Système musculosquelettique

Anesthésié, amputé d'un segment de fémur pour simuler une fracture grave, puis pourvu d'un implant imprimé en 3D fixé par vis et plaques, chaque lapin est ensuite suivi par imagerie jusqu'à sa mise à mort. 21 lapins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec une boiterie temporaire attendue pendant la cicatrisation. Neuf sont tués douze semaines après l'opération et douze autres à seize semaines, pour des analyses radiologiques, bactériologiques et histologiques. Le projet teste un revêtement antibactérien censé éviter les infections osseuses et réduire l'usage d'antibiotiques chez de futurs patients humains.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité d’un implant innovant pour soigner des fractures graves. Lorsque l'os subit une perte de matière trop importante, il ne peut plus se réparer seul. Nous avons donc conçu un dispositif par impression 3D à partir d'un matériau médical (le polycaprolactone) qui est recouvert d'un traitement antibactérien pour empêcher le développement de bactéries. Le lapin est un modèle animal reconnu en recherche médicale car la régénération de ses os est assez proche de celle des humains. Cela permet de vérifier si l'implant est efficace et sécurisé avant d'envisager son utilisation en médecine humaine. Nous suivons la guérison selon trois axes complémentaires : ● L’imagerie : radiologie standard en 2D et scanner en 3D. Ces techniques permettent de voir avec précision comment l'os repousse à l'intérieur de l'implant et de mesurer la quantité d'os solide formé. ● L’analyse microscopique : On observe les tissus de très près pour vérifier que l'implant soit bien accepté, que le sang circule correctement autour et que l'os s'y attache solidement. ● Les tests bactériologiques : L'implant est testé face à des bactéries courantes (Staphylococcus aureus) pour prouver que son revêtement empêche réellement les infections de s'installer. L’étude permet de s'assurer que l'implant est stable mécaniquement et qu'il ne provoque pas d'inflammation. L'objectif final est de valider cette technologie pour offrir une nouvelle solution aux patients souffrant de graves blessures osseuses ou de complications infectieuses.

Bénéfices attendus

1. Apports scientifiques et médicaux ● Validation d'un nouveau matériau : Vérifier l'efficacité d'un implant créé par imprimante 3D et recouvert d'une protection antibactérienne totalement nouvelle. ● Compréhension de la guérison : Mieux comprendre comment l'os se répare face à une blessure importante que le corps ne peut pas soigner seul. ● Nouvelles connaissances : Découvrir comment une surface traitée peut stopper les bactéries directement à l'intérieur de l'os. 2. Progrès pour la chirurgie ● Méthode de référence : Créer une technique d'opération précise et identique pour tous les chirurgiens, afin d'assurer la réussite de la pose de l'implant. ● Amélioration de l'implant : Utiliser des tests préalables pour ajuster la forme et la solidité de l'implant. 3. Innovation et santé publique ● Vers une application humaine : Ce projet est la première étape pour transformer une découverte de laboratoire en un véritable traitement pour les patients qui peut fortement réduire les séquelles des traitements actuels (lourds et chronophages) et la résistance aux antibiotiques qui sont utilisés de façon prolongée et à hautes doses pour traiter les infections osseuses que notre implant sert à éviter. ● Réduire les médicaments : En créant un implant qui élimine lui-même les bactéries, on peut réduire l'utilisation des antibiotiques par voie orale ou intraveineuse après l'opération, le but est de réduire l’utilisation des antibiotiques qui sont utilisés de façon prolongée pour les infections de l’os. 4. Rigueur de la recherche ● Modèle de référence : Les données récoltées pourront servir à d'autres chercheurs travaillant sur de nouveaux matériaux. ● Les protocoles décrits sont ceux déjà mis en œuvre par le service et par les différentes sources de la littérature scientifique. 5. Enjeux de société et éthique ● Respect de l'animal : L'entraînement préalable sur cadavres permet de limiter au maximum le nombre de lapins vivants nécessaires à l'étude. ● Participation à la recherche sur un sujet actuel avec de possible applications médicales sur l’Homme. ● Bénéfice pour les patients : À long terme, l'objectif est de réduire les complications graves après une fracture, car les infections osseuses sont encore aujourd'hui très difficiles à soigner chez l'Homme.

Procédures

Déroulement de la procédure chirurgicale L’intervention dure environ 40 minutes par animal et se déroule en plusieurs étapes précises : Anesthésie générale : Comme pour une opération humaine, le lapin est endormi profondément. Il ne ressent aucune douleur pendant toute la durée de l'acte. Création d'un défaut osseux : Le chirurgien retire un petit segment de l'os (le fémur) pour simuler une blessure grave qui ne peut pas guérir seule. Pose de l'implant : L'implant créé en 3D est placé dans cet espace. Fixation (Ostéosynthèse) : Pour que l'implant reste bien en place et que la patte soit solide, on utilise du matériel chirurgical classique, comme des petites plaques ou des vis métalliques. Suivi de la guérison : Une fois l'opération terminée, la patte du lapin est surveillée de très près pour vérifier comment l'os se reconstruit autour de l'implant. Pour cela : Examens d'imagerie : On réalise des radiographies ou des scanners Objectif : Ces images permettent de voir, sans intervenir à nouveau, si l'implant reste bien fixé et si le nouvel os commence à combler le vide.

Impact sur les animaux

Toute recherche médicale comporte des risques que les chercheurs doivent prévoir et surveiller de près. 1. Douleur – Inconfort post-opératoire : Comme après toute chirurgie, l'animal peut ressentir de la douleur au niveau de la cicatrice et de l'os opéré. – Gêne pour se déplacer : Une boiterie temporaire est attendue pendant la phase de cicatrisation précoce. – La surveillance et la gestion avisée de la douleur des animaux seront primordiales lors de cette phase précoce. 2. Risques liés à l'anesthésie – Effets secondaires : L'endormissement peut ralentir la respiration ou le rythme cardiaque. Certains animaux peuvent également faire une réaction imprévue aux médicaments utilisés pour l'anesthésie. – Stress : L'intervention représente un stress physiologique pour l'organisme de l'animal. Des soins d’apaisement seront réalisés en amont de la chirurgie et un complément médicamenteux pourra être entrepris si l’animal n’est pas suffisamment détendu. 3. Complications locales – Infections : Des bactéries peuvent tenter de se développer au niveau de la plaie ou de l'implant. – Problèmes de cicatrisation : On surveille l'apparition de gonflements (hématomes), d'inflammations ou une ouverture accidentelle des fils de suture. – Problèmes techniques : L'implant ou le matériel de fixation (vis, plaques) pourrait se déplacer ou se casser 4. État de santé général – Réaction du corps : Le lapin peut présenter une légère fièvre ou être moins actif juste après l'opération. – Variation de poids : Le stress de la chirurgie peut entraîner une perte de poids temporaire, ce qui nécessite une surveillance quotidienne de l'alimentation. – Comportement : Si le lapin ressent une gêne persistante, il peut essayer de lécher ou de gratter sa cicatrice. Des protections sont parfois nécessaires pour éviter qu'il ne se blesse. 5. Risques spécifiques au nouveau matériau – Efficacité de la protection : Le but de l'étude est de tester le revêtement antibactérien. Si celui-ci n'est pas assez efficace, des microbes pourraient coloniser l'implant, ce qui nécessiterait une prise en charge rapide.

Devenir

Élevage et opération de 21 lapins. Mise à mort de 9 lapins à 12 semaines post-opératoires : analyses radiologiques, bactériologiques et histologiques après la mise à mort. Mise à mort de 12 lapins à 16 semaines post-opératoires : analyses radiologiques, bactériologiques et histologiques après la mise à mort.

Remplacement

La reconstruction d'un os est un phénomène biologique très complexe qui se déroule en plusieurs étapes. À ce jour, il est impossible de reproduire en laboratoire (dans des tubes à essai) l'ensemble des éléments nécessaires à cette guérison, comme : - La circulation sanguine : L'os a besoin d'être irrigué par le sang pour cicatriser. - Les forces mécaniques : Les mouvements et le poids du corps stimulent la repousse de l'os. - Les interactions cellulaires : Des milliers de cellules différentes communiquent entre elles pour reconstruire la matière osseuse. Pour comprendre comment l'implant est progressivement remplacé par du véritable os, les chercheurs doivent analyser les tissus à différents moments de la cicatrisation. Pour cela, les examens sont réalisés par étapes tout au long du projet. Cela permet de voir si l'implant fonctionne aussi bien après quelques semaines qu'après plusieurs mois. Le projet est organisé de manière très stricte pour utiliser le moins d'animaux possible : Tests préalables en laboratoire : Avant de passer à l'animal, l'implant et son revêtement antibactérien ont déjà été testés en contact de bactéries. Phase sur cadavres : La première étape de la chirurgie est réalisée sur des lapins déjà décédés. Cela permet de vérifier que l'implant s'ajuste parfaitement et que la technique de fixation est solide avant d'opérer des animaux vivants. Validation progressive : On ne passe à une étape supérieure que si les résultats précédents sont concluants, afin de garantir la sécurité et l'utilité scientifique de chaque procédure. Ce protocole permet de s'assurer que l'implant est efficace et sans danger dans un organisme vivant. C'est une étape indispensable pour espérer, un jour, utiliser cette technologie pour soigner des humains souffrant de graves blessures et infections osseuses.

Réduction

Avant de commencer l’étude sur des animaux vivants, une phase de test sur des cadavres est organisée. Cela permet aux chirurgiens de s'assurer que l'implant s'adapte parfaitement à l'os et de régler les derniers détails techniques. Cette étape est essentielle pour réduire le nombre d’animaux vivants utilisés et garantir le succès des opérations. Le nombre de lapins n'est pas choisi au hasard. Nous utilisons une méthode de calcul scientifique pour déterminer le nombre minimum d'animaux nécessaires (ici 21 lapins) pour que les résultats soient statistiquement valables. Si on utilise trop peu d'animaux, l'étude ne prouve rien. Si on en utilise trop, ce n'est pas éthique. Le groupe final est légèrement plus nombreux pour garantir la fiabilité des résultats, même en cas d'imprévu.

Raffinement

Pour limiter le stress et garantir une récupération rapide, plusieurs précautions sont mises en place avant, pendant et après l'opération. 1. Gestion de la douleur et anesthésie - Sommeil profond : L'animal est endormi durant toute l'opération pour ne ressentir aucune douleur. - Traitement anti-douleur : Des médicaments (analgésiques) sont administrés avant le réveil et continués les jours suivants, exactement comme on le ferait pour un humain opéré. 2. Confort durant l'opération - Maintien de la chaleur : Sous anesthésie, le corps se refroidit vite. Le lapin est donc installé sur un tapis chauffant et un tapis absorbant pour maintenir sa température. - Efficacité chirurgicale : grâce à l'entraînement préalable sur cadavres, l'équipe opère plus vite. Moins de temps passé sous anesthésie signifie un réveil plus facile pour l'animal. 3. Récupération et environnement - Liberté de mouvement : Dès son réveil, le lapin peut se déplacer dans sa cage. On ne l'immobilise pas, car le mouvement aide à la guérison de l'os. - Accès direct aux besoins : Pour éviter que le lapin ne se fatigue, l'eau et la nourriture sont placées juste à côté de lui. Il n'a pas besoin de traverser la cage pour s'alimenter. 4. Surveillance et soins quotidiens - Visite médicale journalière : Chaque jour, un soignant vérifie l'état général du lapin : son poids, son appétit, sa façon de marcher et le bon état de l'implant. - Soins de la plaie : La cicatrice est nettoyée régulièrement avec des compresses et du sérum physiologique (eau salée stérile). On retire les petites croûtes pour que la peau cicatrise proprement et sans infection.

Choix des espèces

Pour cette étude, nous avons choisi d’utiliser des lapins de race Néo-Zélandais Blanc de taille adulte pesant entre 3 kg et 3,5 kg. Ce choix ne doit rien au hasard et s'appuie sur plusieurs critères scientifiques : 1. Un modèle de référence mondial Ce lapin est utilisé par les chercheurs du monde entier pour étudier la réparation des os. Comme il existe déjà énormément de documents scientifiques sur cette espèce, nous pouvons comparer nos résultats avec ceux d'autres laboratoires pour vérifier que nos découvertes sont exactes. Le modèle le plus fréquemment utilisé est le lapin NZW de taille adulte. 2. Une taille d'os adaptée Le fémur (l’os de la cuisse) de ce lapin a une taille et une solidité idéales. Il est assez grand pour que l'on puisse y fixer nos implants imprimés en 3D avec des vis et des plaques chirurgicales, exactement comme on le ferait sur un doigt (métacarpien) humain dont nous connaissons la technique opératoire et le matériel nécessaire. 3. Une guérison prévisible La façon dont l’os du lapin cicatrise est bien connue. Cela nous permet d'obtenir des résultats reproductibles : cela signifie que si l'implant fonctionne sur un lapin, il y a de fortes chances qu'il fonctionne de la même manière sur les autres. 4. Une efficacité scientifique Grâce à toutes les données déjà connues sur ce modèle, nous pouvons obtenir des résultats fiables en utilisant le plus petit nombre d'animaux possible. C'est un point essentiel pour respecter les règles d'éthique de la recherche.

2 232 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, réparties en groupes d'âge de deux à dix-neuf mois. Chacune subit gavages, injections dans le muscle de la cuisse, tests d'effort et prélèvements sanguins, certaines étant transportées entre deux établissements, pour étudier le lien entre la graisse intramusculaire et le métabolisme du muscle. Les retombées pour la santé humaine, fragilité musculaire liée à l'âge ou à l'obésité, sont annoncées "à plus long terme". Le porteur reconnaît qu'aucun calcul de puissance n'a été possible et que l'effectif repose sur ses habitudes expérimentales.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 2 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux établissements utilisateurs (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

4 648 rats porteurs du gène humain HLA-B27, qui développent spontanément une spondylarthrite, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. La majorité sert à l'élevage des lignées, les autres subissent un stress par immobilisation deux heures par jour pendant deux semaines, des administrations de composés bactériens ou des injections de cellules immunitaires. Le porteur indique que ces rats développent colite, inflammation articulaire et atteintes de la peau, avec un antalgique prévu au-delà d'un score articulaire de 8 sur 16. Il affirme que ce modèle est le seul à reproduire toutes les atteintes de la maladie et le juge "indispensable".

Objectifs

La Spondyloarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent au sein de la population adulte française. Le gène d’intérêt est fortement associé au développement de SpA et constitue le facteur génétique principal multipliant le risque de développer cette maladie par 40. Malgré une association démontrée il y a plus de 50 ans, les raisons pour lesquelles ce gène confère cette prédisposition sont encore peu connues. L’identification des mécanismes impliqués dans l’association gène/maladie est importante car la SpA est une maladie fréquente, touchant 0,45% de la population adulte en France. De manière importante, il n’existe aucun traitement curatif, seulement des thérapies ralentissant la progression de l’état inflammatoire et de la maladie. Les modèles in vitro ne permettent pas d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques lors de la SpA car ils ne récapitulent pas la complexité d’un organisme. Ainsi, l’étude du rat transgénique pour ce gène constitue le seul modèle récapitulant toutes les atteintes de la SpA et est considéré comme le modèle le plus pertinent d’étude. Dans ce modèle surviennent spontanément toutes les manifestations de la SpA : une inflammation articulaire chronique, une inflammation intestinale et des atteintes inflammatoires de la peau et des griffes. Le développement de ces symptômes cliniques nécessite une flore microbienne conventionnelle, ainsi ces rats élevés en condition stérile ne développent pas de SpA. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer l’influence des constituants du microbiote intestinal sur l’activation des cellules du système immunitaire du rat conduisant au développement de la SpA et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Une meilleure compréhension du rôle pathogène des composants du microbiote et des cellules immunitaires pourra conduire à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos expériences consisteront d’abord à administrer des composants du microbiote à des rats ainsi qu’à des rats contrôles puis à évaluer l’activation des cellules immunitaires et la sévérité de la SpA. L’ensemble de ces approches permettra de disséquer les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal et ses composants influencent l’activation des cellules immunitaires au cours de la SpA, dans l’objectif final d’identifier et tester de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

La SpA est une maladie multifactorielle impliquant des facteurs génétiques et environnementaux menant à une dérégulation inflammatoire. La SpA est responsable de douleurs invalidantes et d’un handicap fonctionnel chez des jeunes adultes et il n’existe aucun traitement curatif. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires liés aux constituants du microbiote permettra de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. L’utilisation de ce modèle est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques et de pouvoir accéder aux tissus d’intérêt de la SpA, car l’accès en routine aux biopsies humaines (notamment de ganglions lymphatiques, de moelle osseuse ou de tissu synovial d’articulations inflammées) n’est pas envisageable. Par ailleurs, les expérimentations de modifications du microbiote ou du système immunitaire doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Enfin, de telles expérimentations ont permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques telles qu’un médiateur soluble produit par les cellules immunitaires aujourd’hui utilisé en clinique.

Procédures

Les différentes lignées de rats seront élevées et maintenues lors de la procédure 1(3 600 animaux). Le projet s’articule ensuite selon 4 procédures indépendantes avec un animal n’étant impliqué que dans une seule de ces 4 procédures. Lors de la procédure 2, les animaux seront soumis à un stress contrôlé par immobilisation 2 heures par jour, 5 jours par semaine pendant 2 semaines. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 144 animaux. Lors de la procédure 3, les animaux recevront plusieurs administrations de composés bactériens, 5 fois par semaines pendant 3 semaines par voie orale. En cas d’échec de la voie oral, les animaux seront soumis à deux administrations de composés bactériens en 1 seul jour par voie sous-cutanée ou intradermiques. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 360 animaux. Lors de la procédure 4, les animaux seront soumis à une injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 384 animaux. Enfin, lors de la procédure 5, les animaux seront administrés avec des agents biologiques et chimiques (candidats thérapeutiques) par infusion continue en utilisant des pompes osmotiques. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 160 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent les rats qui développent de manière spontanée les symptômes de la SpA à partir de 3-4 semaines d’âge. Le premier symptôme est la survenue d’une inflammation intestinale se traduisant par une colite qui sera accompagnée dans 15% des cas par des atteintes articulaires. Ces inflammations articulaires varient au cours du temps et certaines se résorbent sur le temps (environ 20% des cas). Les animaux seront suivis pour le développement de ces symptômes à l’aide d’une grille d’évaluation (annexe 2) utilisée dans plusieurs laboratoires permettant de quantifier la sévérité de la maladie et la nécessite si la maladie est très sévère d’mettre à mort l’animal. Depuis plus de 20 ans d’utilisation de ce modèle un nombre presque nul d’animaux a atteint ce stade de sévérité. La procédure de stress (procédure 2) vise à augmenter l’incidence d’arthrite chez ces animaux mais de nombreuses études montrent que ce stress induit est seulement temporaire. Enfin les administrations par voie orale sous-cutanée ou intradermiques présenteront un léger inconfort aux animaux le plus souvent associé à la contention de l’animal. En cas de douleur, un traitement antalgique par voie sous-cutanée sera mis en place.

Devenir

A l'issue des procédures 1 à 5, les animaux seront euthanaisés.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant l’étude de la SpA, une pathologie qui est responsable de douleurs invalidantes et d’un handicap fonctionnel chez des jeunes adultes. De manière importante, Il n’existe aucun traitement curatif. De plus, l’étiologie de la SpA est encore mal connue, mais pourrait être la résultante de la dérégulation de plusieurs composantes (microbiote intestinal et cellules immunitaires). Les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire cette complexité. Ainsi, l’étude de l’interaction entre ces différentes composantes impliquées nécessite un modèle animal. Dans ce contexte, plusieurs modèles précliniques de SpA ont été développés. Parmi eux, le rat B27 est le modèle le plus pertinent pour étudier cette pathologie associée à l’expression de l’allèle de susceptibilité majeur de la SpA : le HLA-B27. Ce modèle, particulièrement utilisé, est indispensable pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques et une application chez l’homme. En outre, de telles expérimentations ont permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques telles que l’IL-17 (maintenant utilisé en clinique) et plus récemment CCR6.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est strictement limité tout en garantissant la robustesse statistique des résultats afin de respecter le principe de réduction. Plusieurs test préalables nous permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet significatif. Le nombre d’animaux par groupe varie selon le type d’expérience. Tandis que des effectifs réduits (environ 4 animaux) peuvent suffire pour des analyses moléculaires et tissulaires ; des évaluations fonctionnelles sur le développement et la sévérité de la SpA nécessitent des effectifs plus élevés (environ 6 à 8 animaux par groupe), pouvant être ajustés si nécessaire. Une expérience de mise au point du système expérimental permet aussi ensuite de réduire le nombre d’animaux utilisés ensuite (procédure 3). Ce projet s’inscrit dans la continuité de nos travaux antérieurs au laboratoire, ainsi que de projets similaires menés dans d’autres établissements. Lorsque cela est possible et compatible avec les exigences règlementaires, les animaux proviennent d’élevages issus de notre projet précédent, limitant ainsi l’acquisition de nouveaux animaux spécifiquement pour cette étude. Des animaux initialement utilises pour la caractérisation de lignées et génotypes pourront ainsi être inclus ultérieurement dans des procédures de stress ou d’administration (procédure 2 à 5). De même, des animaux reproducteurs vieillissants pourront être réaffectés lorsque cela est scientifiquement et éthiquement justifié. Enfin, les analyses seront faites à la fin de chacune des expériences et permettront le cas échéant de ne pas effectuer une expérience supplémentaire si la significativité est atteinte.

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement sont mises en oeuvre pour garantir le bien-être des animaux tout au long du protocole. Lors de la procédure d’élevage utilisant des rates transgéniques B27, l’alimentation sera supplémentée en fromage pour les femelles gestantes leur permettant une alimentation plus riche lors de cette période afin de mieux nourir les petits. Après chaque séance de stress contrôlé, les rats seront retournés dans leur cage respective avec 1 autre rat pour permettre de réduire le stress de la contention. Pour les administrations intraveineuses, les animaux seront anesthésiés avant l’injection afin de diminuer le stress et la douleur liées à la procédure. L’anesthésique utilisé sera l’isoflurane par voie inhalée. Pour le confort des animaux, les rats ne seront pas isolés mais le nombre d’animaux sera de 2 à 3 par cage suivant leur poids et les changes des cages seront plus fréquents (2 fois par semaine) chez les animaux malades. Pour l’administration par voie orale de composés du microbiote, nous utiliserons une canule en plastique adaptée à l’animal et à son poids, afin de diminuer la douleur liée à la procédure. Le geste sera réalisé par des personnes entraînées à cette technique. Pour limiter le stress après administration de composés du microbiote, les animaux seront maintenus en cage par groupe expérimental respectif, 2 ou 3 animaux par cage. Les changes des cages seront plus fréquents chez les animaux dont l'inflammation intestinale est importante. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel compétent, permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’inconfort. Ces observations sont effectuées par le personnel de zootechnie, par le vétérinaire lors des contrôles réguliers et par les expérimentateurs. Nous utiliserons un tableau de scoring hebdomadaire permettant d’évaluer la sévérité des symptômes (annexe 2). L'administration d'un médicament analgésique (Butorphanol par voie sous-cutanée 1 fois par jour pendant 1 semaine) est prévue pour limiter les douleurs liées à la SpA chez les rats qui présentent une inflammation articulaire forte mais qui n'ont pas atteint le point limite (score articulaire supérieure à 8/16). En cas de présence d’arthrites, l’alimentation humidifiée avec de l’eau sera mise à disposition dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est le rat, en raison de sa pertinence préclinique et de son adéquation expérimentale mimant les formes axiales et périphériques de la SpA. Les atouts sont la survenue spontanée de la maladie chez les rats B27 possédant le facteur génétique majeur de prédisposition à la SpA, et la disponibilité de plusieurs lignées génétiquement modifiées. Les lignées de rats B27 utilisées sont complémentaires et permettent d’évaluer l’efficacité des traitements en fonction des atteintes cliniques. Les analyses cellulaires, moléculaires, histologiques et cliniques permettent d’appréhender le bénéfice fonctionnel global, tout en respectant les principes des 3R. Ainsi, l’utilisation des rats B27 est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques de la SpA. Par ailleurs, les expérimentations de modulation du microbiote ou du système immunitaire doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Les animaux utilisés dans ce projet seront des rats à différents stades de développement allant de 3 semaines d’âge (correspondant au sevrage et au stade prémorbide chez le rat B27) à l’adulte. Ce choix permet d’évaluer le rôle du stress (procédure 2), des composant du microbiote (procédure 3) et de cellules immunitaires purifiées (procédure 4) et de composés thérapeutiques candidats (procédure 5) lors du développement de la SpA du rat B27. Quelques expériences de caractérisation de nos lignées utiliseront des femelles gestantes (n=10 sur 5 ans). Cette saisine inclue une procédure d’entretien des lignées (procédure 1) nécessitant des rats adultes âgés de 2 à 6 mois. Ces âges correspondent à la période de fertilité de ces animaux en laboratoire.

Opérées pour une dénervation musculaire, parfois alors qu'elles sont gestantes, 1 048 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour l'analyse de leurs tissus. Les animaux subissent des injections, des chirurgies sous anesthésie, des tests comportementaux d'une heure, un électromyogramme et une mesure de force, la chirurgie pouvant provoquer douleurs, infection et boiterie. Le projet étudie la jonction entre le nerf et le muscle, en vue de comprendre des maladies neuromusculaires rares comme les syndromes myasthéniques congénitaux. Le porteur décrit ces syndromes comme touchant une personne sur 250 000, situant le bénéfice attendu à distance de l'atteinte infligée.

Objectifs

La jonction neuromusculaire (JNM) est la zone de contact entre les neurones moteurs et les muscles striés squelettiques qu'ils innervent. Cette synapse est responsable de l'initiation et du contrôle du mouvement. Le dysfonctionnement de cette synapse entraîne un défaut de la transmission nerf muscle, avec des conséquences dramatiques sur notre capacité à contracter nos muscles, à nous mouvoir ou tout simplement à respirer. Décrypter comment la JNM acquiert sa morphologie complexe et régule sa communication nerf/muscle au cours du développement embryonnaire et tout au long de la vie est essentiel pour comprendre comment le système nerveux fournit le lien entre les pensées et les actions, en relayant des messages qui voyagent si vite que nous ne les remarquons même pas. Compte tenu de la complexité de ces connexions spécifiques, même des défauts subtils dans les événements moléculaires entraînant l'attachement nerf muscle sont à la base d'un large éventail de troubles neurodéveloppementaux affectant en particulier le système neuromusculaire. Par conséquent, l'étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation et la maintenance de la JNM est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués et restaurer une connectivité synaptique appropriée dans les pathologies de la JNM.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet vont de l’élucidation, in vivo, des mécanismes moléculaires physiopathologiques qui sous-tendent la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) chez les mammifères, jusqu’à la création d’une base solide pour le développement d’essais cliniques chez des patients atteints de certaines pathologies neuromusculaires comme par exemple les syndromes myasthéniques congénitaux (SMC). Les SMC sont des maladies rares (1 personne sur 250 000) causées par la mutation d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire.

Procédures

Au cours du projet, une partie des animaux recevront des injections non répétées apres anesthésie (générale et locale) et analgésie. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale anesthésie et analgésie (générale et locale) suivie d'une injection non répétée pour une durée de 10 minutes par animal. L'ensemble des animaux du projet effectueront tests comportementaux totalisant une durée d'une heure de tests par animal. De plus, un électromyogramme unique d'une durée de 10 minutes sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés. Enfin l'ensemble des animaux du projet subiront un test de mesure de force (10 minutes) apres anesthésie et analgésie de l'animal et sera ensuite euthanasié. Une autre parti des animaux subira une procédure chirurgicale apres anesthésie et analgésie (générale et locale) d'une durée de 20 minutes maximum par animal. A la fin de le période de maintien, les animaux seront euthanasiés pour des prévelement tissulaires suivis d'analyses cellulaires et moléculaires.

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées sur les animaux nécessitent leur manipulation (injections, tests comportementaux), ce qui engendre un stress de courte durée pour l’animal. Les injections et éléctromyogrammes peuvent induire une douleur locale également de courte durée. Les différentes anesthésies réalisées peuvent entraîner une baisse de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire. La chirurgie visant une dénervation musculaire peut engendrer des douleurs, des risques d’infection postopératoire ainsi qu’une boiterie.

Devenir

L'euthanasie est, dans ce projet, strictement nécessaire pour l'analyse phénotypique au niveau cellulaire et moléculaire des animaux impliqués et est réalisée selon des méthodes réglementaires.

Remplacement

L'étude de la formation et de la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) est un processus complexe incluant pléthore d'acteurs cellulaires et moléculaires ne pouvant pas être modélisés in vitro. La qualité de la mise en place de la jonction neuromusculaire et de sa maintenance a des conséquences physiologiques qui nécessitent l’analyse de paramètres physiques, moteurs, propres aux animaux vivants. Cependant, une partie des études in vivo est complétée par des méthodes de (co-)culture cellulaire cherchant à mimer le développement de la JNM dans le but d'évaluer le rôle d'acteurs moléculaires sur celui-ci.

Réduction

Au total, 1048 animaux sont impliqués. Ce nombre est calculé et strictement limité afin d'avoir une puissance statistique suffisante permettant de montrer la significativité d'une différence lorsque celle-ci existe et d'obtenir des résultats fiables. Le calcul de puissance est réalisé avec un logiciel statistique dédié à cet effet. Par ailleurs, diverses cultures et co-cultures cellulaires sont mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel étant limité au maximum) en portoirs ventilés, avec un système d’abreuvement automatique et un accès ilimité à la nourriture et à l’eau. Le milieu est enrichi avec au moins deux enrichissements, et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été conçu de manière à permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les études comportementales reposent sur les comportements spontanés propres aux animaux. L’évaluation motrice est réalisée après différentes phases d’habituation (à l’expérimentateur et aux tests), permettant de minimiser le stress associé aux manipulations répétées. La majorité des actes techniques sont réalisés sous anesthésie et analgésie. Pour les chirurgies, une analgésie post opératoire sera également mise en place. Ainsi, la douleur et le stress sont limités grâce à des soins adaptés et une surveillance attentive, accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Le protocole mis en place est optimisé pour respecter le bien-être des animaux et pour réduire la durée de l’expérimentation au minimum.

Choix des espèces

Le développement des techniques d’imagerie et de transgénèse chez la souris rend cet animal le plus adapté à l’identification et à l’étude de nouvelles molécules impliquées dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM). Les animaux sont des souris agées de 20 à 180 jours pour les études comportementales et l’analyse des étapes de maintenance de la JNM.