la GSDIII permet une évaluation fonctionnelle très complète de différents groupes musculaires, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque des individus affectés par la GSDIII. Le rat est le seul modèle reproduisant cet aspect de la pathologie. L'utilisation des deux modèles de GSDIII permettra de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. Les souris et les rats seront de jeunes adultes âgés de 4 mois au moment du traitement et de 8 mois à la fin du protocole. La caractérisation préalable des deux modèles a permis de déterminer que la pathologie sera déjà présente au moment du traitement, ce qui permettra de tester l’effet de réversion de la pathologie, et non pas sa simple prévention. Ce choix permet de se rapprocher au plus juste de la pathologie humaine, qui sera traitée majoritairement après l’apparition des symptômes.