Système musculosquelettique
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Thérapie pour la myopathie à agrégats tubulaires en utilisant des AAV dans le modèle souris – «TransTAM»
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
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285 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Ces souris porteuses d'une mutation reproduisant la myopathie à agrégats tubulaires subissent des tests de force et de saignement répétés et des injections d'un vecteur AAV, pour tester une thérapie génique censée corriger les atteintes musculaires. Le porteur décrit des tests de force et d'activité locomotrice et une mesure de production musculaire réalisée sous anesthésie sans réveil, suivie de la mise à mort. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité du muscle ni les effets sur l'"organisme entier".
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible. Nous avons l’intention d'inverser les symptomes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des injections intramusculaires de souris TAM/STRMK et déterminé un effet positif sur la fonction musculaire. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche sous une forme systémique, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.
Bénéfices attendus
Il est attendu que cette étude apportera la première preuve de concept pour un traitement efficace de TAM/STRMK. En effet, nos résultats préliminaires ont montré un effet bénéfique suite à l'administration du traitement dans le muscle, et il reste à démontrer que cette approche est également efficace par injection systémique et capable d’améliorer les phénotypes des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os. De manière importante, la thérapie est conservée entre la souris et l’homme et pourra être utilisée chez les patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.
Procédures
Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant à partir de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportament permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportament permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répeté 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésion vasculaire. Il sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Le test pour l'obtention du sang sera répeté 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections intraveineuses seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problemes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, démontrant que notre modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie. Pour la deuxième lignée de souris, une caractérisation complète sera bientôt effectuée pour confirmer un phénotype dommageable. Les tests de comportament peuvent induire du stress sur l'animal. Ces tests dureront le moins de temps possible pour que les tests soient significatifs, de sorte que l'animal souffre le moins possible.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la présence d'une poche de lait seront évalués tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environment sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué.
Choix des espèces
Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces évoluant plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.
Thyroïdie-parathyroïdectomie chez le rat de laboratoire pour une utilisation à des fins scientifiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'établissement produisant des rats privés de thyroïde et de parathyroïdes pour d'autres laboratoires. Chaque rat subit l'ablation chirurgicale de ces glandes sous anesthésie, avec des risques de saignement, de mauvaise cicatrisation et de chute de calcémie pouvant provoquer une tétanie. Le résumé indique que la majorité des rats jugés aptes sont expédiés vivants vers des laboratoires clients, les autres étant tués. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'évaluer les réactions du "corps vivant entier" et ne fournit aucune justification statistique du nombre d'animaux.
Objectifs
Les rats font partie des animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent un modèle animal de choix dans les domaines tels que les maladies endocriniennes. Ce projet a pour but de fournir des rats sans thyroïde, ni parathyroïde, cela va agir sur le poid, la masse musculaire, la solidité des os, le cholestérole, la glycémie, la température corporelle, le rythme cardiaque, en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année : 100 rats par an.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.
Procédures
Chaque animal subira une ablation de la thyroïde et des parathyroïdes sous anesthésie d'une durée maximale de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie et celle en post-opératoire, le risque de saignement continu et une mauvaise cicatrisation. Et également les problématiques liées à l'absence de thyroïde et parathyroïdes (perte de poids, diminution du rythme cardiaque, risque d'une chute importante de la calcémie avec risque de tétanie...).
Devenir
La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés. Les autres animaux seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).
Remplacement
Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans les études expérimentales.
Réduction
Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique n'a été réalisée.
Raffinement
Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.Les animaux sont supplémentés en lactate de calcium 2% dans l’eau de boisson pendant au moins 5 jours préopératoires et au moins 10 postopératoires, pour pallier a l'hypocalcémie.
Choix des espèces
Les rats sont une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 5 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet. Puis, 10-15 jours après l'opération, les animaux lui seront envoyés après un examen vérifiant la bonne récupération des animaux de la chirurgie.
Etude du rôle métabolique et cardiovasculaire des récepteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines et la fonction mitochondriale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
2 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. La plupart sont soumises jusqu'à soixante semaines à un régime gras et sucré, à des tests de tolérance au glucose, à des chirurgies de prélèvement du foie ou de la bile, et une partie à une irradiation aux rayons X suivie d'une greffe de moelle osseuse. Le porteur indique que la manipulation, l'irradiation et l'injection d'un composé inflammatoire peuvent provoquer peur, douleur ou fièvre. Il justifie le recours à la souris par la disponibilité de lignées transgéniques et de données antérieures sur le métabolisme des lipides.
Objectifs
Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladie du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme.
Bénéfices attendus
Ce projet aboutira a une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, 2/ dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l'homme: - Identifier des candidats/protéines tissulaires cibles de futurs médicaments.
Procédures
Les animaux (2900 souris) sont placés sous un régime riche en gras et sucre (2660 animaux, durée maximale: 60 semaines). Le poids et la masse grasse corporelle sont mesurés sur les animaux vigiles avec une technologie non invasive (2160 animaux, 3 minutes). Le diabète est mesuré au cours d'un test de charge orale en sucre, et un autre test implique une injection d’insuline dans l’abdomen. Ces tests impliquent des prélèvement de sang à la queue à différents temps (2160 animaux, durée de l'expérimentation: 2h). Les consommations alimentaires et de boissons ainsi que les dépenses énergétiques sont évaluées sur des animaux vigiles grâce à l’utilisation de cages dédiées où chaque animal est isolé avec un visuel sur les congénères (480 animaux vigiles, durée: 48h). L’utilisation du tapis roulant permet d’évaluer les performances physiques de chaque animal (480 animaux, durée: 15 minutes à 1 heure). Des actes chirurgicaux sont effectués sur les animaux anesthésiés pour mesurer les capacités métaboliques du foie : un prélèvement de bile (foie) est réalisé à un groupe pour mesurer les lipides excrétés dans la bile (480 souris, durée: 1 heure) ; sur un autre groupe, le sang et le foie sont prélevés (360 animaux, durée: 1 heure) ; sur une autre série, le foie est prélevé afin de réaliser une culture de cellules du foie (500 animaux, durée: 30 minutes) et d’en étudier les caractéristiques. Des prélèvements à la queue sont réalisés sur l’animal vigile afin d’étudier la sécrétion par le foie de lipides (480 souris vigiles, durée: 4h). En amont, un composé est injecté dans l’abdomen des animaux afin de bloquer les voies concourant à l'élimination de ces lipides du sang. Afin de mesurer l'élimination du cholestérol par le foie, des macrophages sont prélevés chez des souris (ayant au préalable reçu par injection un composé chargé d'attirer les macrophages dans l'abdomen) sous anesthésie, par piqûre dans l'abdomen, (240 souris, durée : 30 min) puis sont ré-injectés dans l’abdomen d'un autre groupe, sous une forme chargée en cholestérol. Des prélèvements de sang sont réalisés sur l’animal receveur à la queue à différents temps, puis, le foie est prélevé en terminal sous anesthésie (480 souris, durée totale: 48h). Afin d’étudier le rôle du système immunitaire dans les mécanismes, des animaux vigiles sont irradiés (rayons X) puis ils reçoivent une greffe de moelle osseuse lors de l'injection dans le coin de l’œil sous anesthésie générale (360 souris, durée: 48 heures).
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. La fatigue est un effet indésirable attendu lors de l'épreuve d'endurance sur tapis roulant. D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées : - suite à l'administration d'une substance (thioglycolate) qui induit une réaction inflammatoire dans le péritoine et aussi, - suite à l'irradiation de l'animal afin de procéder à une greffe de moelle osseuse.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques. Sur cette base, un transfert peut-être envisagé sur des cellules cultivées in vitro afin d'étudier des mécanismes précis. Ainsi, des études, in vitro, sur des lignées de cellules sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter dans la mesure du possible l'utilisation des animaux à cette fin.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : sécrétions biliaires, tests de tolérance au glucose et à l'insuline, prélèvements de tissus, prélèvement de plasma pour l'étude des lipoprotéines (profils), prélèvement de foie pour le développement de la culture primaire d'hépatocytes,... 2/ une réflexion biostatique est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre: - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agréée. - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux invités à coopérer dans les actes non invasifs et non douloureux (exemple: test de tolérance au glucose ou à l'insuline, mesure de la composition corporelle au minispec), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agréé pour transport d'animaux sera réquisitionné - des points limites (ou critères d’arrêt anticipés) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits. - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (anesthésie/analgésie), - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques), - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons utiliser la souris pour plusieurs raisons : - La souris est un animal petit,facile à élever dans une animalerie. Cet animal possède un taux élevé de reproduction ce qui nous permet d’avoir à disponibilité un nombre suffisant d’animaux dans notre protocole. - Nous disposons de lignées murines transgéniques pour réaliser notre projet. Ces modèles permettent d'étudier et d'identifier le rôle de certaines protéines ou récepteurs dans les mécanismes biologiques étudiés au sein d'un tissu ou organe. - Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. - Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides sur ce modèle animal. - Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'atherosclérose sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 12 semaines. Cet âge est classiquement utilisé dans les études portant sur le métabolisme ou l'athérosclérose. Des mises sous régime gras contenant du sucrose et du cholestérol pourront avoir lieu, à partir de cet âge, sur une durée maximum de 60 semaines. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris. Ce protocole permet aussi d'étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme.
Développement d’une stratégie de ciblage des macrophages synoviaux pour le traitement personnalisé des différents pathotypes d’arthrose dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
3 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie de déstabilisation du ménisque du genou, une autre reçoit des injections de collagénase dans l'articulation pour induire une arthrose, et toutes reçoivent des injections intra-articulaires d'un traitement ciblant les macrophages. Le porteur indique que l'arthrose peut provoquer douleur, prostration et isolement, et que des infections des sutures ou des points d'injection restent possibles. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit simultanément tous les paramètres de la maladie.
Objectifs
L’arthrose est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50% de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble de l’articulation (cartilage, os, membrane synoviale) et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’arthrose est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements traitant les symptômes de la douleur et non les causes précises de l’arthrose existent, ne permettant pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’arthrose. L’inflammation de la membrane synoviale (tissu entourant la zone d’interface entre deux os, lubrifiée par du liquide synovial) semble être un mécanisme clé dans l’initiation et la progression de l’arthrose. Les macrophages, cellules immunitaires impliquées dans la surveillance de notre organisme et dans certaines réactions inflammatoires, représentent la population immunitaire la plus importante dans la membrane synoviale et plusieurs études ont montré leur rôle pathologique au cours du développement et de la perpétuation de l’arthrose. De plus, nos résultats préliminaires ont identifié plusieurs sous-populations de macrophages d’intérêt au sein d’échantillons de membranes synoviales de patients atteints d’arthrose. L’objectif de ce projet vise donc (1) à valider chez la souris l’identification d’une ou plusieurs populations de macrophages de la membrane synoviale impliquées dans l’arthrose ; et (2) à développer une stratégie de ciblage de ces macrophages pour le traitement spécifique de l’arthrose. Pour cela, l’utilisation de trois modèles murins différents est nécessaire afin de représenter au mieux les différents sous-groupes de patients atteints d’arthrose observés en clinique. L’ensemble de ces données ouvrira la voie à l’étude de cette stratégie de ciblage spécifique des macrophages dans l’arthrose pour une utilisation thérapeutique. Enfin, dans la littérature, des données montrent une association entre les modifications du microbiote intestinal (ensemble des microorganismes du système digestif) et le développement de l’arthrose. Ainsi, nous mettrons à profit les expérimentations précédentes et nous analyserons le microbiote intestinal des trois modèles murins d’arthrose afin d’étudier le lien, à l’heure actuelle incompris, entre composition de ce microbiote et développement de l’arthrose.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints d’arthrose est à ce jour peu efficace et, compte-tenu l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le développement de traitements de l’arthrose représente un défi majeur. Ce projet permettra d'une part, de confirmer l’implication des macrophages de la membrane synoviale dans le développement et la progression de l'arthrose ; et d'autre part, d’apporter la preuve de concept de l’efficacité d’un nouveau traitement spécifique de cette maladie, ciblant les macrophages de la membrane synoviale dans différents modèles murins représentant la diversité des manifestations cliniques et biologiques observées chez les patients. Ces travaux pourront, à plus long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques personnalisées pour des essais cliniques chez le patient chien (animal présentant naturellement de l’arthrose, de façon similaire à l’Homme) puis chez l’Homme. En parallèle, ce projet permettra également d’approfondir l’axe de recherche du microbiote dans l’arthrose. Il permettra, pour la première fois, d’évaluer l’impact du développement de l’arthrose sur la composition microbienne intestinale. Ainsi, ces résultats préliminaires ouvriront la voie à des études ultérieures et leur impact pour les patients sera majeur.
Procédures
Une partie des animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d'un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs à l’articulation) du genou droit. Une autre partie sera soumise à deux injections intra-articulaires de collagénase (molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage) dans le genou droit. L’ensemble des animaux recevra une ou plusieurs injections intra-articulaires du traitement spécifique, appelé lipoplexes, permettant de modifier l’activité des macrophages de la membrane synoviale pour le traitement de l’arthrose. Ces opérations seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire.
Impact sur les animaux
Lors du développement de l’arthrose, de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer se proster, s’isoler des autres animaux et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Dans le modèle d'induction chirurgicale de l'arthrose, une déchirure de la peau, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant la chirurgie, pourrait avoir lieu. De plus, dans de rares cas, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales, au niveau du point d’injection du modèle d'induction chimique de l'arthrose ou au niveau du point d’injection des lipoplexes servant au ciblage des macrophages de la membrane synoviale. De façon générale, les animaux sont suivis régulièrement et différents indicateurs précoces d’une éventuelle douleur et/ou détresse (points limites) seront attentivement observés (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter des tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.
Remplacement
L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires, ainsi que d’un liquide synovial. L'ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant, dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d'une pathologie, comme dans le cas de l'arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour laquelle il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences pertinentes (statistiquement significatives) et reproductibles entre les groupes. De plus, pour mettre au point l'utilisation des lipoplexes, permettant le ciblage des macrophages dans les animaux, des tests préliminaires in vitro seront réalisés sur des cellules en culture et sur des cultures de membrane synoviale, ainsi que des tests préliminaires in vivo sur des souris non arthrosiques, permettant in fine de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. L’association du projet principal, concernant le ciblage des macrophages dans les trois modèles murins d’arthrose, avec le projet secondaire, portant sur l’étude préliminaire du microbiote intestinal dans l’arthrose, permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l'obtention de conclusions fiables concernant les deux questions de recherche distinctes.
Raffinement
De façon générale, un suivi hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-opératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux. Les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec des frisottis et un dôme, permettant de l'amélioration ou enrichissement du milieu de vie. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de chacun 12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront sous couverture anesthésique et analgésique adaptée, en pré- et post-opératoire. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, et la phase de réveil seront effectuées sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils et méthodes d'analyse sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose, plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autres part, elle permet la constitution de groupes d'animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des analyses pertinentes et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation, assurant la faisabilité de notre stratégie. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose est possible et documentée dans la littérature. Dans le cas du développement d’une arthrose spontanée, les protocoles débuteront chez des souris âgées de 12 mois (âge minimum à partir duquel une arthrose spontanée se développe).
Etude du stress mitochondrial dans le muscle squelettique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont mises à jeun, subissent des prélèvements sanguins, des épreuves de course et une mesure de force musculaire sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever leurs tissus. Le porteur mène une étude fondamentale sur un axe de signalisation mitochondrial et renvoie au conditionnel d'éventuelles orientations thérapeutiques. Il revendique un "besoin urgent" d'explorer cet axe in vivo et affirme n'avoir "pas d'autre choix" qu'un "organisme entier".
Objectifs
Dans les cellules qui composent notre corps, il existe des petites centrales énergétiques (les mitochondries) qui fournissent une grande partie de l’énergie nécessaire au fonctionnement de notre organisme. Or, des dysfonctionnements de ces mitochondries dans les muscles, le cerveau ou le système immunitaire sont responsables de nombreuses pathologies chez l’homme. Lorsqu’elles sont endommagées ou bien stressées, les mitochondries transmettent des signaux à la cellule qui adapte alors son métabolisme pour compenser le dysfonctionnement des mitochondries. C’est grâce à un axe impliquant 3 protéines (OMA1, DELE1 et HRI) que les mitochondries affaiblies communiquent avec la cellule pour qu’elle s’adapte. Jusqu’à présent, cet axe OMA1-DELE1-HRI n’a été exploré in vitro que dans des lignées de cellules en culture qui paradoxalement utilisent peu les mitochondries pour produire de l’énergie contrairement aux tissus tels que les muscles où la production d’énergie dépend largement des mitochondries. Il existe donc un besoin urgent d'explorer le rôle physiologique de cet axe OMA1-DELE1-HRI in vivo, notamment dans le muscle, et de mieux caractériser ses modes spécifiques de régulation et d'activation. C'est ce que nous proposons de réaliser dans ce projet. Ainsi, nos résultats fourniront de nouvelles informations sur les mécanismes impliqués dans la restauration du bon fonctionnement cellulaire suite à un stress mitochondrial.
Bénéfices attendus
L'hypothèse centrale de ce projet de recherche est que l'axe OMA1-DELE1-HRI contrôle l’équilibre énergétique du muscle squelettique en régulant l’activité métabolique, et contrôle ainsi les performances musculaires qui se dégradent au cours du vieillissement ou dans des maladies résultant d'un dysfonctionnement mitochondrial, telles que les myopathies mitochondriales. Bien qu’il s’agisse d’une étude fondamentale, l’exploration de l’axe OMA1-DELE1-HRI dans le contrôle de l’équilibre énergétique du muscle squelettique pourrait permettre de déterminer de nouvelles orientations thérapeutiques pour lutter contre les myopathies mitochondriales ainsi qu’améliorer les performances musculaires qui diminuent lors du vieillissement.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - Mise à jeun de 16h ou 4h, 7 prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 secondes, sur 2h, 1 fois dans la vie. - Epreuves de course, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la vitesse maximale aérobie environ 30 min, l’endurance environ 1h30 et la mesure du lactate dans le sang après une épreuve d’endurance à nouveau environ 1h30. Pour la mesure du lactate dans le sang, les animaux subiront deux prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 s, l’un avant et l’autre après la course. - Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale avec analgésie forte, 1 fois dans leur vie : chaque intervention durera au maximum 1h, soit 2h30 de manipulation au total en comptant depuis la première injection d’analgésique et jusqu’au réveil complet. Toutes ces interventions seront séparées a minima de 4 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress léger lié à la contention, aux injections ou aux prélèvements, ou modéré lors des épreuves de course. Les injections et prélèvements pourront causer une douleur légère et brève aux animaux. A l’issue de la mesure de force sous anesthésie, les animaux pourraient ressentir une douleur légère à modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Le but de ce projet est d'explorer le rôle physiologique de l’axe OMA1-DELE1-HRI dans la réponse intégrée au stress médiée par les mitochondries in vivo, cela dans le muscle squelettique. Pour évaluer la conséquence de l’absence de Dele1 sur la fonction et la physiologie musculaire notamment suite à un effort, nous n’avons pas d’autres choix que d’étudier un organisme entier, ici la souris, dans un contexte de délétion génétique dont nous avons pu établir la pertinence.
Réduction
Grâce à nos connaissances accumulées sur les tests d’efforts chez les souris et les études ex vivo réalisées, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possible, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. Nous utiliserons pour cela des analyses statistiques adaptées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, par groupe social stable, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). En dehors de ce cas, seuls les mâles reproducteurs seront maintenus isolés. Pour l’optimisation de la fonction locomotrice des animaux réalisant des tests de course, nous rajoutons une grille amovible sous le couvercle des cages. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Grâce à la génération de délétion génétique de protéines d’intérêt par manipulation du génome, la souris est un mammifère particulièrement pertinent pour l’étude de l’implication d’une protéine dans les mécanismes physiologiques et physiopathologiques. La souris présente par ailleurs des atouts zootechniques (temps de reproduction court, petite taille, effectifs importants) et techniques (familiarité et facilité de manipulation). Nous utiliserons des animaux Dele1-KO et WT issus de mêmes portées entre l’âge de 2 à 9 mois. Ces âges seront pertinents pour les études réalisées car c’est à cet âge que les capacités physiques de la souris sont les meilleures.
Caractérisation d’un modèle murin reproduisant une myopathie liée à une déficience en cavéoline 3 et évaluation de potentielles thérapies. 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour une myopathie qui reste sans symptômes marqués, elles subissent des tests de force, des courses jusqu'à épuisement contraintes par de petits chocs électriques et des prélèvements sanguins répétés, avant la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur évalue deux thérapies et attend du projet de "premières preuves de concept" pour de futurs patients. Il écarte le modèle cellulaire, qui n'évalue pas la contractilité du muscle, et juge l'évaluation in vivo "indispensable".
Objectifs
Les cavéolinopathies sont des maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. Actuellement, aucun traitement n’existe. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de deux thérapies, capables d’améliorer les fonctions motrices de souris atteintes d’autres maladies du muscle et présentant des symptômes similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra fournir les premières preuves de concept pour soigner des patients atteints d'une maladie rare du muscle. Elle permettra, en outre, de mieux comprendre cette maladie et les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force non invasifs et durant 1 minute au maximum seront réalisés une fois par semaine entre 7 et 12 semaines. Chacun de ces tests sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 mins. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à épuisement sera réalisés entre 1 et 3 fois durant la période de test des animaux et durera au maximum 1h40. L'animal sera également laissé libre dans une cage pendant 12h afin d'étudier ses mouvement spontanés. Des prélèvements de sang seront effectués toutes les deux semaines au maximum et ne dépasseront pas 10% du volume total de l'animal. Durant ces prélèvements, les souris seront maintenues dans un tube pendant moins de 5 mins afin d'avoir accès à leur queue pour la prise de sang. Des tests cardiaques seront réalisés sur des souris anesthésiées au cours de la même expérience, afin de limiter le nombre d'anesthésies. Ces tests dureront au maximum 30 mins. Un test final sera effectué sur souris anesthésiées précédant l’euthanasie des animaux pour mesurer la force musculaire des souris. Ce test dure au maximum une heure. Une biopsie auriculaire durant moins de 2 mins sera effectuée à 3 semaines afin d'identifier les animaux ainsi que leur mutation grâce à l'ADN qui sera extrait de cette biopsie.
Impact sur les animaux
Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont la contention temporaire de l’animal, la chute de l’animal dans une cage remplie de litière, l’extension de l’animal par tirement progressif de la queue par l’expérimentateur, l’isolement de l’animal dans un cage spéciale pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques et l’anesthésie générale de l’animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de deux thérapies sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisament proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.
Réduction
La grande majorité des tests étant non invasif, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre ainsi que du carton, pour permettre aux souris de ronger. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 à 2 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. L’animal sera sorti de la cage à l’aide d’un tube ou les mains du manipulateur disposées en coupe pour réduire leur stress. Lors de l'évaluation des fonctions cardiaques sous anesthésie, une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Durant les mesures de force, l'animal sera anesthésié et analgésié afin d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. Pour chaque anesthésie, la température corporelle de l'animal sera maintenue au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Pour chaque expérience de phénotypage, l'animal sera tout d'abord familiarisé avec le matériel pour minimiser autant que possible son stress.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé reproduit les problèmes de dégénérescence de fibres musculaires retrouvés chez les patients. Les souris malades ne présentent cependant pas de symptômes cliniques importants et peuvent vivre aussi longtemps que des souris saines sans être handicapées au quotidien. Dès 8 semaines, on retrouve des défauts de fibres musculaires, et à 12 semaines une forte régénération des fibres. Les tests seront donc réalisés entre 7 et 12 semaines, sur souris adultes.
Caractérisation des effets du tamoxifène sur la fonction musculaire chez un modèle murin reproduisant une forme récessive de myopathie centronucléaire causée par des mutations dans le gène Ryr1
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 70 après des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour reproduire une myopathie congénitale, elles développent atrophie musculaire, scoliose et espérance de vie réduite à moins de 57 jours, et subissent des tests moteurs répétés puis des mesures de force sous anesthésie. Le porteur teste un médicament déjà utilisé en clinique et affirme viser une application clinique rapide. Il écarte les modèles cellulaires, qui n'évaluent pas la contractilité musculaire, et juge l'essai in vivo "indispensable".
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’un agent pharmacologique déjà utilisé en clinique dans d’autres maladies pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets d’une molécule pharmacologique déjà approuvée et utilisée en clinique dans d’autres pathologies pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pouvant avoir une application en clinique rapide.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs, qui permettront d’évaluer les performances et capacités motrices de l’animal, seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines pendant 5 semaines (i.e. jusqu’à l’âge de 8 semaines). Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. L’activité locomotrice spontanée et la posture debout de l’animal seront acquises pendant 24h, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par inhalation d’un mélange gazeux ou par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux présentent une perte de poids à partir de 14 jours après la naissance, une scoliose et une cyphose, une atrophie musculaire, une faiblesse musculaire et une durée de vie réduite par rapport à des animaux contrôles (les animaux ne survivent pas plus de 57 jours). Les mâles et les femelles sont affectés. Aucune douleur n'a été rapportée chez ces animaux. Les animaux seront identifiés et génotypés à partir d’une biopsie prélevée à partir de 14 jours suivant la naissance. Les animaux seront isolés. Les animaux seront mis sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets d’un agent pharmacologique sur le muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation des effets d’un agent pharmacologique in vivo est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Pour la partie accouplement, le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en faisant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement en fin de traitement, ce qui permet non seulement de collecter les différents tissus sur ces mêmes animaux mais également de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. Ce point est important car il est à l’origine de la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé est modèle transgénique non disponible sur le marché qui reproduit les caractéristiques principales de la maladie étudiée. Le modèle développe des symptômes de myopathie dès 14 jours après la naissance. La durée de vie maximale est de 57 jours et la majorité des animaux meurt avant l’âge de 7 semaines, nécessitant la mise à mort entre 5 et 8 semaines du fait de la perte de poids et de la faiblesse musculaire sévère. Les tests comportementaux seront réalisés une fois par semaine sur des animaux âgés de 3 semaines sur une période de 5 semaines (donc jusqu’à l’âge de 8 semaines). Les animaux utilisés pour l’évaluation de l’espérance de vie seront maintenus en vie jusqu’à l’âge de 7 mois.
Evaluation du potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes pour traiter les dysferlinopathies
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
163 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, pour 35 d'entre elles, et modéré, pour 128. Modèles d'une myopathie, elles subissent des tests de force et une course forcée jusqu'à l'abandon, entretenue par de petits chocs électriques, ainsi que des prélèvements pouvant atteindre 15 % de leur volume sanguin, avant d'être mises à mort à six mois pour prélever leurs muscles. Le porteur affirme qu'un modèle cellulaire "ne suffit pas" pour évaluer une thérapie sur la contractilité musculaire et l'organisme entier. Il justifie la mise à mort précoce par la volonté d'éviter la progression de la maladie.
Objectifs
Les dysferlinopathies font partie des maladies rares du muscle et regroupent notamment la myopathie distale de Miyoshi et la myopathie des ceintures 2B. Les principaux signes cliniques sont la faiblesse musculaire et une atrophie prononcée des muscles, pouvant mener à des déficiences fonctionnelles sévères. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces maladies, et aucune preuve de concept thérapeutique permettant de restaurer les fonctions motrices de souris modélisant cette myopathie. L'objectif de ce projet est ainsi d'étudier le potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes jouant un rôle important dans le muscle et s'étant déjà montrée efficace pour d'autres types de myopathies présentant des dérégulations similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'évaluer deux potentielles thérapies et pourrait permettre de fournir une première preuve de concept thérapeutique en vue de traiter des patients atteints de dysferlinopathie. En outre, cette étude apportera de nouvelles clés de compréhension sur les mécanismes associés à cette maladie et sur les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force et de coordination non invasifs réalisés sur un temps court (une minute environ et 5 mins respectivement) seront réalisés trois fois durant la période d'étude des souris (de 4 à 6 mois d'âge). Chaque test sera réalisé trois fois avec un temps de repos de 10 minutes. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à abandon sera réalisé 1 à 3 fois durant la vie de l'animal et durera au maximum 1h40. Les mouvements spontanées de l'animal seront également quantifiés durant 12h en laissant l'animal seul dans une cage. Des prélèvements de sang de 15% du volume total de l'animal seront réalisés toutes les deux semaines au maximum. Un dernier test sous anesthésie précédant l'euthanasie des animaux permettra de mesurer la force musculaire des souris. Ce test durera au maximum une heure, et l'animal sera surveillé. Afin de savoir quels sont les animaux myopathes et/ou traités, une biopsie sera obtenue par poinçonnage de l'oreille entre 14 et 28 jours d'âge. Les animaux seront identifiés par tatouage d'un numéro à la base de la queue.
Impact sur les animaux
Les premiers signes cliniques apparaîssent à 4 mois chez les souris et se limitent à de la faiblesse musculaire au niveau des membres, pouvant induire une angoisse modérée chez l'animal. Les animaux seront euthanasiés à 6 mois afin d'éviter la progression de la maladie et pour réaliser par la suite des analyses moléculaires. Les nuisances causées par les différents tests sont la chute de l'animal dans une cage remplie de litière entraînant une légère peur chez l'animal, l'extension de l'animal par tirement progressif de la queue par l'expérimentateur, l'isolement de l'animal pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques pouvant entraîner des douleurs musculaires sur le court terme et l'anesthésie générale de l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des deux procédures afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et histologiques. Les animaux issus des accouplements ayant pour but le maintien de la lignée durant la durée du projet seront euthanasiés avant l'apparition des signes cliniques.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de thérapies sur les fonctions locomotrices et la fatigue musculaire. Malheureusement, l'utilisation d'un modèle cellulaire ne suffit pas pour évaluer le potentiel d'une thérapie dans le cas d'une maladie musculaire. En effet, il est nécessaire de pouvoir évaluer les effets sur la contractilité du muscle ainsi que sur l'ensemble de l'organisme. Le modèle murin, étant suffisamment proche de l'homme physiologiquement et structurellement, permet de pouvoir étudier la physiopathologie ainsi que les effets d'une thérapie.
Réduction
Les tests phénotypiques prévus sont faiblement invasifs et permettent donc un suivi longitudinal des souris, ce qui réduit fortement le nombre de souris nécessaires. Les analyses histologiques et moléculaires seront effectuées sur les mêmes animaux après euthanasie. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans une étude traitant des déficits moteurs du même modèle de souris et permettant d'observer des différences de démarche, d'activité locomotrice et de poids de muscles entre les souris myopathes et les souris saines dès 15 semaines d'âge.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre. En cas de difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Lors des mesures in situ, le stress et la douleur liés à la procédure seront éliminés par injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésiants et d'analgésiques. Durant toute l'expérience, la température corporelle de l'animal sera maintenue à sa valeur basale au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Un contrôle visuel de sa respiration sera effectué. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et observé quotidiennement pour vérifier que leur état ne se dégrade pas. Dès lors qu'une perte de poids est observée, les animaux seront alors pesés quotidiennement. L'animal sera sorti de sa cage par les mains du manipulateur disposées en coupe. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour minimiser son stress.
Choix des espèces
Les souris sont suffisamment semblables à l'homme physiologiquement pour être un bon modèle d'étude des maladies musculaires. Dans notre projet, par exemple, la mutation présente chez les souris provient d'une mutation spontanée d'une lignée murine récapitulant les principaux signes cliniques observés chez l'homme. Les souris seront utilisées entre 4 mois et 6 mois d'âge, i.e. adultes. Cet âge correspond à l'apparition des signes cliniques moteurs chez les souris déficientes en dysferline. Le phénotype dégénère progressivement tout au long de la vie de la souris, il est donc préférable de réaliser les tests phénotypiques le plus tôt possible afin de limiter l'angoisse animale.
Mesures par électromyographie de l’activité neuro-musculaire chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent des électromyographies sous anesthésie tous les trois mois pendant vingt et un mois, sous régime obésogène pour une partie, avant le prélèvement de leurs muscles, pour valider un protocole de mesure de l'onde H et prendre en main un nouvel appareil. Le porteur présente ces mesures comme non invasives et vise à en faire une "prestation" ouverte à la communauté scientifique. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet ces mesures et qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal.
Objectifs
Examen de référence en neurologie, l’électromyographie (EMG) permet d’analyser l’activité électrique des nerfs et des muscles chez l'Homme. En complément de l’examen clinique, il aide au diagnostic de différentes pathologies nerveuses et musculaires. L'EMG est utilisée chez la souris pour étudier les maladies neuromusculaires. Après stimulation électrique du nerf sciatique, la réponse électrique au niveau du muscle plantaire est enregistrée. Deux ondes sont présentes dans cette réponse : une onde motrice (onde M), correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres motrices du nerf sciatique, et une onde réflexe (onde H) correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres sensorielles du nerf sciatique. La latence et l'amplitude de ces ondes permettent de détecter une atteinte neuromusculaire. L'onde H est difficile à détecter et à mesurer car son amplitude est faible (inférieure à 1 mV) et l'onde peut être difficile à distinguer du bruit de fond. Nous avons fait l'acquisition d'un système EMG qui permet d'éliminer le bruit de fond et de visualiser l'onde H. Une équipe partenaire a mis au point et validé un protocole permettant d'observer correctement l'onde H. Nous souhaitons d'une part prendre en main ce nouvel appareil et valider notre capacité à observer une onde H en utilisant quelques animaux envoyés par cette équipe, d'autre part valider ce protocole de mesure de l'onde H dans notre laboratoire avec les souris C57Bl6J adultes jeunes et âgées afin de déterminer si l'évolution de l'amplitude de l'onde H chez ces souris est une variable d'intérêt pour les études sur le vieillissement, et enfin, tester si un régime obésogène, entraine une diminution plus rapide de l'amplitude de l'onde H chez les souris, signant un développement précoce d'atteintes neuromusculaires liées à l'âge. Ces mesures non invasives, si nous validons nos protocoles lors de ce projet, seront proposées à la prestation dans notre plateforme d'exploration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Validation du protocole de mesure de l'onde H dans notre laboratoire, plateforme d'exploration fonctionnelle ouverte à la communauté scientifique - Ouverture d'une nouvelle prestation répondant à des besoins exprimés par la communauté scientifique locale - Utilisation d'une variable obtenue de manière non invasive dans les études du vieillissement.
Procédures
Mesures de l'electromyogramme (EMG) sous anesthésie générale chaque 3 mois durant 21 mois maximum. Mise en régime obésognène durant 21 mois. Pour l'enregistrement de l'EMG, les souris sont anesthésiées par voie intra-péritonéale (durée de l'injection
Impact sur les animaux
La mesure de l'EMG ne présente pas de nuisance pour l'animal qui est anesthésié. Si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Les souris FXN-Pvalb ont une délétion homozygote du gène codant pour la frataxine. Ces animaux présentent une mortalité liée à l'apparition de crises épileptiques à partir de l'âge de 20 semaines, âge qui ne sera pas atteint au cours de notre protocole, les animaux étant euthanasiés à l'âge de 15 semaines. Par ailleurs, des déficits de coordination motrice apparaissent dès l'âge de 5 semaines. Ces déficits augmentent au cours du temps et à l'âge de 15 semaines, ces animaux présentent des troubles de la démarche marqués mais non délétères.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de permettre le prélèvement de différents organes d'intérêt, notamment des muscles afin de comparer les mesures EMG et des observations histologiques.
Remplacement
Les modèles murins de neuropathies présentent des troubles moteurs. Pour étudier l'efficacité thérapeutique d'une molécule d'intérêt, ces troubles moteurs sont évalués au cours du temps et les mesures électromyographiques viennent compléter les phénotypes observés. Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique ou du vieillissement sur la coordination motrice. Il est donc indispensable de pouvoir réaliser des mesures électromyographiques sur l'animal.
Réduction
Les effectifs utilisés dans ce protocole ont été établis par étude de puissance sur les mesures électromyographiques. Ainsi, pour une puissance d'analyse de 80% avec un risque de 5%, nous avons défini des tailles de groupes de n=12 pour pouvoir conclure sur les paramètres mesurés. Nous avons constaté que cette taille d'effectif convenait dans les études électromyographiques antérieures réalisées chez nos partenaires d'autres plateformes nationales. Dans le protocole de challenge nutritionnel qui s'étale sur 21 mois, la cohorte de départ est doublée pour garantir un nombre correct d'animaux exploitables jusqu'au dernier point de mesure. La latence et l'amplitude de l'onde H seront les paramètres analysés. En fonction de la normalité des données, la comparaison des résultats entre deux groupes sera réalisée à l'aide d'un test paramétrique ou non paramétrique. Nous utiliserons 168 souris au total pour cette étude.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un travail de raffinement qui devrait nous permettre de préserver au maximum le bien-être des animaux tout au long des procédures. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage, ils sont hébergées par cage de 4. De l'enrichissement sera ajouté pour pour amoindrir le stress et permettre aux animaux de faire un nid, des igloos seront placés dans les cages. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours par les personnels de la zootechnie et 2 fois par semaine par une personne impliquée sur le projet, ceci permettant de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements.
Choix des espèces
Notre plateforme propose des expérimentations sur les souris de laboratoire, c'est également l'espère hébergée dans la zootechnie dans laquelle sera installé le matériel. C'est par conséquent l'espèce sur laquelle nous souhaitons travailler et nous entrainer afin de répondre aux besoin de nos utilisateurs. Les souris FXN-Pvalb sont utilisées pour modéliser l'ataxie de Friedreich et montrent une diminution progressive de l'amplitude de l'onde H à partir de l'âge de 7 semaines. Un premier EMG sera réalisé à l'âge de 5 semaines, avant que l'amplitude de l'onde H ne commence à diminuer chez ces souris, puis un deuxième EMG sera réalisé à l'âge de 15 semaines, lorsque l'amplitude de l'onde H est fortement diminuée chez les souris FXN-Pvalb. Ces animaux seront donc utilisés au stade jeune et adulte. Les souris C57Bl6J seront utilisées du stade jeune adulte (3 mois) jusqu'au stade âgé (24 mois) pour répondre à la question de l'évolution de l'onde H au cours du vieillissement sous challenge nutritionnel ou non.
Etude de la physiopathologie du syndrome de Marfan dans un modèle de poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
2 814 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Porteurs de mutations reproduisant le syndrome de Marfan, ils subissent des prélèvements de nageoire, des exercices de nage forcée pour mesurer vitesse et endurance et un protocole d'entraînement de plusieurs semaines, pour étudier les atteintes musculo-squelettiques de la maladie. Le porteur décrit une possible émaciation et des comportements d'anxiété ou de résignation, avec arrêt du protocole au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme que le poisson zèbre est le modèle vertébré "le plus simple" pour cette étude, plus rapide et moins coûteux que le rongeur.
Objectifs
Le syndrome de Marfan (SM) est une maladie génétique rare (1/5000), touchant aussi bien les hommes que les femmes. Les patients présentent des atteintes cardiovasculaires, oculaires et musculo squelettiques. Les anomalies cardiaques sont responsables d’une mortalité précoce, qui est maintenant contrôlable grâce aux progrès dans la prise en charge de la maladie. Par contre, la fatigue chronique et la moindre endurance physique sont des affections fréquentes des patients atteints de SM avec un impact important sur la qualité de vie, aussi l’intérêt de recherche s’est tourné vers une meilleure compréhension des atteintes musculosquelettiques. Une fragilité des tissus de soutien et un déficit musculaire, à l’origine d’un stress accru sur le système musculosquelettique, pourraient participer à ces symptômes. Une étude clinique a rapporté un déficit en masse maigre dès l'enfance et s'aggravant avec l'âge, et la pertinence d'un programme d'entraînement est actuellement évaluée. Comprendre les mécanismes à l’origine de ce déficit musculo-squelettique pourrait permettre l’identification de cibles thérapeutiques spécifiques et le développement de traitements. Nous proposons donc de développer un modèle animal original de la maladie et d’explorer les paramètres osseux et musculaires. Le poisson zèbre représente le système vertébré le plus simple disponible à ce jour pour évaluer l’impact d’une mutation d'un gène associé à une maladie génétique sur le système musculo squelettique à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire et de pouvoir évaluer les bénéfices éventuels d’un entrainement. Nous souhaitons donc développer et caractériser des lignées de poisson zèbre portant des mutations équivalentes aux mutations responsables du SM chez l'Homme. Leur comparaison permettra de mieux comprendre la physiopathologie du SM, afin d’identifier de possibles cibles thérapeutiques et d’optimiser les protocoles d’entrainement personnalisé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux documenter la physiopathologie du SM, qui est à l’heure actuelle mal comprise, et d’identifier des stratégies thérapeutiques allant de programme d’entrainement à des approches pharmacologiques qui pourront toutes deux être testées dans ce modèle poisson -zèbre de la maladie.
Procédures
-Prélèvement unique à la nageoire caudale pour génotypage sous anesthésie -Mesure mensuelle de la taille et du poids sous anesthésie -Analyse locomotion et comportement; durée 3h avec acclimatation; isolement -Exercice de nage forcée pour détermination de la vitesse maximale; durée
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus concernent essentiellement le phénotype associé à la perte de fonction du gène muté chez les patients atteints du syndrome de Marfan, qui devrait reproduire le syndrome de Marfan humain, et associe des malformations cardiovasculaires, oculaires et musculo-squelettiques. D’après les quelques données de la littérature, le développement du phénotype chez le poisson zèbre ne s’observe qu’à l’état homozygote (c'est-à-dire quand les 2 exemplaires du gène sont mutés) ou sur des doubles mutants. Cependant, le SM étant une maladie dominante (c'est-à-dire que la mutation sur un seul exemplaire du gène suffit à déclencher la maladie) chez l’Homme, une attention sera portée sur les hétérozygotes (un seul exemplaire du gène muté). En lien avec ces atteintes, les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnée de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qui sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Pour les procédures expérimentales, le prélèvement caudal pour le génotypage est réalisé sous anesthésie et les animaux recouvrent leur capacité à nager normalement dès le réveil. L’analyse du comportement de nage nécessite l’isolement du poisson dans le bac où le film est réalisé, isolement qui est maintenu pendant une durée maximale de 3 heures. Pour la nage forcée, la durée de nage à la vitesse maximale est une source de stress, mais ne pourra excéder 3 minutes. L'ensemble des points limites est détaillé dans chaque procédure.
Devenir
A l'issue des différentes procédures les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus pour des analyses histologiques et de l'expression génique (taille des fibres musculaires, structure des tissus de soutien, analyse du squelette, inflammation).
Remplacement
Comprendre la physiopathologie du SM nécessite l’utilisation d’un organisme intégré dans lequel l’étude des différents systèmes (cardiovasculaire, musculosquelettique) altérés dans cette maladie soit possible de même qu’une évaluation comportementale transposable à l’Homme. A ce jour, ces informations ne peuvent être obtenues à partir de modèles non animaux (cultures cellulaires ou organoïdes). Le poisson -zèbre représente pour cela le modèle vertébré le plus simple à ce jour, avec de nombreux systèmes moléculaires et cellulaires conservés avec les mammifères, et présente l’avantage de pouvoir facilement réaliser de la mutagenèse in vivo et produire des lignées transgéniques d’intérêt.
Réduction
A notre connaissance, 3 équipes ont développé des modèles de SM (perte de fonction) mais qui ne sont pas rendus disponibles à ce jour. De plus, dans l’idée de réaliser des corrélations phénotype/génotype entre ces mutations perte de fonction et des mutations ponctuelles générées de façon originale par notre équipe, il est essentiel de comparer des animaux de même fond génétique afin de s’affranchir de l’effet de gènes influenceurs pouvant différer d’un fond génétique à un autre. Nous effectuerons cependant une veille régulière des différents dépositaires afin de stopper la production de modèles redondants avec ceux disponibles. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observés au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 8 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour le suivi longitudinal des cohortes, des sous-groupes de 4 animaux seront nécessaires pour documenter les différents phénotypes au cours du temps. Les différents tissus seront biobanqués (congélation et inclusion paraffine) afin d’optimiser l’utilisation des animaux. Si un phénotype est présent sur les lignées simple mutation, les autres lignées ne seront pas produites. De même, si un phénotype est présent dès le stade hétérozygote, les élevages seront réalisés de façon à ne pas produire d’homozygotes. Afin de réduire le nombre d’animaux, les expérimentations n’ayant pas d’impact les unes sur les autres seront réalisées sur les mêmes animaux.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres pourra induire une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% du poids de référence de l'animal (poids maximal atteint) conduira à l'arrêt du protocole expérimental. Lors des expérimentations, des phases d’isolement ou des mises en reproduction, les bacs seront posés sur des photos représentant des fond aquatiques. Pour les suivis longitudinaux nécessitant une séparation des différents animaux d’une même ponte, les animaux d’intérêt seront maintenus avec des animaux d’un autre fond génétique afin de ne pas rester isolés. Pour les tests fonctionnels (tunnel de nage), une phase d’habituation au nouvel environnement sera systématiquement réalisée. Tous les poissons sont nourris deux fois par jour, avec notamment des artémies (crevettes fraiches) vivantes, cultivées sur place, qui représentent une source de nutriments frais et une forme d'enrichissement, puisque les poissons les chassent dans le bac.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est génétiquement modifiable, rendant aisé la génération de mutant d’un gène d’intérêt reproduisant une maladie génétique humaine comme le SM, et permet des études de grande envergure tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses que celles menées chez le rongeur. Le poisson zèbre est aussi un modèle pertinent pour étudier les dysfonctions musculo- squelettiques et cardiovasculaires, et récapitule les processus physiopathologiques observés chez l'Homme. De plus, beaucoup d’événements biologiques sont analysables par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées rapportrices ont été générées et sont facilement disponibles dans la communauté scientifique, permettant de répondre à de vraies questions biomédicales. Pour toutes ces raisons, le poisson zèbre est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration mécanistique. Un suivi du développement des signes de la maladie sera réalisé depuis le stade larvaire jusqu’au stade adulte, le SM étant une maladie se développant dès l’embryogenèse mais évoluant tout au long de la vie. De plus, une finalité du projet étant d’identifier des leviers thérapeutiques potentiels, l’évaluation du potentiel curatif d’approches thérapeutiques sur des traits cliniques installés est nécessaire.
Impact d’un régime hypoprotéique sur le métabolisme protéino-énergétique en cas de déficience en OTC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales destinées à inactiver un gène intestinal, puis 48 d'entre elles subissent trois semaines de régime pauvre en protéines et un isolement de 48 heures sans enrichissement, pour étudier le rôle de la citrulline dans le métabolisme. Le porteur assume une perte de poids importante comme donnée centrale et fixe la mise à mort à -15 % en une semaine ou -40 % en trois semaines. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" et que la souris est la seule espèce disposant du système génétique utilisé.
Objectifs
Depuis plusieurs années, l’intérêt s’est porté sur les propriétés régulatrices des acides aminés. Plus particulièrement, différents travaux ont montré que la citrulline, un acide aminé n’entrant pas dans la production des protéines, était un puissant activateur de la production des protéines musculaires. De telles propriétés pourraient être mises à profit dans la prise en charge de pathologies atteignant la fonction musculaire. En parallèle, une étude réalisée chez des rats âgés dénutris et confirmée chez l’Homme sain soumis à un régime hypoprotéique, a montré que la citrulline était capable de stimuler la synthèse protéique musculaire et d’augmenter le contenu protéique musculaire. En effet, il a été mis en évidence que l’absence de citrulline plasmatique (via l’extinction du gène de l’OTC, enzyme responsable de la production intestinale de citrulline), lors d’un régime standard, n’avait pas d’effet sur les animaux. En revanche, sous régime faible en protéines, l’absence de citrulline plasmatique entrainait une importante perte de poids chez les animaux (masse maigre et masse grasse). Ces effets n’étaient pas retrouvés chez les animaux recevant de la citrulline par voie orale. Nous cherchons donc maintenant à expliquer pourquoi la citrulline joue un rôle majeur en cas de régime hypoprotéique, et non sous régime standard, sur le métabolisme protéino-énergétique. Le but de ce projet-ci est donc de comprendre les mécanismes par lesquels la citrulline joue un rôle fondamental dans la régulation du métabolisme protéino-énergétique, sous régime hypoprotéique. De ce fait, nous avons choisi de travailler sur une lignée de souris génétiquement modifiée nous permettant d’inactiver spécifiquement la production intestinale de citrulline et d’en évaluer les conséquences sur le métabolisme protéino-énergétique. Nous évaluerons donc le métabolisme protéino-énergétique des souris sans production de citrulline intestinale sous un régime alimentaire hypoprotéique, ainsi que l’intérêt d’une supplémentation exogène en citrulline dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension du rôle de la citrulline intestinale dans le contrôle du métabolisme protéino-énergétique. Une perte de poids importante des animaux (procédure sévère) est fondamentale car elle est une indication du rôle de la citrulline endogène pour maintenir une synthèse protéique physiologique (comparable à la perte musculaire observée lors d’alitement prolongé). Il nous est donc primordial d’avoir assez de temps (3 semaines) pour étudier ce phénomène et donc de tolérer une perte de poids assez importante.
Procédures
Une partie des souris (n=16) recevra de la citrulline par voie orale (administrée dans les croquettes) pendant 7 semaines. Tous les animaux (n=80) seront injectés avec l'agent chimique inducteur de l'inactivation en intrapéritonéal (durée : 30 secondes) pendant 5 jours. Une partie des animaux (n=48) sera soumise à un régime légèrement hypoprotéique (75% des besoins) pendant 3 semaines. Tous les animaux (n=80) : hébergement isolé et sans enrichissement pendant 48h, de façon à suivre leur activité physique spontannée. Tous les animaux (n=80) : Anesthésie et analgésie par injection unique (30 secondes) suivi du prélèvement du cœur.
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux sont les suivantes : stress lié à la contrainte légère et très brève liée à la préhension des animaux pour leur pesée quotidienne, stress lié aux injections intrapéritonéales de l'agent chimique inducteur de l'inactivation (5 fois) et du mélange chimique analgésique/anesthésiant (1 fois) et stress lié à l'isolement et à l'absence d’enrichissement pendant 48h lors des mesures de l’activité locomotrice, d’où le classement en procédure modérée.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés. Le muscle et le coeur ainsi que divers tissus d'intérêt sont prélevés sur l'animal pour être conservés en vue d'analyses futures.
Remplacement
Ce projet étudie les conséquences d’une diminution de la concentration en citrulline plasmatique (via une suppression de l’OTC intestinale) sur le métabolisme protéino-énergétique. Le recours à des modèles alternatifs comme des cellules en culture n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas possible parce que nous nous situons dans le domaine de la physiologie intégrée. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment la citrulline produite par l’intestin module l’équilibre protéino-énergétique au niveau corps entier. Dans le but d’observer des modulations phénotypiques, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce pour laquelle le système de recombinaison CreLox existe.
Réduction
Dans ce modèle, seuls 50% des animaux ont leur concentration plasmatique de citrulline diminuée. De façon à ne pas euthanasier les 50% de souris restantes, nous avons décidé de les utiliser comme groupe contrôle. De plus, un groupe Ctrl-HP+Cit n’a pas été ajouté car, il a été démontré que le métabolisme protéino-énergétique des souris ctrl sous régime hypoprotéique (Ctrl-HP) n’était pas modifié. Il n’y a donc pas d’intérêt à apporter de la citrulline à ce groupe d’animaux. En outre, nous prendrons le soin d’utiliser le nombre minimal d’animaux mais qui permette cependant de tirer des conclusions statistiques (utilisation de tests statistiques adaptés au plan expérimental) avec une puissance de test suffisante. Le nombre d’animaux par groupe (16 dont 8 mâles et 8 femelles) a été estimé sur la base d’études publiées et des résultats précédents obtenus dans cette étude. En effet, il a été utilisé 12 animaux/groupe pour le dosage du rapport ATP/ADP, mais, compte-tenu de la possible mise à mort des animaux avant la fin du protocole due à une perte de poids trop importante (15% en 1 semaine ou 40% en 3 semaines), 16 animaux minimum par condition expérimentale sont nécessaires pour mettre en évidence des modifications significatives du rapport ATP/ADP induites par l’invalidation du gène OTC. Enfin, les expériences ont été soigneusement planifiées (par rapport aux données bibliographiques et à nos résultats préalables) pour permettre la collecte d’un maximum d’informations à partir des individus étudiés. De plus, les organes non utilisés seront congelés pour des études complémentaires éventuelles ou des mises au point de protocoles d'analyses.
Raffinement
Ce protocole fait appel à des procédures expérimentales sévères qui n’engendrent pas de douleur chez nos animaux, mais un stress/une angoisse liée à une perte potentielle d’activité locomotrice nuisant à l’expression de leur comportement fondamental. Pour s’assurer de l’état de santé de nos animaux, nous suivrons très précisément l’état général des animaux ainsi que leur poids à raison de 2 fois par semaine tout au long du protocole, puis tous les jours à partir de la mise sous régime hypoprotéique. Ce suivi entraînera une contrainte légère et très brève liée à la préhension. S’il s’avère que l’un d’entre eux perde du poids de façon importante (-15% au cours d'une semaine ou -40% sur 3 semaines), ou soit blessé ou souffrant, il sera exclu du projet et mis à mort. Une autopsie sera réalisée pour identifier plus précisément les causes de cet état ayant justifié la mise à mort le cas échéant, de façon à optimiser nos procédures pour d'éventuelles études futures. La décision de mise à mort sera prise par un des responsables du projet et/ou la SBEA si le porteur de projet n’est pas disponible rapidement/réactif. Pendant toute la durée de l'étude, à l'exception des 48h nécessaires à la mesure de l'activité locomotrice spontanée, les animaux seront en collectivité, en cages ouvertes, permettant aux individus de sentir la présence de leurs congénères, avec un milieu enrichi par l'ajout d'objets dans les cages (tunnels, abris en carton...). Au moment de la mise à mort, les animaux seront anesthésiés et sous analgésie de façon à ne pas souffrir.
Choix des espèces
La citrulline plasmatique est exclusivement produite via l’Ornithine Transcarbamylase (OTC) au niveau de l’intestin. Afin de pouvoir moduler l’action de cette enzyme et donc la production de citrulline et son impact niveau corps entier, l’utilisation d’animaux transgéniques est indispensable. Les animaux seront injectés avec l'agent chimique inducteur de l'inactivation à l’âge de 10 semaines pour être sûr que le gène de l’OTC soit bien mis en place (inactif avant le sevrage). L’étude à proprement parler (début du régime hypoprotéique) commencera lorsqu’ils seront âgés de 14 semaines, soit 4 semaines après l’injection de tamoxifène de façon à s’assurer que l’OTC est bien inactivée.
Impact d’un composé anti-inflammatoire sur la fonction musculaire dans un modèle murin de la Myopathie de Duchenne
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
36 souris vont être utilisées, en gravité légère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles. Génétiquement porteuses de la myopathie de Duchenne, elles reçoivent un composé anti-inflammatoire mêlé à la nourriture, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie, pour évaluer un candidat-traitement d'une maladie aujourd'hui sans thérapie. Le porteur limite les gestes invasifs, composé dans l'aliment plutôt qu'en injection et mesure par voie cutanée, et n'attend pas d'atteinte au-delà du stress de manipulation. Il indique avoir mené des analyses in vitro au préalable et présente la validation in vivo comme l'étape suivante.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une maladie musculaire irréversible pour laquelle il n'existe actuellement pas de thérapie. Cette pathologie est associée à une inflammation chronique. Des évidences existent montrant un bénéfice d'un traitement anti-inflammatoire sur le muscle, mais actuellement le traitement proposé sont les glucocorticoides qui ont des effets indésirables majeurs lors d'une prise à long terme. L'objectif du projet est d'évaluer l'impact d'une molécule anti-inflammatoire, qui a montré des effets positifs dans d'autres maladies, sur la fonction musculaire de souris atteintes de la myopathie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Le projet vise à évaluer le bénéfice d'un composé anti-inflammatoire sur le muscle malade. Si le composé améliore la force musculaire des animaux malades, des analyses plus poussées pourront être menées (en utilisant les tissus prélevés lors de cette étude), dans une perspective d'utilisation thérapeutique.
Procédures
Les animaux subissent une anesthésie générale pour pouvoir effectuer la mesure de la force musculaire sans stress. La mise en place dans la cage d'anesthésie dure environ 10 secondes et sera effectuée une fois.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont le stress généré par la manipulation des animaux au moment de l'anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en vue de prélever leurs muscles pour des analyses.
Remplacement
Des analyses in vitro ont été menées au préalable et montrent un effet anti-inflammatoire du composé. L'étape suivante est donc de valider in vivo l'efficacité de ce composé. L'amélioration de la fonction musculaire ne peut être réalisée que de façon intégrée et permet d'évaluer l'intérêt thérapeutique de ce traitement dans des conditions précliniques.
Réduction
La force musculaire est un paramètre variable d'un individu à l'autre. Le nombre d'animaux nécessaire pour avoir un résultat définitif a été calculé au plus juste avec un test statistique.
Raffinement
Le composé à tester est inclus dans la nourriture (ce qui évite des injections ou du gavage). La mesure de la force musculaire est réalisée en cutanée (pas d'introduction d'électrodes dans le muscle). Des études précédentes ont montré une prise alimentaire normale et aucun effet indésirable pendant le traitement à la même dose. Aucun impact sur le bien-être de l'animal n'est attendu. Donc, les points limites habituels en vigueur dans l'EU seront suivis en cas de mal être animal, attesté par le comportement (faible mobilité, prostration).
Choix des espèces
La souris myopathe reproduit au niveau de son muscle les défauts observés dans la myopathie de Duchenne, c'est donc un modèle adapté pour tester un composé susceptible d'améliorer le muscle. Les animaux sont utilisés à partir de 8 semaines, c’est-à-dire à l'apparition des symptômes de la maladie dans le muscle.