Système musculosquelettique

Le muscle tibial antérieur d'une patte est retiré et remplacé par une matrice artificielle, puis enrichi par injection de cellules humaines. 120 souris immunodéficientes vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec six séances d'imagerie sous anesthésie et un transport à pied entre deux établissements. Le porteur ramène ces atteintes à des douleurs modérées et à un risque d'infection lié à l'immunodéficience, et prévoit que chaque souris serve de témoin à elle-même par comparaison de ses deux pattes. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever et analyser les muscles.

Objectifs

Ce projet vise à tester une nouvelle approche pour remplacer un muscle endommagé. Aujourd’hui, lorsqu’un muscle est perdu à cause d’une maladie ou d’un accident, il ne peut pas être remplacé. Nous développons une structure artificielle qui imite un muscle et qui peut être implantée à la place du muscle manquant. Cette structure est ensuite enrichie avec des cellules capables de former du tissu musculaire. L’objectif est de vérifier si cette approche permet de recréer un muscle fonctionnel dans un organisme vivant.

Bénéfices attendus

La perte d’un muscle, liée à une maladie ou à un accident, est aujourd’hui irréversible car il n’est pas possible de transplanter un muscle entre humains en raison des réactions du système immunitaire. Pourtant, ce type de handicap pourrait concerner des centaines de millions de personnes dans le monde. En effet, les maladies musculaires touchent une personne sur 3000 en Europe et la prise en charge actuelle varie entre 100 000 et 150 000 euros par patient et par an pour les formes les plus avancées. Ce projet propose une nouvelle approche pour répondre à ce besoin : remplacer le muscle manquant par une structure artificielle qui imite un muscle naturel. Une fois implantée, cette structure est enrichie avec différents types de cellules humaines capables de reconstruire un tissu musculaire. L’objectif est de démontrer que cette solution peut permettre de recréer un muscle fonctionnel. À terme, cette approche pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour les personnes ayant perdu la fonctionnalité d'un muscle.

Procédures

Au cours du projet, les animaux auront une chirurgie sous anesthésie et analgésie (1 fois, durée : 15 minutes) et une injection de cellules sous anesthésie (1 fois, 5 minutes). Les animaux seront transportés d'un établissement 1 vers un établissement 2 (animaux vigiles, 10 minutes). Enfin, les animaux seront suivis par imagerie sous anesthésie (6 fois, durée : 15 minutes).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux sont immunodéprimés ce qui les exposent à un risque accru aux infections. Plusieurs actes seront réalisés sous anesthésie (chirurgie, injection, imagerie), elle pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. L’intervention chirurgicale pourra engendrer des douleurs modérées et des risques d’infections. Les injections pourront induire une douleur légère de courte durée. Le transport entre les deux établissements pour la mise en oeuvre du projet et les imageries pourront engendrer un léger stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la procédure afin de prélever et analyser les muscles.

Remplacement

Avant toute utilisation chez l’animal, les différentes cellules sont étudiées en laboratoire grâce à des modèles in vitro. Ces tests permettent de vérifier leur bon fonctionnement et leur capacité à former des structures proches de celles observées dans l’organisme. Concrètement, certaines cellules sont sélectionnées pour leur capacité à former des fibres musculaires capables de se contracter, d’autres pour leur aptitude à former des vaisseaux sanguins, et d’autres encore pour leur rôle dans la production de composants essentiels du tissu. Ces propriétés sont évaluées à l’aide d’observations au microscope, de manière qualitative. Cette étape permet de s’assurer que les cellules présentent les caractéristiques attendues avant leur utilisation dans un organisme vivant. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble des mécanismes impliqués dans la formation d’un muscle complet. Les interactions complexes entre les différents types de cellules, les vaisseaux sanguins et les tissus ne peuvent pas être modélisées de manière fiable uniquement en laboratoire. C’est pourquoi une approche in vivo reste nécessaire pour répondre aux objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été défini de manière à obtenir des résultats fiables tout en respectant la règle des 3R. Au total, jusqu’à 120 animaux seront utilisés dans le cadre du projet. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, chaque souris servira de contrôle pour elle-même lorsque cela est pertinent, notamment en comparant les deux muscles de l’animal. Cette approche permet d’augmenter la puissance des analyses sans augmenter le nombre d’animaux. Les données seront comparées entre groupes à l’aide d’analyses statistiques adaptées, afin de garantir la robustesse et la fiabilité des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour limiter les risques d'infections liés au phénotype, les animaux auront de la nourriture, de la litière et des enrichissements stérilisés et l'eau de boisson sera purifiée. Les animaux seront également manipulés avec des gants sous hotte et hébergés en cages ventilées. L'ensemble des actes seront réalisés sous anesthésie générale et avec analgésie pour la chirurgie. Pendant l'anesthésie, les animaux sont placés sur tapis chauffant afin de maintenir leur température corporelle et un gel ophtalmique est appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux. Avant et après la chirurgie, un gel nutritif sera introduit dans la cage ainsi que des croquttes au sol pour faciliter la prise hydrique et alimentaire. Pour le transfert entre les deux établissements, les animaux seront placés dans une boite de transport avec litière, croquettes et enrichissement. La boite sera placée dans un sac opaque pour préserver les animaux de la lumière extérieure. Le transport de l’établissement 1 à l’établissement 2 est de 10 minutes maximum à pied. Les examens seront réalisés après une semaine d’acclimatation. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

L’utilisation de souris immunodéficientes est indispensable pour ce projet, car elle permet d’évaluer la greffe de cellules humaines dans un organisme vivant. Ces animaux présentent une déficience du système immunitaire ce qui limite fortement le rejet des cellules humaines injectées. Cette caractéristique est essentielle pour permettre la survie, l’intégration et l’étude des cellules humaines dans le tissu musculaire. Le modèle murin est largement utilisé en recherche biomédicale pour l’étude de la régénération musculaire, en raison de sa pertinence biologique et de la disponibilité de modèles adaptés. Ainsi, l’utilisation de cette lignée permet d’obtenir des résultats fiables et pertinents au regard des objectifs du projet. Les animaux seront utilisés à un stade adulte (entre 2 et 8 mois), ce qui correspond à un organisme mature et permet d’étudier la régénération musculaire dans des conditions proches de celles observées chez l’humain adulte. Ce choix est particulièrement pertinent pour évaluer l’intégration de la matrice et la formation d’un tissu musculaire fonctionnel dans un environnement physiologique stabilisé.

Élevées pour développer spontanément une arthrite inflammatoire, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est génotypée par poinçonnage de l'oreille sur animal vigile, sans anesthésie mentionnée. Le porteur décrit une inflammation articulaire apparaissant vers huit à dix semaines, avec un gonflement des pattes pouvant affecter la mobilité. Sur les 1 200 animaux, 900 sont expédiés vers un autre établissement pour y être utilisés, 300 servent à l'élevage et sont tués avant vingt semaines pour limiter l'aggravation de la maladie avec l'âge.

Objectifs

Ce projet décrit une procédure de l'élevage avec la prise en charge des animaux d’une lignée de souris développant progressivement une arthrite inflammatoire. Ces souris sont un modèle d’inflammation articulaire qui est causée par un mélange de facteurs génétiques, environnementaux et liés aux microbes présents dans l’intestin. Normalement, le corps produit une molécule inhibant l’interleukine 1 qui va limiter l’inflammation. Mais chez ces souris, cette molécule est absente, ce qui entraîne une inflammation excessive qui va notamment toucher les articulations. De plus, des éléments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques ou les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal peuvent aggraver cette inflammation. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie observée chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans des projets de recherche afin d'étudier l’arthrite inflammatoire et, à terme, aider à la recherche sur cette maladie chez l’homme qui représente 1 million de patients en France.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à l'équipe de recherche et à leurs partenaires d’avoir les souris nécessaires pour mener leurs études sur l’arthrite inflammatoire. A long terme, ces souris aideront les chercheurs à : mieux comprendre l’arthrite, identifier des marqueurs pour mieux la diagnostiquer, trouver de nouvelles façons de traiter cette maladie, tester de nouveaux médicaments anti-inflammatoires et évaluer leur efficacité par rapport aux traitements déjà disponibles pour les patients atteints d’arthrite.

Procédures

Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 14 jours. Cette méthode consiste à prélever sur animaux vigiles un petit échantillon de tissu (environ 2 mm de diamètre) sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement certains animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.

Impact sur les animaux

Les souris qui n’expriment pas le récepteur inhibant la molécule de l’inflammation interleukine 1 peuvent, pour certaines, développer spontanément une inflammation articulaire à partir de l'âge de 5 semaines. Cependant, les observations récentes de l’équipe de recherche démontrent un âge plus tardif pour l’apparition de l’arthrite, vers 8-10 semaines. Il s’agit de symptômes comme une rougeur ou un gonflement des articulations. Lorsque l’atteinte est sévère, elle peut se manifester par un gonflement des pattes qui peut affecter la mobilité de la souris. Selon les observations antérieures, ces souris ne développent que très peu de signes généraux et leur mobilité est peu affectée. Les souris reproductrices pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage (douleur légère de courte durée).

Devenir

Une partie des animaux sera expédiée en début ou avant l’expression du phénotype dommageable et utilisée dans des projets de l’équipe de recherche dans un autre établissement utilisateur (900 animaux pour l’expérimentation en 5 ans). Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement (300 animaux pour l’élevage en 5 ans). Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 20 semaines, pour limiter l’évolution du phénotype dommageable avec l’âge. Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.

Remplacement

L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie l’arthrite, qui est une maladie complexe multifactorielle faisant intervenir différents facteurs (le système immunitaire, les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal, le patrimoine génétique et l’environnement), différents organes et la présence d’une inflammation à la fois chronique locale (articulation) et systémique. Par ailleurs, l’utilisation d’un modèle mammifère vertébré est nécessaire, car les organes impliqués dans la physiopathologie de l’arthrite (notamment le système immunitaire, l’intestin, les articulations et les tissus lymphoïdes associés) présentent des différences anatomiques, physiologiques et immunologiques importantes chez les espèces non mammifères, limitant leur pertinence translationnelle pour l’étude de cette pathologie humaine. Afin d'étudier l'interaction entre l’environnement, le microbiote intestinal et le génome de l'hôte, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (par exemple, modèles cellulaires).

Réduction

Un nombre total de 1200 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour l’élevage et les animaux nécessaires pour l’expérimentation pour les projets scientifiques associés. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, le modèle pourra être cryoarchivé dans notre établissement.

Raffinement

Tous les animaux mutés de manière homozygote pour la modification génétique et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 5 semaines seront suivis à partir de 4 semaines et ce jusqu'à leur envoi avant 8 semaines vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation (ou leur mise à mort) : une évaluation du bien-être animal sera réalisée en prenant en compte l'arthrite, la sensibilité articulaire, l'aspect général, le comportement et la mobilité de l’animal. En fonction de l’état de l’animal, des mesures de raffinement seront mises en place selon les conseils de la vétérinaire et/ou la SBEA (disponibilité de la nourriture directement dans la cage, mise à disposition d’une solution de réhydratation gélifiée, augmentation de la fréquence du suivi, application d'un antiseptique). Les points limites précoces et spécifiques pour les signes cliniques de l’arthrite ont été définis. Si, malgré le raffinement mis en place, un point limite est atteint, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour l’élevage et mis à mort avant 20 semaines (pour limiter les nuisances liées à la progression de l’arthrite avec l’âge).

Choix des espèces

Les souris sont souvent utilisées pour étudier l’arthrite, car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’articulation elle-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entraînant ainsi une inflammation articulaire ressemblant à une arthrite chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris seront utilisées pour les croisements dès l’âge de 7-8 semaines (maturité sexuelle) et ce jusqu’à 20 semaines, pour limiter l’expression du phénotype dommageable qui progresse avec l’âge. Le phénotype dommageable d’arthrite est susceptible d'apparaître à partir de l'âge de 5 semaines, mais dans l’élevage de l’EU du chercheur ne se manifeste pas avant 8-10 semaines. Les animaux envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 5-8 semaines pour limiter et potentiellement éviter l’expression du phénotype dommageable avant l’envoi.

288 rats génétiquement modifiés vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue, pour étudier le rôle du microbiote dans une forme de rhumatisme inflammatoire. Chaque animal reçoit six administrations orales de composés bactériens puis est suivi six mois, développant diarrhée, arthrites des pattes arrière et, spontanément, une inflammation des testicules. Le modèle transgénique est présenté comme le "seul" à reproduire l'ensemble des atteintes de la maladie. Le porteur juge son usage "indispensable" pour disséquer les mécanismes, en vue d'une application chez l'humain.

Objectifs

La Spondylarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent au sein de la population adulte française. Le gène d’intérêt est fortement associé au développement de la maladie et constitue le facteur génétique principal multipliant le risque de développer cette maladie par 40. Malgré une association démontrée il y a plus de 50 ans, les raisons pour lesquelles ce gène confère cette prédisposition sont encore peu connues. L’identification des mécanismes impliqués dans l’association gène/maladie est importante car c’est une maladie fréquente, touchant 0,45% de la population adulte en France. De manière importante, il n’existe aucun traitement curatif, seulement des thérapies ralentissant la progression de l’état inflammatoire et de la maladie. Les modèles in vitro ne permettent pas d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques car ils ne récapitulent pas la complexité d’un organisme. Ainsi, l’étude du rat surexprimant le gène d’intérêt constitue le seul modèle récapitulant toutes les atteintes de la SpA.: une inflammation articulaire chronique, une inflammation intestinale et des atteintes inflammatoires de la peau et des griffes. Le développement de ces symptômes cliniques nécessite une un ensemble normal des microbes (bactéries surtout) vivant naturellement dans un organisme (par exemple dans l’intestin), ainsi ces rats élevés en condition stérile ne développent pas de SpA. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer l’influence des constituants du microbiote intestinal sur l’activation des cellules du système immunitaire du rat conduisant au développement de la SpA et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Une meilleure compréhension du rôle pathogène de ces microbes et de leurs constituants pourra conduire à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos expériences consisteront d’abord à administrer des ces microbes à des rats puis à évaluer l’activation des cellules du système immunitaire et s’ils sont capables d’induire la SpA. L’ensemble de ces approches permettra de révéler les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal et ses composants influencent l’activation des cellules immunitaires au cours de la SpA, dans l’objectif final d’identifier et tester de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

La spondylarthrite (SpA) est une maladie complexe qui résulte à la fois de facteurs héréditaires et de l’environnement. Elle provoque une inflammation anormale dans l’organisme, entraînant des douleurs importantes et un handicap, souvent chez de jeunes adultes. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir la maladie, seulement des traitements pour en atténuer les symptômes. Mieux comprendre comment le système immunitaire interagit avec les micro‑organismes vivant naturellement dans l’intestin (le microbiote) pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’utilisation d’un modèle animal chez le rat est indispensable pour étudier ces mécanismes en détail et analyser des tissus touchés par la maladie, comme les articulations, qui ne peuvent pas être prélevés régulièrement chez l’être humain. De plus, les études visant à modifier le microbiote doivent d’abord être réalisées chez l’animal avant toute application chez l’Homme. De telles recherches ont déjà permis, par le passé, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, dont certaines sont aujourd’hui utilisées avec succès en pratique clinique.

Procédures

Lors de la procédure, les rats recevront 6 administrations de composés bactériens par voie orale (durée 15 secondes). Les animaux seront suivis ensuite pendant 6 mois pour le développement de la SpA. Des prélèvements de selles fraîches seront effectuées au cours de l’expérimentation à raison de 1 fois toutes les 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent les rats qui développent de manière spontanée une inflammation testiculaire en conditions stériles. À la suite de la colonisation par des bactéries les rats peuvent développer une SpA. Le premier symptôme est la survenue d’une inflammation intestinale se traduisant par une diarrhée qui sera accompagnée par des arthrites (inflammation au niveau des articulations) aux pattes arrière. Ces arthrites évoluent au cours du temps et certaines se résorbent complètement (environ 20% des cas). Les administrations par voie orale et la collection des selles présenteront un léger inconfort aux animaux le plus souvent associé à la contention de l’animal. En cas de douleur, un traitement antalgique par voie sous-cutanée sera mis en place.

Devenir

Tous les animaux issus de la procédure seront mis à mort à la fin de la procédure. Les organes et tissus seront ensuite collectés pour des analyses biologiques et histologies et ajoutés dès que possible à une biobanque limitant des ajouts futurs d’animaux

Remplacement

Les cultures cellulaires in vitro ne sont pas adaptées pour étudier l’interaction hôte–microbiote dans ce contexte, car la maladie étudiée est complexe et implique plusieurs organes (intestin et articulations). Ces modèles simplifiés risquent de ne pas reproduire les mécanismes biologiques pertinents et ne permettent pas de maintenir les conditions anaérobies nécessaires au microbiote. Il est donc nécessaire de recourir à un organisme vivant. Des tests in vitro sont néanmoins réalisés en amont pour vérifier l’absence de toxicité des substances testées.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est strictement limité tout en garantissant que les conclusions tirées d’une étude sont fiables et peuvent être considérées avec confiance afin de respecter le principe de réduction. Plusieurs tests statistiques préalables nous permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet réel, fiable et peu probable d’être dû au hasard. Des tests pour déterminer l’effet sur le développement et la sévérité de la SpA nécessitent des effectifs plus élevés (6 animaux par groupe) Ce projet s’inscrit dans une thématique importante avec des projets similaires menés dans d’autres établissements. Enfin, les analyses seront faites à la fin de chacune des expériences et permettront le cas échéant de ne pas effectuer une expérience supplémentaire si la significativité est atteinte

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre pour garantir le bien-être des animaux tout au long du protocole. Pour l’administration par voie orale de composés du microbiote, nous utiliserons une canule en plastique adaptée à l’animal et à son poids, afin de diminuer la douleur liée à la procédure. Les changes des cages seront plus fréquents chez les animaux dont l'inflammation intestinale est présente. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel compétent, permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’inconfort. Ces observations sont effectuées par le personnel de zootechnie, par le vétérinaire lors des contrôles réguliers et par les expérimentateurs. L'administration d'un médicament analgésique est prévue pour limiter les douleurs liées à la SpA. En cas de présence d’arthrites causant une difficulté de la mobilité des rats, l’alimentation humidifiée avec de l’eau sera mise à disposition dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement. Des points limites ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est le rat, en raison de sa pertinence préclinique et de son adéquation expérimentale mimant la SpA. Les rats surexprimant le gène d’intérêt permettent ainsi d’évaluer l’efficacité des traitements en fonction des atteintes cliniques. Les analyses cellulaires, moléculaires, histologiques et cliniques permettent d’appréhender le bénéfice fonctionnel global, tout en respectant les principes des 3R. Ainsi, l’utilisation des rats surexprimant le gène d’intérêt est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques de la SpA. Par ailleurs, les expérimentations de modulation du microbiote doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Les animaux utilisés dans ce projet seront des rats à différents stades de développement allant de 3 semaines d’âge (correspondant au sevrage chez le rat : période de colonisation bactérienne) à l’adulte. Ce choix permet d’évaluer le rôle des composant du microbiote lors du développement de la SpA du rat.

Pour savoir si un gène répare les micro-lésions du muscle adulte, 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le gène est éteint par un vecteur viral injecté sous anesthésie, puis les souris sont poussées à courir sur un tapis incliné jusqu'à soixante minutes d'effort intense provoquant des lésions musculaires, avec des stimulations pour les relancer si elles s'arrêtent. Chez chaque souris, une patte part en histologie et l'autre en biochimie, et toutes sont tuées pour prélever les muscles. Les applications annoncées, mieux soigner les blessures sportives ou la faiblesse liée à l'âge, sont repoussées au long terme.

Objectifs

Les muscles squelettiques nous permettent de bouger, respirer et maintenir notre posture. Ils contiennent des unités contractiles appelées sarcomères, qui génèrent la force nécessaire au mouvement. Lors d’activités normales ou d’exercice, ces sarcomères peuvent être endommagés. En général, le muscle répare rapidement ces micro-lésions pour maintenir sa force. Si ce processus de réparation échoue, cela peut entraîner une faiblesse musculaire, une mobilité réduite et un risque accru de blessures. Nous avons précédemment identifié un gène d’intérêt comme un régulateur potentiel de ce mécanisme de réparation. Les souris dépourvues de ce gène dès la naissance présentent des muscles plus faibles et davantage de dommages après l’exercice, mais nous ne savons pas si cela est dû à des effets développementaux ou à un rôle direct dans la réparation du muscle adulte. Pour répondre à cette question, nous allons supprimer ce gène spécifiquement dans les myofibres adultes en utilisant un vecteur viral inoffensif. Nous évaluerons ensuite la capacité de ces muscles à se réparer après un exercice contrôlé. Cela nous permettra de déterminer si notre gène d’intérêt joue un rôle direct dans la réparation des dommages aux sarcomères.

Bénéfices attendus

Cette étude fournira des informations importantes sur la manière dont les muscles squelettiques adultes maintiennent leur structure et leur fonction sous stress mécanique. En clarifiant le rôle de notre gène d’intérêt dans la réparation des sarcomères, nous visons à identifier les mécanismes moléculaires qui soutiennent l’entretien normal du muscle. À long terme, ces connaissances pourraient informer des stratégies pour améliorer la réparation musculaire chez les personnes souffrant de blessures sportives, de maladies musculaires ou de faiblesse musculaire liée à l’âge. Améliorer la capacité de réparation des muscles pourrait contribuer à une meilleure mobilité, une récupération plus rapide et une qualité de vie améliorée.

Procédures

Injection d’analgésique, d’anesthésique et d'antidote à l'anesthésique: ces injections sont très rapides, elles ne durent que quelques secondes chacune. Injection d’un vecteur viral chez des souris âgées d’au moins 10 semaines : Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie afin de minimiser l’inconfort. L’injection est rapide, elle ne dure pas plus de 30 secondes. Protocole d’exercice excentrique: Le programme d’exercice réalisé par les animaux est un modèle d’activité physique intense. Il s’agit d’une procédure qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Cet exercice est réalisé une seule fois, il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation sur tapis roulant légèrement incliné suivi d’un jour de course de 60 min maximum comparable à un exercice physique intense. L’animal reçoit des stimulations légères et brèves pour le motiver à courir s’il s’arrête. Si l’animal ne court pas pendant plus de 5 secondes le test est arrêté.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes pour le gène d'interêt dans les muscles (mutant injecté avec le vecteur viral) devraient être en bonne santé et ne devraient pas présenter de phénotype visuellement apparent. Toutefois, d’après nos études précédentes, elles peuvent présenter une légère faiblesse musculaire et une susceptibilité accrue aux dommages induits par l’exercice. Néanmoins, ces effets n’entraînent pas de détresse significative ni d’altération des fonctions de base. Les injections intramusculaires de vecteurs viraux seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie afin de minimiser l’inconfort et un antidote à l'anesthésique sera administré pour accélerer et améliorer le reveil. Cette procédure peut provoquer une douleur locale légère et transitoire au site d’injection. Le protocole d’exercice excentrique induit des dommages modérés aux sarcomères physiologiques, pouvant entraîner une gêne musculaire temporaire, sans provoquer de détresse durable.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Les mécanismes de dommage et de réparation des sarcomères impliquent des forces mécaniques complexes ainsi que des réponses coordonnées des myofibres pleinement développées. Ces processus ne peuvent pas être reproduits in vitro à l’aide de cellules musculaires en culture, qui ne possèdent pas une organisation sarcomérique mature, ni modélisés de manière fiable in silico. Par conséquent, des études in vivo chez la souris adulte sont indispensables pour atteindre les objectifs de recherche de ce projet.

Réduction

L’injection intramusculaire de vecteur viral permet d’induire la délétion génique chez les souris adultes, évitant ainsi la nécessité de croiser des lignées mutantes supplémentaires et réduisant considérablement le nombre total d’animaux utilisés. Les deux membres d’une même souris seront utilisés pour différentes analyses (un muscle pour l’histologie et le controlatéral pour un test biochimique) afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal. Nous utiliserons des groupes composés de 8 femelles et 8 mâles, ce nombre d’animaux (n = 8) est fondé sur des expériences antérieures ayant démontré une puissance statistique suffisante pour détecter des différences physiologiques dans les processus de lésion et de réparation musculaires. Nous utiliserons 6 groupes de 16 individus (8 mâles et 8 femelles) par groupe soit un total de 96 souris comprenant les animaux contrôles et les expérimentaux (traités avec un vecteur viral vide ou traités avec le vecteur expérimental), 2 points temporelles après exercice ainsi que des animaux sans exercice. Les resultats seront analysés en utilisant les statistiques appropriées.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans des conditions réglementaires, conformes à la réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les injections intramusculaires seront effectuées sous anesthésie générale et analgésie. La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée par l’absence du réflexe en pinçant des orteils. Les souris seront placées sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, et leurs yeux seront protégés à l’aide d’un gel ophtalmique. Un antidote à l'anesthésie sera administré pour accéler et améliorer le reveil. Une surveillance post-injection sera effectuée quotidiennement pendant les 3 premiers jours, puis 2 à 3 fois par semaine par la suite. La surveillance comprend l’observation de l’état de santé général (motricité, apathie, aspect du pelage, aspect physique, vigilance, interaction sociale, toilettage). Le niveau de douleur sera évalué grâce à la fiche d'évaluation de la douleur fournie en annexe. Les manipulations seront réalisées à l’aide de tunnels afin de réduire le stress, et du matériel de nidification sera fourni pour l’enrichissement environnemental. L’exercice excentrique devrait provoquer uniquement un inconfort léger et transitoire. Les souris seront étroitement surveillées après la séance d’exercice pour détecter toute démarche anormale, boiterie ou réduction de l’activité. En cas de douleur de niveau 1 (légère boiterie), d'un anti-inflammatoire sera administré une fois par jour. Pour une douleur de niveau 2 (altération marquée de la mobilité), la dose d'anti-infammatoire sera augmentée. En cas de douleur de niveau 3 ou de détresse sévère, les animaux recevront une injection combinée d'anti-inflammatoire et d'analgésique et si leur état dne s'améliore pas sous 48h, alors ils seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les souris constituent le modèle le plus approprié pour ce projet. Nos études précédentes sur notre gène d'interêt ont été réalisées chez la souris, fournissant une base de référence bien définie pour l’interprétation des phénotypes. Les outils génétiques utilisés dans cette étude, notamment la lignée mutante d'interêt et les vecteurs viraux utilisés, sont déjà établis et optimisés chez cette espèce. De plus, la physiologie du muscle squelettique de la souris est bien caractérisée et présente de fortes similitudes structurelles et fonctionnelles avec celle du muscle humain, ce qui en fait un modèle largement reconnu pour l’étude de la réparation des sarcomères et de la biologie musculaire. L’utilisation de la souris permet de combiner une manipulation génétique précise avec des analyses physiologiques et éthiquement maîtrisable. Toutes les injections seront effectuées sur des souris mutantes âgées de 10 à 12 semaines, correspondant à l’âge adulte. À ce stade, les muscles squelettiques sont pleinement développés et physiologiquement stables, ce qui permet d’étudier la réparation des sarcomères dans un contexte mature, plutôt que pendant la croissance développementale. L’utilisation d’animaux adultes garantit également une anesthésie sûre et efficace et réduit la variabilité de l’efficacité de la transduction virale, puisque des titres de vecteurs viraux plus faibles sont suffisants à cet âge. De plus, cette tranche d’âge est cohérente avec les études précédentes, permettant une comparaison directe des résultats avec les données de référence existantes.