Système musculosquelettique

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une lésion musculaire par injection de cardiotoxine puis des injections intramusculaires sous anesthésie, avant d'être mises à mort pour prélever leurs muscles, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la régénération. Le porteur affirme que les injections ne provoquent pas d'effets indésirables aux doses utilisées et que les souris reprennent leur activité dès le réveil. Il conclut qu'"aucune autre méthode alternative" ne peut se substituer à l'animal pour ce processus.

Objectifs

Les muscles squelettiques composent la moitié de la masse totale d'un individu et permettent la motricité du corps. Ils sont principalement composés de fibres musculaires mais également de vaisseaux sanguins, de nerfs et d'un tissu de soutien. Suite à une blessure, les différents types cellulaires qui composent le tissu coopèrent et interagissent pour reconstruire le muscle blessé. Parmi elles, les cellules souches musculaires s'activent et fusionnent ensemble pour former de nouvelles fibres musculaires. Le projet de recherche porte sur l'étude du rôle d'une protéine impliquée dans la fusion de ces cellules souches. Cette protéine est connue pour bloquer la fusion et donc la bonne réparation des muscles blessés. Le projet consiste à étudier par quels mécanismes elle agit sur la régénération. L’hypothèse est que plusieurs types cellulaires participent à ce processus en réponse à la protéine d'intérêt. L’approche qui sera développée consiste à isoler et étudier les cellules issues d'animaux modèles traités avec la protéine lors de la régénération musculaire. Cela permettra d'évaluer quelles sont les cellules répondeuses à cette protéine et comment ces cellules réagissent au traitement par cette protéine. A terme, ce projet de recherche permettra de comprendre les mécanismes par lesquels la protéine contrôle la réparation du muscle blessé.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats du projet permettront de comprendre précisément comment la protéine d'intérêt contrôle les différents types cellulaires lors de la réparation d'un muscle squelettique blessé. En plus d'augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction de ces cellules lors de la régénération, les résultats de cette étude pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies de médecine régénérative.

Procédures

Deux injections intramusculaires dans le muscle releveur de la patte seront réalisées. Elles durent moins de 5 secondes et seront faites sur animaux anesthésiés. Une injection d’analgésique (anti-douleur) sera également réalisée.

Impact sur les animaux

Les injections de la protéine d'intérêt n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal aux doses utilisées. L'utilisation d'anesthésiques au cours des procédures de lésion musculaire et d'injection de la protéine garantit l'absence de douleur chez l'animal. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu'elles ne montrent pas de signes de douleurs pendant les jours suivants.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les muscles seront prélevés.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative actuelle ne peut se substituer à l'utilisation d'animaux pour l'étude de la régénération du muscle via l'activation des cellules souches musculaires. Ce processus repose sur des interactions complexes entre les tissus blessés et sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Ces résultats ne peuvent pas être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ce qui justifie la poursuite de notre projet utilisant des modèles murins.

Réduction

L'utilisation des animaux sera réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales et contrôlée à l'aide d'analyses statistiques adaptées. Nous avons optimisé notre expérience afin d’utiliser un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiques fiables, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisé. La méthode de lésion musculaire utilisée est déjà très décrite au sein de la littérature et provoque peu de douleur chez l’animal.

Raffinement

Avant le début de la procédure, les animaux suivront une période d'acclimatation d'au moins une semaine. Les animaux seront également pesés 4 jours avant l’injection de cardiotoxine puis 4 jours après afin de vérifier qu'il n'y a pas de perte de poids anormale. Des anesthésiques et des médicaments anti- douleur seront utilisés afin de prévenir au maximum le stress et la souffrance des animaux. En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés avant et après la manipulation. Si des changements sont relevés pendant plus de 24h, des mesures adéquates seront prises en accord avec le personnel animalier afin d'améliorer les conditions de vie de l'animal et d'éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l'humain, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l'analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. Les expériences seront principalement réalisées sur des souris âgées de 8 à 12 semaines. L'âge choisi est le plus adapté à l'étude de la régénération du muscle squelettique. Plus jeune, le tissu est encore en croissance. Plus âgé, une fibrose peut se développer et perturber le processus de régénération.

272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent un traitement par gavage puis un suivi mensuel de la force musculaire, des tests de sociabilité et un test du nid avec isolement d'une nuit, avant un électromyogramme sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur teste si la relocalisation de la protéine FUS dans le noyau des neurones rétablit les capacités motrices. Il présente une extension possible à l'humain comme un axe futur, sans traitement existant à ce jour.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée par une paralysie des muscles qui entrainent le décès des patients par insuffisance respiratoire. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime cette maladie en reproduisant la mutation d’une protéine mutée chez les patients. Le but du projet est de relocaliser cette protéine dans le noyau des neurones et de voir si cela suffit à rétablir les capacités motrices de nos souris.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace de la SLA. Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche en remettant une protéine qui s’est déplacée à cause de la maladie dans sa localisation normale puis d’évaluer si cette stratégie permet de rétablir les capacités motrices de ces souris. Si en remettant FUS à sa place, nous arrivons à réduire les troubles moteurs et sociaux observés, nous pourrons envisager que les prochains axes de recherche se tourneront vers la possibilité de trouver un moyen pour relocaliser FUS dans le noyau des patients souffrants de SLA.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure d’administration par gavage d’un traitement durant 5 jours. Nous réaliserons un suivi mensuel des capacités motrices (force musculaire) sur un dispositif dédié afin de voir l’évolution de la maladie. Ce test se passe en 3 session de 3 minutes maximum chacune, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes. Les animaux seront toujours remis en groupe et de l’enrichissement sera mis à disposition dans leur cage d’élevage. Nous réaliserons deux tests de sociabilité 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal (à 4, 10 et peut-être 14 mois selon l’évolution de la maladie). Le premier test dure 5 minutes tandis que pour le second, les souris passeront 4 sessions de 5 minutes chacune (avec des phases de retour en cage de 8 minutes entre les sessions). La passation du premier et du second test sera espacée d’une semaine. Le test du nid sera réalisé 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal et nécessitera que les souris soient isolées durant une nuit. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris endormies afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement. Pour éviter cela, l’expérimentateur en charge de cette partie a suivi des formations pour apprendre à réaliser ce geste et s’est entrainé un grand nombre de fois. Nous pourrions également observer un léger stress causé par la passation du test moteur et des tests de sociabilité. Un temps de repos sera systématiquement appliqué pour les procédures nécessitant plusieurs passages successifs pour le test moteur. Si nous remarquons que les souris sont fatiguées, nous espacerons les différentes sessions. Un délai d’une semaine sera appliqué entre chaque test social. La procédure d’électro myo gramme qui permet d’observer la présence ou non d'atteinte des muscles sera réalisée sous anesthésie, les souris ne ressentiront donc aucune douleur.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures 1 et 2 car nous avons besoin de prélever les tissus pour vérifier 1. la relocalisation nucléaire de FUS mais aussi 2. pour étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer s’il est possible de remettre à sa place une protéine dont le changement de localisation entraine la SLA. Pour étudier cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale (avec l’apparition possible des troubles de la sociabilité) mais aussi une complexité structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme. La souris nous offre la possibilité de travailler avec ces deux niveaux de complexité.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé le suivi longitudinal. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pilote pour valider l’approche expérimentale utilisée et potentiellement réduite le nombre de groupes contrôles que nous utiliserons. Si cette étude pilote est validée sur ces deux aspects, nous pourrons réduite de moitié les animaux nécessaires à la réalisation de la seconde partie du projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles.

77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs ovaires sont retirés par chirurgie pour reproduire l'ostéoporose post-ménopause, puis elles reçoivent des injections tous les deux jours pendant jusqu'à huit semaines et deux prélèvements de sang. Le porteur admet une mortalité chirurgicale acceptée jusqu'à 10 %, et une mise à mort finale pour analyser les tissus osseux. Le test porte sur une famille de molécules développée avec des chimistes, dont l'effet reste à consolider.

Objectifs

L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Dans le cadre du développement de traitements contre l’ostéoporose nous avons développé, conjointement avec une équipe de chimistes, une famille de molécules agissant à la fois sur les symptômes directs de la maladie associés au remodelage osseux (pertes osseuses) mais également sur les phénomènes inflammatoires associés. L’objectif de ce projet est donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de ces molécules, en étudiant la restauration du phénotype osseux associé à leurs emplois, dans un modèle murin d’ostéoporose induit chez l’animal par le retrait des ovaires (ovariectomie). Cette approche expérimentale permet de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause et impactant l’homéostasie tissulaire osseuse (ostéoporose post-ménopause). Ce travail permettra donc, à terme, de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre l’ostéoporose.

Bénéfices attendus

L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse ou des substituts hormonaux, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques. En traitement de première intention, si certaines molécules bloquent la formation et l’activité des cellules qui dégradent naturellement l'os limitant ainsi la perte osseuse, cette approche thérapeutique ne permet pas de récupérer de la densité osseuse car elle bloque également à terme la reformation osseuse. Par ailleurs de nombreux effets secondaires sont associés à ces différents types de traitements : douleurs musculo-squelettiques et troubles digestifs auxquels s’ajoute un risque de destruction des os de la mâchoire avec certaines molecules. L’approche proposée vise à l’obtention d’une efficacité similaire à celle de ces molécules via des modes d’actions différents, laissant présager de ne pas reproduire leurs effets indésirables principaux, favorisant la prise en charge des patientes souffrant d’ostéoporose post-ménopause.

Procédures

Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30min sous anesthésie générale visant au retrait de leurs ovaires, puis des injections tous les 2 jours pendant 8 semaines au maximum sur animaux vigiles, sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale. Les animaux auront également deux prélèvements sanguins (100µL chacun) à la queue, sous anesthésie générale, le premier en pré-opératoire et le second à 4 semaines post-opératoires.

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque non négligeable de mortalité. Une mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie de 10% est le maximum acceptable au-delà duquel la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée en post-opératoire, est attendue dans les premiers jours.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés suite à la nécessité de réaliser un prélèvement sanguin puis de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner et analyses histologiques et immunohistochimiques afin de pouvoir évaluer l'efficacité des traitements.

Remplacement

A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme. Les modèles d’organes isolés ne peuvent pas, à notre connaissance, fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.

Réduction

Des analyses à mi-parcours avec dispositif d’arrêt de l’expérience si l'expérmentation ne peut statistiquement pas donner de résultat seront appliquées. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Nous proposons donc d’effectuer une première série de 5 animaux par groupe, avec une analyse statistique intermédiaire permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique satisfaisante dans la limite de 10 animaux par groupe au maximum. Des tests statistiques adaptés aux effectifs de cette étude seront ensuite utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton…) permettant aux animaux d'améliorer leur milieu. A chaque intervention les animaux seront anesthésiés si nécessaire afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’approche chirurgicale, une douleur post-opératoire sera anticipée avec l’injection préventive et curative d’antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois jours suivants la chirurgie et dès les premiers signes d’inconfort détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours lors des injections de façon à contrôler l'absence de points limites tout au long de l'étude. Les molécules choisies seront injectées sur animaux vigiles sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale (afin de réduire le stress des animaux) tous les deux jours pendant 28 à 56 jours. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés sous anesthésie générale gazeuse.

Choix des espèces

La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures de l’équipe ont donné des résultats exploitables concernant les traitements dans d’autres champs d’application. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.

120 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous la peau d'un biomatériau osseux, avant d'être tué pour l'analyse histologique des tissus. Le porteur indique que l'implantation peut provoquer une gêne ou une douleur légère et fixe un seuil d'euthanasie. Il décrit cette étape sur souris comme un préalable à des essais sur os de rat puis chez le "gros animal", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation.

Objectifs

En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Notre projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse, qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matériaux personnalisés qui permettraient d'aboutir à une meilleure réparation osseuse par la stimulation conjointe de la réparation des nerfs, des vaisseaux et des os. Ici, il s’agit de réaliser une première évaluation de nos matériaux en les implantant sous la peau de souris, en préalable à des expérimentations sur site osseux chez le rat. Cette évaluation servira deux objectifs : d’une part, évaluer la biocompatibilité (réaction inflammatoire, réaction à corps étranger, …), et d’autre part évaluer la fonctionnalité (formation osseuse, vascularisation, innervation) des produits, pour définir la ou les formulations les plus appropriées pour l’application chez le rat en modèle de réparation osseuse.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences d’implantation de nos matériaux menées sur modèle souris sont un préalable à la poursuite des travaux sur site osseux chez le rat. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau et/ou l'un des gènes administrés conduiront à l’abandon de l’élément mis en cause. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager dans un premier temps les expérimentations en site osseux chez le rat, et dans un deuxième temps le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée de 5 à 10 minutes)

Impact sur les animaux

L'implantation sous-cutanée peut entraîner une gêne voire une douleur légère. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie selon les standards européens. Au-delà d'un certain seuil, l’animal sera euthanasié sans attendre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de leur temps expérimental pour procéder à une analyse histologique des tissus de la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel régénératif de celui-ci. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Les échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux. La possibilité d'implanter au moins deux matériaux par animal, de réaliser un suivi longitudinal, d'analyser plusieurs paramètres à partir des mêmes prélèvements sur animaux après euthanasie, permet de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés.

Raffinement

L’opération est réalisée sous anesthésie générale. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques sont utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. En cas de lésion sérieuse ne pouvant être traitée par suture et/ou antiseptique, l’animal est euthanasié. La cage reçoit un surcroît d’enrichissements le jour de la chirurgie de manière à distraire l’animal de la gêne liée à la présence du matériau implanté, et ainsi limiter les risques d’arrachement de l’implant, de rupture des points de suture, et d’infection de la plaie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris présentant une immuno-déficience marquée, adaptée à l'implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Les souris seront implantées à l'âge de 7 à 12 semaines. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´implantation sous-cutanée.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent pendant quatre semaines des instillations intra-trachéales d'un agent pro-inflammatoire sous anesthésie et, pour certains, une exposition continue à un air appauvri en oxygène simulant 4 300 à 5 000 mètres d'altitude, avant d'être tués par exsanguination pour prélever cœur et muscles. Le porteur décrit une baisse transitoire de prise alimentaire et d'activité, sans douleur attendue selon lui. Il affirme que ce dialogue entre organes ne peut s'étudier que sur "l'organisme entier" et retient le rat pour la quantité de muscle qu'il fournit.

Objectifs

Le tissu musculaire squelettique est doté d'une plasticité particulièrement sollicitée en réponse à des contraintes comme l'entraînement, la réhabilitation, la nutrition ou l'environnement permettant une amélioration de la performance sportive mais aussi de la santé au sens large. De nombreux travaux montrent une corrélation entre la masse musculaire et la survie des individus âgés, qu'ils soient en bonne santé ou porteurs de pathologies chroniques. Ainsi, dans les pathologies chroniques, le maintien voire l'amélioration de la masse et de la fonction musculaires sont considérés comme des outils de santé, justifiant le recours à la réhabilitation par l'activité physique. Cependant, que ce soit dans le cadre de l'optimisation de la performance ou dans la prise en charge des patients, on note une fraction non négligeable de personnes ne répondant pas ou pas bien à de tels programmes qui peut aller jusqu'à 30% dans le cas de la maladie respiratoire chronique. Cette non-réponse est encore mal expliquée. A côté des mécanismes classiques de régulation de gènes d'intérêt dont l'expression peut varier fortement avec l'exercice, l'hypothèse d'un rôle significatif du micro-environnement musculaire sur le contrôle de ces adaptations, s'appuyant sur l'existence de régulations d'ordre épigénétique, semble privilégiée, que ce soit chez le sportif de haut niveau ou chez le patient. Ces modifications pourraient conduire à des difficultés à activer les voies de signalisation classiques contrôlant la masse musculaire (protéosynthèse, protéolyse) selon des critères qui restent à préciser (prédisposition, mode de vie, environnement, niveau d'activité physique). Ces critères agiraient via des modifications épigénétiques sur le développement musculaire et en particulier sur les limitations des capacités hypertrophiques du muscle en présence d'hypoxie et d'inflammation. Il convient maintenant de disséquer les mécanismes qui pourraient être à l'origine de ces réponses différentielles. Dans le cadre de la maladie respiratoire, ces échecs pourraient être liés à des modifications de la chromatine (ADN+histones) qui contrôleraient négativement la régulation de la masse musculaire mais dont on ne sait pas comment elle obéit au stress hypoxique et/ou inflammatoire associé. Notre objectif est de déterminer ces modifications pour ensuite proposer des solutions de contournement pour rendre plus efficace la réponse du tissu musculaire des patients au réentrainement à l'effort.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer la signature épigénétique du tissu musculaire ainsi que ses signaux de réponse à l'exposition à l'hypoxie et/ou à l'inflammation d'origine pulmonaire, pouvant expliquer les niveaux de réponse variables du muscle à un stimulus hypertrophique observée dans des travaux précédents. Nos résultats permettront de relier les caractéristiques de l'épigénome associé à une contrainte environnementale (hypoxie et/ou inflammation) en fonction du type de muscle (oxydatif ou glycolytique) à des indicateurs métaboliques déterminés sur fibres isolées ou mitochondries isolées. L'objectif est ensuite d'utiliser des perturbations du métabolisme énergétique afin de modifier cet épigénome pour le rendre plus favorable, constituant ainsi un outil de personnalisation de la prise en charge de la fonction musculaire dans un contexte similaire d'hypoxie et d'inflammation comme chez le malade respiratoire.

Procédures

Les animaux utilisés pour ce projet subiront soit des instillations intra-trachéales bi-hebdomadaires d'un agent pro-inflammatoire, sous anesthésie gazeuse de courte durée (inférieure à 2 min/session), pendant 4 semaines (groupes Inflammation seule et Hypoxie+Inflamation) représentant un total de 8 instillations. De plus, le groupe Hypoxie+Inflamation sera exposé en continu durant les 2 dernières semaines à un environnement appauvri en oxygène (similaire à une altitude de 4300m à 5000m) ainsi que le groupe Hypoxie seule. Après cette période de conditionnement, les animaux seront endormis (anesthésie gazeuse) et mis à mort immédiatement par exsanguination et prélèvement du coeur, suivis de prélèvements de divers organes ou tissus d'intérêt pour analyses ultérieures in vitro.

Impact sur les animaux

Le statut nutritionnel des animaux exposés à l'hypoxie continue peut être légèrement impacté avec une prise alimentaire diminuée dans les premiers jours en dépit d'un accès à l'eau de boisson et à la nourriture ad libitum mais qui revient ensuite à une quantité de nourriture consommée normale. L'activité locomotrice spontanée peut également être légèrement diminuée les premiers jours d'hypoxie pour revenir à la normale, facilitée en cela par l'hébergement qui se fait dans les mêmes cages que la stabulation normale, en groupe, avec enrichissement du milieu. L'instillation pulmonaire de LPS, génératrice d'une inflammation pulmonaire (avec présence de signes d'atteinte de l'épithélium pulmonaire) n'engendre pas de douleurs ou limitation physiologique chez l'animal au repos sur une période aussi courte (4 semaines). Le laryngoscope utilisé pour insérer la canule pour l'instillation de LPS est adapté à l'anatomie des animaux (diamètre, longueur) et n'est pas susceptible d'induire de gêne ou souffrance. L'exposition à l'hypoxie se faisant dans une enceinte accueillant les cages d'hébergement qui est installée dans une pièce d'hébergement où les paramètres environnementaux sont régulés, aucune nuisance relative à l'environnement thermique ou lumineux n'est attendu.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever divers tissus et organes d'intérêt étudiés in vitro ensuite.

Remplacement

Nous voulons explorer les conséquences d'une perturbation de la disponibilité en oxygène associées à une inflammation pulmonaire similaires à celles engendrées par la maladie respiratoire, sur des tissus périphériques comme les muscles squelettiques en utilisant un modèle combinant une hypoxie et une inflammation environnementale reproduisant les principales conséquences de la maladie respiratoire chronique. Cette relation inter-organes n'est pas possible sur un modèle autre que l'organisme entier. En raison de la quantité de tissus nécessaire pour un rendement d'isolement de mitochondries musculaires ou de fibres perméabilisées suffisant, nous avons choisi le rat qui propose une taille adaptée, par rapport à la souris.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux pour atteindre le seuil de significativité lors de l'analyse statistique des résultats avec une puissance de test cible de 0.8. Les méthodes d'exploration utilisées introduisent une variabilité qui reste limitée à 5%. Les changements attendus sur les paramètres mesurés sont de l'ordre de + ou - 15% par rapport à la valeur moyenne contrôle. Avec ces différents critères pris en compte, notre approche statistique donne un calcul d'effectif de 10 animaux par groupe. Par mesure de précaution, afin de tenir compte des aléas expérimentaux, nous incluerons 12 animaux par groupe soit un total de 48. Nous profiterons de ce protocole pour prélever et stocker des tissus qui ne seront pas directement utilisés dans ce projet. Cependant, ils seront stockés pour éventuellement être analysés dans le cadre d'un projet portant sur le foie, évitant de reconditonner de nouveaux lots d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, en cages ouvertes, avec un enrichissement du milieu (cachettes, litière) dans des locaux où les paramètres d'ambiance (température, hygrométrie, lumière, cascades de pression) sont suivis et enregistrés en continu, avec remontée d'alarme en cas d'écart avec les valeurs de consigne. L'exposition à l'hypoxie sera réalisée dans le même matériel d'hébergement, dans une enceinte pouvant accueillir plusieurs cages de plusieurs animaux. L'instillation intra-trachéale se fera après une légère anesthésie gazeuse d'une durée maximale de 2 min/session et l'animal sera observé jusqu'à son réveil complet avec de retrouver ses congénères. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés 2 fois par jour après chaque procédure ou 3 fois par jour en cas de symptômes cliniques jusqu'à leur disparition ou la mise à mort de l'animal. Les gestes techniques seront réalisés par des personnes compétentes et formées pour leur exécution. Ceux-ci comprennent l'observation de l'apparition éventuelle de signes cliniques (troubles du comportement, prostration, manque de toilettage) ou une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids de départ. Ils seront alors mis à mort et exclus de l'étude. Un examen post-mortem sera pratiqué pour identifier d'éventuelles lésions pouvant expliquer cet état afin de trouver des mesures de correction pour de futurs projets. Le volume à instiller sera limité à 1 µL/g de poids corporel.

Choix des espèces

Ce projet porte sur les conséquences d'une exposition environnementale à l'hypoxie et/ou à une inflammation pulmonaire sur le tissu musculaire squelettique. Le seul moyen d'étudier ce dialogue interorganes et l'influence d'un tissu ou d'un organe sur le fonctionnement d'un autre est d'utiliser l'organisme entier. Il n'existe actuellement aucune alternative scientifiquement validée. Le rat de laboratoire est l'espèce la plus adaptée car sa taille adulte permet d'obtenir des quantités de muscle adaptées aux mesures à réaliser, limitant le nombre d'animaux à utiliser par rapport au recours à d'autres espèces plus petites (souris..). De plus, la littérature scientifique montre que cette espèce présente des signes d'adaptation musculaire et cardiaque à ces facteurs environnementaux semblables à ce que l'on peut observer chez l'être humain dans un contexte de maladie respiratoire chronique, en faisant ainsi un modèle d'étude pertinent. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte moyen (âge en début de projet : 6 à 8 mois), de façon à se rapprocher de l'âge moyen d'apparition de la maladie respiratoire chez l'homme (âge adulte moyen) correspondant à l'entrée dans la 2ème partie de la vie.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un morceau d'os du crâne leur est retiré par chirurgie, puis elles reçoivent trois injections. Le porteur reconnaît des douleurs post-opératoires liées au défaut osseux, à la coupe du périoste et aux sutures. Il indique qu'il faut prélever l'os pour l'analyser, ce qui impose de tuer les animaux, et présente le modèle du défaut de crâne comme largement validé.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment l'os se répare physiologiquement, afin de pouvoir à plus long terme créer des solutions efficaces pour la réparation osseuse de fractures qui ne se réparent pas seules. Dans un premier temps, des ablations d'un morceau de calvaria (crâne) seront réalisés sur des souris adultes. Les "trous" seront soit laissés vides, soit comblés avec un morceau d'os de calvaria contenant des cellules ostéocytes, soit comblés avec un morceau de calvaria sans ostéocytes, car les cellules seront tuées grâce à une technique de changement de température à plusieurs reprises. L'efficacité et la rapidité de la réparation de ces trous sera comparée à de l'os natif, sur des animaux qui n'auront pas subi de chirurgie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre si les ostéocytes jouent un rôle dans la réparation osseuse. Des études récentes montrent que tel est le cas. Les données apportées par ce travail permettront de créer des biomatériaux et des solutions thérapeutiques efficaces pour mieux traiter les défauts osseux critiques chez les patients malades ou atteints de trauma. Les ostéocytes ont été peu étudiées, bien qu'elles représentent 90 à 95% des cellules osseuses, et les différents biomatériaux permettant de réparer l'os à l'heure actuelle ne sont pas très efficaces.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ ) et à 3 injections intra-péritonéales à différents temps (durée 1 minute pour chaque injection, espacées de plusieurs jours).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie au gaz (phase d'induction dans la boite) avant la chirurgie et des douleurs pourront être perçues après la chirurgie, dues au défaut osseux réalisé, à la coupe du périoste et/ou aux points de suture réalisés pour refermer la peau.

Devenir

Nous travaillons sur la réparation osseuse. Nous avons donc besoin des pièces osseuses pour pouvoir les analyser. De ce fait, comme il n'est pas possible de prélever les os de calvaria et de laisser les animaux vivants ensuite, ils seront tous euthanasiés avant le prélèvement.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'étude in vivo par de l'in vitro. Des expérimentations in vitro seront menées en même temps sur de la co-culture de cellules mais cela ne remplacera pas la compréhension in vivo de la réparation osseuse et ne permet pas de comprendre le rôle des ostéocytes dans ce processus complexe, faisant intervenir différents types de cellules à différents temps de la réparation.

Réduction

Afin d'utiliser moins d'animaux, deux défauts seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture sagittale. Nous effectuerons les deux premières études sur des mâles et des femelles car leur physiologie est différente. Pour les études suivantes, et afin de nous affranchir du rôle des hormones sexuelles qui affectent l'os, nous utiliserons uniquement des mâles. Cela évite de doubler le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, qui nécessitera beaucoup de temps d'analyse par la suite. Les femelles âgées et transgéniques seront étudiées dans un projet ultérieur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur cadre pendant l'étude. Nous utiliserons du gel lacrymal si les chirurgies durent plus de 5 minutes. Celles-ci seront réalisées sous anesthésie au gaz avec de l'isoflurane car le réveil est ensuite très rapide. Afin de diminuer le temps de la chirurgie, nous utiliserons le fait que la souris C57Bl6 est une lignée syngénique. Ainsi, les premiers volets osseux du groupe 3 (défauts laissés vides) seront traités (congélation/décongélation) par une tierce personne présente dans la salle de chirurgie, et réimplantés sur des souris du groupe 1 opérées ensuite. Ainsi, nous éviterons l'attente d'une quinzaine de minutes nécessaire pour tuer les ostéocytes du volet osseux. Il n'y aura pas de couverture chauffante car la table de chirurgie contient des plaques chauffantes que nous règlerons sur 37°C. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin (buprénorphine). Une anesthésie locale type lidocaine pourra également être utilisée ainsi que des AINS. Cette analgésie multimodale sera discutée en SBEA avec le vétérinaire référent. Le stress sera également réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. En cas de signes de douleurs persistantes en dépit des analgésiques, un score sera établi grâce à une échelle spécifique tenant compte des signes d'apparence, de comportement, d'hydratation et de signes cliniques bien spécifiques. Si le score est supérieur à 14 sur un total de 19 points, ce seuil limite entraînera l'euthanasie de l'animal pour abréger ses souffrances.

Choix des espèces

Le défaut de calvaria (ablation d'une petite partie de l'os du crâne) chez le rongeur est un modèle largement utilisé au laboratoire et validé dans la littérature. Ce sont des modèles de choix pour étudier l'influence des cellules et biomatériaux sur la réparation osseuse. Plusieurs lignées de souris seront utilisées dans ce projet: animaux avec ou sans mutations génétiques. Les mutations génétiques utilisées servent à voir les vaisseaux en vert en microscopie et d'autres animaux permettront de comprendre le rôle de la contrainte mécanique sur la réparation osseuse. Nous travaillerons sur des animaux adultes, et âgés car ce sont dans ces populations que l'on retrouve le plus de problèmes de réparation osseuse chez l'homme, en raison de trauma ou d'opération visant à extraire des tumeurs cancéreuses.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes chargés en phosphate, passent deux fois 24 heures en cage métabolique et reçoivent des injections de tétracycline. Le porteur décrit ces contraintes comme des stress légers déjà bien supportés lors d'un projet antérieur. L'objectif se limite à confirmer des résultats précédents et à tester si la source du phosphate alimentaire modifie le métabolisme phospho-calcique.

Objectifs

Le premier objectif est de confirmer les résultats issus des études précédentes réalisées dans le laboratoire sur l’homéostasie du métabolisme phospho-calcique. La première étude était constituée de souris sauvages et génétiquement modifiées (pour l’expression de protéines impliquées dans la régulation de la minéralisation osseuse) pour la BSP (Bone Sialoprotein) et/ou l’OPN (Osteopontin), ces souris recevaient un régime classique. La seconde étude a été réalisée avec ces mêmes souris, cependant, les souris recevaient des régimes avec diverses concentrations de phosphate (Pi) : standard, riche ou pauvre en Pi. Etonnamment, la régulation du métabolisme phospho-calcique des animaux a été impactée par le type de régime reçu : régime classique ou régime standard. Pourtant dans ceux-ci, la quantité de Pi est sensiblement égale (0.55%vs0.58%), mais, la source d’apport du Pi était différente (minérale vs organique). De ce fait, nous souhaitons valider que la source de Pi alimentaire (organique/minérale) modifie le contrôle du métabolisme phospho-calcique dans nos modèles. Le second objectif est de visualiser l’impact du fond génique des souris sur la régulation du métabolisme phospho-calcique. En effet, l’absorption intestinale est la voie d’entrée du Pi dans la circulation sanguine générale. Elle peut être effectuée par voie paracellulaire ou transcellulaire, le choix de la voie est dépendant de la charge alimentaire en Pi. En effet, la littérature démontre, qu’en condition d’apport faible en Pi, la voie transcellulaire domine, via une activation majeure d’un transporteur de Pi dans l’intestin : Npt2b. Lors d’une étude antérieure nos souris ont reçu un apport alimentaire faible en Pi, cependant le niveau d’expression du récepteur Npt2b a été réduite par rapport à un apport de Pi dit standard. Cette observation est donc en total contradiction avec les résultats de la littérature obtenus sur des souris C57Bl/6. Plusieurs hypothèses : la source de Pi du régime (minérale ou organique – objectif 1), ou alors le fond génique des souris (CD1/129sv) ne possède pas les mêmes mécanismes de régulation du métabolisme du phosphate. Pour répondre à cette hypothèse, des souris contrôles (C57Bl/6) et des souris (CD1/129sv) seront soumis aux mêmes régimes dans les mêmes conditions. Si la régulation est différente, cela signifie que le fond génique impact la réponse aux changements de l’apport alimentaire en phosphate.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider nos résultats préalablement obtenus sur les souris sur fond génique CD1/129sv, mais également de déterminer si les données divergentes avec la littérature, proviennent du fond génique ou de la source de phosphate dans l’alimentation.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une charge alimentaire en phosphate via des régimes spécifiques. De plus, les animaux passeront par deux, 24h en cage métabolique de manière à récupérer les urines et les fèces pour doser les marqueurs du métabolisme phospho-calcique. De plus, les animaux recevront deux injections de Tétracycline en intrapéritonéale (5 secondes par injections-30mg/kg) à 5 jours d’intervalle. La tétracycline est un antibiotique utilisée comme marqueur en histologie (marquage des fronts de minéralisation).

Impact sur les animaux

Les injections de tétracycline par voie intrapéritonéale, le passage en cage métabolique inférieur à 24h et le changement de régime alimentaire peuvent êtres des sources de stress pour les animaux. On s’attend donc à une légère modification du comportement (agitation/baisse de la consommation de la nourriture). Cependant, ces expériences ont déjà été effectuées lors de projet antérieur, et tous les paramètres (contrôle du poids/comportement) indiquent que les animaux supportent très bien les différents stress légers de ce projet. Enfin, la mise à mort des animaux sera effectuée par une personne habilitée et compétente et sur des animaux préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse (Isoflurane)) pour qu’aucune douleur ne soit ressentie.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissu biologique et de sang.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la régulation du métabolisme phospho-calcique, et ce contrôle est effectué à travers divers organes : l’intestin, l’os et le rein. La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme minéral et surtout celui du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

5 génotypes de souris seront nécessaires à l’étude et 4 régimes seront testés : classique, standard, pauvre et élevé en phosphate. Il y a donc 4 conditions par génotype et 5 génotypes ce qui fait 20 groupes expérimentaux. D’après nos études antérieures, un nombre de 8 points est jugé robuste et suffisant, mais sachant que les souris sont placées par 2 en cage métabolique pour réduire leur stress (permettant une meilleure homogénéisation des données, et une amélioration du bien-être notamment en réduisant la sensation de froid des animaux), il faut donc 16 souris par groupe. De ce fait, 16*4 (régime)*5 (génotype)= 320 animaux. En prenant compte, des expériences complémentaires/répétées qui pourront être nécessaires, 400 animaux seront nécessaires. Ainsi, le nombre d’animaux est réduit au juste nécessaire pour obtenir une puissance statistique robuste en tenant compte de la variabilité inter-individu.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. Les actes qui pourront produire un stress chez les animaux (cage métabolique/injections) seront réalisés dans des salles dédiées et par un expérimentateur habilité. La nourriture et l’eau seront à volonté. L’acte de mise à mort sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiés (Isoflurane) et réalisé rapidement par un manipulateur expérimenté. Les animaux qui proviennent de fournisseur agréé recevront la même attention que les animaux issus de l’élevage interne. De plus, ils seront inclus dans l’étude uniquement après une période d’acclimatation dans l’animalerie.

Choix des espèces

Les précédentes études de notre laboratoire ont été effectuées sur ces même souris avec le fond génique CD1/129 sv. L’ajout des souris sur fond génique C57BL/6 provient des résultats obtenus dans les données de littérature. L’étude sera menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population. De plus, c’est à cet âge que les précédentes expériences ont été menées.