Système musculosquelettique

1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène et une alimentation à la doxycycline, après une biopsie digitale pratiquée dès l'âge de 7 à 10 jours pour les génotyper, afin de suivre le devenir des noyaux des cellules musculaires marqués par fluorescence. Le porteur ne décrit comme nuisance que la biopsie et affirme que le tamoxifène ne fait pas plus mal qu'une injection d'anesthésique, sans détailler d'autre atteinte pour une gravité classée modérée. Il conclut que ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro et que seule la souris permet cette étude.

Objectifs

L'homéostasie tissulaire est maintenue par la génération de nouvelles cellules et la perte de cellules existantes. La génération de nouvelles cellules est généralement assurée par les cellules souches des tissus, qui se divisent continuellement et dont les cellules filles se différencient en cellules matures. Les cellules musculaires ont un défi très particulier à relever pour maintenir l'homéostasie tissulaire car elles possèdent des centaines de noyaux dans un cytoplasme partagé. En outre, les noyaux musculaires se différencient pour remplir des fonctions spécialisées, comme les cellules mononucléées différenciées des tissus ordinaires. Lorsque les cellules souches musculaires se divisent, des cellules filles fusionnent avec une cellule musculaire existante pour former de nouveaux noyaux. Malgré cette propriété intrigante, nous ne connaissons pas le sort des noyaux des cellules souches musculaires et des noyaux musculaires existants : que deviennent les noyaux musculaires nouvellement fusionnés ? quelle est la cinétique de la perte des noyaux musculaires pour chaque sous-type nucléaire spécialisé ? Dans ce projet, nous voulons répondre à cette question en marquant les noyaux des cellules souches et des muscles avec des protéines fluorescentes et en suivant leur devenir.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet donneront un tout nouvel aperçu de la façon dont nous pensons à l'homéostasie des tissus musculaires. Ceci, à son tour, aura un large impact sur la compréhension des maladies musculaires ou des mécanismes de l'exercice.

Procédures

Le groupe expérimental d’animaux A recevra une injection intrapéritonéale (IP) de tamoxifène par jour pendant 5 jours. Le groupe B sera nourrit avec une alimentation contenant de la doxycycline pendant 1 mois. Et le groupe C sera nourrit avec une alimentation contenant de la doxycycline pendant 1 mois puis recevra une injection IP de tamoxifène par jour pendant 5 jours et continuera d’avoir une alimentation contenant de la doxycycline. Les injections IP sont faites très rapidement en quelques secondes. Tous ces animaux auront été préalablement identifiés et génotypés par le prélèvement d’une biopsie digitale à l’âge de 7 à 10 jours. Cet acte est très rapide, il ne dure que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La seule nuisance attendue est celle provoquée par le prélèvement de biopsie digitale pour l’identification et le génotypage : Il s'agit d’une procédure très rapide qui prend moins d'une minute par animal et qui sera faite très tôt sur les animaux âgés de 7 à 10 jours par du personnel qualifié. Les souris seront remises dans leur cage après l'expérience où elles seront surveillées pendant leur rétablissement. L'alimentation à la doxycycline est supposée ne provoquer aucune gêne. L’injection intrapéritonéale de tamoxifène ne sera pas plus douloureuse qu’une injection intrapéritonéale d’anesthésique qui correspond à la douleur causée par l’aiguille.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçerons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Notre projet porte sur la dynamique cellulaire entre les myofibres et les cellules souches musculaires et nécessite la présence des cellules souches musculaires, des myofibres, des tendons (pour la JMT) et des motoneurones (pour la JNM) fonctionnels dans des conditions physiologiques normales. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites actuellement in vitro, ce projet ne peut être étudiée que chez des animaux vivants.

Réduction

Nous prendrons des mesures permettant de minimiser le nombre d'animaux utilisés. 1. Dans un premier temps des analyses histologiques approfondies seront effectuées pour déterminer à quels périodes après la dernière injection IP de tamoxifène ou après un mois sous doxycycline réaliser le séquençage d’ARN de noyaux uniques. 2. Nous collecterons tous les tissus musculaires pertinents de chaque souris.

Raffinement

L’alimentation à la doxycycline est supposée ne provoquer aucune gêne et les injections IP de tamoxifène ne seront pas plus douloureuse qu’une injection IP d’anesthésique qui correspond à la douleur causée par l’aiguille. Aucune mesure particulière n’est jugée nécessaire. Néanmoins d’une manière générale, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Les souris seront surveillées régulièrement et plus particulièrement après les injections IP de tamoxifène. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés).

Choix des espèces

Nous utiliserons plusieurs stratégies de marquage des lignées pour suivre le devenir des noyaux des cellules musculaires et des noyaux des CSM. Tous ces marquages ont été développés dans des modèles de souris et nécessitent la création de lignées mutantes. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. Comme notre projet porte sur la régulation de la dynamique cellulaire dans le muscle mature, nous devons utiliser des souris dont le développement est terminé. Par conséquent, l'âge de 10 semaines (avant administration de doxycycline et injection de tamoxifène) est l’âge le plus approprié.

310 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un test de nage à contre-courant croissant jusqu'à ce qu'elles ne puissent plus se maintenir à la verticale et soient plaquées contre une grille, puis pêchées et mises à mort. Le projet cherche à savoir si une faible proportion de muscle rouge, recherchée par sélection génétique pour la vente en tranches fumées, réduit les capacités de nage. Le porteur présente aussi l'étude comme visant le "bien-être" des poissons, alors que l'enjeu affiché est d'abord "agronomique et économique".

Objectifs

La production de truite arc en ciel en France s’oriente de plus en plus vers des poissons de grande taille destinés à la fumaison et vendus sous forme de tranches fines. La présence du muscle rouge, facilement repérable par sa couleur brune est fortement préjudiciable pour la vente. En effet, outre l’aspect visuel, le muscle rouge riche en lipides s’oxyde rapidement conduisant à des défauts de flaveur. C’est pourquoi certains cahiers des charges imposent aux transformateurs d’éliminer ce muscle. Ce niveau de parage élevé (élimination du muscle rouge) entraîne une perte en matière première et donc une perte économique pour les producteurs et les transformateurs. Il y a donc un enjeu agronomique et économique à maîtriser la croissance de ce muscle. C’est pourquoi les professionnels étudient la possibilité de diminuer la proportion de muscle rouge par sélection génomique. La musculature des poissons est très majoritairement (>90%) constituée d’un muscle blanc à contraction rapide et d’un muscle rouge à contraction lente. D’après la littérature, le muscle blanc avec un métabolisme anaérobie est surtout sollicité par le poisson pour la nage rapide alors que le muscle rouge avec un métabolisme aérobie est principalement sollicité pour la nage lente. Chez le zebrafish, l’absence totale de muscle rouge dans les stades précoces entraîne une forte mortalité résultant d’une incapacité à s’alimenter (Li et al 2019). Alors que les études sur la croissance du muscle blanc sont nombreuses et que l’impact des facteurs externes est bien connu, les facteurs qui influencent la proportion de muscle rouge chez les poissons sont très mal connus. Parmi les différents facteurs d’élevage, l’exercice modéré semble stimuler la croissance du muscle rouge sans modifier significativement la taille des fibres lentes (Davie et al 1986). Cependant, l’impact de l’exercice sur la taille des fibres du muscle rouge de truite reste controversé puisque certaines études rapportent une augmentation de 25 % du diamètre moyen des fibres (Greer-Walker et al 1978), alors qu’une autre n’observe aucun effet (Davie et al 1986) L'objectif du projet est de déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Il s'agit notamment de vérifier si une proportion faible de muscle rouge n’entraîne pas de défauts dans la capacité de nage ce qui pourrait nuire au bien-être de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Il s'agit notamment de vérifier si une proportion faible de muscle rouge n’entraîne pas de défauts dans la capacité de nage ce qui pourrait nuire au bien-être de l’animal. Étant donné que le muscle rouge est décrit comme étant principalement sollicité pour la nage lente, il s'agit de vérifier si les poissons avec une faible proportion de muscle rouge n’ont pas une capacité de nage limité ce qui pourrait nuire à leur bien-être. Il se basera sur l’utilisation d’un modèle biologique tout à fait pertinent, deux lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle : lignée grasse (LG) et lignée maigre (LM), ainsi que des lignées isogéniques. En effet, des travaux préliminaires ont montré qu'il existait une variabilité de la proportion de muscle rouge entre différentes lignées de truites : Lignées A02 (faible), N38 (forte), AB1 (moyenne) et lignée grasse (très faible) et maigre (moyen).

Procédures

Les animaux seront soumis à un test de nage qui consiste à exposer les poissons à un courant de plus en plus fort dans un bassin expérimental avec une accélération graduelle jusqu'à 2 longueurs par seconde. Ce bassin de test de nage sera constitué d'un tunnel de nage de 300 cm de long, 70cm de large et 32 cm de haut représentant un volume de 680 L environ. Il sera alimenté en eau d’élevage par deux pompes équipées de variateur de tension afin d’assurer un renouvellement d’eau suffisant et augmenter progressivement le courant d’eau. Dès que le poisson n’arrive plus à se maintenir en position verticale dans le courant d’eau et qu’il est plaqué sur la grille disposée à la fin du tunnel de nage pendant quelques secondes, il est pêché et mis à mort. Le test doit durer 2 heures. Un test avec 10 poissons sera réalisé en préambule pour valider la fonctionnalité du système de test., Puis 5 tests avec 60 poissons seront réalisés.

Impact sur les animaux

Les poissons utilisés dans ce projet subiront un stress modéré généré par un test de nage où l’on va mesurer le temps au bout duquel ils ne parviennent plus à se maintenir en position verticale dans le courant d’eau et qu’il est plaqué sur la grille à la fin du tunnel de nage pendant quelques secondes, il est retiré du bassin de test. Pour limiter le stress, les groupes de poissons seront constitués entre 3 et 4 semaines avant le test de nage et placés dans un bac d’élevage proche du bassin de test. Les animaux seront mis à jeun avant le test afin d'éviter qu'ils ne soient malades et transférés avec une épuisette dans le bassin de test la veille pour s’habituer à ce bassin.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet ou par les responsables du projet eux-mêmes. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés. Tous les éléments justifiant leur mise à mort sont conservés et transmis à la SBEA de l'établissement et au vétérinaire référent de l'établissement, ainsi qu’au responsable du projet.

Remplacement

Les objectifs du projet étant de déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage des poissons ce qui ne peut se faire que sur animaux vivants.

Réduction

D'après notre expérience et la variabilité de la réponse au test de nage, il est indispensable de réaliser le test sur au moins 60 truites de chaque lignée. Nous utiliserons pour cela au total 310 animaux : 10 animaux pour adapter le test, et 60 animaux de chaque lignée (60*5 lignées) qui possède des proportions différentes de muscle rouge (faible, moyenne et forte) ce qui nous permettra d'obtenir des mesures précises et fiables de la proportion de muscle rouge et des capacités de nage. Cet effectif nous permettra d’avoir une puissance statistique suffisante (test du khi2, test t, ANOVA) et pour mettre en évidence un impact de la proportion du muscle rouge sur les performances de nage.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, nourriture, enrichissement). Pour limiter le stress, les groupes de poissons seront constitués entre 3 et 4 semaines avant le test de nage et placés dans un bac d’élevage proche du bassin de test. Les animaux seront mis à jeun avant le test afin d'éviter qu'ils ne soient malades et transférés avec une épuisette dans le bassin de test la veille pour s’habituer à ce bassin. Pendant les procédures la manipulation des animaux sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Les animaux seront anesthésiés puis mis à mort dès la fin du test.

Choix des espèces

L'étude s'effectue sur la truite arc en ciel car c'est l'espèce piscicole utilisée pour le projet. C'est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. De plus, il s’agit d’un poisson d’intérêt économique dans le monde entier, et qui représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement étudié dans la communauté scientifique. Nous allons réaliser les tests sur des animaux de 200g qui correspond à la taille où l’on peut mesurer le plus précisément la proportion de muscle rouge ainsi que les capacités de nage.

3 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement déficientes en facteurs de coagulation subissent l'induction d'un saignement articulaire par une aiguille dans le genou ou d'une lésion musculaire par injection de cardiotoxine, pour étudier les atteintes osseuses et musculaires de l'hémophilie. Le porteur indique que la douleur est gérée par une échelle de score et de la buprénorphine, une souris atteignant le score maximal étant mise à mort. Il rattache le projet à des financements des laboratoires Baxter et Takeda et affirme que l'accès limité aux échantillons humains rend le recours à la souris "nécessaire".

Objectifs

Ces pathologies étant des maladies rares orphelines, il est nécessaire d'avoir recours à des modèles animaux (souris) mimant la pathologie humaine pour pouvoir mieux comprendre l'impact de la déficience de ces facteurs et de proposer des approches thérapeutiques complémentaires. Ce projet a pour objectifs : 1) de caractériser l’impact d’un saignement ou d’une blessure sur la biologie des tissus ostéoarticulaires et musculaires ; 2) de caractériser l’impact des facteurs recombinant de modulation de la coagulation (utilisés en clinique) sur la régénération des tissus musculaires et les tissus ostéoarticulaires ; 3) de tester l’efficacité de facteurs de substitution aux facteurs de coagulation sur la protection tissulaire.

Bénéfices attendus

Ces pathologies étant des maladies rares orphelines, il est nécessaire d'avoir recours à des modèles animaux (souris) mimant la pathologie humaine pour pouvoir mieux comprendre l'impact de la déficience de ces facteurs et de proposer des approches thérapeutiques complémentaires. Ce projet a pour objectifs : 1) de caractériser l’impact d’un saignement ou d’une blessure sur la biologie des tissus ostéoarticulaires et musculaires ; 2) de caractériser l’impact des facteurs recombinant de modulation de la coagulation (utilisés en clinique) sur la régénération des tissus musculaires et les tissus ostéoarticulaires ; 3) de tester l’efficacité de facteurs de substitution aux facteurs de coagulation sur la protection tissulaire.

Procédures

Lésion articulaire : Induction d’un saignement par l’introduction d’une aiguille de 30,5 gauge et injection de 5 microlitres de solution saline dans la cavité articulaire du genou. Ce geste sera pratiqué au maximum 1 fois par animal. Lésion musculaire : Induction d’un saignement intramusculaire à l’aide d’une aiguille intramusculaire ou induction d’une lésion musculaire par injection intramusculaire de 0,1 mL de cardiotoxine. Ce geste sera pratiqué au maximum 1 fois par animal. Il n'y aura pas de prélèvements sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les patients hémophiles (déficience en FVIII ou FIX, déficients en facteur von Willebrand) ont des troubles de la coagulation mais présentent également une ostéopénie, une sarcopénie et des altérations du processus inflammatoire. Les aspects moléculaires de ces troubles restent mal connus. Ces pathologies étant des maladies rares orphelines, il est nécessaire d'avoir recours à des modèles murins mimant la pathologie humaine pour pouvoir mieux comprendre l'impact tissulaire de l’hémophilie et de proposer des approches thérapeutiques. Ce projet a fait l’objet d’un premier financement par les laboratoires Baxter (travail franco-américain) et deux financements actuels par Takeda. Selon la procédure interne de ces laboratoires, un projet complet a été déposé intégrant la justification de la problématique des pertes musculosquelettiques dans l’hémophilie et des approches expérimentales proposées (incluant l’expérimentation animale décrite ici). Ces dossiers ont été expertisés et a fait l’objet d’échanges avant d’être validé par la direction scientifique de ces 3 laboratoires.

Devenir

Ils seront tous mis à mort

Remplacement

L’hémophilie et la maladie de von Willebrand sont des maladies rares. L’accès aux échantillons humains est très limité en particulier en lien avec les risques hémorragiques et est essentiellement restreint à des cohortes de sérums. Ce faible accès rend impossible l’étude du rôle des facteurs de coagulation sur les différents tissus. Des souris génétiquement invalidées pour ces facteurs miment la pathologie humaine et permettent de mieux appréhender la pathogenèse de la maladie et le développement de nouvelles approches thérapeutiques en particulier les pertes osseuses et musculaires. Le nombre d’animaux utilisés pour caractériser l’effet de ces facteurs sur les tissus osseux, musculaire et immunitaire et développer de nouvelles approches thérapeutiques sera limité au strict minimum afin d’obtenir des résultats fiables.

Réduction

Pour la réduction d'animaux, nous optons pour des études avec plusieurs molécules testées en parallèle pour avoir un groupe contrôle pour plusieurs molécules. Le nombre d'animaux utilisé pour mener à bien ce projet sera réduit au strict minimum pour pouvoir aboutir à des résultats fiables.

Raffinement

Concernant le raffinement, le bien-être des animaux sera primordial durant les expérimentations, notamment par une phase d’acclimatation de minimum 7 jours, un enrichissement de l’environnement (un tunnel et un carré de cellulose pour permettre la conception d'un "nid"), une visite quotidienne, une gestion de la douleur suivant une échelle stricte et des points limites bien établis. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 selon la procédure. Les points limites de l'étude dépendent des résultats de l'évaluation clinique, de l'observation d'une douleur non gérable suite à la mise en place d'un protocole analgésique. De façon générale, les différents points limites observés sont, la diminution de poids corporel, l'apparence physique et le comportement de l'animal sans intervention humaine. Ces 3 critères sont évalués sur une échelle de 0 à 3. A partir de deux scores de 2, une injection de Buprénorphine à 0.05mg/kg en injection intra-musculaire sera administrée et la fréquence d’administration sera adaptée en fonction des signes de la douleur avec une fréquence toutes les 12h et pouvant être accrue toutes les 8 heures. Si une souris atteint un score de 3, elle sera alors sacrifiée.

Choix des espèces

- Les souris homozygotes déficientes en VWF sont viables, fertiles, de taille normale et ne présentent aucune anomalie physique ou comportementale grave. Ces souris présentent des défauts dans l'hémostase caractérisés par des temps de saignement prolongés avec des saignements spontanés observés chez dix pour cent des nouveaux nés. Les caractéristiques présentées par les animaux déficients homozygotes sont considérées comme un modèle approprié pour mimer la maladie de von Willebrand sévère humaine. - Les souris déficientes en FVIII (homozygotes) sont viables et fertiles. Ces souris récapitulent les principales caractéristiques de l'hémophilie A humaine et constituent un excellent modèle pour explorer l’impact physiopathologique des troubles de la coagulation. - Des souris déficiente en Tnfrsf11b (ostéoprotégérine : OPG) homozygotes (développent une ostéoporose marquée et une dysrégulation hématopoïétique. Des liens OPG/VWF ont été démontrés et une implication de leur interaction est suspectée dans l’hémophilie. Pour les analyses de phénotype, de pertes musculaires et de caractérisation des populations immunitaires, des souris adultes âgées de 5 et 24 semaines seront utilisées. Pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques des souris adultes. Pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques des souris adultes âgées de 5 ou 24 semaines seront utilisées selon les résultats de la procédure 2. Réception de souris âgées de 4 ou 23 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 ou 24 semaines).

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une maladie osseuse pédiatrique, elles subissent des radiographies sous anesthésie à quatre reprises, un isolement de deux heures en cage à urines et des injections de fluorochromes, avant d'être tuées pour prélever leurs os. Le porteur décrit ces actes comme une simple gêne passagère, malgré la gravité modérée déclarée. Il affirme que l'effet de l'inhibition de l'inflammation sur l'os ne peut être caractérisé qu'à l'échelle d'un "organisme entier".

Objectifs

La maladie osseuse pédiatrique rare qui nous intéresse est caractérisée par le remplacement de l’os des mâchoires par un tissu mou fibreux appelé granulome. Cette pathologie se met en place vers 3 à 5 ans et est d’origine génétique. Les lésions caractéristiques de cette maladie sont toujours symétriques et bilatérales et peuvent ne concerner que des zones restreintes de la mandibule ou au contraire toutes les mâchoires jusqu’au plancher de l’orbite. Cette pathologie est caractérisée par une inflammation chronique qui serait responsable de la dégradation de l’os des mâchoires. L’hypothèse que nous avons émise est qu’en inhibant l’inflammation par l’invalidation d’un gène de l’inflammation, le phénotype osseux serait résolu. Ainsi les souris modèles du chérubisme ont aussi été invalidées pour ce gène impliqué dans l’inflammation. Nous allons étudier le phénotype osseux de ces souris à 4, 6, 8 et 10 semaines

Bénéfices attendus

L’impact de l’inhibition de l’inflammasome sur le phénotype osseux (dégradation de l'os des mâchoires) ne peut être caractérisée qu’à l’échelle d’un organisme entier. L’étude de l’effet de l’inhibition de l’inflammasome sur le phénotype osseux pourrait ouvrir des pistes de thérapie pour le chérubisme, une maladie pédiatrique rare et pour le moment ne bénéficiant d’aucun traitement.

Procédures

Le phénotype osseux des souris est exploré par un examen radiographique à 4, 6, 8 et 10 semaines qui nécessite une anesthésie et qui dure 5 minutes, un seul recueil d’urines en cage métabolique (durée maximale 2h) pour l’analyse des marqueurs osseux urinaires, l’injection de 2 fluorochromes pour analyser la formation dynamique de l’os (2 minutes par injection).

Impact sur les animaux

Aucun autre dommage que d’être manipulé pour l’injection (anesthésies et injections de fluorochromes) et isolé pendant 2h maximum n’est envisagé dans le cadre de la caractérisation du phénotype osseux. Les injections, peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère mais qui ne nécessite pas de médication particulière.

Devenir

Les animaux concernés par cette procédure sont mis à mort pour réaliser des prélèvements post-mortem des os et des caecum qui permettront de caractériser le phénotype osseux et l’apparition du granulome du chérubisme.

Remplacement

La mutation d’un gène particulier est responsable du développement du chérubisme. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement du chérubisme mais toutes ces études préalables in vitro sont menées sur des cellules de patients. Or, ces derniers ne peuvent être diagnostiqués que quand le granulome est déjà installé. C’est pourquoi une souche murine répondant aux besoins de l’étude a été préalablement généré. L’utilisation de ce modèle nous permettra d’observer les interactions entre l’inflammation et le développement du phénotype osseux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques solides. Leur nombre (48) a été restreint au minimum indispensable pour obtenir des données nécessaires à la caractérisation de l’impact de l’invalidation de l’inflammasome sur le phénotype osseux (dégradation de l’os) du chérubisme. L’analyse préalablement publiée du modèle à 10 semaines permet d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.

Raffinement

Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées tous les 15 jours sous anesthésie avec analgésie. Le temps de radiographie sera d’environ 5 minutes par animal et il sera surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure qui se résument à 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes dilués dans du sérum physiologique), 2h maximum d’isolement en cage métabolique. L’assurance d’une anesthésie profonde sera vérifiée par un test de l’abolition du réflexe des extrémités. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de points limites mentionnés plus loin, une surveillance plus fréquente et un apport de nourriture gélifiée seront mis en place. Les animaux seront hébergés sous conditions standards - température 20/24°, cycle jour/nuit 12h/12h, hygrométrie entre 50/55%. Enrichissement : tunnel de carton, nids en papier kraft, maisonnette rouge, bâtons à ronger.

Choix des espèces

Suite aux raisons déjà invoquées dans la section 5.10 / item « remplacement », il a été nécessaire pour mettre en œuvre ce projet de générer un modèle murin répondant aux besoins de notre étude. La densité minérale osseuse des animaux sera évaluée à 4,6, 8 et 10 semaines, dernier temps de l’étude où les animaux seront euthanasiés pour l’analyse plus précise car le phénotype osseux d’ostéolyse est clairement observable.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit une chirurgie du fémur pour y greffer un biomatériau imprimé en 3D, puis quatre séances d'imagerie X et IRM sous anesthésie sur huit semaines, avant la mise à mort pour analyser l'os. Le porteur indique une douleur modérée liée à la chirurgie et prévoit la mise à mort si la perte de poids dépasse le seuil fixé. Il présente cette étape sur le rat comme un préalable à des essais chez de "gros animaux" puis en clinique, l'issue conditionnant de futures demandes de financement.

Objectifs

En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Ce projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matrices personnalisées qui permettraient d'aboutir à une meilleur réparation osseuse ainsi qu'une meilleure régénération des nerfs et des vaisseaux sanguins de la zone.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences menées sur ce modèle animal sont un préalable à la poursuite des travaux sur d'autres modèles, notamment chez les gros animaux. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau conduiront à son abandon. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie orthopédique (il s'agit d'un acte chirurgical unique d'une durée de 20 minutes), puis à 2 séances d'imagerie de rayons X (durée de l'examen: 15 minutes) et d'IRM (durée de l'examen: 30 minutes) à J1, J14, J28, J56. Toutes les séances d'imagerie se dérouleront sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La chirurgie orthopédique peut entraîner une douleur modérée. La radiographie et l'IRM peuvent être considérées comme des actes expérimentaux de gravité légère , développées sous anesthésie générale.

Devenir

Ils sont tous euthanasiés à semaine 8 pour procéder à une analyse histologique des tissus dans la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel de différenciation ostéoblastique de ce complexe. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).

Réduction

L'utilisation de systèmes d'imagerie non invasive (IRM et microtomographie de rayons X) permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, le suivi de chaque animal permet d'obtenir des informations sur le processus de régénération et sur divers autres paramètres biologiques à différents temps, sans avoir besoin de euthanasier les animaux. Sans ces procédures, il faudrait envisager des groupes de rats pour chaque temps expérimental où une analyse est requise.

Raffinement

Toutes les interventions sont faites sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée en post-opératoire pour limiter la douleur. La chirurgie est faite dans les meilleures conditions d’asepsie, d’anesthésie, de prise en charge de la douleur. Surveillance accrue des animaux en post opératoire pour détecter tout signe de souffrance, et la soulager. L'itinéraire et les plans de voyage entre l'animalerie et les sites d'imagerie par rayons X et IRM seront optimisés afin de réduire la durée du voyage. Les animaux pourront s'acclimater après le transport afin de réduire leur détresse. Les conditions optimales d’hébergement sont garanties pour les animaux tout au long du projet. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Les critères suivants seront prépondérants dans la détermination des points limites: en cas de isolement de l’animal, poil hérissé́, ou perte de poids hebdomadaire supérieure à 20 %, de la nourriture hydraté et de l’eau sera mise à disposition au fond de la cage, et un traitement antalgique par Buprénorphine sera également administré, cependant, en cas de persistance de un de ces points pendant plus de 3 jours, le vétérinaire ou le porteur de projet sera contacté pour prendre une décision sur la procédure à adopter (continuation/adaptation des soins ou mise à mort); la perte de poids pendant plus de 5 jours entraînera la mise à mort immédiate de l’animal; et la perte de poids pendant plus de 2 jours, associé à des problèmes de locomotion, et douleur évidente au niveau de la patte opéré, entraînera aussi la mise à mort immédiate de l’animal.

Choix des espèces

Le rat Sprague Dawley a été choisi à la suite de travaux réalisés dans notre laboratoire et par d'autres équipes portant sur l'analyse des propriétés histologiques et biologiques des membranes induites en site osseux fémoral chez le rat . Il est d'autre part décrit dans de nombreuses études dans le monde. Animaux adultes , poids 350-400 grammes. La croissance du squelette doit être arrivée à son terme. Il faut des animaux de poids suffisant pour supporter la procédure

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un sepsis leur est provoqué par chirurgie, puis elles reçoivent des séances d'électrostimulation musculaire sous anesthésie, pour évaluer un protocole d'exercice contre la fonte musculaire des patients en réanimation. Le porteur annonce une faiblesse et une fonte musculaires, un cumul d'anesthésies, un isolement de 72 heures et une restriction alimentaire imposée aux témoins, les souris étant tuées pour analyser leurs muscles. Il juge le modèle animal "indispensable" car le sepsis touche plusieurs organes, les retombées pour les patients restant annoncées.

Objectifs

Le sepsis, une infection généralisée pouvant conduire les patients en réanimation et sous ventilation mécanique, a des conséquences désastreuses sur le muscle squelettique conduisant à une faiblesse et à une fonte du tissu musculaire. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour lutter contre ces dysfonctions musculaires sévères. Nos travaux montrent que l’augmentation de l’activité musculaire à l’aide de stimulations électriques répétées, contrôlées et non-traumatiques a des effets bénéfiques sur le muscle normal. Ce projet a pour but d’évaluer les effets d’un protocole d’exercice induit par des stimulations électriques musculaires chez des souris atteintes de sepsis. Des analyses de force musculaire, de taille des fibres musculaires couplées à des investigations cellulaires sont réalisées pour objectiver l’efficacité du protocole d’exercice.

Bénéfices attendus

Les patients atteints de sepsis et admis en réanimation présentent une fonte du tissu musculaire et une réduction de la force, responsables d’atteintes fonctionnelles pouvant perdurer jusqu’à 5 ans après la sortie de réanimation. Ce projet permettra de développer un traitement permettant d’améliorer la fonction musculaire de patients atteints de sepsis

Procédures

Les animaux sont soit soumis à un sepsis soit à une procédure contrôle. La durée de l’anesthésie pour la procédure chirurgicale est d’environ 30 minutes. Les animaux reçoivent des injections sous cutanées 4 injections par jour pendant 3 jours. La durée de la contention et des injections est inférieure à 1 minute. Une première procédure permettra de raffiner le protocole de sepsis grâce à un traitement antibiotique et d’évaluer les conséquences des anesthésies indispensables au protocole d’exercice par stimulations électriques musculaires sur la proportion des animaux atteignant les points limites éthiques. Si le traitement antibiotique permet de limiter la proportion des animaux atteignant les points limites éthiques, une seconde procédure sera réalisée et visera à évaluer les effets d’un protocole d’exercice par stimulations électriques sur le système musculaire. Le protocole d’exercice sera réalisé sous anesthésie générale soit dans la phase aiguë (soit au 1er jour post-chirurgie) soit dans la phase tardive (au 4ème post-chirurgie) de l’induction du sepsis. Un protocole contrôle (sans stimulations électriques musculaires) sera également inclus. Dans les deux cas, la durée d’anesthésie générale est de 20 minutes. Six séances d’exercice (ou contrôle) sont réalisées sur une période de 7 jours.

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (chirurgie, injections sous cutanée, stimulations électriques musculaires, anesthésies). La procédure de sepsis a pour conséquence d’induire une faiblesse et d’une fonte musculaires. La procédure contrôle induit également un stress pour les animaux. Pour les deux groupes, le stress des animaux inclut également : 1) la contention lors des injections sous cutanée de buprénorphine, d’antibiotiques, de sérum salé et de solution glucosée (durée inférieure à 1 minute) et de la prise de température, 2) l'anesthésie lors de la procédure chirurgicale (sepsis et contrôle, durée inférieure à 30 minutes) 3) l'anesthésie lors des séances d’exercice par stimulations électriques musculaires ou la procédure contrôle (durée 20 minutes), 4) l’anesthésie avant la mise à mort (durée inférieure à 2 minutes), 5) la réduction de la prise alimentaire pour le groupe sham afin de mimer l’anorexie du groupe sepsis. L’isolement en cage individuelle pendant 72 heures pour faciliter la cicatrisation post-chirurgie

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car le sepsis impacte plusieurs organes, dont les conséquences sur le système musculaire sont impossibles à modéliser in vitro. Aussi, la procédure implique un exercice par stimulations électriques musculaires qui est impossible à reproduire in vitro. Enfin, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous proposons un traitement antibiotique qui permet de minimiser les conséquences fonctionnelles du sepsis. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement peu-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice par stimulations électriques musculaires et de mesurer la force musculaire de manière simultanée sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Si le traitement antibiotique n’est pas efficace pour raffiner le protocole de sepsis, la seconde procédure ne sera pas effectuée. Aussi, en l’absence d’effets du protocole d’exercice sur la force musculaire ou sur la taille des fibres musculaires, les analyses biologiques proposées ne seront pas effectuées.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique aux antalgiques, à l’injection de sérum physiologiques et de solution glucosée ainsi qu’à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice de stimulations électriques musculaires. Aussi, le sepsis est traité par un traitement antibiotique. Des fibres de peuplier, du coton et un igloo seront placés dans les cages d’hébergement pour favoriser la nidification des souris et leur bien-être. De la nourriture et un hydrogel seront déposés à même la litière afin de prendre en compte la réduction de la mobilité de l’animal et le risque de ne plus pouvoir accéder facilement à la nourriture dans les 72 heures post-chirurgie. Une grille de score et une prise de température sont utilisées pour déterminer les points limites. L’expérience de l’équipe montre que cette stratégie est suffisamment prédictive pour que 93% des animaux soient inclus dans l’étude.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.

581 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité tuées à l'issue et 110 replacées comme reproductrices. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie humaine, elles subissent des tests de glucose avec prélèvements par section de la queue, des épreuves de course et des mesures de force musculaire sous anesthésie, certaines recevant des injections six jours sur sept pendant plusieurs mois. Le porteur annonce un stress léger à modéré et utilise des animaux de réforme pour former les manipulateurs, les souris étant tuées pour prélever leurs muscles. Il teste un peptide qu'il juge prometteur après un essai sur levures, une piste d'essai clinique restant renvoyée au terme du projet.

Objectifs

Notre groupe étudie des souris modèles d’une myopathie congénitale de l’être humain. Nous avons mis en évidence que cette maladie s’accompagne d’une anomalie cellulaire qui amène à un défaut de production d’énergie par les muscles, ce qui explique leur capacité d’endurance réduite et les amène à consommer plus d’énergie pour assurer le fonctionnement de leurs muscles. Le gène muté dans cette affection participe à la synthèse de certains lipides et dans une étude précédente, nous avons pu montrer l’intérêt thérapeutique chez les souris mutante d’un peptide stabilisant un lipide dont le contenu est diminué dans les muscles atteints. Nous avons ainsi pu observer une amélioration des performances musculaires et de la respiration musculaire chez les souris traitées par ce peptide. Suite à ces résultats prometteurs, ce projet vise à consolider la caractérisation des effets thérapeutiques de ce peptide chez les souris mutantes et à poursuivre l’évaluation métabolique et musculaire de ces souris hors traitement. Nous évaluerons également l’impact de cette mutation sur les capacités de lactation des femelles en analysant la composition lipidique de leur lait et en suivant la croissance de leurs petits. Enfin, pour la bonne réalisation de ces expériences, nous souhaitons pouvoir former les utilisateurs aux gestes nécessaires grâce à des animaux de réforme.

Bénéfices attendus

Notre équipe a pour mission de caractériser des myopathies affectant l’être humain et de développer des thérapies susceptibles d’améliorer leur condition grâce à des modèles animaux. Une première étude nous a permis de démontrer un rôle prometteur d’un peptide sur le fonctionnement énergétique des muscles de souris modèles d’une myopathie congénitale rare chez l’être humain, à ce jour orpheline de tout traitement. Le projet que nous proposons vise à poursuivre la caractérisation de cet effet thérapeutique afin d’offrir à la communauté scientifique une description la plus précise possible de l’intérêt de cette molécule pour cette affection. Plus largement, ce projet améliorera notre connaissance de cette myopathie, sur le plan musculaire, métabolique et reproducteur. L’objectif est à terme de pouvoir fournir aux médecins en charge des patients atteints de cette myopathie des informations les plus précises possibles sur un modèle animal pertinent de cette maladie, concernant ses mécanismes, son évolution et ses conséquences. Enfin, l’objectif est de pouvoir leur proposer une piste pour un essai clinique à partir d’éléments fiables et précis sur la sécurité et l’efficacité d’une molécule, telle que potentiellement ce peptide.

Procédures

Selon les procédures, les animaux subiront l’une de ces séries d’interventions : 1. a. Test de tolérance au glucose ou de sensibilité à l’insuline : mise à jeun respectivement 12h ou 4h, 7 prélèvements de sang, de 20 secondes, sur 2h, après section d’1/2 mm de queue, 1 fois dans la vie. b. Epreuves de course comprenant habituation sur 4 jours, mesure de la vitesse maximale aérobie (VMA), endurance et mesure du taux de lactates dans le sang, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la VMA environ 30 min, l’endurance environ 1h30 et la mesure du taux de lactates dans le sang après une épreuve d’endurance à nouveau environ 1h30 maximum. Pour la mesure du taux de lactates dans le sang, les animaux subiront 2 prélèvements de sang de 30 s, l’un avant et l’autre après la course, après section d’1/2 mm de queue. c. Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale avec analgésie forte : chaque intervention durera au maximum 1h, soit 2h30 de manipulation au total en comptant depuis la première injection d’analgésique et jusqu’au réveil complet. Réalisée au maximum 3 fois dans leur vie. Tous les tests fonctionnels (test de tolérance au glucose, de sensibilité à l’insuline, mesure de la vitesse maximale aérobie, endurance, mesure du taux de lactates dans le sang, mesure de la force musculaire) seront séparés a minima de 4 jours. 2. Mêmes interventions qu’en 1, avec en plus une injection sous-cutanée 6 jours sur 7 de l’âge de 4 semaines jusqu’à 4 mois. Chaque injection dure environ 30 s. 3. Trois injections sous-cutanées ou intrapéritonéales ou prélèvements d’une micro-goutte de sang, ou toute combinaison de 3 de ces gestes, séparés a minima de 24h (30 s pour chaque geste) ou une série d’épreuves de course (habituation, VMA, endurance, mesure de la lactatémie) ou 3 mesures de force musculaire, séparées a minima de 4 jours, tels que décrits en 1. 4. Mesure de la glycémie par un prélèvement de sang de 20 s après section d’1/2 mm de queue, 1 fois dans la vie.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger lié à la contention, aux injections ou aux prélèvements, ou modéré lors des épreuves de course. Les femelles en lactation et leurs petits pourront subir un stress énergétique modéré. Les injections et prélèvements pourront causer une douleur légère et brève aux animaux.

Devenir

La majorité des animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires. Une partie des animaux sera replacée comme reproducteurs.

Remplacement

Nous étudions des souris mutantes qui constituent un modèle de myopathie humaine. Une molécule semblait prometteuse d’après son mécanisme d’action et nous l’avons donc testée chez des levures mutantes pour le gène équivalent à celui qui est muté chez les souris que nous étudions. Ces levures présentent en effet des défaut cellulaires et métaboliques très proches de ceux observés dans les cellules musculaires des souris mutantes. Dans ce contexte de remplacement, cette molécule a restauré la croissance des levures mutantes. Forts de cette preuve de concept, nous avons ensuite testé cette molécule chez les souris mutantes. A ce stade, nous avons besoin de nouvelles analyses sur ces souris mutantes pour poursuivre l’évaluation de cette molécule à potentiel thérapeutique sur la fonction musculaire et métabolique de ces souris. Nous avons également besoin d’utiliser des animaux pour évaluer les conséquences de la mutation de ce gène sur la fonction musculaire et la reproduction.

Réduction

Grâce aux connaissances accumulées ces dernières années sur ces souris mutantes et les tests réalisés, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possibe, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. Nous utiliserons pour cela des analyses statistiques adaptées. Par ailleurs, nous utiliserons des animaux de réforme pour la formation aux gestes techniques et tests fonctionnels.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). En dehors de ce cas, seuls les mâles reproducteurs seront maintenus isolés. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Grâce à la génération de mutations d’intérêt par manipulation du génome, la souris est un mammifère particulièrement pertinent pour l’étude des affections humaines et notamment des myopathies congénitales, que ce soit pour l’étude des mécanismes en jeu ou la réalisation d’essais thérapeutiques. Elle présente par ailleurs des atouts zootechniques (temps de reproduction court, petite taille, effectifs importants) et techniques (familiarité et facilité de manipulation). Nous utiliserons de animaux à partir du sevrage, et jusqu’à un an maximum, ainsi que des jeunes, suivis de leur naissance jusqu’au sevrage (étude de la lactation). Pour la procédure de formation, nous utiliserons des animaux de réforme, âgés d’un mois à un an. Ces âges seront pertinents pour les études réalisées et minimiseront le risque d’effet dommageable de la mutation étudiée.