Système musculosquelettique
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Caractérisation du modele de rat DMD avec une etude comparative de l’efficacité de deux produits de therapie genique MODIFICATION
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Tous tués pour le prélèvement de tissus et de fluides, 426 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteurs d'une mutation qui reproduit la dystrophie musculaire de Duchenne, ils subissent l'ablation d'un bout de queue pour génotypage, une injection intraveineuse de vecteur viral sur animal éveillé, des prises de sang répétées et une batterie de mesures allant d'une heure de test de force à trente minutes d'exploration respiratoire, sous trois anesthésies générales. Le porteur indique que l'électromyographie et certains tests de force peuvent provoquer des lésions inflammatoires douloureuses, et que l'épilation nécessaire à la mesure cardiaque irrite la peau, avant de conclure que ces nuisances restent "localisées et réversibles". Le rat a été retenu parce que la souris ne développe pas l'atteinte cardiaque de la maladie, et l'objectif immédiat est de fixer la dose minimale efficace de deux produits de thérapie génique en développement.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire récessive liée au chromosome X et elle est causée par des mutations du gène DMD qui entraînent la perte de la protéine dystrophine, une protéine essentielle à la santé et au fonctionnement des muscles. Cette mutation affecte les muscles et provoque leur atrophie progressive causant une perte progressive de la fonction motrice avec, à terme, la perte de la capacité de marcher, puis une insuffisance respiratoire et une cardiomyopathie. La dystrophie musculaire de Duchenne se manifeste dès les premières années de la vie et malheureusement il n'existe pas encore de traitement curatif. La thérapie génique est en cours d’études pour re-établir l’expression de la protéine dystrophine dans les muscles et traiter la maladie. Il existe très peu de modèles animaux de la maladie Duchenne qui manifestent tous les symptômes de la maladie et sur lesquelles les études d’efficacité peuvent être amené. Le modèle de souris reproduit bien la pathologie au niveau des muscles squelettiques, mais seul le modèle de rats présente un déficit cardiaque représentatif de la pathologie. Pour cela nous envisagions la création d’une lignée de rat DMD pour déterminer les anomalies fonctionnelles au niveau des muscles du cœur et le biomarquers sanguing. L’étude de ce modèle au cours du temps nous permettra de mieux comprendre les processus pathologiques afin d’envisager les stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La caractérisation du modèle rat DMD nous permettra de déterminer la fenêtre optimale pour le traitement par thérapie génique dans la phase suivante. A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les rats DMD devraient permettre d’exprimer la protéine dystrophine au niveau des muscles squelettiques et cardiaques, ce qui devrait entrainer une amélioration du phenotype dystrophique. Ce projet de développement non clinique permettra de comparer la dose minimale efficace de deux terapie genique afin d'envisager, dans un second temps, une application clinique pour le traitement de la DMD par la thérapie génique chez les patients.
Procédures
Afin d’identifier le fond génétique de l’animal, un prélèvement d’un bout de queue sera réalisé sur chaque animal. En cas de doute sur l’échantillon, un deuxième prélèvement sera réalisé à l’oreille au cas par cas. Chacun de ces gestes ne durera en moyenne pas plus d’une minute. Les molécules thérapeutiques (virus non pathogènes transportant le médicament) seront délivrées par une injection intraveineuse unique sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés au cours du temps sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes) ou anesthésié (10 minutes maximum avec l’anesthésie). Les rats seront soumis à des tests permettant de mesurer la fonction de différents organes : mesure de la force musculaire (durée moyenne 1 heure), mesure de l’activité électrique du cœur (durée moyenne 30 min), mesure de l’activité électrique du muscle (durée moyenne 15 min), mesure de la fonction cardiaque (durée moyenne 20 min), mesure de la fonction respiratoire (durée moyenne 30 min), mesure d’activité et de mobilité et mesure de composition corporelle (durée moyenne 15min). Certains de ces tests nécessitent une anesthésie ou un traitement antidouleur préalable : pour réaliser l’ensemble des tests, les rats recevront trois anesthésies générales par voie aérienne, une injection d’un traitement antidouleur et une injection d’une molécule anesthésique avant l’euthanasie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention, ce qui pourrait entrainer un stress. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un bout de queue ou d’oreille, des injections du traitement thérapeutique, des injections de molécules anesthésiques ou antidouleurs, ainsi qu’au moment des prélèvements de sang. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire. Une sécheresse oculaire pourrait être observée au cours des anesthésies gazeuses. Des irritations de la peau pourraient être observées à l’endroit de l’épilation nécessaire pour la mesure de la fonction cardiaque. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements et analyses des tissus et des fluides.
Remplacement
La maladie de Duchenne est causée par l’absence d’une protéine appelée la dystrophine : les muscles et le cœur perdent progressivement leurs fonctions. Le projet consiste à mesurer l'effet d’un médicament composé d’un virus non pathogène transportant la dystrophine au sein des cellules cardiaques et musculaires malades : ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du médicament entre les différents organes. De plus, l’utilisation de virus transporteurs de notre médicament entraine une réaction de défense immunitaire de l’organisme contre les virus, réaction impossible à recréer en laboratoire à ce jour. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.
Réduction
Le nombre de rats utilisés dans ce projet a été réduit grâce à :1) le calcul par des tests statistiques des effectifs minimaux mais adéquats permettant une analyse fiable et une exploitation garantie des résultats (groupes de 10 ou 11 rats selon les procédures) ; 2) l’analyse d’un maximum de paramètres chez chaque animal (plusieurs dizaines) ; 3) l’obtention des rats non malades et malades en utilisant les mêmes croisements parentaux et 4) un suivi quotidien, des règles strictes de raffinement et le respect des points limites permettant de garantir le bien-être animal et l’exploitation de toutes les données produites.
Raffinement
Les conditions d'hébergement et d'enrichissement du milieu sont gérés par le CERFE. Les animaux seront surveillés et pesés à minima 1 fois par semaine pendant tout le protocole pour détecter tout signe de souffrance. Des points limites ont été définis et seront respectés. Les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation avant certains tests visant à mesurer le fonctionnement des muscles. Lors de certains de ces tests, il y a un risque exceptionnel de blessures aux griffes : dans ce cas, un traitement avec un désinfectant sera appliqué jusqu’à la guérison. Afin de contrôler la douleur et le stress de l’animal, certains tests seront réalisés sous anesthésie gazeuse ou sous anesthésie générale et un antidouleur sera administré avant et pendant les 48 heures qui suivront la fin des tests. Dans le cas d’animaux anesthésiés, les tests seront réalisés sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle constante. Une application de crème anti-irritation sera appliquée sur le thorax des animaux après l’épilation nécessaire pour la mesure du fonctionnement du cœur. Tous les tests seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés une fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance. Les rats étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés par la communauté scientifique pour mesurer l'efficacité de médicaments pour la maladie de Duchenne (DMD), pathologie qui affecte le bon fonctionnement des muscles et du cœur. Le modèle de souris de cette maladie permet une évaluation très complète des différents muscles, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque typique des Hommes affectés par la maladie. Le rat est le modèle reproduisant tous les aspects de la pathologie (atteinte des muscles et du cœur). L'utilisation du modèle de rats DMD permettra donc de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. Les rats utilisés seront de jeunes adultes âgés de 1 mois à 9 mois. La caractérisation préalable du modèle permettra de déterminer à quel moment la pathologie apparait et son évolution, ce qui permettra de tester l’effet du traitement à différents stades de progression de la maladie (prévention ou guérison), afin de se rapprocher au plus juste des différentes conditions de traitement qui seront testées sur les malades humains.
Étude de nouvelles approches thérapeutiques contre la drépanocytose chez des souris Townes
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Quatre-vingt-dix souris atteintes de drépanocytose vont courir sur tapis roulant une heure par jour, cinq jours par semaine, pendant quarante séances. 215 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de sang et de muscles. Le RNT décrit chez les patients des crises vaso-occlusives déclenchées par l'effort physique, avec des douleurs musculaires intenses, et ne retient de ces courses forcées qu'une "fatigue et détresse modérée". Les souris utilisées ont une espérance de vie raccourcie, une anémie chronique et une fonction musculaire diminuée, et subissent en plus deux explorations de quatre-vingt-dix à cent cinq minutes sous anesthésie générale.
Objectifs
Avec plus de 7 millions de personnes atteintes dans le monde, la drépanocytose, aussi appelée anémie falciforme, est la maladie génétique héréditaire la plus répandue. Cette pathologie des globules rouges, pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement efficace, est due à une mutation génétique provoquant une déformation des globules rouges qui, de forme biconcave à l’état normal, vont prendre l’aspect d’une faucille. Les globules rouges falciformes, qui sont plus rigides que les globules rouges normaux, vont avoir tendance à se bloquer dans les microvaisseaux conduisant ainsi à des crises vaso-occlusives lors d’un effort physique. Ces crises causent des dysfonctionnements dans tous les organes avec notamment des douleurs musculaires intenses et des difficultés respiratoires pouvant mettre en jeu le pronostic vital des patients. Par ailleurs, la fragilité accrue des globules rouges falciformes provoque leur destruction en excès, aboutissant à une anémie chronique (c’est-à-dire un faible taux de globules rouges dans le sang) associée à une réduction de l’oxygénation tissulaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à améliorer la fonction musculaire chez un modèle murin de la drépanocytose. Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette pathologie, ce projet est une première étape indispensable avant d’envisager une application clinique.
Procédures
1) Tous les animaux (n=215) réaliseront sous anesthésie générale un protocole totalement non invasif consistant en une phase d’exercice-récupération. Ce protocole (d’une durée de 90 à 105 min) sera réalisé deux fois à 3 jours d’intervalle, 2) Les souris soumises à l’entrainement en endurance (n=90) réaliseront 40 sessions de course sur tapis roulant (durée d’une heure, 5 jours par semaine). 3) Les traitements pharmaceutiques contre la drépanocytose seront administrés dans l'eau de boisson (pour l'hydroxyurée) et dans la nourriture (Mitapivat). 4) Pour tous les animaux (n=215), des prélèvements de sang et de certains muscles seront réalisés sous anesthésie générale (en semaine 10 de manière à laisser aux muscles le temps de récupérer d’un point de vue métabolique et fonctionnel après leurs explorations) immédiatement avant leur euthanasie.
Impact sur les animaux
1/ Les courses sur tapis roulant pourront engendrer une fatigue et une détresse modérée. 2/ Les explorations RMN pourront provoquer un stress léger de l’animal pendant les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil. 3/ Les molécules administrées sont déjà utilisées dans le cadre clinique et ne cause aucun effet nuisible. 4/ Des souris atteintes de drépanocytose seront utilisées dans ce projet. Les conséquences connues de cette pathologie sur la vie de ces animaux sont une espérance de vie raccourcie de quelques mois, une moindre fertilité, une anémie et une réduction de la fonction musculaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés après les expérimentations car des prélèvements de sang et de certains muscles seront nécessaires pour réaliser des dosages biochimiques et des analyses histologiques complémentaires à nos enregistrements RMN.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de tester chez un modèle murin de la drépanocytose humaine si la supplémentation chronique en hydroxyurée ou en Mitapivat, combinée à un entrainement en endurance produit des effets bénéfiques par le biais d’une action synergique. Les critères métaboliques et fonctionnels que nous allons étudier sont de types physiologiques, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux de manière longitudinale ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours aux techniques RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal des mesures du métabolisme énergétique dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques de biochimie qui auraient nécessité de sacrifier des cohortes d’animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser des dosages métaboliques sur biopsies musculaires. Ainsi, notre approche nous permettra de limiter le nombre d’animaux à 215.
Raffinement
Les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage) en milieu adapté (armoires ventilées maintenues à température constante et éclairage alterné) et enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation (coton), d’abris en plastique permettant aux animaux de se cacher, et de bûchettes de bois destinées à être rongées. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières sera effectué une fois par semaine. Par ailleurs, l’utilisation de nos techniques sur animaux anesthésiés par inhalation gazeuse permettra, du fait de leur caractère non invasif et totalement indolore, de réduire le stress. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal. A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale induite par inhalation gazeuse afin de réduire au maximum leur douleur et leur détresse. Il est également important de préciser qu’une fois arrivés dans nos locaux, tous les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 3 semaine avant le début des expérimentations.
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’Homme et qui soit génétiquement modifiable. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris utilisées seront âgées de 5 mois au début de l’étude, lorsqu’elles présentent une masse musculaire suffisante pour l’étude du métabolisme énergétique, de l’oxygénation et de la fonction musculaire avec nos méthodologies. L’évolution ontogénique de l’hémoglobine étant terminée après 3 semaines dans ce modèle de souris, ces animaux représenteront bien un modèle de drépanocytose chez l’adulte.
Caractérisation fonctionnelle des atteintes neuromusculaires dans un modèle de rat de neuropathie périphérique génétique axonale liée au gène Mfn2
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Aux stades avancés de la maladie, les rats peuvent ne plus accéder à la nourriture ni à l'eau, et ceux dont l'état général se dégrade sont tués par anticipation. 30 rats porteurs d'une mutation du gène Mfn2, qui reproduit la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À six semaines, trois mois et cinq mois, ils passent une mesure de force d'agrippement, une analyse de la marche et un test du faisceau rétréci, de cinq à dix minutes chacun. Tous seront tués pour peser leurs muscles et mesurer les propriétés contractiles de muscles isolés, le projet ne visant pas à les soigner mais à repérer des paramètres de suivi utilisables dans de futurs essais thérapeutiques.
Objectifs
La neuropathie périphérique axonale liée au gène Mfn2 (correspondant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A ou CMT2A) est une affection génétique du système nerveux périphérique caractérisée par une dégénérescence progressive des axones, entraînant des déficits moteurs et sensitifs prédominant aux extrémités des membres. Malgré une compréhension partielle des mécanismes physiopathologiques impliqués, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de caractériser de manière fonctionnelle les atteintes neuromusculaires dans un modèle de rat CMT2A, porteur de cette mutation. Cette étude vise à décrire l’installation et la progression des déficits moteurs et musculaires par une approche intégrée combinant des évaluations in vivo longitudinales et des analyses in vitro à des temps clés. Elle a pour finalité d’identifier des paramètres fonctionnels pertinents et robustes, en lien avec la physiopathologie de la maladie, pouvant servir de critères de suivi de la progression et d’outils d’évaluation dans un contexte de développement thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des atteintes neuromusculaires associées aux neuropathies périphériques axonales liées au gène Mfn2, en documentant leur installation et leur progression dans un modèle préclinique pertinent. L’identification de paramètres fonctionnels robustes et reproductibles contribuera à définir des critères objectifs de suivi de la maladie. Ces éléments constituent un prérequis essentiel au développement et à l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques, en facilitant la mise en place d’études précliniques et en renforçant la transposabilité des résultats vers la clinique.
Procédures
Au cours de la période de suivi, les animaux seront soumis à des tests non invasifs d’exploration fonctionnelle réalisés sur animaux vigiles, incluant des évaluations de la force musculaire, de la marche et de la coordination motrice. Chaque test a une durée comprise entre 5 et 10 minutes. Ces évaluations seront réalisées à trois reprises au cours du projet, aux âges de 6 semaines, 3 mois et 5 mois. En fin d’étude, les animaux seront soumis à une procédure terminale comprenant une anesthésie suivie d’une euthanasie conforme à la réglementation, puis à des prélèvements tissulaires (muscles squelettiques et cœur) réalisés après confirmation de la mort.
Impact sur les animaux
Les tests fonctionnels non invasifs (mesure de la force d’agrippement, analyse de la marche, test du faisceau rétréci) peuvent induire un stress léger à modéré lié à la manipulation des animaux et à leur isolement temporaire. La répétition des mesures au cours du suivi longitudinal peut également entraîner une fatigue passagère. L’évolution de la pathologie elle-même peut entraîner une altération progressive de l’état général, se traduisant notamment par des troubles locomoteurs, une diminution de la force musculaire et, potentiellement, des difficultés d’accès à la nourriture ou à l’eau aux stades avancés.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de la procédure expérimentale afin de permettre la réalisation d’analyses terminales indispensables à la caractérisation du phénotype neuromusculaire. Ces analyses incluent notamment la mesure de la masse de différents muscles ainsi que l’étude des propriétés contractiles de muscles isolés, qui ne peuvent être réalisées que sur des tissus prélevés post-mortem.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal permettant de caractériser de manière intégrée le phénotype neuromusculaire associé à une neuropathie périphérique axonale liée au gène Mfn2. Les approches in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre système nerveux périphérique, muscle et contrôle moteur, ni d’évaluer la progression de la maladie à l’échelle de l’organisme. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour étudier de façon fonctionnelle et longitudinale les altérations neuromusculaires et identifier des paramètres pertinents de suivi.
Réduction
Le nombre d’animaux a été défini au strict minimum nécessaire pour garantir la validité scientifique des résultats, tout en respectant le principe de réduction. Sur la base de données issues de la littérature et d’expériences antérieures sur des modèles similaires, un effectif de 15 animaux par groupe a été retenu.Ce nombre est nécessaire pour mettre en évidence de manière fiable les différences attendues entre les animaux porteurs de la mutation et les animaux témoins sains. Afin de limiter la variabilité expérimentale, les groupes seront constitués d’animaux issus de plusieurs portées, avec inclusion d’animaux mutés et témoins issus des mêmes portées lorsque cela est possible. Cette stratégie permet de contrôler les effets liés à la portée tout en optimisant le nombre total d’animaux utilisés. Par ailleurs, une approche longitudinale sera mise en œuvre, permettant le suivi répété des mêmes animaux au cours du temps, ce qui réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Enfin, les différentes analyses (fonctionnelles in vivo et ex vivo) seront réalisées sur les mêmes individus afin de maximiser les informations obtenues par animal et d’éviter toute utilisation supplémentaire.
Raffinement
Les animaux seront hébergés conformément à la réglementation en vigueur, avec un enrichissement du milieu adapté. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de détecter précocement tout signe de gêne, de douleur ou d’altération de l’état de santé, notamment en lien avec la progression de la pathologie (troubles locomoteurs). Des critères d’arrêt anticipé, définis à partir de grilles de suivi du bien-être animal et des recommandations en vigueur, seront appliqués. En cas d’apparition de signes cliniques sévères ou d’une dégradation importante de l’état général, le responsable de l’étude et le responsable de la structure de bien-être animal (SBEA) seront informés et une euthanasie sera réalisée sans délai afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les signes observés seront évalués en tenant compte de leur persistance et de leur impact sur l’état général de l’animal. L’ensemble des évaluations fonctionnelles, validées et non invasives, sera réalisé sur animaux vigiles. Afin de limiter le stress lié à la manipulation et aux procédures expérimentales, les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation préalable à la salle d’expérimentation, aux dispositifs et à l’expérimentateur. Les tests seront réalisés dans un environnement dédié, distinct de la salle d’hébergement, et des mesures de renforcement positif (récompense après les essais) seront mises en place. L’organisation et la fréquence des tests seront optimisées afin de limiter la fatigue et l’impact sur le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal permettant de caractériser de manière intégrée le phénotype neuromusculaire associé à une neuropathie périphérique axonale liée au gène Mfn2. Les approches in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre système nerveux périphérique, muscle et contrôle moteur, ni d’évaluer la progression de la maladie à l’échelle de l’organisme. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour étudier de façon fonctionnelle et longitudinale les altérations neuromusculaires et identifier des paramètres pertinents de suivi. Les animaux seront suivis à partir du stade juvénile, dès le sevrage (3–4 semaines), et jusqu’à l’âge adulte (jusqu’à 5 mois). Les évaluations in vivo neuromusculaires seront réalisées à 6 semaines, 3 mois et 5 mois d’âge permettent ainsi de caractériser précocement les premiers signes fonctionnels, puis leur évolution au cours du temps.
Lien entre consistance des aliments et malocclusion au cours du développement postnatal
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour vérifier si une nourriture plus molle provoque des malocclusions dentaires, 168 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Mesurer la ration de chaque individu impose de les héberger seuls en cage pendant toute leur croissance, du sevrage jusqu'à 110 jours. Si les incisives de ceux qui reçoivent des granulés moins denses poussent trop faute de mastication, elles seront taillées au Dremel. Le porteur justifie la mise à mort par la résolution insuffisante des scanners réalisés sur animal vivant anesthésié pour analyser la microarchitecture osseuse.
Objectifs
Les résultats expérimentaux obtenus à partir de différents modèles animaux soutiennent l’hypothèse selon laquelle une nourriture moins consistante entraîne une diminution de la croissance faciale au niveau des arcades mandibulaire et maxillaire. Ceci est interprété comme la conséquence d’une diminution de la croissance osseuse en relation avec la diminution des contraintes biomécaniques appliquées à l’os au cours de la mastication. Cependant, la question de savoir si une alimentation plus molle constitue également un facteur causal de malocclusions et de dysmorphologies craniofaciales demeure sans réponse claire. Ce projet vise à déterminer si, en plus de la réduction de la taille, une alimentation plus molle peut être à l’origine de malocclusions et de dysmorphologies craniofaciales chez le rat de laboratoire.
Bénéfices attendus
Les mécanismes sous-jacents à l’évolution de la morphologie du squelette facial et des fonctions associées, telles que la mastication et la respiration, sont complexes et demeurent encore mal compris. Au cours des deux derniers siècles, les populations humaines ont connu plusieurs bouleversements sociaux et économiques, notamment la Révolution industrielle. Des hypothèses ont été formulées quant aux effets de cette révolution socio-économique sur la morphologie du squelette facial ainsi que sur l’augmentation des malocclusions dentaires dans les populations modernes. Cette tendance séculaire des relations squelettiques et de l’occlusion dentaire est supposée résulter d’un ramollissement général de l’alimentation, lié à la révolution agroalimentaire et à la transformation des aliments. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) identifie la malocclusion — définie comme un mauvais alignement ou une relation incorrecte entre les dents des arcades mandibulaire et maxillaire — comme un problème majeur de santé bucco-dentaire, la plaçant au même niveau que la carie et les maladies parodontales en termes d’impact sur la santé publique mondiale. Les revues systématiques et méta-analyses portant sur la prévalence mondiale des malocclusions indiquent que plus de la moitié des enfants et des adolescents dans le monde présentent un type de malocclusion. Ce nombre élevé d’enfants nécessitant un traitement orthodontique, et parfois une chirurgie cranio-faciale, représente une charge croissante à l’échelle mondiale pour les patients et les sociétés. Il existe donc un besoin crucial d’améliorer notre compréhension de ces troubles de la croissance afin de développer des programmes de prévention personnalisés. Cette expérience, permettra de quantifier l’effet de la dureté des aliments sur la morphologie et la microstructure osseuse du squelette facial.
Procédures
Aucune intervention sur les animaux n’est prévue. Les animaux seront simplement pesé régulièrement.
Impact sur les animaux
La principale nuisance pour les animaux sera liée à la nécessité de mesurer précisément la quantité de nourriture ingérée par chaque animal impliquant la présence d’un seul rat par cage et limitant ainsi les interactions sociales entre animaux. Les rats nourris avec des granulés moins denses seront surveillés afin de s’assurer que la croissance continue de leurs incisives ne soit pas excessive par manque d’activité masticatrice. Si tel était le cas, les incisives des animaux concernées seraient coupées/taillées à l’aide d’un Dremel. Aucune autre nuisance ou effet indésirable n’est anticipé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser des images microscanner par rayons X permettant l’étude du squelette. Les microscanners invivo permettant de produire des images du squelette sur des animaux anesthésiés ne produisent pas des images de qualité (résolution) suffisante pour les analyses que nous prévoyons de mener (ex. analyse de la microarchitecture osseuse).
Remplacement
Notre objectif étant d’intégrer la complexité du développement in vivo et ses interactions avec les contraintes physiques de l’environnement, une approche de Remplacement via de la simulation in silico n’est pas envisageable.
Réduction
Dans cette expérience, nous utiliserons une lignée consanguine (inbred) afin de réduire la variabilité des réponses de l’organisme aux conditions expérimentales et ainsi optimiser la taille des effectifs. Les tailles d’effectifs proposées ont été déterminées afin de conserver un niveau de puissance statistique satisfaisant pour étudier aussi de potentielles modifications de la variance intra-groupe.
Raffinement
Les rats auront un accès illimité à la nourriture qu’elle soit de dureté standard or plus molle. Le protocole expérimental n’est pas anticipé comme générant des douleurs pour les animaux. La mise à mort des animaux s’effectuera de manière standard par anesthésie à l’isoflurane puis dislocation cervicale.
Choix des espèces
Notre choix de modèle animal s’est porté sur le rat car il présente une période de croissance post-natale plus longue que la souris sur laquelle nous avons déjà mené une première expérimentation. Nous espérons ainsi maximiser l’effet des variables contrôlées de notre étude (c.à.d. dureté et quantité de nourriture) sur la morphologie et la microarchitecture du squelette facial. Notre objectif est d’étudier l’effet de la dureté et de la quantité de nourriture ingérée, de l’âge, du sexe et de la variance individuelle. Afin de déterminer l’évolution au cours du développement et de la croissance des traits étudiés, le premier stade de développement considéré sera le 21e jour postnatal (P21, après sevrage), P65, qui permettra de faire un point d’étape à mi-parcours, et P110, un stade de développement auquel on considère que notre protocole expérimental n’aura plus d’effet majeur sur la croissance, la morphologie et l’architecture interne des mâchoires.
Rôle de DICER dans l’homéostasie du muscle squelettique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Gavées quotidiennement pendant sept jours, injectées dans l'abdomen, soumises à un test de force d'agrippement, 360 souris privées de micro-ARN dans leurs fibres musculaires vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 240 d'entre elles et modéré pour 120. Le porteur conclut que ces interventions restent "transitoires et réversibles, sans conséquence durable sur la santé des animaux", tout en indiquant que ces souris présentent une faiblesse musculaire et qu'une alimentation en gel sera ajoutée dans la cage de celles qui n'accèdent plus normalement à la nourriture. Deux traitements aux glucocorticoïdes, prednisone par gavage et dexaméthasone par injection, servent à mesurer la part de l'inflammation dans les atteintes musculaires. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever leurs muscles et d'autres tissus.
Objectifs
Les micro-ARN (ou miARN) sont de très petites molécules présentes dans nos cellules, qui jouent un rôle important pour contrôler le fonctionnement des gènes. Ils agissent un peu comme des interrupteurs qui ajustent la production de protéines selon les besoins de la cellule. On sait déjà qu’ils sont essentiels pour la formation des muscles pendant le développement de l’embryon, mais on connaît encore mal leur rôle une fois que le muscle est formé, notamment chez l’adulte. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de souris dans lequel les micro-ARN sont supprimés uniquement dans les fibres musculaires, grâce à la désactivation d’un gène appelé Dicer, nécessaire à leur fabrication. Cela nous permettra d’observer comment les muscles réagissent lorsqu’ils ne peuvent plus produire ces petites molécules : leur structure, leur force, et leur capacité à bien fonctionner au quotidien. L’objectif est de mieux comprendre comment les micro-ARN participent à l’équilibre et à la santé du muscle. À plus long terme, ces recherches pourraient aider à développer de nouvelles pistes pour prévenir ou traiter certaines maladies qui provoquent la faiblesse ou la dégénérescence musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre le rôle des micro-ARN, de petites molécules qui aident les cellules à fonctionner correctement, dans la santé du muscle après la naissance. Nous nous intéressons plus particulièrement à leur influence sur la structure des fibres musculaires et sur la régulation de l’inflammation au sein du muscle. Pour cela, nous étudierons des souris chez lesquelles ces micro-ARN sont absents dans les fibres musculaires. En observant ces souris à différents âges (4 semaines, 2 mois et 8 mois), nous pourrons suivre l’évolution des éventuelles altérations du muscle et identifier les périodes où ces petites molécules jouent un rôle clé. Grâce à des analyses précises des tissus et des protéines musculaires, nous chercherons à comprendre quels mécanismes sont touchés par la perte des micro-ARN. Nous testerons également deux traitements anti-inflammatoires à base de glucocorticoïdes (prednisone par gavage et dexaméthasone par injection intrapéritonéale) afin d’évaluer dans quelle mesure l’inflammation contribue aux altérations musculaires observées. En résumé, ce projet permettra de mieux comprendre comment le muscle adulte garde son équilibre et se protège au fil du temps. Ces connaissances pourraient, à terme, aider à développer de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter certaines maladies musculaires liées à la dégénérescence ou à une inflammation chronique.
Procédures
1) Gavage oral : administration quotidienne pendant 7 jours consécutifs et habituation pendant 3 jours en amont (environ 30 secondes à 1 minute par souri). 2) Injection intrapéritonéale (IP) : administration quotidienne pendant 7 jours consécutifs (selon le groupe, 30 secondes maximum par souris). 3) Prélèvement sanguin : effectué une seule fois par animal, au moment prévu après le GRIP test et avant l'euthanasie (environ 30 secondes à 1 minute par souri). 4) GRIP test : réalisé une seule fois par animal, conformément au calendrier expérimental (environ 20 seconds par souris). 5) Contention : utilisée pendant les manipulations nécessaires (gavage, IP, prélèvement sanguin, GRIP test) uniquement pour la durée de l’intervention (environ 10 à 20 secondes par souris).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les différentes interventions expérimentales peuvent entraîner des effets indésirables ou des gênes temporaires pour les animaux. Le gavage oral, peut provoquer un léger stress transitoire, une gêne liée à la contention, ainsi que de petites irritations de l’œsophage et, plus rarement, de brèves complications respiratoires. Une légère perte de poids ou des variations temporaires du comportement alimentaire peuvent également survenir. L’injection intrapéritonéale peut provoquer un inconfort local au point d’injection et un stress léger lors de la manipulation, ainsi que, très rarement, une irritation ou inflammation locale. Le prélèvement sanguin nécessite une immobilisation brève, pouvant entraîner un stress léger et passager, et une gêne locale mineure au point de ponction, sans douleur durable ni lésion significative. Le GRIP test implique également une courte contention et une mobilisation des membres, ce qui peut occasionner un stress transitoire et une fatigue musculaire passagère. Dans l’ensemble, toutes ces interventions entraînent un niveau de contrainte modéré, avec des effets transitoires et réversibles, sans conséquence durable sur la santé des animaux.
Devenir
À l’issue des différentes procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés de manière conforme aux recommandations réglementaires (arrêté du 1er février 2013, annexe IV de la directive 2010/63/UE). Cette étape est nécessaire afin de prélever les muscles et autres tissus d’intérêt pour réaliser les analyses moléculaires, histologiques et biochimiques prévues dans le protocole.
Remplacement
Pour comprendre le rôle des micro-ARN dans le bon fonctionnement et l’équilibre du muscle, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant dans son ensemble. En effet, le muscle ne fonctionne pas isolément : il dépend de nombreux types de cellules, ainsi que de facteurs hormonaux et physiologiques qui agissent ensemble pour maintenir sa structure et sa force. Aujourd’hui, il n’existe aucun modèle en laboratoire (in vitro) capable de reproduire fidèlement ces interactions complexes entre les cellules du muscle et leur environnement. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle vivant (in vivo) est indispensable pour obtenir des résultats fiables et représentatifs du fonctionnement réel du muscle. La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce type d’étude, car son organisation musculaire et sa fonction contractile sont très similaires à celles de l’être humain. Cela permet de mieux comprendre les mécanismes en jeu chez l’Homme et, à terme, de favoriser le développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les maladies musculaires.
Réduction
Les recherches précédentes menées dans notre laboratoire ont permis d’acquérir une solide expérience du modèle utilisé et de la méthodologie expérimentale. Cela nous permet aujourd’hui de réaliser des expériences précises, bien contrôlées et de qualité, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux nécessaires. Chaque expérience sera menée sur un nombre réduit de souris, défini pour garantir à la fois la fiabilité scientifique et le respect du bien-être animal. Pour chaque animal, une patte servira aux analyses moléculaires et l’autre aux observations histologiques, ce qui évite de multiplier les animaux pour différentes analyses. Ce choix garantit donc une utilisation raisonnée et éthique des animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement afin de vérifier leur état général. Bien que les souris utilisées dans ce projet puissent présenter une légère faiblesse musculaire, les études précédentes ont montré qu’elles conservent une bonne mobilité et peuvent se nourrir et s’hydrater normalement. Leur déplacement sera toutefois surveillé régulièrement pour repérer tout signe de difficulté (ralentissement, boitement ou absence de mouvement). Avant le début des traitements, les animaux seront habitués au GRIP test et au gavage pendant une semaine, afin de réduire le stress et faciliter la tolérance à ces manipulations. En cas de gêne, des mesures rapides seront prises pour éviter toute souffrance inutile. Si un animal montre des signes de faiblesse empêchant un accès normal à la nourriture, une alimentation en gel sera ajoutée directement dans la cage pour faciliter la prise alimentaire. En cas de perte de poids ou si un point limite de souffrance est atteint, l’animal sera immédiatement euthanasié de manière rapide et indolore, conformément aux recommandations éthiques. Le traitement médicamenteux administré est habituellement bien toléré et ne provoque pas d’effets indésirables significatifs. Le prélèvement sanguin, réalisé sur une petite veine de la tête, représentera un volume très minime de sang et sera effectué au moment de l’euthanasie afin d’éviter tout stress ou inconfort supplémentaire.
Choix des espèces
Les études réalisées uniquement sur des cellules en culture ne permettent pas de comprendre le rôle des micro-ARN dans la structure et le bon fonctionnement du muscle, ni d’observer les interactions naturelles entre les différentes cellules qui composent le tissu musculaire. Les modèles de muscles reconstitués en laboratoire (appelés muscle-on-chip ou organoïdes) sont encore en développement et ne reproduisent pas fidèlement le comportement des micro-ARN ni la complexité des échanges cellulaires observés dans un organisme vivant. Ces limites rendent difficile l’étude précise des mécanismes biologiques impliqués dans la régulation du muscle. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser la souris, un modèle reconnu et bien documenté, pour lequel tous les outils génétiques et moléculaires nécessaires à cette étude sont disponibles. La sélection de différents stades – 4 semaines, 2 mois et 8 mois – permet d’observer l’évolution des altérations musculaires au fil du temps : 4 semaines correspond à l’âge post-sevrage, où les premières modifications du muscle peuvent être détectées ; 2 mois représente l’âge jeune adulte, période où la fonction musculaire est stabilisée ; et 8 mois correspond à un âge adulte intermédiaire, permettant d’évaluer l’impact à plus long terme de l’absence de micro-ARN sur la structure et la physiologie du muscle. De plus, la grande similarité entre la souris et l’être humain (environ 99 % des gènes sont communs) permet d’obtenir des résultats pertinents et transposables à la compréhension des maladies musculaires humaines.
Physiopathologie de l’appareil neuromusculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une chirurgie du nerf sciatique de dix minutes, des micro-impulsions électriques dans la patte postérieure et des injections quotidiennes pendant cinq à dix jours sont infligées à 676 souris, dont 84 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes. Le projet vise à caractériser le dialogue entre nerfs et fibres musculaires chez des lignées génétiquement modifiées. La rubrique consacrée aux effets sur les animaux ne mentionne que la biopsie de queue, les injections et le stress de l'anesthésie, et passe sous silence la chirurgie du nerf sciatique et les impulsions électriques.
Objectifs
Le système neuromusculaire nous permet de respirer, marcher, manger, sourire. Les muscles et les neurones associés dégénèrent au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans nombreuses maladies neuromusculaires d’origine génétique. Dans ce dernier cas les interactions entre les neurones et les fibres musculaires se détériorent conduisant à des défauts de contraction des fibres du muscle. Différents modèles de souris génétiquement modifiées permettent de mieux comprendre les propriétés des différents types de fibres musculaires et de leur environnement, et de leur dialogue. L’objectif principal de cette étude sera de caractériser les interactions nerf-fibres musculaires, et d’identifier les mécanismes mis en jeu dans le maitien de l’axe neuromusculaire.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les bases du système neuromusculaire, et d’en comprendre ses atteintes est un enjeu majeur. Cette étude sur la vulnérabilité neuromusculaire devrait aussi permettre de mieux comprendre les bases moléculaires qui contrôlent la formation de l’axe neuromusculaire, en fonction des muscles étudiés. En effet mieux comprendre les interactions entre neurones et fibres musculaires dans le but de caractériser, grâce à des approches techniques innovantes de nouveaux gènes qui contrôlent son intégrité est essentiel pour un jour permettre de guérir les malades atteints de défauts neuromusculaires. En conclusion, les études menées amélioreront nos connaissances sur les propriétés de l’axe neuromusculaire en prenant en compte les neurones et les fibres musculaires.
Procédures
Sur animaux vigiles : le prélèvement unique d’une biopsie de l’extrémité de la queue pour génotypage (5 secondes). L’injection quotidienne sur 5 ou 10 jours, durée 30 secondes. Sur animaux anesthésiés –Injection unique de 10 secondes. -Tonte de la patte postérieure (2 minutes par souris). -Micro impulsions électriques de la patte postérieure (5 minutes par souris). -Chirurgie du nerf sciatique (10 minutes par souris).
Impact sur les animaux
Une douleur légère et de courte durée est occasionnée lors de la biopsie de l’extrémité de la queue des animaux en vue de leur génotypage. Une douleur légère et de courte durée et un stress passager sont occasionnés lors d’injections chez les animaux. Un stress de courte durée peut aussi être occasionné lors des anesthésies.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.
Remplacement
Nous utilisons un modèle de souris car il mime la mise en place de l’appareil neuromusculaire au cours du développement embryonnaire, nous renseigne de manière unique sur le dialogue et les propriétés de l’interaction nerf-muscle en physiologie et en physiopathologie. Les modèles cellulaires ne permettent pas à ce jour de comprendre la diversité de ce dialogue et ne permettent pas de reconstituer la diversité des types de neurones moteurs et des fibres musculaires associées.
Réduction
Nous prélevons le maximum de tissus sur les animaux mis à morts pour éviter l’utilisation ultérieure de nouveaux lots d’animaux. Nous veillerons enfin à utiliser au maximum les mêmes lots d’animaux contrôle quand cela est possible pour éviter d’avoir à élever des animaux surnuméraires. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Le milieu d’hébergement est enrichi à l’aide de coton de nidification et d’une roue d’activité en accès libre. Les animaux sont surveillés régulièrement par le porteur de projet. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Des points limites ont été établis entrainant la mise à mort anticipée ou l’administration d’un analgésique si nécessaire.
Choix des espèces
Les muscles et les nerfs moteurs humains sont bien conservés chez la souris, qui en fait un bon modèle. Le modèle de souris permet également d’accéder à tous les acteurs qui contrôelnt la formation des muscles et des nerfs moteurs associés, sa diversité et sa physiopathologie. Les souris à différents stades de développement post natal sont utilisées pour mieux comprendre le dialogue entre les différents muscles et leurs nerfs moteurs associés.
Maintien d’une lignée de rat modèle de mucoviscidose
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Porteurs par construction génétique d'une mucoviscidose, 600 rats reçoivent une alimentation modifiée et du laxatif dans l'eau de boisson depuis l'âge de dix jours jusqu'à leur mise à mort, ce qui provoque des selles molles en continu. Le niveau de souffrance déclaré est léger et le projet se limite à entretenir la lignée. Les rats sont tués pour prélèvement d'organes ou versés dans d'autres projets soumis à autorisation, sans que le RNT indique la part de chacun. Le porteur écarte les modèles drosophile et poisson zèbre, qui existent, au motif qu'ils ne renseignent ni sur le microbiote pulmonaire ni sur la fonction testiculaire, et affirme la supériorité du rat sur la souris.
Objectifs
Le projet a pour but le maintien d'une lignée de rat mucoviscidose. Ce modèle permettra de mieux comprendre la genèse de la pathologie, d'évaluer son impact sur les différents organes et sur le microbiote intestinal et pulmonaire et de proposer ou de tester des solutions thérapeutiques pour limiter l'expression de la maladie.
Bénéfices attendus
Mettre à disposition d'équipes de recherche un modèle pertient de la mucoviscidose pour répondre à leurs questions scientifiques sur le sujet.
Procédures
Les animaux recoivent une alimentation adaptée et du laxatif dans l'eau de boisson depuis l'âge de 10 jours jusqu'à leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux recoivent une alimentation modifiée et du laxatif dans l'eau de boisson qui peuvent provoquer la production de selles molles depuis le sevrage jusqu'à l'âge de sortie du projet.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure en cas de prélèvement d'organes ou de matériel biologique post mortem ou ils seront inclus dans d'autres projets soumis à demande d'autorisation.
Remplacement
Pour la mucoviscidose qui touche de nombreux organes, il n'existe pas de modèle intégré in vitro reproduisant la compléxité de la pathologie et les interactions entre les différents organes touchés. Il existe des modèles drosophile et zebrafish mais qui ne permettent pas de répondre à certaines questions ( caractérisation du microbiote pulmonaire et digestif, fonction testiculaire, ...). Des expériences ont montrées une supériorité du modèle rat sur le modèle souris avec un phénotype qui se rapproche plus de celui de l'humain.
Réduction
En fonction des demandes des équipes intéressées par le modèle, des tests statistiques seront réalisés à priori pour déterminer la taille des groupes expérimentaux en vue des différentes attendues (test de puissance) et/ou des tests à posteriori pour s’assurer de la validité statistique des résultats obtenus. En cas de projets en prévision ou en préparation, la lignée sera maintenue sous forme d'animaux porteurs d’une seule mutation ce qui permet d'avoir des animaux qui n’expriment pas la maladie et avec une alimentation conventionnelle (en effet, seuls les rats porteurs de 2 mutations expriment la maladie). Cela permettra la production des animaux d'intérêt au moment de la réalisation du projet. Si aucun projet n'est en prévision, la lignée sera conservée au maximum 12 mois à l'état respirant puis sera maintenue sous forme non respirante par conservation d’embryons congelés. Le maintien de la lignée à l’état respirant sur 12 mois correspond à peu près à une génération de rat (car les rats mâles peuvent être mis en reproduction jusqu'à cet âge) et permet d'éviter la décongélation de la souche cryoconservée qui est aussi consommatrice d'animaux. En effet les animaux obtenus nécessitent des accouplements sur une génération avec des animaux non consanguins pour éviter tout accouplement frère-sœur issus des embryons ce qui pourrait introduire un biais lié à la consanguinité
Raffinement
Des grilles de score seront mises en place pour détecter une altération du bien-être des animaux et prendre des mesures correctrices grâce à des points limites qui déclencheront une action curatrice ou une mise à mort des animaux si la souffrance ne peut pas être réduite. Un antalgique sera administré en cas de signe d'expression de douleur.
Choix des espèces
Le modèle rat a montré qu'à plusieurs égards qu'il est plus pertinent que le modèle souris. Il existe des modèles drosophile et zebrafish mais qui ne permettent pas de répondre à certaines questions ( caractérisation du microbiote pulmonaire, fonction testiculaire, ...).
Modèle préclinique pour l’induction du syndrome d’ovaire polykystique associée à l’obésité
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système urogénital
Hamsters dorés : 1500
Quarante heures en cage individuelle sans enrichissement, répétées trois fois, et jusqu'à 52 semaines de régime hypercalorique : 1 400 souris et 1 500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin. Les souris femelles reçoivent chaque jour un dérivé de la testostérone qui supprime leur cycle, les hamsters femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, et l'ensemble subit frottis vaginaux quotidiens pendant quatorze jours, prises de sang après jeûne, tests de tolérance au glucose, épilation sous anesthésie et échocardiographie. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est attendu de ces mesures. L'objectif est de construire des modèles de syndrome des ovaires polykystiques associé à l'obésité pour y tester des composés, aucun modèle in vitro ou ex vivo de présélection n'existant selon lui.
Objectifs
Le syndrome d’ovaires polykystiques (SOPK) touche 6 à 13% des femmes en âge de procréer. Elle se traduit par un désordre hormonal menant à l’anovulation et à l’infertilité. Outre le fait que le syndrome impacte la vie sexuelle des femmes atteintes, il peut induire un désordre métabolique et un risque cardiovasculaire important : ces femmes sont plus susceptibles de développer un surpoids/une obésité, de l’hypertension artérielle, de l’hyperlipidémie, un diabète de type 2. Aujourd’hui les traitements anti-obésité et anti-diabète ne sont pas compatibles avec le souhait de procréation et d’enfanter et il est donc nécessaire de trouver une stratégie thérapeutique efficace pour traiter les atteintes métaboliques de ses femmes sans pour autant les empêcher de procréer. Pour ce faire, il faut donc développer des modèles précliniques atteints de syndrome d’ovaires polykystiques et d’obésité permettant de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées à cette population de patientes.
Bénéfices attendus
L'intérêt de ce projet est le développement de modèles SOPK associé à l’obésité mimant ce qui est observé chez les femmes atteintes. Ils permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques associée à la SOPK et ainsi de tester et valider de nouvelles thérapies.
Procédures
Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en sucre seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 52 semaines pour les hamsters). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeûn 6h maximum avant le prélèvement. Des frottis vaginaux seront réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (quotidiennement pendant 14 jours et jusqu’à 4 fois durant le projet, sur animal vigile, quelques secondes). Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à un taux normal de sucre dans le sang. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille (2 minutes en fin de période de traitement). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
-Le traitement quotidien avec un dérivé de la testostérone induit l’absence de cycle menstruel chez la souris femelle. -L’ovariectomie (retrait des ovaires) induit l’absence de cycle œstral chez le hamster femelle. -Obésité induite par l’ingestion d’un régime gras : Le maintien de l’animal sous régime gras favorise sa prise de poids et limite ses capacités de mouvements. -Les mesures réalisées et les traitements : aucun effet douloureux n’est attendu après ces mesures cependant, il peut arriver qu’un animal supporte mal l’anesthésie ou soit stressé par certains gestes techniques. -Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.
Devenir
Nous devons collecter les organes cibles (foie, système génital, tissus adipeux, muscles, cœur, tibia a minima) donc tous les animaux seront mis à mort en fin de projet.
Remplacement
Le dérèglement associé à la SOPK et l’obésité est un dérèglement multi organique, qui se passe de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo de préscreening. La SOPK est une maladie combinant dérégulation du cycle hormonal et dérégulation métabolique. Ces dérégulations ciblent de multiples organes de l’appareil reproducteur et du système métaboliques (foie, tissu adipeux, muscle, pancréas, …). Aujourd’hui il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo mimant l’ensemble de ces dérégulations.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses comorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.
Raffinement
Lors de la mise sous régime et lors du traitement pharmacologique, l’état physique des animaux est monitoré et scoré 1 fois par jour tous les jours de l’étude. Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage, entraineront un examen clinique poussé par la structure du bien-être animal (SBEA). Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier serait mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être sera placé en armoire chauffante. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage individuelle (dépense énergétique) se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les animaux peuvent voir leur congénère à proximité. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés par la SBEA avec du cicalfate crème et du cicalfate lotion 2/jour jusqu'à l'apparition des croutes. L'utilisation des antibiotiques type acide fusidique sera validé avec le vétérinaire désigné.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète car suffisamment caractérisé et publié. Le hamster est un modèle bien connu pour avoir un métabolisme des lipides (cholestérol et triglycérides) et des lipoprotéines, comparable à l’homme. En outre, nous avons caractérisé et publié plusieurs modèles nutritionnels de hamster, y compris celui utilisé dans le présent projet, en utilisant des mâles. En conséquence la connaissance acquise sur ces espèces permet de limiter le nombre d'animaux utilisé. Les souris sont utilisées à partir de 4 semaines d’âge et les hamsters sont utilisés à partir de 13 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine où la SOPK se met en place au moment de la puberté.
Etude des causes génétiques des maladies affectant le cerveau et le muscle dans des modèles de souris transgéniques (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Biopsiées à l'oreille vers une semaine de vie, testées cinq fois avant trois semaines d'âge, les mêmes souris enchaînent treize tests entre dix et dix-neuf semaines, répartis sur dix semaines avec trois à sept jours de repos entre chacun. Certains se déroulent dans l'eau, d'autres mesurent la force musculaire ou la mémoire, et un sous-groupe reçoit une injection déclenchant des crises d'épilepsie. 768 souris sont utilisées dans ce second volet, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau et les muscles.
Objectifs
Les maladies du cerveau représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré les progrès récents de la génétique, près d’un patient sur deux ne bénéficie toujours pas d’un diagnostic génétique précis. Cette situation est souvent liée au fait que les gènes impliqués sont encore mal compris, ce qui entraîne des délais prolongés avant que les enfants concernés puissent recevoir un diagnostic. Ces maladies sont très diverses sur le plan génétique. A ce jour, plus de 2 000 gènes sont impliqués dans les maladies du cerveau. De plus, les atteintes du cerveau sont fréquemment associées à des problèmes musculaires, tels que des difficultés de mouvement, de coordination ou une faiblesse musculaire. Ce lien suggère que certains gènes jouent un rôle commun dans le fonctionnement du cerveau et des muscles. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre le rôle de plusieurs gènes récemment identifiés chez des patients présentant à la fois des maladies du cerveau et des atteintes musculaires. Ces gènes ont été choisis car ils sont systématiquement associés à ces deux types de symptômes, ce qui en fait des gènes candidats particulièrement pertinents pour étudier les liens entre cerveau et muscle. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées afin d’analyser le développement moteur, les capacités de mouvement et certaines fonctions cognitives, comme la mémoire, à différents stades de la vie. L’étude portera à la fois sur des stades précoces du développement et sur l’âge adulte, afin d’identifier le moment où apparaissent les anomalies et leur évolution dans le temps. Ce projet qui sera realisé sur deux établissements (EU 1/2 et EU 2/2), vise à améliorer la compréhension des maladies touchant à la fois le cerveau et les muscles chez les patients, souvent des enfants, afin de contribuer au développement futur de meilleures stratégies diagnostiques et, à terme, thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans de nombreuses maladies du cerveau, les premiers signes apparaissent d’abord au niveau des muscles, peu de temps après la naissance et avant l’apparition des atteintes cognitives. Ainsi, étudier précocement le développement moteur permettrait de détecter très tôt les signes cliniques qui sont parfois invisibles à l’âge adulte, soit parce qu’elles sont corrigées par l’organisme, soit parce qu’elles s’aggravent avec le temps. Ce projet va permettre d’identifier précisément quand apparaissent les premiers signes de la maladie, d’améliorer la compréhension de son évolution et de disposer d’indicateurs précoces utiles pour mieux orienter le diagnostic et la prise en charge des patients, tout en évitant des méthodes plus invasives.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à des interventions sans chirurgie qui sont basées sur l’observation de leur comportement et de leurs capacités de mouvement. Dans un premier temps, un très petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille de chaque souris afin de caractériser leurs gènes. Ce geste est réalisé une seule fois et dure quelques secondes. Chez les jeunes souris, des observations seront réalisées pour suivre le développement des mouvements, comme la capacité à se déplacer, à se retourner ou à utiliser leurs pattes. Ces tests sont courts et durent moins d’une minute. Le nombre total de tests effectués au stade précoce (entre 1 et 3 semaines d’âge) dans l’EU 1/2 est de cinq, pour une durée totale maximale d’environ cinq minutes, les tests étant réalisés successivement. À l’âge adulte, les mêmes souris participeront à différents tests permettant d’évaluer leur comportement, leur mémoire et leurs capacités physiques. Ces tests consistent principalement à observer leurs déplacements, l’exploration d’un environnement ou la force musculaire. Chaque test dure quelques minutes et les animaux bénéficient de périodes de repos entre les séances. Le nombre total de tests effectués à l’âge adulte dans l’EU 2/2 est de treize. Ils seront répartis sur une période de 10 semaines avec des périodes de repos de 3 à 7 jours entre les tests. Les animaux auront alors entre 10 et 19 semaines d’âge. Pour un nombre limité de souris adultes (un sous-groupe), un test spécifique permettra d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie à l’aide d’une injection unique. Les animaux seront ensuite surveillés en continu pendant 20 minutes après l’injection. Cette étape est importante car, dans de nombreux cas, les crises d’épilepsie représentent un symptôme majeur qui aggrave fortement la maladie et la qualité de vie des patients. Étudier ces crises chez la souris permet donc de mieux comprendre leur origine et leur lien avec les autres symptômes observés. À la fin du projet, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement et l’analyse de certains organes, dont le cerveau et les muscles. Ces analyses sont indispensables pour mieux comprendre les maladies qui touchent à la fois le cerveau et les muscles chez les enfants malades.
Impact sur les animaux
À l’âge d’environ une semaine, un petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille des souris afin d’analyser leurs gènes. Ce geste peut provoquer une douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Le risque de saignement est très faible. Tout au long du projet, chez les souris jeunes et adultes, différents tests seront réalisés pour observer leurs mouvements et leur comportement. Ces manipulations peuvent entraîner un stress temporaire, notamment lors de la prise en main ou de l’exposition à un nouvel environnement. Les tests sont courts, espacés dans le temps et les animaux sont habitués au matériel et à la salle d’expérimentation afin de limiter ces effets. Lors de certains tests, notamment ceux réalisés dans l’eau, les souris peuvent ressentir un inconfort passager lié au contact avec l’eau. Ces effets sont limités par une durée d’exposition courte de quelques minutes, une température de l’eau contrôlée, une surveillance continue et un séchage immédiat après chaque session. Pour un nombre limité de souris adultes, un test permettant d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie sera réalisé à l’aide d’une injection unique. Cette injection peut entraîner une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi que l’apparition temporaire de crises convulsives. Les animaux seront surveillés en continu pendant une période maximale de 20 minutes. Si des signes de détresse sévère apparaissent, le test sera immédiatement interrompu et l’animal pris en charge. Enfin, une lignée de souris particulière peut développer des tumeurs à partir de l’âge de 6 mois. Les animaux utilisés pour les tests seront mis à mort bien avant cet âge. Les animaux conservés en élevage seront également mis à mort avant l’âge limite de 6 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des muscles et du cerveau. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser des analyses anatomiques et moléculaires, permettant d’étudier les similitudes et les différences entre ces deux organes et de mieux comprendre les maladies associées.
Remplacement
Les maladies du cerveau font intervenir des mécanismes complexes qui touchent à la fois le cerveau, les muscles et le comportement. Ces interactions ne peuvent pas être étudiées à l’aide de modèles simplifiés, comme des cellules cultivées en laboratoire ou des simulations informatiques. Même si les études sur cellules permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques de base, elles ne permettent pas d’observer comment les gènes influencent le développement du cerveau, les capacités de mouvement ou les comportements dans un organisme vivant. Or, ces aspects sont essentiels pour comprendre les maladies étudiées dans ce projet. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. La souris est particulièrement adaptée, car son fonctionnement biologique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. De plus, il existe déjà un grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées, développés dans le cadre de collaborations internationales, ce qui permet d’étudier de manière ciblée le rôle de nombreux gènes impliqués dans ces maladies. Enfin, ces maladies étant rares et touchant souvent des enfants, il est très difficile de réaliser ce type d’études directement chez l’être humain. Le recours à la souris est donc nécessaire pour améliorer la compréhension de ces maladies et préparer le développement de futures approches diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats fiables, tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Les effectifs ont été déterminés à partir de données issues d’études précédentes et de méthodes statistiques, de manière à utiliser uniquement le nombre de souris strictement nécessaire. Afin de réduire le nombre total d’animaux, les mêmes souris sont suivies tout au long du projet, depuis les premières étapes du développement jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet de recueillir plusieurs types d’informations chez les mêmes animaux, évitant ainsi de multiplier les groupes expérimentaux. Ce suivi sur la durée permet également de mieux comprendre l’évolution des maladies étudiées, en observant comment les symptômes apparaissent et évoluent avec le temps. Chez la souris, l’âge adulte atteint en fin de projet correspond approximativement à un âge avancé chez l’humain, ce qui rend cette approche particulièrement pertinente pour étudier l’évolution des maladies du cerveau associées à des atteintes musculaires. Les analyses des résultats seront réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, ce qui permet d’obtenir des conclusions solides sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les souris témoins sont issues des mêmes portées que les souris génétiquement modifiées, afin de limiter la production d’animaux en excès. Au total, ce projet nécessitera un maximum de 768 souris, incluant des mâles et des femelles. Ce nombre correspond au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et des expérimentateurs et au contact avant le début de chaque procédure. Un petit tunnel sera utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10jours après la naissance, à un âge où le système nerveux est pas encore complètement développé. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera limité à une seule fois. Il sera réalisé sur une courte distance de moins de 1 km dans des conditions adaptées, en conservant les cages d’origine, la litière et les élèments d’enrichissement habituel afin de maintenir un environnement familier. À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation suffisante avant toute nouvelle manipulation expérimentale. Chez les souris adultes, une phase d’habituation sera mise en place avant le début des tests afin de réduire l’anxiété liée à la nouveauté. Les animaux seront familiarisés avec les dispositifs utilisés et la présence des expérimentateurs. Les évaluations seront organisées de manière progressive, en commençant par les moins contraignantes, avec des périodes de repos suffisantes entre chaque étape pour permettre une récupération complète. Certaines évaluations pouvant entraîner un inconfort temporaire feront l’objet de mesures spécifiques. Lors des tests impliquant une exposition à l’eau, les conditions seront strictement contrôlées, la durée d’exposition sera limitée, et les animaux seront immédiatement séchés et maintenus au chaud après chaque session afin d’éviter toute gêne. Tout au long des manipulations, les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant des abris et des matériaux adaptés, afin de favoriser les comportements naturels et de limiter le stress. Les animaux seront surveillés régulièrement, avec un suivi du poids et de l’état général, afin de détecter précocement tout signe de mal-être, de souffrance ou de détérioration de leur état de santé. Des points limites adaptés permettront d’interrompre la participation d’un animal au projet si nécessaire. En cas de dégradation de l’état général ou de souffrance persistante, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle d’étude car elle présente de nombreuses similitudes avec l’être humain. Bien que la surface de son cerveau soit plus simple que celle de l’homme, la grande majorité des structures cérébrales est commune aux deux espèces. De plus, une part très importante des mécanismes biologiques est partagée, ce qui permet d’étudier de manière pertinente l’origine de certaines maladies affectant le cerveau et les muscles. La souris est également un modèle particulièrement adapté pour l’étude des comportements. Elle permet d’analyser des fonctions complexes telles que les capacités de mouvement, certaines formes de mémoire ou les interactions sociales, qui ne peuvent pas être étudiées de manière fiable avec des modèles non animaux. Par ailleurs, ce modèle permet d’étudier séparément les mâles et les femelles, un point essentiel car certaines maladies du cerveau touchent différemment les deux sexes et sont plus fréquentes chez les garçons. Les animaux seront étudiés à plusieurs stades clés de leur développement afin de mieux comprendre l’apparition et l’évolution des maladies. Une première phase concernera la période précoce après la naissance, jusqu’à la troisième semaine de vie. À ce stade, le système nerveux et les muscles sont encore en cours de maturation. L’étude de cette période permet de détecter d’éventuels retards ou anomalies du développement moteur dès leur apparition. Une seconde phase sera réalisée chez les mêmes animaux à l’âge adulte, lorsque le cerveau et les muscles ont atteint leur maturité. Cette étape est indispensable pour évaluer de manière fiable les capacités motrices, musculaires et certaines fonctions cognitives, et pour comprendre comment les anomalies observées précocement évoluent au cours du temps.
Etude des causes génétiques des maladies affectant le cerveau et le muscle dans des modèles de souris transgéniques (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour porter des mutations trouvées chez des enfants atteints à la fois de maladies du cerveau et de faiblesse musculaire, 768 souris vont être utilisées, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un morceau d'oreille leur est prélevé vers 7 à 10 jours de vie pour le génotypage, puis cinq tests de motricité leur sont appliqués entre une et trois semaines d'âge. Un sous-groupe reçoit une injection destinée à déclencher des crises d'épilepsie, avec vingt minutes d'observation ensuite. Toutes sont tuées pour prélever cerveau et muscles, la comparaison de ces deux organes étant l'objet même du projet.
Objectifs
Les maladies du cerveau représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré les progrès récents de la génétique, près d’un patient sur deux ne bénéficie toujours pas d’un diagnostic génétique précis. Cette situation est souvent liée au fait que les gènes impliqués sont encore mal compris, ce qui entraîne des délais prolongés avant que les enfants concernés puissent recevoir un diagnostic. Ces maladies sont très diverses sur le plan génétique. A ce jour, plus de 2 000 gènes sont impliqués dans les maladies du cerveau. De plus, les atteintes du cerveau sont fréquemment associées à des problèmes musculaires, tels que des difficultés de mouvement, de coordination ou une faiblesse musculaire. Ce lien suggère que certains gènes jouent un rôle commun dans le fonctionnement du cerveau et des muscles. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre le rôle de plusieurs gènes récemment identifiés chez des patients présentant à la fois des maladies du cerveau et des atteintes musculaires. Ces gènes ont été choisis car ils sont systématiquement associés à ces deux types de symptômes, ce qui en fait des gènes candidats particulièrement pertinents pour étudier les liens entre cerveau et muscle. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées afin d’analyser le développement moteur, les capacités de mouvement et certaines fonctions cognitives, comme la mémoire, à différents stades de la vie. L’étude portera à la fois sur des stades précoces du développement et sur l’âge adulte, afin d’identifier le moment où apparaissent les anomalies et leur évolution dans le temps. Ce projet qui sera realisé sur deux établissements (EU 1/2 et EU 2/2), vise à améliorer la compréhension des maladies touchant à la fois le cerveau et les muscles chez les patients, souvent des enfants, afin de contribuer au développement futur de meilleures stratégies diagnostiques et, à terme, thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans de nombreuses maladies du cerveau, les premiers signes apparaissent d’abord au niveau des muscles, peu de temps après la naissance et avant l’apparition des atteintes cognitives. Ainsi, étudier précocement le développement moteur permettrait de détecter très tôt les signes cliniques qui sont parfois invisibles à l’âge adulte, soit parce qu’elles sont corrigées par l’organisme, soit parce qu’elles s’aggravent avec le temps. Ce projet va permettre d’identifier précisément quand apparaissent les premiers signes de la maladie, d’améliorer la compréhension de son évolution et de disposer d’indicateurs précoces utiles pour mieux orienter le diagnostic et la prise en charge des patients, tout en évitant des méthodes plus invasives.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à des interventions sans chirurgie qui sont basées sur l’observation de leur comportement et de leurs capacités de mouvement. Dans un premier temps, un très petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille de chaque souris afin de caractériser leurs gènes. Ce geste est réalisé une seule fois et dure quelques secondes. Chez les jeunes souris, des observations seront réalisées pour suivre le développement des mouvements, comme la capacité à se déplacer, à se retourner ou à utiliser leurs pattes. Ces tests sont courts et durent moins d’une minute. Le nombre total de tests effectués au stade précoce (entre 1 et 3 semaines d’âge) dans l’EU 1/2 est de cinq, pour une durée totale maximale d’environ cinq minutes, les tests étant réalisés successivement. À l’âge adulte, les mêmes souris participeront à différents tests permettant d’évaluer leur comportement, leur mémoire et leurs capacités physiques. Ces tests consistent principalement à observer leurs déplacements, l’exploration d’un environnement ou la force musculaire. Chaque test dure quelques minutes et les animaux bénéficient de périodes de repos entre les séances. Le nombre total de tests effectués à l’âge adulte dans l’EU 2/2 est de treize. Ils seront répartis sur une période de 10 semaines avec des périodes de repos de 3 à 7 jours entre les tests. Les animaux auront alors entre 10 et 19 semaines d’âge. Pour un nombre limité de souris adultes (un sous-groupe), un test spécifique permettra d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie à l’aide d’une injection unique. Les animaux seront ensuite surveillés en continu pendant 20 minutes après l’injection. Cette étape est importante car, dans de nombreux cas, les crises d’épilepsie représentent un symptôme majeur qui aggrave fortement la maladie et la qualité de vie des patients. Étudier ces crises chez la souris permet donc de mieux comprendre leur origine et leur lien avec les autres symptômes observés. À la fin du projet, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement et l’analyse de certains organes, dont le cerveau et les muscles. Ces analyses sont indispensables pour mieux comprendre les maladies qui touchent à la fois le cerveau et les muscles chez les enfants malades.
Impact sur les animaux
À l’âge d’environ une semaine, un petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille des souris afin d’analyser leurs gènes. Ce geste peut provoquer une douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Le risque de saignement est très faible. Tout au long du projet, chez les souris jeunes et adultes, différents tests seront réalisés pour observer leurs mouvements et leur comportement. Ces manipulations peuvent entraîner un stress temporaire, notamment lors de la prise en main ou de l’exposition à un nouvel environnement. Les tests sont courts, espacés dans le temps et les animaux sont habitués au matériel et à la salle d’expérimentation afin de limiter ces effets. Lors de certains tests, notamment ceux réalisés dans l’eau, les souris peuvent ressentir un inconfort passager lié au contact avec l’eau. Ces effets sont limités par une durée d’exposition courte de quelques minutes, une température de l’eau contrôlée, une surveillance continue et un séchage immédiat après chaque session. Pour un nombre limité de souris adultes, un test permettant d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie sera réalisé à l’aide d’une injection unique. Cette injection peut entraîner une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi que l’apparition temporaire de crises convulsives. Les animaux seront surveillés en continu pendant une période maximale de 20 minutes. Si des signes de détresse sévère apparaissent, le test sera immédiatement interrompu et l’animal pris en charge. Enfin, une lignée de souris particulière peut développer des tumeurs à partir de l’âge de 6 mois. Les animaux utilisés pour les tests seront mis à mort bien avant cet âge. Les animaux conservés en élevage seront également mis à mort avant l’âge limite de 6 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des muscles et du cerveau. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser des analyses anatomiques et moléculaires, permettant d’étudier les similitudes et les différences entre ces deux organes et de mieux comprendre les maladies associées.
Remplacement
Les maladies du cerveau font intervenir des mécanismes complexes qui touchent à la fois le cerveau, les muscles et le comportement. Ces interactions ne peuvent pas être étudiées à l’aide de modèles simplifiés, comme des cellules cultivées en laboratoire ou des simulations informatiques. Même si les études sur cellules permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques de base, elles ne permettent pas d’observer comment les gènes influencent le développement du cerveau, les capacités de mouvement ou les comportements dans un organisme vivant. Or, ces aspects sont essentiels pour comprendre les maladies étudiées dans ce projet. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. La souris est particulièrement adaptée, car son fonctionnement biologique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. De plus, il existe déjà un grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées, développés dans le cadre de collaborations internationales, ce qui permet d’étudier de manière ciblée le rôle de nombreux gènes impliqués dans ces maladies. Enfin, ces maladies étant rares et touchant souvent des enfants, il est très difficile de réaliser ce type d’études directement chez l’être humain. Le recours à la souris est donc nécessaire pour améliorer la compréhension de ces maladies et préparer le développement de futures approches diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats fiables, tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Les effectifs ont été déterminés à partir de données issues d’études précédentes et de méthodes statistiques, de manière à utiliser uniquement le nombre de souris strictement nécessaire. Afin de réduire le nombre total d’animaux, les mêmes souris sont suivies tout au long du projet, depuis les premières étapes du développement jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet de recueillir plusieurs types d’informations chez les mêmes animaux, évitant ainsi de multiplier les groupes expérimentaux. Ce suivi sur la durée permet également de mieux comprendre l’évolution des maladies étudiées, en observant comment les symptômes apparaissent et évoluent avec le temps. Chez la souris, l’âge adulte atteint en fin de projet correspond approximativement à un âge avancé chez l’humain, ce qui rend cette approche particulièrement pertinente pour étudier l’évolution des maladies du cerveau associées à des atteintes musculaires. Les analyses des résultats seront réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, ce qui permet d’obtenir des conclusions solides sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les souris témoins sont issues des mêmes portées que les souris génétiquement modifiées, afin de limiter la production d’animaux en excès. Au total, ce projet nécessitera un maximum de 768 souris, incluant des mâles et des femelles. Ce nombre correspond au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et des expérimentateurs et au contact avant le début de chaque procédure. Un petit tunnel sera utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10jours après la naissance, à un âge où le système nerveux est pas encore complètement développé. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera limité à une seule fois. Il sera réalisé sur une courte distance de moins de 1 km dans des conditions adaptées, en conservant les cages d’origine, la litière et les élèments d’enrichissement habituel afin de maintenir un environnement familier. À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation suffisante avant toute nouvelle manipulation expérimentale. Chez les souris adultes, une phase d’habituation sera mise en place avant le début des tests afin de réduire l’anxiété liée à la nouveauté. Les animaux seront familiarisés avec les dispositifs utilisés et la présence des expérimentateurs. Les évaluations seront organisées de manière progressive, en commençant par les moins contraignantes, avec des périodes de repos suffisantes entre chaque étape pour permettre une récupération complète. Certaines évaluations pouvant entraîner un inconfort temporaire feront l’objet de mesures spécifiques. Lors des tests impliquant une exposition à l’eau, les conditions seront strictement contrôlées, la durée d’exposition sera limitée, et les animaux seront immédiatement séchés et maintenus au chaud après chaque session afin d’éviter toute gêne. Tout au long des manipulations, les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant des abris et des matériaux adaptés, afin de favoriser les comportements naturels et de limiter le stress. Les animaux seront surveillés régulièrement, avec un suivi du poids et de l’état général, afin de détecter précocement tout signe de mal-être, de souffrance ou de détérioration de leur état de santé. Des points limites adaptés permettront d’interrompre la participation d’un animal au projet si nécessaire. En cas de dégradation de l’état général ou de souffrance persistante, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Sur le plan anatomique, même si la surface du cerveau de la souris adulte présente moins de circonvolutions que celle de l’homme, la quasi-totalité des structures cérébrales est commune aux deux espèces. Sur le plan génétique, environ 90% des gènes sont conservés entre la souris et l’homme, ce qui rend les études génétiques particulièrement pertinentes dans ce modèle. Sur le plan comportemental, la souris présente un excellent compromis entre complexité comportementale et proximité phylogénétique, permettant la modélisation de pathologies associées à des comportements complexes tels que la reconnaissance sociale ou la reconnaissance d’objets. Et enfin, contrairement à certains autres modèles expérimentaux, la souris permet également d’étudier les différences liées au sexe, un paramètre particulièrement important dans les troubles du neurodéveloppement, qui présentent une prévalence plus élevée chez les garçons. Les souris seront utilisées à différents stades de développement.
Prélèvement invasif de tissu pour la caractérisation de lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des pathologies osseuses
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une biopsie d'oreille, un tatouage sur les coussinets, et pour les souris dont la mâchoire inférieure pousse trop en avant, une coupe des dents jusqu'à deux fois par semaine. 20 400 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour un projet qui ne couvre que l'élevage, le marquage et l'analyse des gènes de lignées destinées à l'étude des maladies osseuses. La mâchoire déformée est un phénotype dommageable produit par la modification génétique elle-même, et le porteur ramène la coupe des dents à une douleur et un stress de courte durée. Les animaux trop âgés pour se reproduire, stériles, ou dont le génotype n'est pas celui attendu sont tués.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la création et le maintien de lignées de souris génétiquement modifiées permettant l’étude des mécanismes impliqués dans la formation de l'os dans un contexte physiologique mais aussi pathologique. Cette demande de projet concerne strictement l’élevage, le marquage et l’analyse des gènes de ces animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de générer et de maintenir des modèles de souris permettant l’étude des mécanismes impliqués dans les maladies osseuses afin d'envisager des approches thérapeutiques. Une meilleure compréhension des mécanismes permettra d’améliorer les traitements à destination des patients atteints de ces maladies.
Procédures
Prélèvement de tissu à l'oreille sur animal vigile (1 fois, 5 secondes); tatouage sur les coussinets (1 fois, 5 secondes); coupe de dents pour les animaux présentant une mâchoire inférieure trop avancée (maximum 2 fois par semaine, 15 secondes); application d'une solution de désinfection et de pommade anti-septique si une infection est constatée à l'endroit de la biopsie (1 fois par jour, maximum 3 jours de suite).
Impact sur les animaux
La contention, la biopsie et le tatouage peuvent provoquer un stress léger chez l’animal. La coupe des dents due au phénotype dommageable (mâchoire inférieure trop avancée) provoque une douleur et un stress de courte durée.
Devenir
A l’issue de la procédure d’élevage, les animaux trop âgés pour se reproduire ou stériles sont mis à mort, ou si leur génotype n’est pas celui attendu.
Remplacement
Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées que dans un organisme vivant, car le squelette entier à différents âges est étudié. Il s’agit ici d’études sur la formation et la croissance osseuse, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle hors du vivant, ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien les projets de recherche. Les modèles souris miment de nombreuses pathologies et sont impliqués dans de différents projets.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi adapté. Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Des points limites spécifiques ont été établis. Tout animal en souffrance recevra un soin adapté (compression, application de pommade anti-septique). Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement du squelette, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux de son développement du squelette entre les rongeurs et l’Homme. De plus, de nombreux outils d'analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Afin de permettre l’identification des souris et l’analyse de leurs gènes avant leur sevrage, le tatouage des coussinets et le prélèvement d'oreille sont effectués entre 7 et 10 jours de vie.
Étude fonctionnelle de gènes pertinents dans l’étiopathogénie de la scoliose idiopathique chez le poisson-zèbre – EU1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Un supplément de 30 % est ajouté à l'effectif pour absorber la mortalité et les variations du sex-ratio, ce qui porte le projet à 27 116 poissons zèbres, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Douze gènes sont inactivés séparément pour provoquer des déformations de la colonne vertébrale, un morceau de nageoire caudale est prélevé sous anesthésie pour le génotypage, et chaque poisson attend seul dans son bac jusqu'à quatorze jours le résultat de cette analyse. Les animaux font ensuite jusqu'à dix trajets vers un centre d'imagerie et cinq passages sous anesthésie, à 8 semaines puis à 3, 4, 6 et 12 mois, pour suivre la progression de la déformation. Le porteur retient le poisson zèbre justement parce qu'il n'a pas de membres pour compenser une torsion de la colonne, contrairement aux quadrupèdes, et attend une déformation qui n'empêche ni de nager ni de se nourrir.
Objectifs
La scoliose idiopathique adolescente est une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale qui touche 1 à 3 pourcents des enfants et adolescents, et dont l’origine reste aujourd’hui inconnue. Notamment, les mécanismes génétiques conduisant à cette déformation sont très mal élucidés. Ce projet aura pour objectif de mieux les comprendre. Il repose sur l’étude de familles présentant des cas de scoliose idiopathique, ainsi que sur l’analyse de modèles de poisson-zèbres mutants ayant développé des déformations vertébrales. L’analyse familiale, combinant l’analyse des déformations et une analyse génétique, a permis l’identification de six gènes d’intérêt. Par ailleurs, six autres gènes ont été mis en évidence à partir de lignées de poissons-zèbres mutants présentant des déformations vertébrales. Nous utiliserons dans ce projet des poissons zèbre et inactiverons séparément les gènes d’intérêt identifiés comme impliqués dans la déformation de la colonne vertébrale, afin d’étudier leur rôle dans l’apparition de la scoliose. Nous réaliserons chez ces poissons une analyse clinique par imagerie visant à détecter des déformations similaires à celles observées chez les patients, et nous étudierons leur comportement. Ce projet se réalisera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la scoliose idiopathique et, à terme, sa prise en charge. En étudiant le rôle de douze gènes candidats à l’aide de modèles de poissons-zèbres mutants, il permettra d’identifier les mécanismes biologiques à l’origine des déformations tridimensionnelles de la colonne vertébrale et de mieux caractériser les facteurs génétiques impliqués. La validation de l’implication de certains gènes contribuera à enrichir les connaissances fondamentales sur la physiopathologie de cette pathologie encore largement méconnue. Ces avancées pourraient, à plus long terme, avoir des retombées cliniques significatives. D’une part, une meilleure identification des déterminants génétiques pourrait permettre le développement d’outils diagnostiques plus précoces et plus précis, fondés sur l’analyse du génome. Cela favoriserait une meilleure anticipation de l’évolution de la scoliose, notamment en termes de sévérité, et une adaptation plus précoce de la prise en charge. D’autre part, l’identification des voies moléculaires impliquées pourrait ouvrir la voie, à plus long terme, à des approches thérapeutiques ciblées. Ce projet s’inscrit ainsi dans une perspective de médecine personnalisée, visant à mieux évaluer le risque individuel en fonction du profil génétique des patients et à adapter en conséquence les stratégies de suivi et de traitement, qu’il s’agisse de mesures conservatrices (comme le port d’un corset) ou d’interventions chirurgicales. En résumé, ce projet a pour objectif de faire progresser les connaissances sur les facteurs de risque de la scoliose idiopathique afin d’améliorer, à terme, le diagnostic, le suivi et la prise en charge des patients.
Procédures
Une partie des animaux sera testée sur le comportement (Etablissement 1) alors qu’une partie sera imagée pour caractérisation des déformations de la colonne vertébrale (Etablissement 2). Etablissement 1 : Afin de connaitre le patrimoine génétique des poissons zèbre génétiquement modifiés, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale est réalisé sous anesthésie générale. Un seul prélèvement est effectué par animal et ce en moins de 2 minutes. En attendant les résultats du génotypage (14 jours maximum), les poissons sont hébergés individuellement afin de garantir leur identification et d’éviter des confusions d’identification. Pour les études des comportements, les poissons seront transférés individuellement dans les arènes afin d’être filmé dans un temps limité (1h, 4 sessions au total). Etablissement 2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (établissement 1) jusqu’au centre d’imagerie (établissement 2) pour la réalisation d’une imagerie aux stades de 8 semaines, puis 3 ,4, 6, 12 mois. La durée du trajet est inférieure à 1h (animal vigile, 10 trajets au total). L’imagerie a lieu sous anesthésie générale et dure moins de 4 minutes pour chaque animal (5 sessions au total). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Concernant la création (6 gènes) ou la maintenance (6 gènes) de lignées mutantes pour ces 12 gènes au total (établissement 1), le phénotype dommageable attendu correspond à une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale sans impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter. Nous ne pouvons pas exclure que l’inactivation d’un des gènes puisse entrainer en outre des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance ou leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique (établissement 1) est une petite plaie associée à un inconfort de courte durée. Le prélèvement est réalisé sous anesthésie générale qui génèrera un potentiel risque d’arrêt cardiorespiratoire en lien avec l’anesthésie, ce risque sera minime en raison de la très courte durée de l’anesthésie ainsi que la faible profondeur de narcose. Les animaux devront être hébergés seuls dans l’attente des résultats du génotypage (14 jours maximum) ce qui génèrera un stress. Le protocole d’imagerie (établissement 2) est réalisé sous anesthésie générale et dure moins de 4 minutes, ce qui peut entrainer un risque d’arrêt cardiorespiratoire en lien avec l’anesthésie. Les tests comportementaux (établissement 1) seront associés à un stress social pour les poissons en raison du changement d’environnement et de l’individualisation (1h) nécessaire pour le test. La manipulation des poissons à l'aide d'une pipette en plastique peut également être source de stress et présenter un risque de blessure mécanique pour les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés, une partie afin de faire des analyses post-mortem pour répondre à notre question scientifique, et l’autre partie car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Les études de l’effet de mutations génétiques sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la forme de la colonne vertébrale ni de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de l’absence de contact au sol via des membres, sont facilement susceptibles de développer des torsions axiales de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) et constituent ainsi un modèle de choix pour l’étude des déformations tridimensionnelles de la colonne vertébrale rappelant les scolioses idiopathiques chez l’humain.
Réduction
Le projet prévoit l’utilisation de 27 116 poissons zèbres. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, l’effectif a été défini en tenant compte : (i) des stades clés du développement pertinents pour tester les hypothèses du projet en incluant des poissons mâles et femelles ; (ii) de la répartition génétique attendue lors de croisements ; (iii) du nombre minimal d’animaux requis pour détecter des effets morphologiques, estimé à partir d’analyses statistiques issues d’études pilotes; (iv) du taux de mortalité entre le stade larvaire (6 jours) et l’âge adulte (3 mois) lié à la sensibilité de l’espèce aux conditions environnementales durant le développement précoce et v) des variations de l’environnement impactant la survie, la reproduction et le ratio male-femelle. Pour réduire le nombre d’animaux à élever, nous mettrons en place un protocole de génotypage au stade larvaire, en commençant par les gènes tph2 et uts2r. La réussite de ce protocole pourrait permettre de génotyper les animaux dès le stade larvaire, puis de n’élever que ceux nécessaires à la procédure 2 et la procédure 3. L’identification rapide des mutations impliquées dans des anomalies du développement reposera sur l’analyse de larves âgées de 2 à 6 jours (hors champ de la directive). L’inactivation du gène d’intérêt sera réalisée par une méthode d’édition génétique ciblée permettant d’observer rapidement les effets phénotypiques chez les larves et les jeunes poissons de la première génération. Pour nos calculs de puissance, nous utilisons nos résultats précédents sur des gènes impliqués dans les déformations. Nous utilisons un calculateur basé sur un t-test indépendant qui compare des animaux injectés contrôles à des animaux chez lesquels le gène ciblé a été modifié. Les tests statistiques utilisés dans nos publications sont des modèles linéaires à effets mixte qui tiennent compte de la taille de la ponte, de l’effet ponte en plus du génotype. Nous utiliserons au maximum 27 116 poissons zèbres, répartis en quatre lots expérimentaux. Du fait de variations de l’environnement impactant la survie et le ratio male/femelle, un delta maximum de 30 pourcents est ajouté.
Raffinement
Afin de limiter les procédures invasives, le prélèvement pour identifier le patrimoine génétique des poissons génétiquement modifiés sera réalisé préférentiellement sur de très jeunes larves par une méthode non invasive. Si cela n’est pas possible nous aurons recours à un prélèvement invasif sur les poissons adultes. Dans ce cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal sous anesthésie générale, par manipulation atraumatique, avec un prélèvement le plus petit possible et à l'aide d'instruments désinfectés. Les poissons seront maintenus en hébergement individuel uniquement pendant la durée nécessaire à l'identification génétique, pour une durée typiquement de 7 jours et exceptionnellement jusqu' à 14 jours maximum en cas de difficultés rencontrées pour les analyses. Cette durée sera toujours la plus courte possible, dès les résultats connus les animaux seront remis en groupe. Les poissons de lignées génétiquement modifiés présenteront une déformation de la colonne vertébrale qui ne doit pas impacter leur capacité à se nourrir ou se déplacer. Nous assurerons un suivi et une prise en charge spécifique pour ces animaux, si nécessaire, pour limiter au maximum l’impact de cette déformation sur leur bien-être et leur état général. Lors des tests comportementaux les poissons seront habitués à la salle de comportement pendant 30 minutes avant le début des tests afin de réduire leur stress. Lors des analyses morphologiques, le transport des poissons vers un site d'imagerie est organisé de manière à limiter le stress, avec des contenants adaptés, un contrôle de la température et un temps de trajet réduit au minimum. Toutes les manipulations seront réalisées de manière douce et calme, avec le matériel adapté et de façon à réduire au maximum le stress induit pour les animaux. Tous les animaux seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration entre les équipes de recherche, l’équipe vétérinaire et la structure chargée du bien-être animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des poissons.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre partage environ 70 pour cent de son génome avec l'humain et peut être modifié génétiquement avec succès par injection d'outils d'édition génique dans ses œufs. Dès l’âge de 3 mois, les poissons zèbre se reproduisent fréquemment, avec un seul couple adulte pouvant pondre plusieurs centaines d'œufs. Dans le cadre de l'étude de la scoliose, une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont peu adaptés. Le soutien apporté par leurs membres antérieurs leur permet de compenser partiellement cette déformation et d'en limiter la progression. Le poisson-zèbre, en revanche, constitue un modèle pertinent pour l'étude des déformations vertébrales. Sa colonne vertébrale présente des similitudes structurelles avec celle de l'humain, avec une organisation longitudinale composée de vertèbres mobiles et de disques intervertébraux organisés en plusieurs segments. L'analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par tomodensitométrie chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études antérieures. La génération et le maintien des lignées seront réalisés à partir de poissons âgés de 3 à 18 mois. Le prélèvement pour génotypage sera effectué au stade larvaire (2 à 3 jours jours post-fécondation) lorsque possible ou sur des adultes de 3 à 6 mois, âge optimal permettant une bonne récupération après anesthésie et limitant l’impact du prélèvement grâce à leur taille. L’analyse comportementale portera sur les stades larvaires de 1 à 4 semaines, période durant laquelle le comportement de recherche de nourriture est essentiel au développement, alors que les altérations morphologiques ne sont pas encore visibles. Cette fenêtre permettra de détecter d’éventuelles anomalies comportementales précoces. L’évolution du phénotype de scoliose sera étudiée par imagerie à 2 mois (stade juvénile à forte croissance, comparable à l’aggravation pubertaire chez l’humain), puis à 3, 4, 6 et 12 mois (stade adulte). Cette approche longitudinale permettra de suivre la progression de la déformation spinale au cours du temps. Le génotypage sera effectué au stade adulte et quand c’est possible sur des larves âgées de 1 à 6 jours post-fécondation.