Système musculosquelettique

1 060 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent un prélèvement d'un à deux millimètres de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, l'administration de molécules candidates par l'eau ou par injection, et un test comportemental de tunnel de nage prolongé jusqu'à la fatigue de l'animal. Ce projet est le volet jumeau d'une même étude sur une maladie neuromusculaire humaine sans traitement curatif, et le porteur affirme qu'un essai dans un "organisme entier" est nécessaire, l'in vitro ne permettant pas d'étudier le comportement. Tous les poissons sont tués pour des analyses post-mortem.

Objectifs

Ce projet s’intéresse à une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène entrainant des troubles moteurs chez les patients dès l’enfance. Deux modèles poisson zèbre de la pathologie ont été créés et présentent les défauts de motilité au stade larvaire. Des molécules ont été identifiées comme capables de restaurer la motilité à ce stade de développement. Le premier objectif du projet est de définir s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la maladie. Le deuxième est de déterminer si les molécules ont un potentiel thérapeutique lorsqu’elles sont administrées à un stade présymptomatique ou symptomatique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale en permettant de déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie. Il s’inscrit également dans une démarche de recherche translationnelle puisqu’il permettra de déterminer quelle fenêtre de temps est adéquate pour le traitement.

Procédures

- Génotypage par prélèvement d’une petite partie de la nageoire caudale (1 – 2 mm) sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 15mn) : réalisé 1 fois – concerne 240 poissons - Administration de molécules candidates au stade développemental (durée d’administration de 8 à 48 heures post-fertilisation) directement dans l’eau : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Administration de molécules thérapeutiques au stade adulte par injection sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 20mn) : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Test du tunnel de nage sur animal vigile (Durée totale : 9 x 15mn) : réalisé 1 seule fois – concerne tous les poissons

Impact sur les animaux

Le génotypage des poissons par fin clip (prélèvement de 1 à 2 mm de la nageoire caudale) se fera à 4 mois sous anesthésie générale. La nageoire se reconstituant au cours du temps, il s’agit d’un acte pour lequel aucun effet indésirable n’est attendu (durée totale comprenant balnéation, prélèvement et réveil : 20mn – stress faible). Avant de réaliser le test du tunnel de nage, chaque individu est placé dans le tunnel de nage (phase d’habituation – durée : 15h) avec mise à jeun pour éviter toute contamination de l’eau avec les déjections et une altération des performances de nage. Le tunnel de nage (durée : 9 x 15mn – stress moyen) se déroule sur animal vigile dans un environnement proche de son habitacle naturel (faible court d’eau, oxygénation) et s’arrête dès lors que l’animal est fatigué, visualisé par le recul de l’animal dans le tunnel. L’administration des molécules thérapeutiques au stade développemental se fera par balnéation (durée : 40h – stress faible). L’administration des molécules thérapeutiques au stade adulte se fera par injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (durée totale comprenant balnéation, injection et réveil : 20mn – stress faible). Les molécules thérapeutiques ne devraient apriori n’avoir aucun effet indésirable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issu de chaque procédure pour permettre des analyses post-mortem.

Remplacement

Le projet vise à déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie par analyse comportementale, et de déterminer le potentiel thérapeutique de molécules candidates sur les défauts moteurs de deux modèles poisson zèbre de la maladie. Les modèles in vitro ne permettant pas d’étuder le comportement, seul le modèle animal est donc possible. Le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce projet puisque son système neuromusculaire est similaire à celui de l’Homme et fonctionnel au stade larvaire. De plus, l’utilisation de molécules candidates nécessite en première intention un essai dans un organisme entier. La formulation et l’administration de ces molécules sont simplifiées chez le poisson zèbre par rapport aux mammifères.

Réduction

Le projet est mené sur un nombre d’animaux réduit tout en permettant une analyse statistique suffisante. L’unique procédure de ce projet repose sur un test comportemental (tunnel de nage) qui permet d’évaluer les performances de nage dans un couloir qui reproduit le flux d’eau des habitats naturels. Un seul test par animal suffit à déterminer différents paramètres (temps de nage, distance de nage, vitesse de nage…) qui sont quantifiés par analyses statistiques. L’expérience indique qu’il est nécessaire d’avoir 20 animaux par condition. Le criblage pharmacologique effectué dans une étude antérieure in vivo nous permet également de réduire le nombre de molécules candidates à tester et donc le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les modèles poissons utilisés dans le projet permettent un élevage en conditions d’hébergement standards avec une surveillance quotidienne. Le temps entre le prélèvement de la nageoire caudale pour génotypage (4 mois) et le test du tunnel (6 mois) de nage permet de laisser le temps à la nageoire de se régénérer et de permettre une performance de nage optimale pour nos poissons. Les conditions du test comportemental sont proches de celles de son habitat naturel et des points limites adaptés ont été déterminés en amont pour éviter toute souffrance à l’animal. Dans le cas de l’injection intrapéritonéale, les animaux seront mis à jeun 24h avant pour permettre la rapidité du geste.

Choix des espèces

Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et d’organisme entier. Il permet également de tester des approches pharmacologiques grâce à une formulation et administration simplifiées. L’étude de nos modèles a permis de démontrer des défauts moteurs durant les stades de développement. Il est maintenant nécessaire d’évaluer le phénotype au stade adulte pour considérer la robustesse de nos modèles, et de valider l’effet bénéfique de nos molécules candidates au regard de la pathologie humaine. Notre projet vise à déterminer si l’absence d’expression du gène causant la maladie durant le développement conduit à un phénotype moteur lors d’une stimulation (épreuve motrice) chez l’adulte. Pour cela, les poissons passeront le test du tunnel de nage à 6 mois, considéré comme stade adulte. Notre projet a également pour but de déterminer l’effet bénéfique de molécules candidates à deux temps différents, au stade développemental et au stade adulte. Les poissons seront donc traités avec les molécules candidates soit durant le développement (2 jours), soit à 4 mois.

1 060 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent un prélèvement d'un à deux millimètres de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, l'administration de molécules candidates par l'eau ou par injection, et un test comportemental de tunnel de nage prolongé jusqu'à la fatigue de l'animal. Le projet porte sur une maladie neuromusculaire humaine sans traitement curatif, et le porteur affirme qu'un essai dans un "organisme entier" est nécessaire, l'in vitro ne permettant pas d'étudier le comportement. Tous les poissons sont tués pour des analyses post-mortem.

Objectifs

Ce projet s’intéresse à une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène entrainant des troubles moteurs chez les patients dès l’enfance. Deux modèles poisson zèbre de la pathologie ont été créés et présentent les défauts de motilité au stade larvaire. Des molécules ont été identifiées comme capables de restaurer la motilité à ce stade de développement. Le premier objectif du projet est de définir s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la maladie. Le deuxième est de déterminer si les molécules ont un potentiel thérapeutique lorsqu’elles sont administrées à un stade présymptomatique ou symptomatique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale en permettant de déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie. Il s’inscrit également dans une démarche de recherche translationnelle puisqu’il permettra de déterminer quelle fenêtre de temps est adéquate pour le traitement.

Procédures

- Génotypage par prélèvement d’une petite partie de la nageoire caudale (1 – 2 mm) sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 15mn) : réalisé 1 fois – concerne 240 poissons - Administration de molécules candidates au stade développemental (durée d’administration de 8 à 48 heures post-fertilisation) directement dans l’eau : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Administration de molécules thérapeutiques au stade adulte par injection sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 20mn) : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Test du tunnel de nage sur animal vigile (Durée totale : 9 x 15mn) : réalisé 1 seule fois – concerne tous les poissons

Impact sur les animaux

Le génotypage des poissons par fin clip (prélèvement de 1 à 2 mm de la nageoire caudale) se fera à 4 mois sous anesthésie générale. La nageoire se reconstituant au cours du temps, il s’agit d’un acte pour lequel aucun effet indésirable n’est attendu (durée totale comprenant balnéation, prélèvement et réveil : 20mn – stress faible). Avant de réaliser le test du tunnel de nage, chaque individu est placé dans le tunnel de nage (phase d’habituation – durée : 15h) avec mise à jeun pour éviter toute contamination de l’eau avec les déjections et une altération des performances de nage. Le tunnel de nage (durée : 9 x 15mn – stress moyen) se déroule sur animal vigile dans un environnement proche de son habitacle naturel (faible court d’eau, oxygénation) et s’arrête dès lors que l’animal est fatigué, visualisé par le recul de l’animal dans le tunnel. L’administration des molécules thérapeutiques au stade développemental se fera par balnéation (durée : 40h – stress faible). L’administration des molécules thérapeutiques au stade adulte se fera par injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (durée totale comprenant balnéation, injection et réveil : 20mn – stress faible). Les molécules thérapeutiques ne devraient apriori n’avoir aucun effet indésirable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issu de chaque procédure pour permettre des analyses post-mortem.

Remplacement

Le projet vise à déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie par analyse comportementale, et de déterminer le potentiel thérapeutique de molécules candidates sur les défauts moteurs de deux modèles poisson zèbre de la maladie. Les modèles in vitro ne permettant pas d’étuder le comportement, seul le modèle animal est donc possible. Le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce projet puisque son système neuromusculaire est similaire à celui de l’Homme et fonctionnel au stade larvaire. De plus, l’utilisation de molécules candidates nécessite en première intention un essai dans un organisme entier. La formulation et l’administration de ces molécules sont simplifiées chez le poisson zèbre par rapport aux mammifères.

Réduction

Le projet est mené sur un nombre d’animaux réduit tout en permettant une analyse statistique suffisante. L’unique procédure de ce projet repose sur un test comportemental (tunnel de nage) qui permet d’évaluer les performances de nage dans un couloir qui reproduit le flux d’eau des habitats naturels. Un seul test par animal suffit à déterminer différents paramètres (temps de nage, distance de nage, vitesse de nage…) qui sont quantifiés par analyses statistiques. L’expérience indique qu’il est nécessaire d’avoir 20 animaux par condition. Le criblage pharmacologique effectué dans une étude antérieure in vivo nous permet également de réduire le nombre de molécules candidates à tester et donc le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les modèles poissons utilisés dans le projet permettent un élevage en conditions d’hébergement standards avec une surveillance quotidienne. Le temps entre le prélèvement de la nageoire caudale pour génotypage (4 mois) et le test du tunnel (6 mois) de nage permet de laisser le temps à la nageoire de se régénérer et de permettre une performance de nage optimale pour nos poissons. Les conditions du test comportemental sont proches de celles de son habitat naturel et des points limites adaptés ont été déterminés en amont pour éviter toute souffrance à l’animal. Dans le cas de l’injection intrapéritonéale, les animaux seront mis à jeun 24h avant pour permettre la rapidité du geste.

Choix des espèces

Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et d’organisme entier. Il permet également de tester des approches pharmacologiques grâce à une formulation et administration simplifiées. L’étude de nos modèles a permis de démontrer des défauts moteurs durant les stades de développement. Il est maintenant nécessaire d’évaluer le phénotype au stade adulte pour considérer la robustesse de nos modèles, et de valider l’effet bénéfique de nos molécules candidates au regard de la pathologie humaine. Notre projet vise à déterminer si l’absence d’expression du gène causant la maladie durant le développement conduit à un phénotype moteur lors d’une stimulation (épreuve motrice) chez l’adulte. Pour cela, les poissons passeront le test du tunnel de nage à 6 mois, considéré comme stade adulte. Notre projet a également pour but de déterminer l’effet bénéfique de molécules candidates à deux temps différents, au stade développemental et au stade adulte. Les poissons seront donc traités avec les molécules candidates soit durant le développement (2 jours), soit à 4 mois.

634 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 510 d'entre elles subissent une ovariectomie pour induire une ostéoporose, d'autres reçoivent des injections sous-cutanées ou intrapéritonéales répétées, et toutes une ponction intracardiaque au moment de la mise à mort pour prélever le sang et les organes. Le porteur affirme que l'ovariectomie n'affecte pas le bien-être des animaux non-humains hormis un stress chirurgical transitoire, et fixe un point limite de mise à mort à 15 % de perte de poids. Sur le remplacement, il décrit les rares lignées cellulaires disponibles comme incapables de reproduire la diversité des ostéoclastes et conclut que le recours à la souris reste "indispensable".

Objectifs

L'ostéoporose est une pathologie liée à la chute des estrogènes à la ménopause ou à certaines maladies inflammatoires. Elle est caractérisée par une diminution de la masse osseuse due à une différenciation accrue des ostéoclastes, cellules responsables de la dégradation de la matrice osseuse. Ces cellules ont été longtemps considérées comme une population unique de cellules et les thérapies actuelles bloquent de façon globale l'activité des ostéoclastes. Elles sont efficaces, mais à long terme, elles ont des effets néfastes (os de mauvaise qualité, risque accru de fracture). De nouvelles approches thérapeutiques sont donc nécessaires. Il a été récemment démontré qu’il existe plusieurs populations d'ostéoclastes qui ont des propriétés et des fonctions différentes. Notre but est donc de caractériser ces différentes populations d'ostéoclastes en condition normale ou ostéoporotique pour déterminer quels ostéoclastes sont responsables de la destruction osseuse pathologique associée à l’ostéoporose. Cela pourrait conduire à des thérapies ciblées sur ces ostéoclastes pathologiques, sans affecter les autres. Ce projet aura donc des retombées importantes pour l’ostéoporose et les maladies inflammatoires associées à une perte osseuse. Nous travaillerons sur 2 modèles bien caractérisés et largement étudiés, l'ostéoporose post-ménopausique induite chez la souris femelle par ovariectomie, et la destruction osseuse inflammatoire induite par injection sous-cutanée au niveau de la calvaria (os supérieur du crâne) de facteurs stimulant la formation des ostéoclastes. Ces 2 modèles ont déjà permis de caractériser certaines propriétés des ostéoclastes conservées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris normales commerciales et des souris génétiquement modifiées, déficientes pour le métabolisme du glucose (pfkb3) car nos résultats in vitro suggèrent que les populations d'ostéoclastes diffèrent dans leur capacité à utiliser et métaboliser le glucose, ce qui peut impacter leur fonction. Cela nous permettra de déterminer si la modulation du métabolisme du glucose peut réduire les ostéoclastes pathologiques in vivo dans le contexte de la destruction osseuse.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre la diversité des ostéoclastes chez un individu normal ou ayant une destruction osseuse. Cette diversité a été identifiée très récemmment et est très peu documentée dans la litérature. C'est donc un projet original qui apportera des connaissances très nouvelles sur la biologie des ostéoclastes. Identifier les sous-populations d'ostéoclastes qui sont spécifiquement impliquées dans la destruction osseuse pourra à terme permettre d'améliorer les traitements des pertes osseuses en ciblant de façon spécifique ces ostéoclastes pathologiques sans affecter ceux responsables du remodelage osseux physiologique. Enfin, de nombreuses maladies sont associées à une destruction osseuse (rhumatismes inflammatoires, tumeurs osseusesn et autres maladies inflammatoires). Nos résultats pourront donc avoir des conséquences plus larges que l'ostéoporose post-ménauposique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale pour induire une ostéoporose par ovariectomie. L’intervention (temps d’anesthésie) dure environ 15 minutes. Cela concerne 510 animaux qui seront opérés une seule fois. Les animaux recevront également des injections sous-cutanées de quelques secondes, soit 1 seule fois pour 96 animaux, soit 2 fois par jour pendant 3 jours consécutifs pour 48 animaux. Tous les animaux recevront des injections intrapéritonéales, soit une seule fois au moment de la mise à mort pour 144 animaux, soit 2 fois (une au moment de la chirurgie et une au moment de la mise à mort) pour les 510 animaux soumis à la procédure de chirurgie. Enfin ils seront également soumis une seule fois à une ponction intracardiaque de 2-3 minutes après anesthésie pour collecter le sang. Cela concerne tous les animaux au moment de la mise à mort.

Impact sur les animaux

L'ovariectomie est le modèle standard d'ostéoporose utilisé en recherche. En dehors de l'acte chirurgical qui peut induire un stress transitoire, elle n'affecte pas le bien-être des animaux. La perte osseuse résultante n'induit pas de souffrance et est observable après 3 semaines. Dans quelques cas, il peut y avoir une mauvaise cicatrisation de la plaie. La perte osseuse locale induite par injection sous-cutanée au niveau de la calvaria de facteurs stimulant les ostéoclastes est aussi un modèle validé. En dehors de l'injection sous-cutanée elle-même qui peut induire un stress très transitoire, elle n'affecte pas le bien-être des animaux et la perte osseuse résultante n'induit pas de souffrance. Elle est observée 5 jours après l'injection et est localisée à la calvaria. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons n'ont pas de phénotype dommageable (viabilité, poids, comportement et reproduction normaux). Nos résultats préliminaires montrent que les ostéoclastes pathologiques sont présents en très faible proportion chez les souris normales. Leur phénotype n'a donc pas d'incidence sur les animaux

Devenir

Tous les animaux dans chacune des procédures seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes pour l'analyse du phénotype et de la fonction des ostéoclastes et de leurs progéniteurs, ainsi que pour la mise en culture de cellules primaires.

Remplacement

L’existence de plusieurs populations d’ostéoclastes n’a été mise en évidence que très récemment et les rares lignées de cellules disponbles pour étudier les ostéoclastes ne reproduisent pas leur diversité et ne permettent pas d'analyser leur interaction avec leur environnement. Elles ne reproduisent pas non plus le phénotype des ostéoclastes pathologiques. L'utilisation d'ostéoclastes primaires issus de souris saines ou ayant une destruction osseuse reste donc indispensable. De plus, étant donné la complexité des mécanismes impliqués, aborder ce problème seulement par des analyses in vitro n'est pas suffisant et le recours à des modèles animaux est lui aussi indispensable. Pour l’instant, aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Cependant, nos résultats pourraient permettre à terme d’améliorer ces modèles in vitro en les modifiant génétiquement grâce aux marqueurs et autres caractéristiques que nous identifierons pour qu'ils reproduisent les différentes sous-populations d'ostéoclastes. Si cela est possible, cela permettrait à terme de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de ces cellules en condition normale et pathologique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé au plus juste en fonction du nombre de cellules nécessaire aux différentes analyses et d'une évaluation statistique, en tenant compte de pertes éventuelles afin de ne pas avoir à répéter inutilement les procédures, et avec le nombre de souris minimum par groupe. Pour l'évaluation statistique, nous avons utilisé le test G*power qui permet d'estimer le nombre d'animaux nécessaires en fonction des différences attendues sur la base de nos expériences antérieures et des résultats de la littérature. Chaque animal inclus dans l'analyse est utilisé de façon optimale pour permettre l'analyse simultanée d'un maximum de paramètres et réduire encore le nombre d'animaux. Nous ne produisons ni ne commandons plus d'animaux que ceux nécessaires à chaque expérience. Enfin, l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux

Raffinement

Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Pour réduire au maximum la souffrance des animaux, une grille de score a été établie pour le suivi des animaux avec des critères bien définis pour détecter tout signe de souffrance et des points limites bien définis. La procédure d'ovariectomie inclut un traitement pré-opératoire par un analgésique (buprénorphine), et un suivi post-opératoire selon la grille de score présentée en annexe. Un antalgique sera administré si les animaux présentent des signes de souffrance. Si ces signes ne disparaissent pas, comme indiqué dans la grille de score, ils seront mis à mort par dislocation cervicale. Si le score atteint la limite de 6 (point limite) les animaux seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale. Les animaux ovariectomisés seront pesés toutes les semaines car l'ovariectomie est caractérisée par une prise de poids modérée (environ 10%). Si au contraire une diminution du poids est observée, les animaux seront pesés 2 fois par semaine et s’ils présentent une perte de 15% par rapport à leur poids au jour 0, ils seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale (point limite).

Choix des espèces

Nos résultats précédents, ainsi que la majorité des données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons, ont été obtenus chez la souris. Nous allons travailler par analogie avec ces résultats dans la continuation de nos travaux précédents. Les données de la littérature montrent que les deux modèles utilisés (ovariectomie et modèle calvaria) ont permis de générer des données qui ont ensuite été validées chez les patients (sur d'autres questions touchant les ostéoclastes). Enfin, il existe déjà des modèles de souris génétiquement modifiées dont l'utilisation permettra de répondre à certaines de nos questions. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des animaux au stade adulte, entre 6 et 12 semaines. A ce stade le système osseux des souris est mature et c'est le stade auquel nous avons déjà travaillé dans nos études précédentes.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une double injection d'une solution qui dégrade l'articulation du genou pour provoquer une arthrose, puis une injection de la thérapie testée, avant d'être tué pour prélever le genou. Le projet vise à évaluer une combinaison de cellules-médicament et d'une molécule anti-vieillissement chez des souris jeunes et âgées, les bénéfices pour les patients arthrosiques restant formulés au conditionnel. Sur le remplacement, le porteur affirme que les organoïdes et les organes sur puce sont des pistes prometteuses mais encore trop peu maîtrisées pour remplacer le modèle animal.

Objectifs

L’arthrose est la maladie la plus répandue en rhumatologie. Elle consiste en une dégradation progressive du cartilage pour laquelle, aucun traitement curatif n’est disponible. Parmi les propositions thérapeutiques applicables à l’arthrose, l’injection de cellules-médicament dans le genou a démontré des effets prometteurs chez le modèle de souris d’arthrose traumatique. Néanmoins, les essais cliniques chez les patients arthrosiques âgés n’ont présenté que des résultats très limités. Dans de nombreuses pathologies liées à l’âge telle que l’arthrose, il a été démontré que les tissus âgés malades accumulaient des cellules dites « sénescentes ». Ces dernières sont responsables de la dégénérescence du tissu, et peuvent induire le vieillissement prématuré des cellules environnantes par effet domino. In- vitro, ce même profil de sécrétion a un impact négatif sur les propriétés régénératrices des cellules-médicament. L’environnement articulaire du sujet âgé pourrait donc expliquer le manque d’efficacité de ces thérapies cellulaires chez le patient arthrosique. Cependant, à notre connaissance, aucune étude concernant ce dernier aspect n’a été menée dans le cas de l’arthrose chez la souris âgée. Au laboratoire, nous avons pu démontrer in- vitro que la combinaison d’agents anti-vieillissement cliniquement approuvés et de cellules-médicament, induisait des effets synergiques favorables à la régénération du cartilage. Ce projet de 2 ans a pour but d’étudier in- vivo, l’action d’une telle combinaison afin de développer une biothérapie 2.0 pour le traitement de l’arthrose du sujet âgé. Nous proposons : 1- d’identifier la présence de cellules sénescentes dans un modèle d’arthrose induite par la collagénase chez les souris jeunes et âgées, 2- d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’une combinaison cellules-médicament/médicament anti-vieillissement, 3- de déterminer l’impact de l’âge sur ces mêmes conditions.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont multiples. Dans un premier temps, il permettrait d’évaluer les propriétés thérapeutiques, de manière séparée ou combinée, d’une drogue anti-vieillissement et de cellules-médicament, sur un modèle expérimental et maitrisé d’arthrose. Ensuite, ce projet permettrait une étude de l’effet de l’âge de la souris sur l’efficacité des thérapies cellulaires. Nous envisageons une perte du potentiel de nos cellules-médicament chez la souris âgée, qui pourrait être contrebalancée par l’action d’une molécule anti-vieillissement. En effet, nous avons démontré in- vitro que ce type de drogue réduit l’impact négatifs des cellules sénescentes, favorise la régénération et accroit les propriétés régénératrices des cellule-médicament. Le but de ce projet est donc de proposer une thérapie cellulaire 2.0 en ciblant l'environnement articulaire âgé du patient arthrosique.

Procédures

Toutes les procédures chirurgicales seront effectuées sur des animaux anesthésiés à l’isoflurane avec application d'une analgesie locale avant chirurgie. Nos procédures, depuis l’endormissement au réveil des animaux, prennent environ 5 minutes par souris. Chaque animal recevra trois injections prenant en moyenne 30sec par souris : une double injection de solution dégradant l’articulation à j0 et à j2 et une injection de la thérapie à j7.

Impact sur les animaux

L’injection de la solution dégradant l’articulation peut induire une douleur passagère au niveau du genou

Devenir

A la fin du projet, les souris seront euthanasiées pour permettre le prélevement de l'articulation du genou.

Remplacement

L'arthrose est une maladie de l'ensemble de l'articulation impliquant les cellules qui y résident mais également le système immunitaire circulant dans le sang. En effet, les différents tissus qui composent une articulation sont atteints et par conséquent, l'analyse du rôle de la senescence cellulaire et de son traitement sur un modèle d'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants. Parmi les alternatives aux modèles animaux, les organoïdes et les organes artificiels sur puces sont des pistes prometteuses néanmoins, ces systèmes sont encore peu maitrisés/caractérisés et ne peuvent remplacer, à l'heure actuelle, un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrose chez la souris (~75%) et de mise en évidence d'effet significatif sur les paramètres histologiques mesurés en fin d'expérience. A l’origine du projet, 5 candidats médicaments ont été présélectionnés. Nos expériences in-vitro nous ont permis de réduire à une seule molécule pour éviter d’accroitre le nombre de souris nécessaires pour ce projet.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Les injections intra-articulaires se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter au maximum la douleur infligée aux animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les points limites seront déterminés à l'aide d'une grille d'évaluation permettant d'identifier les signes de douleur ou d'inconfort des animaux. Ces points limites se basent sur un score obtenu en évaluant comportement, la respiration, l'alimentation ou encore, les expressions faciales des animaux. et sont décidés d'un commun d'accord avec la service du Bien-Etre Animal (SBEA). L'échelle de cette grille, allant de 0 à 23, nécessite une intervention analgésique dès le grade 6 et une consultation de la SBEA à partir du grade 12 pour décider des modes de soulagement.

Choix des espèces

Le modèle murin d'arthrose induite chimiquement présente l’avantage de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’Homme, c’est-à-dire chez le sujet jeune après le traumatisme articulaire ou chez le sujet âgé par une arthrose spontanée. Afin de montrer les effets thérapeutiques synergiques d’une combinaison drogue anti-vieillissement/cellules-médicament mais également l’impact de l’âge sur ces mêmes propriétés, les souris seront utilisées à 2-3 mois (groupe jeune) et à 18-20 mois (groupe âgé).

195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2 dans le muscle, elles sont infectées par injection intramusculaire, gavées de tamoxifène cinq jours, saignées tous les deux jours et soumises pendant six mois à des tests d'effort, grip test, tapis roulant et actimétrie. Le porteur n'attend pas de dommage musculaire important, seulement une fatigue, et reconnaît devoir d'abord mettre au point cette infection encore jamais tentée. Il indique compléter par de la culture cellulaire mais juge la souris nécessaire, le modèle devant aussi servir "l'industrie pharmaceutique" pour d'autres projets sur la COVID.

Objectifs

Si la grande majorité des malades infectés par le SRAS-CoV-2 se remettent de cette infection (98,7% au 09 mars 2022, https://COVID19.who.int/) ; certains d’entre eux continuent à présenter des symptômes, parfois des mois après leur guérison. Ce type de manifestations cliniques, qualifié de syndrome post-COVID (PCS), concerne 30 à 60% des malades, principalement des femmes. Le PCS touche plusieurs organes et demande une surveillance et un suivi à long terme des patients, ce qui en fait aujourd’hui un véritable problème de santé publique. Parmi les principaux symptômes observés, on note en troisième position les troubles musculo-squelettiques. Les exercices physiques permettent parfois de réduire ces symptômes suggérant une atteinte directe du muscle. Cependant, à notre connaissance, il n'existe aucune étude sur les effets à long terme de la COVID-19 sur le tissu musculaire. Depuis 2020, la littérature scientifique atteste de la pertinence et de l’intérêt des modèles rongeurs pour l’étude de l’infection par le SRAS-CoV-2 et de la physiopathologie de la COVID-19. Un modèle de souris transgénique HSACreERT2: ACE2(GFP)hACE2 a été développé exprimant le récepteur humain du SRAS-CoV-2, l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (hACE2), uniquement au niveau du tissu musculaire. Nous proposons de l’utiliser pour (i) caractériser l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2 et (ii) comprendre les bases moléculaires de la physiopathologie musculaire de la COVID-19.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’établir une cartographie détaillée des conséquences fonctionnelles et physiopathologiques de l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2. Cette étude jamais réalisée jusqu’à présent permettra de mieux comprendre les symptômes musculaires observés chez les patients COVID Long. Le développement de thérapies ciblées et la prise en charge adaptée des patients pourraient bénéficier de ces observations inédites. Si aucun effet n’est observé à la suite de l’infection directe du muscle, cela apportera néanmoins un élément de réponse à la compréhension du phénotype musculaire dans le cas des patients de COVID Long. Nous pourrons dans ce cas envisager d’orienter nos investigations futures vers le réseau vasculaire ou le système inflammatoire. De plus, notre modèle restera tout de même un outil important pour la communauté scientifique et l’industrie pharmaceutique dans le cadre d’autres projets sur les formes aigues ou persistantes de la COVID.

Procédures

Pour la réalisation des infections virales, les animaux seront anesthésiés sous isofluorane (induction 4%; maintien 2%) et soumis à des injections intramusculaires du SARS-CoV-2. L'intervention sera faite une seule fois par souris et la durée de l'intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Le prélèvement du sang tous les deux jours sera fait sous anesthésie à l'isoflurane. La durée de la prise de sang sera d'environ 30 secondes. Pour réaliser les manipulations, le tamoxifène est administré par gavage pendant 5 jours à la concentration finale de 85 mg/kg de poids corporel. La séance de gavage dure environ 2 minutes pour chaque souris avec une fréquence d'une fois par jour pendant 5 jours. Les études functionelles seront realisées une fois par mois pendant 6 mois. La durée du grip test sera de 30 secondes et la durée de la séance du tapis roulant sera de 20 minutes. Pour finir, l'activité de déplacement mesuré par l'Activmètre aura une durée d'acquisition réglée sur 24/48 heures pour quantifier l'activité tout au long du cycle circadien.

Impact sur les animaux

Le projet porte sur l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2. En raison de l’absence de données préalables, il est nécessaire de mettre au point l’infection expérimentale. Cette étape repose sur notre grande expérience des injections intramusculaires et de la virologie du SRAS-CoV-2. Toutefois, il n’est pas attendu de dommages musculaires importants chez la souris. En effet, seule de la fatigue musculaire est signalée chez les patients COVID Long et un phénotype similaire devrait être observé chez la souris infectée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour les prélevements prévus dans chaque procédure.

Remplacement

Notre projet s’intéresse à l’étude des processus biologiques associés aux interactions entre le virus SRAS-CoV-2 et les cellules ou tissus de l’hôte et de leur évolution au cours du temps (6 mois). De fait, l’analyse de ces interactions au sein d’un organisme, où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication, nécessite des observations chez l’animal et ne peut être substituée qu’en partie par des études in vitro. Des résultats préliminaires ont montré que les cellules musculaires humaines sont susceptibles à l’infection par le SRAS-CoV-2. De plus, nous avons démontré que le récepteur ACE2 est exprimé au niveau du tissu musculaire. La culture cellulaire restera un outil que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de protocoles publiés et de l’expérience acquise précédemment. Un des enjeux est de pouvoir obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses prévues. Ce nombre de souris n’a pas été défini à l’aide de méthodes statistique mais est basé sur notre expérience dans l’obtention de différent matériel biologique pour chaque technique. Les conditions expérimentales de l’infection sont établies sur la base d’une approche par escalade de doses. Cinq souris par condition seront utilisées pour des analyses histologiques et virologiques. La sensibilité de ces techniques est importante et l’effet attendu est fort, ce qui permet de limiter le nombre d’individus. Pour les autres expériences, la sensibilité attendue est moindre, obligeant à augmenter la taille des groupes à 10 individus pour les analyses fonctionnelles. Afin de respecter la règle des 3R, les animaux seront utilisés pour plusieurs études (par exemple, analyses fonctionnelles et investigation de la physiopathologie de l’infection musculaire) et, quand cela est possible, un même tissu sera exploité pour différentes analyses (par exemple, un même muscle pour les analyses histologiques et les analyses moléculaires) dans le but de réduire au maximum le nombre des animaux. Des tests statistiques seront mis en œuvre.

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) avant inoculation intra-musculaire du virus. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide permettant la réalisation de la procédure en un temps court et d’assurer un réveil rapide tout en minimisant l’hypothermie. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les souris seront hébergées par 6 mois dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger. Des points limites (perte excessive >20%, lordose, dyspnée, poil piqué, difficultés locomotrices) seront utilisés afin de garantir le bien-etre des animaux après l'infection.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) constitue un outil essentiel pour la recherche par sa facilité de manipulation, sa petite taille, ses cycles de reproduction courts, et sa grande disponibilité. Cependant, la souris n’est pas sensible à l’infection par le SRAS-CoV-2, puisque la protéine spike “S” ne reconnaît pas le récepteur murin ACE2. Des stratégies d’insertion du gène humain ACE2 dans les modèles transgéniques ont été réalisées, mais son expression est ubiquitaire alors que chez l’homme, elle est restreinte, notamment aux voies respiratoires supérieures et inférieures. Afin de contourner ces différentes limitations et dans l’objectif de fournir à la communauté scientifique un modèle préclinique murin versatile, nous avons généré une lignée murine humanisée (ACE2(GFP)hACE2) exprimant le récepteur hACE2 au locus de mAce2 de manière conditionnelle et inductible. En effet, il n’existe pas à notre connaissance de knock-in inductible, tissu-spécifique et conditionnel de hACE2 chez la souris. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 6 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie osseuse pédiatrique rare, elles subissent des radiographies sous anesthésie tous les quinze jours, jusqu'à six injections de fluorochromes et une ponction cardiaque terminale, pour décrire l'apparition d'un granulome dans les mâchoires. Le porteur affirme que cette cinétique ne peut s'observer chez les patients, diagnostiqués trop tard, et qu'elle requiert un "organisme entier". Les tests de thérapies sont présentés comme une étape ultérieure.

Objectifs

La maladie osseuse pédiatrique rare qui nous intéresse est caractérisée par le remplacement de l’os des mâchoires par un tissu mou fibreux appelé granulome. Cette pathologie se met en place vers 3 à 5 ans et est d’origine génétique. Les lésions spécifiques de la maladie sont toujours symétriques et bilatérales et peuvent ne concerner que des zones restreintes de la mandibule ou au contraire toutes les mâchoires jusqu’au plancher de l’orbite. Le principal traitement proposé aux patients pour le moment consiste principalement en chirurgies itératives et souvent iatrogènes et quelques rares molécules pour les formes très sévères. Ce qui définit la localisation anatomique et la période d’apparition de cette pathologie ne sont pas connues. Avoir accès et comprendre l’apparition du granulome permettrait de proposer des traitements plus précoces et efficaces aux patients. L’objectif de ce projet est donc de définir la cinétique d’apparition du granulome spécifique de cette pathologie dans un modèle murin, cinétique à laquelle nous ne pouvons avoir accès chez les patients. La description de cette cinétique nous permettra d’avoir une progression claire du granulome et dans un second temps de définir plusieurs fenêtres de traitement.

Bénéfices attendus

La description de la cinétique d’apparition du granulome n’est pas possible chez les patients. En effet, les patients sont diagnostiqués quand le granulome est déjà installé voire agressif. La description de cette apparition est la première étape qui permettra de mettre en place des tests de thérapies efficaces (avec un effet évaluable facilement) qui manquent encore pour le traitement des patients.

Procédures

Le phénotype osseux des souris est exploré par un examen radiographique tous les 15 jours qui nécessite une anesthésie et qui dure 5 minutes, un seul recueil d’urines en cage métabolique (durée maximale 2h) pour l’analyse des marqueurs osseux urinaires, l’injection de 2 fluorochromes pour analyser la formation dynamique de l’os (2 minutes par injection) et enfin, le prélèvement sanguin intracardiaque (réalisée sous anesthésie profonde - 5 minutes maximum) pour l’analyse des marqueurs osseux sanguins.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis au maximum 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes), 1h de cage métabolique et une ponction cardiaque terminale. Aucun autre dommage que d’être manipulé pour l’injection et isolé pendant 1h n’est observé dans le cadre de la caractérisation du phénotype osseux. Aucun autre dommage que d’être manipulé pour pratiquer les injections, lesquelles peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère qui ne nécessite pas de médication particulière.

Devenir

Les animaux concernés par cette procédure sont mis à mort pour réaliser des prélèvements post-mortem des os et des caecum qui permettront de caractériser le phénotype osseux et l’apparition du granulome du chérubisme.

Remplacement

La mutation d’un gène est responsable du développement du chérubisme. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement du chérubisme mais toutes ces études préalables in vitro sont menées sur des cellules provenant de granulomes de patients diagnostiqués, quand le granulome est déjà installé voire agressif. La cinétique d’apparition du granulome pathognomonique du chérubisme ne peut être étudié que grâce à l’utilisation d’un modèle animal. Les interactions entre l’os (les cellules osseuses mutées), le ligament parodontale (et ses cellules mutées) et la moelle osseuses (et ses cellules mutées) et leurs implications dans l’apparition du granulome ne pouvant être observées qu’au sein d’un organisme entier. Le granulome pathognomonique du chérubisme n’apparait que lorsque le gène concerné est muté, rendant le modèle animal que nous voudrions utiliser approprié pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (168) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’établissement de la cinétique d’apparition du granulome de chérubisme. L’analyse préalablement publiée du modèle à 10 semaines permet d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.

Raffinement

Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées sous anesthésie avec analgésie. Le temps de radiographie sera très cours, environ 5 minutes par animal. Il sera surveillé jusqu’à son réveil. L’appareil étant à température ambiante, un maintien de la température à 37°de l’animal ne sera pas nécessaire pour une intervention si courte. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure car aucun autre dommage que de courtes anesthésies, espacées de 15 jours, des injections (6 maximum) et un isolement de 2h au plus pour le recueil d’urine ne sont envisagés dans le cadre de la caractérisation du phénotype osseux. Cependant, dans l’éventualité d’une perte de poids ou encore d’un comportement anormal, une surveillance plus fréquente et un apport de nourriture gélifiée seront mis en place. Les animaux seront hébergés sous conditions standards - température 20/24°, cycle jour/nuit 12h/12h, hygrométrie entre 50/55%. L’enrichissement du milieu sera assuré par la mise à disposition de tunnel en carton, de nids en papier kraft, de maisonnettes rouge et de bâtonnets à ronger. L’acte final, une ponction cardiaque, nécessaire pour évaluer les marqueurs osseux sanguins, sera faite sous anesthésie avec antalgique. L’assurance d’une anesthésie profonde sera vérifiée avant par un test de l’abolition du réflexe des extrémités.

Choix des espèces

Un modèle murin de la pathologie osseuse rare pédiatrique qui nous intéresse a été précédemment généré. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement du chérubisme. Cependant, les interactions entre l’os (les cellules osseuses mutées), le ligament parodontale (et ses cellules mutées) et la moelle osseuses (et ses cellules mutées) et leurs implications dans l’apparition du granulome ne peuvent être observées qu’au sein d’un organisme entier. Le granulome spécifique de la pathologie osseuse rare pédiatrique qui nous intéresse apparait dans le modèle murin, rendant ce modèle approprié pour cette étude. A 10 semaines le granulome est mis en place (comme décrit précédemment). Nous voulons décrire son apparition entre 4 et 10 semaines, 4 semaines correspondant au sevrage des animaux et qui correspond au stade d’apparition du granulome chez les patients.