Système musculosquelettique
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Etude pilote – Absorption intestinale et metabolisme du phosphate dans des souris CD1/129sv en situation d’insuffisance renale chronique
- Recherche fondamentale
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48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies retirant les cinq sixièmes du rein, puis dix semaines de régime plus ou moins riche en phosphate et des passages en cage métabolique, avec un risque d'anurie, d'hypothermie, de perte de poids et de douleurs gastriques. Le porteur présente cette étude pilote comme un moyen de fixer le sexe et le nombre d'animaux d'une étude ultérieure sur des souris génétiquement modifiées. Il affirme que seul un modèle in vivo permet d'étudier la relation entre rein, intestin et vaisseaux.
Objectifs
La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l'insuffisance rénale chronique (IRC) à cause du développement de calcifications vasculaires (CV), facteur prédictif important de la mortalité. Lors de cette pathologie, la diminution de la fonction rénale induit la réduction de l’élimination du phosphate (Pi) (sel minéral présent dans le corps humain), cela conduit à une accumulation de cet élément dans le corps au niveau sérique. Ce phénomène est la principale cause de développement de CV. Chez un individu sain, la concentration sérique de Pi est maintenue dans la plage normale par l'équilibre entre un phénomène d’entrée au niveau intestinal et de sortie au niveau rénal, ce dernier étant donc déficient lors de l’IRC. Dans notre étude, nous nous intéressons essentiellement aux mécanismes d’entrée du Pi via le processus d’absorption intestinale et spécifiquement à celui du passage du Pi entre les cellules intestinales. De plus, malgré l’augmentation du taux sériques de Pi, le processus d’entrée reste anormalement activé, cela suggère que la détection et/ou le transport du Pi intestinal sont défectueux dans cette pathologie. Nous souhaitons donc étudier les médiateurs impliqués dans l’absorption du Pi de façon à identifier, dans le futur, des cibles thérapeutiques pour diminuer la concentration sérique de phosphate via la réduction de l’entrée de ce sel dans l’organisme. Ceci permettrait de limiter le développement de CV et donc de réduire la mortalité des patients atteints d’IRC. Nous avons récemment découvert que des souris modifiées génétiquement pour une certaine protéine : la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de Pi réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce défaut dans le développement des CV au cours de l'IRC. Dans le futur ces souris seront étudiées et donc rendues malades via une opération d’ablation de 5/6ème des reins (néphrectomie (Nx)-laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place). De plus ces souris recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 10 semaines. Cependant, la présente demande concerne la mise en place d’une étude pilote préalable. Ici, nous chercherons uniquement à caractériser la réponse en termes de CV de souris contrôle néphrectomisées, en fonction de leur régime (plus ou moins riche en phosphate) et de leur sexe.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, cette étude pilote nous permettra de savoir si les souris contrôles tolèrent bien la néphrectomie, si elles sont capables de développer des CV sous régime riche en phosphate et également si le sexe des animaux impacte leur réponse. Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’ajuster le nombre et le sexe des animaux pour la prochaine étude.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures : buprénorphine (injection sous cutanée de 5 secondes, 30 minutes avant le début de la chirurgie et 4 heures post-op) ; xylocaine (injection sous cutanée de 5 secondes sur le site de l'opération - 5 minutes avant la chirurgie). La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (buprénorphine avec respect du délai d'administration - délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 10 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 24 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. 6 et 2 jours avant le prélèvement sanguin terminal, les animaux recevront une injection en IP de tétracycline (marqueur de formation osseuse). Ces injections seront effectuées rapidement sur animal vigile par contention (5 seconde/animal). A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang sur cœur battant va être réaliser via une ponction cardiaque (sur des animaux anesthésiés (injection en intrapéritonéale de 5 secondes- mélange de Kétamine et Xylazine)), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique (Euthasol, injection en intrapéritonéale de 5 secondes) , pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire, les injections et le passage en cage métabolique. Les effets possibles sont : l’anurie, la perte de poids, l’hypothermie, des modifications comportementales (prostration, hypoactivité), une zone d’incision douloureuse, des douleurs gastriques (dos vouté, diarrhée). Anurie : durée post-chirurgical (environ 3h), Hypothermie : pendant chirurgie et réveil : environ 2h, Modifications comportementales : peut se déclencher pendant les 11 semaines post chirurgie, Zone d’incision douloureuse : pendant la cicatrisation post – chirurgie, Douleurs gastriques : peut arriver pendant les 10 semaines de régime.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissu biologique et de sang.
Remplacement
Nous souhaitons investiguer la relation entre divers organes : le rein (néphrectomie), l’intestin (via l’absorption paracellulaire) et l’arche aortique/carotides (développement de CV). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme minéral et surtout celui du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.
Réduction
De façon à optimiser le nombre d’animaux et notamment à réduire au juste nécessaire, cette étude pilote est proposée. Ces résultats vont nous permettre de choisir le sexe des animaux utilisés pour les prochaines études (non présentées dans cette demande), et d’adapter le nombre au taux de mortalité observer ici. Après étude statistique ; il faut inclure au moins 8 animaux par groupe, mais en prenant en compte un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique robuste. Les études de cages métaboliques seront réalisées sur les mêmes animaux avant et après de façon à ce que l’animal soit son propre contrôle et donc diminuer la variabilité inter-individus.
Raffinement
Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. La procédure expérimentale implique la réalisation d’une néphrectomie pour induire une insuffisance rénale chronique, ce qui engendre de la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. De plus, les souris seront entrainées à être changées via un passage dans un tube pour ne pas avoir à toucher leur dos/queue lors des changes après néphrectomie car la zone pourrait être douloureuse. Ce tube sera toujours dans la cage et constituera également un enrichissement physique. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux, et cette évaluation sera effectuée régulièrement. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie. Concernant les injections en fin de protocole de tétracycline (IP ; 30mg/kg), elles seront effectuées par un expérimentateur habilité et formé. Les animaux seront habitués à la contention 48h avant les injections pour diminuer leur stress et également pour vérifier que la contention ne génère pas de douleur au niveau des cicatrices, bien que les cicatrices soient loin de la zone d’injection. De plus, il n’y a aucun risque de toxicité car la concentration utilisée (30mg/kg) est largement en dessous de la DL50 décrite pour ce produit. L’acte de ponction cardiaque sera réalisé sous anesthésie lourde, la mise à mort sera rapide et sans douleur via l’injection d’un produit euthanasiant.
Choix des espèces
Ici, l'étude pilote est proposée sur des souris contrôles. Dans le futur (si les résultats de cette étude pilote sont concluants), une seconde étude sur des souris génétiquement modifiées sera réalisée pour une meilleure compréhension de la pathologie. Ces études sont la suite de projets portant sur l'étude du métabolisme et menées dans le laboratoire. De ce fait, nous souhaitons continuer ce nouveau projet sur le même modèle que les souris utilisées précédemment au laboratoire et nous disposons de ces modèles de souris à l'animalerie. Cette étude pilote est donc proposée sur la souris. L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place) est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). L’étude pilote sera menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.
Evaluation de composés administrés chez le rat développant une ostéodystrophie consécutive à une insuffisance rénale
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une alimentation enrichie en adénine qui provoque une insuffisance rénale et une forte baisse de poids, puis des composés par gavage ou injection et des prélèvements de sang et d'urine, avant d'être autopsiés pour prélever les os. Le porteur indique que l'insuffisance rénale peut entraîner une rigidité abdominale et une inflammation, surveillées par des grilles cliniques. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier et juge l'évaluation chez l'animal "indispensable" avant l'usage des composés chez des patients.
Objectifs
En France, 10 % des adultes présentent une maladie rénale chronique (MRC). Le nombre de personnes atteintes est ainsi estimé à près de 3 millions. La MRC induit des troubles du métabolisme des minéraux conduisant à des lésions osseuses (ostéodystrophie) et des calcifications vasculaires qui aggravent le pronostic fonctionnel et vital du patient. 45 à 80% des patients atteints de MRC développent des lésions osseuses plus ou moins sévères. Dans le but d'améliorer la qualité de vie des patients et de réduire leur morbidité, l'évaluation de composés susceptibles de réduire les lésions osseuses devient indispensable, et c’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet. La présente demande a pour but d'évaluer les effets de l’administration d’un composé d’intérêt chez le rat atteint d’ostéodystrophie. Le composé étudié est susceptible de réduire des lésions osseuses. Des études pilotes seront réalisées pour chaque lot de composé d’intérêt étudié. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ce composé ainsi que de tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié au niveau systémique, urinaire, fécal. De même, l’analyse de certains organes préalablement déterminés sera réalisée afin de confronter ces observations avec les résultats des observations, mesures, dosages spécifiques qui seront effectués dans l’étude. La durée maximale des protocoles sera de 70 jours, et des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires ou en cas d’atteinte de points limites.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra à son échelle d’informer sur l’efficacité du composé évalué et sur le degré de réduction des lésions osseuses. De plus les informations recueillies à chaque étape mettront en évidence une potentielle toxicité osseuse de la molécule étudiée - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et à l’amélioration de la qualité de vie des patients atteints d’insuffisance rénale développant une ostéodystrophie
Procédures
L’administration orale du composé se fera par gavage sur animaux vigiles (moins de 5min par gavage). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des lots de composé testés. Les injections du composé en parentérale (sous cutanée ou intramusculaire ou intrapéritonéale : dans le cadrant caudal droit de l'abdomen ventral) seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 min par injection). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des lots de composé testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 min par prélèvement). Un traitement analgésique sera systématiquement appliqué aux animaux. Si des prélèvements à l’aorte abdominale sont effectués, ils ne se feront qu’en point final sous anesthésie avant sacrifice de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 min par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où l'urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.
Impact sur les animaux
Du fait du faible attrait des animaux pour la nourriture enrichie en adénine, une forte baisse de poids est observée les premiers jours de la prise alimentaire sans pour autant être délétère pour l’animal. La prise de poids redevient physiologique après 2 semaines maximum d’alimentation spécifique (supplémentée en adénine). L’insuffisance rénale induite par l’apport d’adénine peut induire une rigidité abdominale signe d’inflammation des organes abdominaux comme les reins et/ou une anurie. Une possible réaction inflammatoire pourra également apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ces cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour évaluer les modifications éventuellement des biomarqueurs du remodelage osseux, du métabolisme phosphocalcique, de l’insuffisance rénale et de la présence de cristaux calciques. Les organes seront également utilisés pour doser le composé et/ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie
Remplacement
De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais l’évaluation chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer la réduction de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.
Impact de la proportion de muscle rouge sur la capacité de nage chez la truite automnale
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
180 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque poisson subit deux tests de nage forcée à contre-courant, jusqu'à trois heures, la répétition sur les mêmes individus justifiant la gravité sévère déclarée. Le porteur indique que l'objectif premier relève d'un "enjeu agronomique et économique", diminuer par sélection génomique le muscle rouge qui gêne la vente de truite fumée, et présente comme bénéfice annexe la vérification que cette baisse ne nuit pas à la capacité de nage. Il conclut que la question impose des tests sur animaux vivants.
Objectifs
La production de truite arc en ciel en France s’oriente de plus en plus vers des poissons de grande taille destinés à la fumaison et vendus sous forme de tranches fines. La présence du muscle rouge, facilement repérable par sa couleur brune est fortement préjudiciable pour la vente. En effet, outre l’aspect visuel, le muscle rouge riche en lipides s’oxyde rapidement conduisant à des défauts de flaveur. C’est pourquoi certains cahiers des charges imposent aux transformateurs d’éliminer ce muscle. Ce niveau de parage élevé (élimination du muscle rouge) entraîne une perte en matière première et donc une perte économique pour les producteurs et les transformateurs. Il y a donc un enjeu agronomique et économique à maîtriser la croissance de ce muscle. C’est pourquoi les professionnels étudient la possibilité de diminuer la proportion de muscle rouge par sélection génomique. La musculature des poissons est très majoritairement (>90%) constituée d’un muscle blanc à contraction rapide et d’un muscle rouge à contraction lente. D’après la littérature, le muscle blanc avec un métabolisme anaérobie est surtout sollicité par le poisson pour la nage rapide alors que le muscle rouge avec un métabolisme aérobie est principalement sollicité pour la nage lente. Alors que les études sur la croissance du muscle blanc sont nombreuses et que l’impact des facteurs externes est bien connu, les facteurs qui influencent la proportion de muscle rouge chez les poissons sont très mal connus. Parmi les différents facteurs d’élevage, l’exercice modéré semble stimuler la croissance du muscle rouge sans modifier significativement la taille des fibres lentes . Cependant, l’impact de l’exercice sur la taille des fibres du muscle rouge de truite reste controversé puisque certaines études rapportent une augmentation de 25 % du diamètre moyen des fibres , alors qu’une autre n’observe aucun effet . Un des objectifs du projet est de déterminer s'il existe une relation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Plus spécifiquement, l'objectif de cette expérimentation est de déterminer si la mesure de capacité de nage est répétable entre 2 tests et s'il y a une relation entre capacité de nage et proportion de muscle rouge au sein de la même base génétique. Ce projet comporte une seule procédure expérimentale de test de nage classée sévère.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Il s'agit notamment de vérifier si une proportion faible de muscle rouge n’entraîne pas de défauts dans la capacité de nage ce qui pourrait nuire au bien-être de l’animal. Étant donné que le muscle rouge est décrit comme étant principalement sollicité pour la nage lente, il s'agit de vérifier si les poissons avec une faible proportion de muscle rouge n’ont pas une capacité de nage limité ce qui pourrait nuire à leur bien-être. Par ailleurs, il s'agira de déterminer si la capacité de nage d'un poisson est comparable entre 2 tests séparés de 3 semaines pour permettre une récupération complète. De plus, il s'agira de déterminer s'il existe une relation entre les capacités de nage et la proportion de muscle rouge ou la morphologie au sein d'une même base génétique.
Procédures
Les animaux seront soumis à un test de nage qui consiste à exposer les poissons à un courant de plus en plus fort dans un bassin expérimental. Le débit sera progressivement augmenté par paliers de 10-20min pour atteindre 90cm/s. Le test doit durer 160 minutes. Au cas où un animal n’aurait pas décroché, le test de nage sera arrêté au bout de 3 heures. Le test sera répété 2ème fois sur les mêmes animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les poissons utilisés dans ce projet sont celles générés par un test de nage répété 2 fois (phase 1 et 2) sur les mêmes individus et qui va durer au maximum 3h. Cette nuisance est sévère car répétée 2 fois sur les mêmes individus. Ces tests de nage nécessitent également une émersion des animaux pour les transférer de leur bassin d’élevage jusqu’au dispositif de test de nage qui ne durera pas plus de 5 secondes. Cette émersion des animaux génère un stress de courte durée est considéré comme léger. Enfin, les animaux seront exposés à des phases d’habituation à un environnement nouveau lié au regroupement 3 à 4 semaines avant les tests, et au changement de bassin lorsqu’ils seront transférés du bassin d’élevage au bassin de test induisant un stress modéré. Les animaux seront également mis à jeun la veille du test. Ces mises à jeun, bien supportées par l’espèce, sont léger.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet ou par les responsables du projet eux-mêmes. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés. Tous les éléments justifiant leur mise à mort sont conservés et transmis à la SBEA de l'établissement et au vétérinaire référent de l'établissement, ainsi qu’au responsable du projet.
Remplacement
Les objectifs du projet étant de déterminer s'il existe une relation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage des poissons, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.
Réduction
En prenant en compte la variabilité de la réponse au test de nage et de la proportion de muscle rouge, nous avons pu diminuer le nombre d'animaux utilisés à 180 truites. Cet effectif nous permettra d’avoir une puissance statistique suffisante et de mettre en évidence une relation entre la proportion du muscle rouge et les performances de nage.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèces (photopériode, qualité d'eau, densité, nourriture). Pour limiter le stress, les groupes de poissons seront constitués en même temps que le marquage par pit-tag entre 3 et 4 semaines avant le test de nage et placés dans un bac d’élevage proche du bassin de test afin de limiter au minimum le stress du transfert. Pour cela, les poissons seront pêchés dans leur bassin d’élevage avec une épuisette, puis disposés dans un bac d’anesthésie avec de la tricaïne MS-222 + bicarbonate de soude pour tamponner le milieu et éviter un stress d’acidité. Lors du marquage, les poissons seront déposés sur une serpillère humide pour éviter la déperdition de mucus. Le corps et les yeux des poissons seront recouvert de cette serpillière pour les isoler de l’environnement ambiant. Après injection de la marque, les poissons sont mis dans un bac de réveil, avant d’être regroupés pour constituer les lots destinés aux tests de nage. Toutes les manipulations sont réalisées sous anesthésie par du personnel compétent le plus rapidement possible pour limiter le temps d’émersion des animaux qui ne durera pas plus de 10 secondes. Ils seront également mis à jeun avant le test afin d'éviter qu'ils ne soient malades et transférés avec une épuisette dans le bassin de test la veille pour s’habituer à ce bassin qui sera disposé dans une pièce isolée et ne servant qu’aux tests de nage afin de limiter le stress. Pendant la procédure, la manipulation des animaux sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Cette surveillance du comportement des poissons se fait en continu dès lors que les poissons sont pêchés dans leur bassin d’élevage pour être introduit dans le dispositif de test de nage. Une à deux personnes seront en permanence prêtes à intervenir dès l’atteinte des points limites pendant le test, Notre expérience, nous indique que les poissons bien épuisés récupèrent tous après un test de nage. Par ailleurs, à l'issue de la phase 2, les poissons sont mis à mort dès qu'ils ne sont plus en capacité de nager (cf § 4.2 Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés.
Choix des espèces
L'étude s'effectue sur la truite arc en ciel car c'est l'espèce piscicole utilisée pour le projet. C'est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. De plus, il s’agit d’un poisson d’intérêt économique dans le monde entier, et qui représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement étudié dans la communauté scientifique. Nous allons réaliser les tests sur des animaux de 200g qui correspond à la taille où l’on peut mesurer le plus précisément la proportion de muscle rouge ainsi que les capacités de nage.
Caractérisation des populations cellulaires impliquées dans la cicatrisation tendineuse dans un modèle de lésion tendineuse induite au niveau achilléen et de la coiffe des rotateurs chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie créant une lésion partielle du tendon d'Achille ou de la coiffe des rotateurs, pour suivre la cicatrisation à différents temps. Le porteur reconnaît que la douleur post-opératoire peut plonger l'animal dans la prostration et l'isolement, et qu'une infection des sutures est possible. Il affirme que la cicatrisation ne peut être reproduite sur cellules ou explants, les tendons étant prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Le projet porte sur l’étude des populations cellulaires impliquées dans la cicatrisation tendineuse. Alors que les lésions tendineuses sont fréquentes et ont un impact sociétal majeur, leur prise en charge reste peu satisfaisante et les mécanismes impliqués dans la cicatrisation tendineuse restent à étudier. La biologie des ténocytes, qui sont les cellules majoritaires du tendon, n'est que partiellement connue et nécessite de nouvelles études pour comprendre les diverses populations présentes au sein du tendon et leurs rôles particuliers. L’objectif de l’étude est de collecter des tendons à différents temps de la cicatrisation après une lésion induite chirurgicalement et d’étudier les changements cellulaires au cours du temps. La technique de séquençage de cellule unique (en anglais, single cell RNA-Sequencing) permet l'analyse de l'information génétique à l'échelle d'une seule cellule. Elle permettra d'identifier dans chaque cellule, l'ensemble des gènes exprimés afin de pouvoir les grouper via leur profil d'expression. La réalisation de marquage ciblant certaines protéines exprimées par les cellules au sein du tissu permettra ensuite de localiser les différents groupes cellulaires au niveau de la zone de cicatrisation. Un groupe de souris subira une chirurgie au niveau du tendon achilléen et un autre groupe de souris subira la chirurgie au niveau des tendons de l'épaule pour étudier les deux sites les plus fréquemment atteints par la tendinopathie chez l'Homme.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints de lésions tendineuses reste à ce jour insuffisante et aucun traitement agissant sur les lésions de tendinopathies n’est disponible. Le tendon est un tissu ayant un faible potentiel de régénération et le manque de connaissance sur la biologie des cellules du tendon (ténocytes) et le processus de cicatrisation tendineuse explique en partie ceci. Le projet permettra d’étudier les différentes populations de cellules impliquées dans la cicatrisation, ceci pouvant apporter de nouvelles pistes pour des approches thérapeutiques régénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique chirurgie consistant en la réalisation d’une lésion tendineuse partielle, dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et traitement anti-douleur pré et post-opératoire. La procédure chirurgicale dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Dans les trois premiers jours après la chirurgie, si de la douleur est ressentie par l’animal, celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Une surveillance quotidienne des animaux pourra permettre de repérer ces comportements et de prolonger le traitement analgésique si nécessaire. De plus, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué et réponse comportementale aux stimuli) seront attentivement pointés.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tendons et procéder aux analyses.
Remplacement
Les lésions tendineuses sont complexes et impliquent différents compartiments, le tendon lui-même, le péri-tendon, la bourse synoviale (pour l’épaule) et le muscle. Le tissu qui nous intéresse particulièrement ici est le tendon et bien que les ténocytes (principale population cellulaire du tendon) ou des explants tendineux puissent être utilisée en culture, il n’est pas possible de récapituler le phénomène de cicatrisation tel qu’il existe chez l’animal. De plus, la physiologie tendineuse nécessite que le tendon soit soumis à des contraintes mécaniques (tension, friction, compression) et celles-ci ne sont pas reproductibles aisément in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum (20 par groupe) mais suffisant pour obtenir suffisamment de matériel cellulaire et pour démontrer des différences statistiquement significatives entre les groupes.
Raffinement
La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de quelques minutes, elle sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les souris seront ensuite transférées dans une cage également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, au maximum 5 souris seront hébergées par cage afin de leur fournir un espace suffisant pour cohabiter sans encombrement et le milieu sera enrichi de litière mais également de dômes et de papier afin d’y construire un nid.
Choix des espèces
La souris est régulièrement utilisée pour des études sur le tendon de par son anatomie proche de celle de l’homme au niveau de la coiffe des rotateurs ou du tendon achilléen. La souris est également largement utilisée pour étudier la cicatrisation tendineuse et de nombreuses souris génétiquement modifiées sont disponibles pour de futures études. De plus, les coûts d’hébergement de la souris sont moindres qu’avec le rat ou le lapin. Des souris âgées de 16 semaines seront réceptionnées à l’animalerie, considérées comme adultes, afin d’étudier le phénomène de cicatrisation à l’âge où surviennent les lésions tendineuses. Après réception, les souris sont utilisées après une semaine d’acclimatation (17 semaines).
Caractérisation d’un modèle murin reproduisant une myopathie liée à une déficience en cavéoline 3 et évaluation de potentielles thérapies.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie liée à un déficit en cavéoline 3, elles subissent des tests de force hebdomadaires, des courses forcées jusqu'à épuisement contraintes par de petits chocs électriques, un isolement de douze heures, des prélèvements sanguins par la queue et des examens cardiaques sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les nuisances comprennent la contention, la chute dans la litière et l'extension de l'animal par tirement de la queue, tout en indiquant que les souris ne présentent pas de symptômes cliniques sévères. Il affirme qu'évaluer la force musculaire in vivo est "indispensable" pour tester deux thérapies, les souris étant tuées pour prélever leurs muscles.
Objectifs
Les cavéolinopathies sont des maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. Actuellement, aucun traitement n’existe. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de deux thérapies, capables d’améliorer les fonctions motrices de souris atteintes d’autres maladies du muscle et présentant des symptômes similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra fournir les premières preuves de concept pour soigner des patients atteints d'une maladie rare du muscle. Elle permettra, en outre, de mieux comprendre cette maladie et les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force non invasifs et durant 1 minute au maximum seront réalisés une fois par semaine entre 7 et 12 semaines. Chacun de ces tests sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 mins. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à épuisement sera réalisés entre 1 et 3 fois durant la période de test des animaux et durera au maximum 1h40. L'animal sera également laissé libre dans une cage pendant 12h afin d'étudier ses mouvement spontanés. Des prélèvements de sang seront effectués toutes les deux semaines au maximum et ne dépasseront pas 10% du volume total de l'animal. Durant ces prélèvements, les souris seront maintenues dans un tube pendant moins de 5 mins afin d'avoir accès à leur queue pour la prise de sang. Des tests cardiaques seront réalisés sur des souris anesthésiées au cours de la même expérience, afin de limiter le nombre d'anesthésies. Ces tests dureront au maximum 30 mins. Un test final sera effectué sur souris anesthésiées précédant l’euthanasie des animaux pour mesurer la force musculaire des souris. Ce test dure au maximum une heure. Une biopsie auriculaire durant moins de 2 mins sera effectuée à 3 semaines afin d'identifier les animaux ainsi que leur mutation grâce à l'ADN qui sera extrait de cette biopsie.
Impact sur les animaux
Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont la contention temporaire de l’animal, la chute de l’animal dans une cage remplie de litière, l’extension de l’animal par tirement progressif de la queue par l’expérimentateur, l’isolement de l’animal dans un cage spéciale pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques et l’anesthésie générale de l’animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de deux thérapies sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisament proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.
Réduction
La grande majorité des tests étant non invasif, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre ainsi que du carton, pour permettre aux souris de ronger. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 à 2 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. L’animal sera sorti de la cage à l’aide d’un tube ou les mains du manipulateur disposées en coupe pour réduire leur stress. Lors de l'évaluation des fonctions cardiaques sous anesthésie, une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Durant les mesures de force, l'animal sera anesthésié et analgésié afin d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. Pour chaque anesthésie, la température corporelle de l'animal sera maintenue au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Pour chaque expérience de phénotypage, l'animal sera tout d'abord familiarisé avec le matériel pour minimiser autant que possible son stress.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé reproduit les problèmes de dégénérescence de fibres musculaires retrouvés chez les patients. Les souris malades ne présentent cependant pas de symptômes cliniques importants et peuvent vivre aussi longtemps que des souris saines sans être handicapées au quotidien. Dès 8 semaines, on retrouve des défauts de fibres musculaires, et à 12 semaines une forte régénération des fibres. Les tests seront donc réalisés entre 7 et 12 semaines, sur souris adultes.
Etude du rôle des macrophages thymiques dans la mise en place de la myasthénie autoimmune dans le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
270 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées pendant une à six semaines, subissent des tests moteurs répétés et un électromyogramme sous anesthésie, pour tester l'hypothèse d'un lien entre déficit en macrophages thymiques et myasthénie. Le porteur indique que les molécules injectées peuvent provoquer une fébrilité transitoire. Il justifie le recours à l'animal par un "besoin" de valider chez la souris des observations faites chez des patients et in vitro.
Objectifs
La myasthénie grave est une maladie auto-immune rare. Elle est liée à la production d’auto-anticorps dirigés contre le récepteur à l’acétylcholine (RACh), situé à la jonction entre le nerf et le muscle. Ces auto-anticorps altèrent la transmission du message nerveux entre le nerf et le muscle conduisant à des faiblesses musculaires plus ou moins invalidantes. Il n’existe actuellement aucun traitement pour guérir de la myasthénie. Les traitements actuels proposés aux patients sont essentiellement pour limiter les symptômes ou non-spécifiques, et doivent être pris à vie. Dans la myasthénie, si le muscle est l’organe cible, l’organe effecteur est le thymus. Une diminution du nombre des macrophages dans le thymus des patients myasthéniques a été récemment mise en évidence. Notre hypothèse est que ce défaut en macrophages de l’inflammation du thymus à l’origine de la myasthénie. Ce projet de recherche a pour but de démontrer chez la souris qu’une diminution du nombre de macrophages thymiques induit des changements thymiques comme ceux observés chez les patients, et à long terme une myasthénie.
Bénéfices attendus
La myasthénie autoimmune est une maladie chronique invalidante. On ne sait pas exactement encore pourquoi des personnes développent cette maladie. La compréhension des mécanismes étiologiques est donc très importante pour proposer de nouveaux traitements plus adaptés aux patients. En effet, à l’heure actuelle, les traitements proposés sont souvent des immunosuppresseurs à vie et/ou une ablation radicale du thymus. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un défaut en macrophages thymiques serait à l’origine de l’inflammation thymique conduisant à la myasthénie. Il n’y a pas de modèle spontané connu de cette pathologie chez la souris. Nous souhaitons utiliser une combinaison de molécules pour : 1) Démontrer que l’injection intrapéritonéale de ces molécules peut induire au bout d’une semaine, une inflammation dans le thymus. 2) Démontrer que les effets ces molécules sont exacerbés chez des souris transgénique qui ont moins de macrophages. 3) Sur des manipes plus longues (6 semaines), rechercher chez des souris ayant moins de macrophages thymiques, l’apparition de symptômes myasthéniques. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment la myasthénie se met en place afin de proposer ensuite de nouvelles approches thérapeutiques aux patients.
Procédures
1) L’injection intra péritonéale consiste à injecter un produit directement dans le péritoine, en bas de l’abdomen, afin d’induire une réponse systémique rapide. Cette manipulation se fait sur souris vigiles et dure quelques secondes. Geste réalisé sur chaque souris et selon les procédures: - 3/sem pendant 1 semaine pour 90 souris – 3/sem pendant 4 semaines pour 36 souris – tous les jours pendant 1 semaine 36 souris – 2/sem pendant 6 semaines pour 108 souris. 2) Les tests cliniques visent à étudier l’activité motrice des différents animaux afin d'évaluer l'apparition de la pathologie et les effets du traitement. L’évaluation comportementale de l’activité motrice des souris est pratiquée à l’aide de tests usuels, basés sur le comportement spontané des rongeurs (Grip test après une course sur tapis de 5 minutes et grille retournée) et la mesure du poids. 5 mesures sont faites par souris pour le grip test et un test de la grille retournée; chaque test durant 1 minute maximum. Ces tests concernent 108 souris et sont menés tout au long du protocole expérimental : une séance d’habituation (pour minimiser le stress associé aux manipulations répétées) est effectuée quelques jours avant la première injection et ensuite des séances régulières sont espacées de 8 à 12 jours. 3) L’electromyogramme permet de suivre le statut myasthénique suite à une stimulation du muscle squelettique. Pour ce protocole les souris sont anesthésiées. Après l’examen, les souris sont ensuite replacées dans leur cage initiale. L’examen, qui dure en totalité de 10 à 15 minutes par animal, sera pratiqué quelques heures avant l’euthanasie de la souris à la fin du protocole expérimentale et ne sera donc réalisé qu’une seule fois par animal. Cette procédure concerne 108 souris dans ce projet.
Impact sur les animaux
Les molécules injectées peuvent entrainer une fébrilité transitoire due à l’activation du système immunitaire. Les injections intrapéritonéales ne sont pas invasives pour les souris, le geste étant rapide et n’entrainant pas de blessure chez l’animal ou de gêne pour le déplacement. Les tests cliniques n’entrainent pas de stress particulier chez la souris. L’électromyogramme sera effectué sur les souris anesthésiées et elles ne ressentiront pas la douleur dût au test. Dès la fin de la manipulation, l’animal est euthanasié et n’est donc pas impacté pour la suite par cette procédure.
Devenir
Tous les animaux à la fin de ce projet sont euthanasiés. Effectivement à la fin de chaque protocole, il est nécessaire de prélever différents organes et tissus pour pouvoir étudier l’impact physiologique et moléculaire des différents traitements utilisés. Ceci a pour but d’optimiser l’utilisation des souris de ce projet.
Remplacement
A ce jour notre projet découle d’observations faites chez des patients myasthéniques et d’expériences in vitro. Maintenant, nous avons besoin de valider nos observations avec des modèles animaux, afin de démontrer que la myasthénie pourrait être due à une diminution des macrophages thymiques
Réduction
Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données et par un test de puissance, pour obtenir des résultats fiables à la suite de nos expériences, tout en utilisant le minimum d'animaux. En tout 270 souris sont nécessaires à la réalisation de ce projet expérimentale
Raffinement
Lors de leur arrivée dans l’animalerie, les souris sont acclimatées pendant au moins 1 semaine. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). L'utilisation de "Sizzlenests" (bandes de papier Kraft autoclavées) permet aux rongeurs de faire rapidement des nids. Le nid leur permet d’être moins dérangés par le bruit, la lumière, le mouvement et les changements de température. Il donne un sentiment de sécurité, ce qui réduit le stress des animaux et donc leur agressivité. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles d'aller chercher la nourriture en hauteur. Afin de limiter au maximum la douleur et le stress chez les animaux lors des injections intrapéritonéales, elles seront effectuées alternativement à gauche et à droite dans la partie basse de l’abdomen. Une séance d’habituation aux tests cliniques est effectuée quelques jours avant la première injection pour minimiser le stress associé aux manipulations. Le score clinique complet est évalué tous les 8-12 jours. Lors de l’électromyographie, la souris est anesthésié afin qu’elle ne ressente pas la douleur. La souris est ensuite euthanasiée juste après les mesures et ne ressent pas les conséquences de ce protocole. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers pour repérer d’éventuels signes de mal-être, de blessures ou si elles atteignent des points limites. Dans ces cas la souris est euthanasiée.
Choix des espèces
Les souris sont couramment utilisées pour la mise en place de modèles pour des maladies autoimmunes, dont la myasthénie. L’avantage de la souris est que le système immunitaire est bien mieux connu et que des souris transgéniques, déficientes pour des gènes précis, peuvent être utilisées. Des souris femelles seront utilisées car la myasthénie est une maladie qui touche majoritairement les femmes. Les expériences seront effectuées sur des souris de 6 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence, période d’apparition de la maladie chez l’humain.
Prévention du déconditionnement physique lié à l’inactivité et à la microgravité
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un entraînement forcé sur tapis roulant et sur échelle, des tests moteurs et un test de reconnaissance d'objet, puis une suspension du train arrière jusqu'à trois semaines simulant la microgravité, avec des injections intrapéritonéales, avant le prélèvement de tissus. Le porteur indique que la suspension provoque un stress et une perte de poids modérée les premières 48 heures. Il justifie l'usage animal par l'absence de modèle cellulaire des effets "corps entier" de l'impesanteur, pour une recherche à finalité spatiale et clinique.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer des méthodes de prévention des effets néfastes de l’inactivité physique et de la microgravité sur la santé. Celui-ci s’intègre donc à la fois dans la recherche spatiale (astronautes) mais également dans la recherche clinique (alitement, immobilisation, opération, sédentarité…). Pour répondre à ces objectifs, 7 équipes de recherche de spécialités différentes travailleront enssemble pour évaluer l’effet des méthodes de prévention sur l’ensemble de l’organisme et plus particulièrement l’appareil locomoteur qui est fortement impacté. L’expérimentation proposée sur le modèle rongeur devra permettre de mettre en place des recommandations pour une étude clinique humaine future, et proposer des hypothèses de travail pour des recherches cliniques en lien avec la sédentarité. Ces travaux se centreront autour de trois axes principaux : 1- Évaluer l’intérêt d’une préparation physique spécifique avant un vol spatial. 2- Evaluer un assortiment de moyens de prévention du déconditionnement de l’appareil locomoteur pendant la phase d’immobilisation. 3- Evaluer l’étendue de la récupération dans les différents organes de l’appareil locomoteur induite par les moyens de prévention proposés. L’ensemble de ce projet expérimental vise donc à la fois des études scientifiques fondamentales centrées sur les différents environnements (microgravité et remise en charge), mais également l’évaluation de contremesures pour préparer les défis spatiaux de demain. Enfin, bien que ces expérimentations soient réalisées dans le cadre d’étude du domaine spatial, leurs résultats auront un impact important dans le domaine clinique sur Terre, que ce soit en rapport à l’alitement prolongé, la sédentarité, les maladies chroniques, ou le vieillissement, ainsi que sur les moyens de prévention.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet permettront à la fois d’accroitre les connaissances scientifiques en lien avec l’appareil locomoteur et la microgravité/inactivité, mais également d’évaluer des mesures concrètes pour en atténuer les effets néfastes en se basant sur de nombreux travaux antérieurs. En effet, l’inactivité est, dans l’espace mais également sur Terre dans le domaine clinique, un réèl probème en matière de santé. Ces expérimentations sont de fait à la fois une étape importante pour réaliser les objectifs de demain dans l’exploration spatiale, mais également un axe de recherche primordiale en matière de santé humaine. Ces résultats pourraient donner lieu à des recommandations importantes lors d’immobilisation, de blessure, d’alitement prolongé dans le domaine clinique, ou encore au cours du vieillissement.
Procédures
Les animaux suivront un programme d’entrainement sportif sur tapis roulant (au maximum 9 fois 30 minutes pendant 3 semaines). Cet entraînement sera qualibré de manière individuelle. Les animaux suivront un programme d’entrainement sportif sur échelle d’escalade (au maximum 9 fois 30 minutes pendant 3 semaines). Cet entraînement sera qualibré de manière individuelle à l’aide d’un test de force d’agripement et un test de retournement réalisé une fois préalablement. Les animaux réaliseront également une évaluation de coordination motrice (3 fois 5 min), une évaluation de composition corporelle (3 passages de moins de 2 minutes), et un test comportemental de reconnaissance d’objet (1 passage; 15minutes). Enfin, une partie des animaux seront suspendus selon le modèle de suspension du train arrière (7 jours ou 3 semaines) et 3 injections intra-péritonéales (5 secondes par injection) seront réalisées au cours des 3 derniers jours de suspensions respectant les volumes préconisés (200 microlitres).
Impact sur les animaux
La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera lié à l’inactivité induite par le modèle de suspension du train arrière. En effet, celui-ci peut induire du stress et durant les premières 48h une perte de poids modérée et des bouchons externes des voies uro-génitales. Cette perte de poids s’arrête ensuite. Les animaux seront aussi stréssés lors des tests de force et de l’entrainement sur tapis roulant. Les animaux auront 3 injections intra-péritonéales respectant les volumes recommandés, et induisant une douleur légère de courte durée.
Devenir
A la fin des expérimentations, les animaux sont euthanasiés pour permettre les différents prélèvements de tissus pour analyses.
Remplacement
Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps entier de l’impesanteur sur l’ensemble des tissus d’interêt ainsi que les effets des méthodes de prévention. De plus, ces expériementations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de part les résultats très précieux qu’elle génère.
Réduction
Ces expérimentations ont été adaptées pour diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés au moyens de deux axes de réductions. Le premier axe consiste à centraliser les procédures de 7 équipes de recherches lors d’une unique expérimentation animale, réduisant ainsi par 7 le nombre de souris qui aurait été classiquement employées. Le deuxième axe consiste à réduire le nombre d’animaux par groupe au moyen d’analyses statistiques réalisées préalablement en vue des effets attendus (logiciel Gpower).
Raffinement
Du point de vue du raffinement, les procédures engagées durant l’expérimentation n’entraînent pas de douleurs spécifiques. Pour l’activité physiques et les tests sportifs réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit. L’animal est libre de cesser de courir lorsqu'il le souhaite. Pour les différentes supplémentations de molécules naturelles, celles-ci sont associées à la nourriture. Les procédures de suspension du train arrières ont été validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toute complication. La température d'élevage sera de 24 à 25 degrés pour éviter le refroidissement des animaux. De plus, les souris seront suspendues par deux pour éviter l’isolement social. Chaque procédure possède également des points limites et critères d’arret stricts. Nous assureront un suivi quotidien des animaux et mesureront le poids des souris tous les 3 jours. Enfin, pour permettre les prélèvements finaux des différents tissus d’intérêt les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse avant d’être mis à mort.
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été privilégiée pour plusieurs raisons. Même si il existe des différences subtiles, les espèces murines rat et souris se rapprochent de l'humain en ce qui concerne le système musculosquelettique. Les souris sont par exemple utilisées lors des missions dans l'espace « Bions » pour étudier les effets de la microgravité réèlle. De très nombreuses études ont employé ce modèle et témoignent de sa fiabilité. Les animaux seront utilisés entre 3 et 7 mois en fonction de leurs groupes. Cette tranche d'âge permet de travailler avec des animaux adultes mais non vieillissant, ce qui nous est indispensable vis à vis des différentes analyses (exemple : analyses osseuses) réalisées par la suite.
Modulation du niveau de BIN1 par croisement génétique dans le traitement des myopathies centronucléaires liées au gène SPEG
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie centronucléaire, elles développent une faiblesse musculaire et cardiaque, subissent des tests de force et de coordination (suspension, agrippement, rotarod), des mesures contractiles et une échographie cardiaque sous anesthésie, ainsi qu'un perçage d'oreille, avant le prélèvement d'organes. Le porteur indique que le phénotype cardiaque, progressif, deviendrait "potentiellement sévère" si les souris étaient maintenues en vie, ce qui motive leur mise à mort. Il vise une preuve de concept d'une stratégie de compensation génétique, conditionnée à des résultats hypothétiques.
Objectifs
Les myopathies centronucléaires (CNM) sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints. Aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Récemment dans la littérature, il a été décrit que le gène X, présent au niveau du muscle et du coeur et codant pour une protéine X jouant un rôle clé dans la contraction musculaire, a été identifié comme étant responsable de certains cas de myopathies centronucléaires. Il a été montré également qu’une diminution de la quantité de la protéine Y améliore les signes cliniques musculaires chez la souris ayant un déficit en protéine X (X-déficiente). Cependant, l’amélioration de l’espérance de vie et des signes cliniques cardiaques restent limitée chez ces souris. L’objectif du projet consiste à valider une preuve de concept selon laquelle une augmentation de l'expression d’une autre protéine, protéine Z, pourrait restaurer les signes cliniques cardiaques de la souris X- déficiente. Cette stratégie de thérapie où la surexpression d’une protéine peut compenser les effets négatifs liés à une mutation d’une autre protéine a déjà montré son efficacité dans la littérature. Pour vérifier notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des croisements génétiques de souris afin d'obtenir des souris déficientes en protéine X et surexprimant la protéine Z humaine. Si une amélioration des signes musculaires et cardiaques ainsi qu’une augmentation de l’espérance de vie sont observées, la mise en place d’une thérapie génique sera conduite par la suite dans le modèle de souris X-déficiente.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène X.
Procédures
Concernant les tests liés au phénotype musculaire : - Test de suspension : Mesure de la force du corps. -Test d’agrippement : Mesure de la force des pattes -Test de performance Rotarod : Mesure de la coordination motrice, l'équilibre, l'endurance et la résistance à la fatigue. -Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA): Les souris seront totalement anesthésiées pour qu'il n'y ait pas de réponse à la stimulation tactile (injection intrapéritonéale, deux injections) pendant maximum 1 heure. Concernant les tests liés au phénotype cardiaque: Les animaux seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes pour réaliser l'échographie et l'électrocardiogramme.
Impact sur les animaux
Selon les travaux issus de la littérature, les souris X-déficientes présentent une faiblesse musculaire et cardiaque aux âges étudiés. Dans cette étude, un nouveau modèle de souris X-déficiente sera étudié et des tests seront effectués pour confirmer le même profil observé dans la littérature. Les nuisances ou effets indésirables attendus causés par le retrait de la protéine X dans le modèle de souris X-déficiente sont les suivants : - Les animaux X- déficientes vont avoir une diminution de la motilité à 6 semaines de vie ainsi qu'une diminution de la contractilité musculaire à 13 semaines de vie à cause de la faiblesse musculaire dû à une perte de fonction de la protéine X. Au niveau cardiaque, à 6 semaines, elles vont développer une anomalie cardiaque qui va entraîner comme conséquence une diminution de la fonction cardiaque. Une diminution de la taille de la souris ainsi que du poids seront observées dès la sixième semaine. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests sont les suivants : -Pour le test de suspension et le test d'agrippement, la souris peut subir un léger stress. -Pour l’électrocardiographie, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l'anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la plateforme de l'échographie tout au long de l'expérience. -Pour l'échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l'électrocardiogramme, ce qui peut également entraîner un stress de courte durée -La mesure des propriétés contractiles musculaires est également réalisée sous anesthésie, pouvant provoquer une sécheresse oculaire au réveil. Concernant le perçage d'oreille des animaux à partir du 14ème jour après la naissance pour leur identification couplée au génotypage, ces animaux peuvent ressentir une douleur de courte durée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. Le phénotype cardiaque étudié est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.
Remplacement
Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer les dommages liés à cette lignée, à savoir 20 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles et femelles porteuses de la mutation). Les résultats obtenus des deux cohortes (souris sauvages et souris X-défcientes) seront utilisés pour deux procédures, ce qui permet une réduction du nombre de souris.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène X, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la maladie musculaire. Les symptômes de faiblesse musculaire et cardiaque liés à cette mutation apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 6 semaines et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette maladie. Les tests pour évaluer les signes musculaires et cardiaques ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l'Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.
La dérégulation du catabolisme de la phénylalanine favorise la sarcopénie
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Jeunes ou âgées de 23 mois, elles subissent un test de préhension où l'expérimentateur les tire par la queue contre une barre, un test de course forcée sur tapis roulant jusqu'à épuisement et un régime pauvre en phénylalanine, avant la mise à mort pour prélèvements. Le porteur n'attend guère d'effet indésirable hormis une possible perte de poids. Il affirme que la complexité de la sarcopénie ne peut être reproduite in vitro et qu'un organisme vivant vieillissant est requis.
Objectifs
La sarcopénie est la perte de masse musculaire et de force liée à l'âge. Il a été démontré que les personnes âgées ont des taux circulants élevés de l'acide aminé phénylalanine (un précurseur d'une gamme de molécules hautement bioactives). Des preuves récentes basées sur un examen du muscle squelettique de souris de type sauvage jeunes (âgées de 2 mois) et âgées (28 mois) ont montré que le muscle squelettique sarcopénique des souris âgées a une concentration de phénylalanine 30 % plus élevée que celle du muscle squelettique des jeunes souris. L'augmentation des niveaux de Phénylalanine (Phe) avec l'âge étant cruciale au l’objectif du projet est donc la réduction thérapeutique des taux plasmatiques de l’acide aminé essentiel développement Phénylalanine ( dans le but de rajeunir les muscles squelettiques des souris âgées.
Bénéfices attendus
Résultat attendu : La limitation alimentaire ou pharmacologique des taux circulants de Phe devrait améliorer la sarcopénie et la régénération des lésions musculaires squelettiques chez les souris âgées. Signification clinique : L'inversion thérapeutique de la sarcopénie a un potentiel clinique énorme étant donné le fardeau élevé de ce trouble qui reste à ce jour sans option de traitement.
Procédures
Test de préhension : La force de préhension des membres antérieurs sera mesurée à l'aide d'un dynamomètre électronique. Ce test profite de l'instinct murin pour saisir ce qu'ils peuvent en suspension. Nous entraînerons des souris à saisir une barre horizontale fixée au dynamomètre. Nous tirerons doucement la souris vers l'arrière par la queue dans une direction horizontale parallèle au dynamomètre et forcerons la souris à combattre la traction. Au fur et à mesure que la force que nous appliquons augmente progressivement, la souris finira par se détacher et cette force sera mesurée trois fois. Le test de force de préhension des membres antérieurs est un et indolore pour les souris, auquel elles s'habituent avec l'entraînement. Durée : 5 secondes. Nombre d'interventions: 3. Test sur tapis roulant : un test de course sur tapis roulant sera effectué pour évaluer la tolérance à l'exercice. Pendant deux jours consécutifs avant le test, les souris seront forcées d'effectuer un exercice adaptatif sur le tapis roulant à une vitesse de 10 m/min et un angle de pente de 0°. Le troisième jour, le test de fonctionnement réel sera effectué. La marche sera démarrée à 13 m/min avec un angle de pente de 0°, puis la vitesse et l'angle de pente seront augmentés de 2 m/min et 2° toutes les 3 min jusqu'à atteindre 39 m/min et 14°, respectivement. Lorsqu'une souris ne revient pas sur la piste pendant> 20 s et présente simultanément une réponse nettement diminuée à la charge de travail, elle sera retirée du tapis roulant et le temps de course sera enregistré. Durée : entre 2 et 75 minutes. Nombre d'intervention: 1.
Impact sur les animaux
Le régime pauvre en Phe ne devrait pas influencer la masse corporelle des animaux mais une surveillance hebdomadaire de la prise de poids s’en assurera. La perte de poids peut survenir dans de rares cas et sera donc surveillée visuellement en comparant aux autres animaux de la cage. En cas de doute un protocole de pesée sur 3 jours sera mis en place pour rechercher une perte de poids supérieure à 10-15%. Sinon, aucun effet indésirable n’est attendu lors de la réalisation des différentes procédures.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris seront mis es à mort afin de collecter les échantillons d'intérêt pour les nécessaire, et d'autres échantillons qui pourront potentiellement servir pour répondre à d'autre question dans des projets associés, cela permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le futur.
Remplacement
Notre étude utilisera 165 souris dans un total de 3 procédures expérimentales. Le nombre de souris à utiliser a été déterminé selon la règle des 3R : Remplacement : lorsque l'observation le permet, une approche de remplacement préliminaire utilisant des cultures cellulaires a été utilisée, ce qui remplace l’utilisation des animaux. L'évaluation de la sarcopénie chez la souris âgée et son inversion alimentaire ou pharmacologique ne peut cependant pas être remplacée par des modèles in vitro plus simples.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à notre étude a été calculé pour : - obtenir des résultats concluants basés sur l'expérience antérieure. - optimiser le nombre de souris utilisées (divers tests fonctionnels réalisés par deux équipes dont la nôtre sur les mêmes souris qui seront par la suite mises à mort avant de procéder à des cultures satellites primaires ou à des analyses tissulaires poussées - assurer la reproductibilité et la robustesse des observations. De plus, étant donné que les principaux effets du régime témoin sur la restriction alimentaire en Phe étaient indiscernables du régime conventionnel.
Raffinement
Plusieurs critères d'évaluation ont été définis pour chaque procédure. Tout signe de mauvaise tolérance au traitement (par exemple, perte de poids > 10 %, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) entraînera l'interruption de la procédure. Les animaux sont gardés en groupes sociaux leur permettant d'exprimer leurs besoins avec leurs compagnons et les cages seront enrichies d'une maison en plastique et de papier pour leur permettre de nicher. L'examen clinique des animaux sera effectué en fonction de la procédure.
Choix des espèces
Le développement de la sarcopénie est relativement rapide chez la souris en raison de sa courte durée de vie (durée de vie médiane : 28 mois). Les animaux seront utilisés à 2 mois et 23 mois d’âge, stades de jeune et vieil adulte dont les taux de Phe sont très différents du fait de leur différence d’âge. La complexité de la sarcopénie ne peut être reproduite in vitro, ce qui nécessite l'évaluation simultanée de modèles animaux pertinents. Nous avons l'intention d'évaluer le plus grand nombre possible de paramètres fonctionnels, structurels, moléculaires et métaboliques de nos souris. Nous avons choisi les souris pour de multiples raisons : 1) La sarcopénie étant un phénomène de fin de vie, nous avons besoin d'un organisme vivant dans lequel la sarcopénie se développe. Le développement de la sarcopénie est relativement rapide chez les souris en raison de leur courte durée de vie (durée de vie médiane : 28 mois). 2) Parmi les autres espèces, la souris est l'espèce la mieux caractérisée comme modèle expérimental de la sarcopénie. 3) Nous avons une expérience antérieure de traitements similaires chez la souris, ce qui nous aide à prévoir les pièges potentiels. 4) Si nos études identifient des noeuds cruciaux, dont le ciblage peut prévenir/réverser la sarcopénie, il est plus facile d'utiliser le génie génétique chez la souris que chez d'autres espèces. 5) L'évaluation in vivo comprendra la détermination simultanée de la fonction, de la structure et des conséquences cellulaires et moléculaires du muscle squelettique (toutes les procédures), tandis que dans la procédure 1, elle comprendra également la culture et le traitement des cellules satellites primaires. Cette évaluation multidimensionnelle permettra d'obtenir des informations mécanistes importantes sur la sarcopénie, qui n'a actuellement aucun traitement chez l'homme.
Développement de virus adeno-associé (AAVs) spécifiques pour cibler les cellules satellites du muscle squelettique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit des injections de virus adéno-associés, l'autre subit en plus une lésion musculaire provoquée par un composé chimique, avec mise à mort quinze à trente jours après. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable majeur". Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de prédire in vitro le tropisme réel des vecteurs viraux.
Objectifs
Le muscle squelettique est l'un des rares tissus chez les mammifères capables de régénérer complètement même à un âge avancé, grâce aux cellules souches, les cellules satellites. Afin d'améliorer l'efficacité des thérapies pour certaines maladies musculaires, il est important de pouvoir adresser les traitements vers les cellules satellites, cellules souches du muscle qui en sont la cible principale de ces traitements alors qu'elles résident dans un environnement où coexistent plusieurs autres types de cellules qui ne participent pas directement à la réparation du tissu musculaire. Nous allons utiliser des vecteurs viraux pour tester des séquences régulatrices de certains gènes myogéniques afin de créer des virus adeno-associés (AAVs) qui cibleront spécifiquement les cellules satellites du muscle squelettique pour l'expression des transgènes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Nous espérons développer des AAVs portant des séquences régulatrices qui permettront d'adresser par la suite des produits de thérapie génique spécifiquement dans les cellules satellites du muscle squelettique. L'idée est donc de faire des vecteurs qui vont donner une expression des transgènes thérapeutiques que dans des cellules satellites.
Procédures
Dans la procédure 1, la totalité des animaux (200) seront anesthésiés à 4 semaines sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%) et soumis à des injections d'AAV, puis mis à mort à 15 ou 30 jours après l'infection virale. Dans la procédure 2, les animaux de 8 semaines (100) subiront une lésion musculaire réalisée par injection intramusculaire d'un composé chimique puis une injection d'AAV avant d'être également mis à mort à 15 ou 30 jours après l'infection virale (voir annexe). Les prélèvements des muscles pour analyse seront réalisés en post-mortem.
Impact sur les animaux
Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte de l'injection des AAVs ou de lésion du muscle dans les souris. Les AAVs n'expriment qu'une protéine fluorescente, qui ne doit pas avoir un effet sur le comportement des souris. Le muscle lésé est complètement régénéré dans un mois, et ne pose pas de problème pour le mouvement des souris après quelques jours maximum. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. Donc, à ce jour, nous ne nous attendons pas à un phénotype associé à cette injection ou à la lésion en dehors d'un ciblage spécifique du type celllulaire d'intérêt.
Devenir
Tous les animaux injectés sont mis à mort pour analyse au plus tard 30 jours post-injection.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et/ou l’interaction entre de nombreux types cellulaires/tissus. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par les études in vitro. Même si les constructions AAV sont testées in vitro, on ne peut préfigurer du réel tropisme de ces vecteurs qu'en les testant dans l'animal vivant.
Réduction
Dans un but de réduire l’utilisation excessif d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 5 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires et obtenir des résultats significatifs pour des t-test de student en comparant deux groupes et pour des analyses ANOVA pour plus de deux groupes.
Raffinement
Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire et aussi pour l'injection des AAVs. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Tous les animaux qui présentent les signes anormaux décrits ci-dessus sont soumis à une mise à mort compassionnelle.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. D’abord, la souris est de petite taille ce qui réduit la quantité de virus qu’il faut utiliser, son élevage est facile et sa durée de vie compatible avec nos études. La souris est aussi un mammifère dont une bonne partide des séquences d’ADN que nous allons mettre dans les vecteurs viraux sont conservées ou très similaires. Donc si une séquence a une activité forte dans les cellules murines, il est très probable que cette activité sera maintenue dans les cellules humaines. Pour les souris utilisées en procédure 1, les vecteurs viraux seront injectés à l'âge de 4 semaines d’âge, lorsque le muscle est encore en croissance, parce que les cellules satellites sont plus accessibles au virus à ce stade. Dans la procédure 2, la régénération sera induite à l'âge de 8 semaines, quand la musculature est complètement formée pour que les vecteurs viraux ciblent cette fois les celllules satellites activées suite à la lésion.
Validation d’un dispositif implantable de thérapie cellulaire de la régénération ostéochondrale pour la prévention de l’arthrose précoce chez la brebis
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
16 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 13 tuées à l'issue et 3 rendues à l'élevage après un simple prélèvement de moelle. Les brebis opérées subissent sous anesthésie une ponction de moelle osseuse, l'implantation d'un dispositif dans le genou et des IRM, avant l'euthanasie pour prélever les condyles. Le porteur justifie l'augmentation des effectifs par le risque qu'un incident sur un seul animal "compromette le résultat de l'ensemble de l'étude". Il affirme qu'il n'y a "pas d'alternative non animale" pour étudier le cartilage articulaire et que le passage sur animal vivant est "indispensable".
Objectifs
Les pathologies ostéo-articulaires sont aujourd’hui un problème de santé publique dont la prévalence augmente avec l’augmentation de l’âge de la population avec plus de 10 millions personnes qui souffrent de l’arthrose en France aujourd’hui . Actuellement, les possibilités thérapeutiques proposées chez l’homme ne permettent pas de régénérer un tissu cartilagineux articulaire normal, et de ce fait, sont incapables de restaurer la fonction de l’articulation. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité de ce biomatériau en termes de régénération tissulaire et avons également confirmé ces résultats après implantation chez le petit rongeur. Une étude in vitro réalisée sur le modèle ovin a permis de montrer l'efficacité de notre implant associé une autogreffe de cellules souches mésenchymateuses autologues pour la régénération de lésions ostéocartilagineuses. Dans l’étude actuelle, nous souhaitons confirmer ces résultats chez la brebis, en utilisant le même modèle d’étude que précédemment pour la régénération cartilagineuse avec comme différence l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses (CSM) allogéniques de brebis et d’une membrane déposée en superficie du matériau composite utilisé dans l’étude précédente, au niveau de lésions intra-articulaires du genou. Nous avons développé des biomatériaux résorbables hybrides dans le but de régénérer à la fois le tissu ostéochondral mais également le cartilage articulaire. Ces matériaux sont d’une part nanofibreux et équipés de nanoréservoir contenant de l’hydroxyapatite, pour régénérer l’os sous-chondral et d’autre part, ils sont recouverts d’un hydrogel d’alginate contenant des CSM allogéniques pour la réparation du cartilage articulaire en surface. Une couche superficielle supplémentaire nanofibreuse contenant de la chondroitine sulfate et de l’acide hyaluronique vient recouvrir l’ensemble du biomatériel dans certains groupes à tester. L’hypothèse est que les données apportées par cette étude nous permettrons ainsi de confirmer le potentiel de réparation ostéo-chondrale de ces biomatériaux associés à des CSM allogèniques. L’objectif de cette étude sera d’évaluer l’efficacité sur la régénération du cartilage articulaire de ces implants hybrides.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu à court terme est la validation de l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques dans la réparation des lesions du cartlilage articulaire chez la brebis. Ce travail fera l’objet d’une publication. Le bénéfice à long terme concerne essentiellement l’être humain. Le but est de traiter les lésions cartilagineuses pour éviter qu’elles aboutissent à une arthrose évoluée nécessitant une intervention de type prothèse. Ce serait un bénéfice (une économie) en termes de coût de la santé. Il est nécessaire de tester cette hypothèse sur un modèle gros animal avant de proposer ce type de traitement chez l’être humain (principe de précaution) car les tests sur des petits animaux ne sont pas transposables pour des raisons évidentes de taille, d’anatomie et donc de contraintes mécaniques. Les principaux avantages de l’utilisation de cellules allogéniques par rapport aux cellules autologues sont : a/ d’éviter le prélévement de moelle osseuse 2 à 3 semaines avant l’intervention sur le cartilage b/ de pouvoir administrer un nombre connu à l’avance de cellules.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sur animaux vigiles. Tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. 3 procédures seront utilisées .1. ponction de moelle osseuse (5 min). 2. intervention pour implantation du dispositi (45 min). 3. IRM (3 x15 min)
Impact sur les animaux
Une intervention sur les genoux et douleur post-opératoire au niveau des genoux opérés, traitée par antalgiques adaptés. Tout geste sur une articulation peut entraîner des complications : -Anesthésiques : difficultés à l’intubation, troubles du rythme cardiaque etc … Moyens mis en œuvre = surveillance permanente de l’animal -Per-opératoires : pas de complications per-operatoires prévisibles car - pas de risque de hémorragique puisqu’on est à distance des gros vaisseaux qui sont à la face postérieure du genou. L’hémostase des petits vaisseaux sera faite au bistouri électrique et la brebis n’est pas sous anticoagulant. - Pas de risque de fracture car aucune contrainte sur l’os, seul un geste sur le cartilage - Post-opératoires : comme pour tout geste chirurgical sur une articulation les risques sont : - Une douleur post-opératoire, qui n’est pas certaine mais dont la présence sera détectée par l’observation de l’animal - Un retard de cicatrisation : surveillance quotidienne - Infection : surveillance quotidienne et geste chirurgicale adapté si nécessaire ou euthanasie Déambulation libre en box de 3,5 m x 3,5 m pendant la période de cicactrisation puis jusqu’au 6ème mois, Déambulation quotidienne sur un périmétre plus large.
Devenir
Les 3 brebis prévues pour le prélèvement de moelle osseuse, pourront être replacées dans l’élevage. Ce prélèvement ne modifie en rien leur état. Les 7 brebis opérées devront être euthanasiées pour pouvoir prélever les condyles en vue de l’analyse des implants et de leur effets sur la régénération du cartilage, ainsi que les 6 brebis surnuméraires (3 déjà autorisées, et 3 demandées dans cet avenant).
Remplacement
Ce protocole d’étude respecte la règle des trois R de l’expérimentation animale (Replacement, Reduction, Refinement) grâce à la possibilité d’imagerie non invasive de l’IRM qui permet de suivre l’évolution des lésions sans avoir à faire de prélèvement chez l’animal. L’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques évite une anesthésie supplémentaire car il n’est plus nécessaire de prélever de moelle osseuse autologue. Il n’y a pas d’alternative non animale pour étudier le cartilage articulaire. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité des implants 3D des chondro-, ostéo-inducteurs et des CSM en termes de régénération ostéochondrale. La principale limite des études-in vitro est l’absence de contrainte biomécanique et son effet sur l’implant et la cicatrisation. Le passage sur animal vivant est ensuite indispensable pour valider notre approche. Il n’est actuellement pas légal de tester chez l’homme une technique innovante sans l’avoir testé chez l’animal quand cela est possible (principe de précaution)
Réduction
Une première étude a été faite sur ce même schéma avec 4 brebis mais en utilisant des CSM autologues, confirmant leur utilité dans la réparation des lésions cartilagineuses.
Raffinement
Dans le protocole actuel le même schéma est reproduit avec comme différence l’utilisation des CSM allogéniques et dans un des groupes une membrane superficielle sensée améliorer la cicatrisation du cartilage. Les 4 brebis de la première étude (opérées des 2 genoux) ont pu être toutes suivies jusqu’au terme de l’expérimentation, ce qui a permis de valider le concept de l’implant utilisé. Cependant sur un aussi petit effectif un incident (problème à l’anesthésie, mauvaise récupération post-opératoire, infection du site opératoire) la perte d’un seul animal peut compromettre le résultat de l’ensemble de l’étude et donc finalement avoir inclus inutilement les autres animaux. Pour pallier cela et augmenter les chances d’atteindre les objectifs scientifiques il est prévu d’augmenter le nombre d’animaux à 7 brebis minimum pour pallier aux éventuels incidents rendant inexploitable une implantation chez l’un des animaux. 3 brebis supplémentaires ont déjà été autorisées afin de comparer l’efficacité des cellules allogénique du premier groupe aux cellules autologues de ce nouveau groupe. 3 de plus font l'objet de cet avenant, afin de tester le même implant avec des cellules autologues (provenant des 3 brebis de l’avenant d’octobre 2022) et allogéniques sur 6 brebis (les 3 brebis ayant fourni les cellules, et 3 brebis supplémentaires faisant l’objet de cet avenant) en induisant l'arthrose à l'aide d'une curette. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante, difficulté à se déplacer ; - Fièvre, abattement, polynée en cas d’infection post opératoire.
Choix des espèces
La brebis est le modèle gros animal reconnu pour l’étude de l’arthrose. Les brebis agées de 2 à 4 ans sont le modèle animal utilisé habituellement dans les autres études sur le cartilage. Pour ne pas induire une variable supplémentaire par rapport aux études existantes il a été décidé de conserver ce sexe et cette tranche d’age .
Utilisation de la transplantation mitochondriale dans l’ischémie-reperfusion périphérique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
30 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles subissent une anesthésie générale de quatre heures, pour deux tiers d'entre elles couplée à une chirurgie, et une partie voit l'apport d'oxygène du membre postérieur coupé pendant deux heures pour provoquer une ischémie-reperfusion. L'étude teste la transplantation de mitochondries comme moyen de limiter les lésions, avec en perspective déclarée un traitement adjuvant chez les patients menacés d'amputation. Le porteur indique travailler sur un modèle cellulaire dont les premiers résultats ne sont "pas concluants", et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
L’ischémie, définie par l’arrêt de l’apport sanguin artériel dans un territoire donné, entraîne une inadéquation entre les apports et les besoins de la cellule pour son fonctionnement et sa survie (i.e. apports en oxygène et en nutriments). La reperfusion, correspondant à la restauration de l’apport sanguin artériel nécessaire aux besoins de la cellule, est indispensable mais va paradoxalement provoquer des lésions supplémentaires avec une aggravation de l’état initial (dont la lésion la plus connue est une augmentation de la mort cellulaire). Les mécanismes contribuant aux lésions d’ischémie-reperfusion sont multifactoriels et complexes, mais la dysfonction des mitochondries (centrale énergétique de l'organisme), le stress oxydant et l’inflammation jouent un rôle majeur. Toute la problématique actuelle est de développer des stratégies permettant de lutter contre les effets délétères de l’ischémie-reperfusion. Nous avons ainsi développé des stratégies diverses dont la transplantation mitochondriale, qui a été développée dans l’ischémie-reperfusion cardiaque mais n’est actuellement pas appliquée au niveau des membres inférieurs. Dans ce contexte, l’objectif du présent projet est de développer la transplantation mitochondriale comme stratégie de prévention des effets délétères de l’ischémie-reperfusion périphérique.
Bénéfices attendus
Malgré l’influence des mitochondries dans les dommages engendrés par l’ischémie-reperfusion, peu de travaux se sont intéressés aux effets potentiellement protecteurs d’une transplantation mitochondriale afin de limiter le stress et les dommages engendrés par l’ischémie-reperfusion. Les applications potentielles de la transplantation mitochondriale dans de nombreux domaines thérapeutiques sont importantes. D’un point de vu clinique, la transplantation mitochondriale est un traitement qui pourrait être instauré chez les patients en adjonction à la revascularisation, pour pallier au déconditionnement musculaire lié à l’ischémie critique du membre inférieur. Le pronostic fonctionnel des patients en ischémie critique est extrêmement sombre, car 50% des patients nécessitent une amputation majeure à 1 an de l’évolution initiale de la maladie. Le développement de stratégies permettant de réduire le déconditionnement musculaire permettrait d’améliorer le pronostic fonctionnel des patients, et potentiellement de proposer un traitement aux patients non revascularisables. Cette technique thérapeutique est « simple » puisqu’elle repose sur un isolement de mitochondries afin de les adresser localement au tissu endommagé.
Procédures
Dans notre étude, un groupe qui servira de témoin sera soumis à une anesthésie générale de 4 heures. Deux autres groupes seront soumis à une anesthésie générale couplée à une chirurgie d'une durée de 4 heures.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux sera soumise à une diminution transitoire des apports en oxygène dans le membre postérieur pendant 2 heures. Cette procédure représente l'objet de notre étude et ne peut par conéquent pas être supprimée.
Devenir
Mise à mort des animaux à l'issue de la procédure pour prélèvement des tissus nécessaire à nos études sur la mitochondrie.
Remplacement
Notre équipe travaille actuellement sur un modèle in vitro (modèle cellulaire) d'anoxie-reoxygénation qui permettrait d'étudier les mécanismes sans avoir recours à l'expérimentation animale. Néanmoins, les premiers résultats sur ce modèle ne sont pas concluants et, par conséquent, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro permettant d’évaluer l’impact de l’ischémie reperfusion sur la dysfonction mitochondriale et les potentiels effets bénéfiques d’une transplantation de mitochondries. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d’étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés sur des modèles ex vivo ou in silico. Afin de mieux comprendre les avantages de la transplantation mitochondriale, il semble pertinent de considérer les organes dans leur intégralité et dans des conditions expérimentales les plus proches possibles des conditions physiologiques afin de potentiellement transférer ce modèle en clinique. Par conséquent, l’utilisation du modèle animal est indispensable à la réalisation de ce protocole.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés à leur hébergement 10 jours avant le début des expérimentations. Les animaux sont répartis en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Les animaux seront suivis quotidiennement pour détecter tout signe de malêtre et des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie et les animaux seront maintenus à température grâce à un tapis chauffant.
Choix des espèces
Notre équipe a développé les différents modèles d’ischémie-reperfusion sur la souris afin d’éviter de réaliser des expérimentations sur des gros animaux et pour avoir la possibilité de pouesuivre no travaux sur des modèles de souris génétiquement modifiées pour explorer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Les souris seront âgées de 9 à 15 semaines pour qu’elles aient un poids d’environ 30 grammes. Nous avons choisi de travailler sur des souris jeunes afin d’exclure tout impact du vieillissement sur les paramètres analysés dans notre étude. Il est de même pour le poids, nous avons choisi de travailler sur des souris de 30 afin d’exclure un potentiel impact de l’obésité (accumulation de masse graisseuse) qui pourrait également impacter nos résultats.