Système musculosquelettique

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de collagénase dans un disque de sa queue pour provoquer une discopathie que le porteur décrit comme une douleur "intense et longue", puis une pompe analgésique, une injection de plasma enrichi en plaquettes et un suivi par IRM chaque semaine pendant douze semaines. À la fin, les rats sont tués pour prélever leur queue et réaliser des coupes histologiques. Le porteur présente l'application à l'humain comme un transfert facile si la régénération du disque est démontrée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de l'injection de Plasma riche en plaquettes (PRP) pour la régénération discale chez le rat.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de deux ordres : 1) si l’injection de PRP permet une régénération discale chez le rat, ceci pourra être facilement transféré en clinique pour aider au traitement des discopathies humaines. 2) l’IRM est une méthode d’imagerie non-invasive qui devrait permettre d’évaluer l’efficacité thérapeutique du PRP sans biopsie et à des temps précoces.

Procédures

Toutes les procédures décrites dans ce document seront réalisées sous anesthésie générale, grâce à l'inhalation d'isoflurane à dose contrôlée. Chaque rat de ce projet subira une discopathie dans 1 disque de la queue grâce à une injection de collagénase. Sept jours plus tard, une pompe osmotique sera implantée en sous-cutané pour libérer un analgésique en continu. Puis 1mL de sang sera prélevé par la veine caudale pour préparer le PRP. Celui-ci sera injecté dans le disque pathologique la même journée. Finalement, des examens IRM seront réalisés 1 fois par semaine (sans nécessité d’injection d’agents de contraste) pendant 12 semaines.

Impact sur les animaux

La discopathie mécanique entraine une douleur intense et longue si elle n’est pas soignée, comme c’est le cas chez l’humain. C’est pour cela qu’une administration continue d’analgésique sera réalisée depuis l’induction de la maladie jusqu’à l'euthanasie de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés lorsque les points limites seront atteints ou lorsqu'ils auront subi les 12 semaines de suivi IRM. Cette euthanasie est nécessaire pour prélever les queues et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence de sites inflammatoires, valider la régénération du complexe disco-vertébral et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.

Remplacement

La technique IRM permet de définir, chez l’homme, la maladie établie. Notre projet, à visée translationnelle, vise à optimiser une séquence IRM permettant un diagnostic plus précoce de la maladie humaine de discopathie dégénérative, afin d’améliorer la prise en charge de la maladie chez l’homme. Ce projet utilise un modèle animal de discopathie chez le rat dans cet objectif.

Réduction

Seulement 12 rats seront utilisés car notre étude précédente a permis de suivre par IRM l’inflammation discale sans traitement par PRP. Nous souhaitons donc désormais utiliser principalement des rats traités au PRP. Nous analyserons la différence de vitesse de réparation du disque entre les 2 groupes. Un test Anova sera pratiqué.

Raffinement

Les 12 rats seront répartis dans 4 cages avec des tubes en carton, de la paille, du coton, un bois à ronger, de la nourriture et de l’eau à volonté. Des observations quotidiennes et des scorages d’évaluation de la douleur hebdomadaires seront pratiqués dès le début de l’expérimentation pour évaluer l’évolution de la maladie. De ce fait, des points limites ont pu être établis. La cellule bien-être du laboratoire sera impliquée quotidiennement dans l’évolution du protocole. L’analgésie sera appliquée dès le début de l’expérimentation sur l’animal, et sera administrée en continue grâce à l’installation de pompes osmotiques en sous-cutanée tout au long des 12 semaines d’observations IRM.

Choix des espèces

Les rats Lewis seront utilisés du fait de leur utilisation courante dans la littérature. Nous pourrons ainsi comparer facilement nos résultats. Comme nous souhaitons transférer les séquences IRM 3D nouvellement développées à l’homme, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g pour les rats) car la croissance est terminée et le prélèvement sanguin de 1 mL possible.

756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite leur est induite, avec injections intra-articulaires et prélèvements de sang sous anesthésie, pour évaluer une protéine et repositionner des médicaments existants. Le porteur indique que l'arthrite provoque une douleur et fixe un point limite au score maximal aux quatre pattes ou à 20 % de perte de poids, seuil déclenchant la mise à mort. Il affirme que la complexité de la maladie ne peut être étudiée qu'au niveau d'un "organisme entier", les rubriques réduction et raffinement se réduisant à quelques lignes.

Objectifs

1)-Evaluation du rôle de la protéine QKI5 dans l'inflammation de l'arthrite et dans l'érosion osseuse. 2)-Evaluation de médicaments qui induisent QKI5 ou de lentivirus-QKI5 dans l'inflammation de l'arthrite et dans l'érosion osseuse (Repositionnement de médicaments déjà existants sur le marché).

Bénéfices attendus

Compréhension du rôle de QKI5 dans l'arthrite et l'inflammation. Repositionnement de médicaments qui induisent QKI5 pour une application anti-inflammatoire et anti-érosion osseuse.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles, aucune procédure chirurgicale. Prélèvements de sang sous anesthésie. Injections IP de serum ou de médicament Injections intra-articulaires sous anesthésie. Durée de la procédure pour chaque souris : 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'arthrite induite par les différents modèles provoquera une douleur dont l'intensité sera examinée suivant le codage suivant : Le point limite est atteint lorsque le score de l’arthrite est de 12 (3 à chaque patte) et le score total (apparence générale, apparence des orbites, apparence des oreilles, prise alimentaire ou boisson) est > 15 ou lorsque la perte de poids est de 20 % . Les modèles présentés ici ne sont pas nouveaux et ont été décrits de façon extensive dans la littérature par d'autres auteurs.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux justifiée par l'impossibilité de réutilisation.

Remplacement

la complexité de la maladie ne peut être étudiée qu’au niveau d’un organisme entier. Cependant, chaque fois que cela sera possible, les analyses seront effectuées sur des cellules en culture. Réduire : Raffiner : La douleur des animaux sera réduite au maximum par l’utilisation des anesthésiques et l’euthanasie si cela est nécessaire.

Réduction

Le nombre de souris sera limité au strict nombre nécessaire pour une signification statistique des résultats. Six à 8 souris par groupe d’expériences seront utilisées. Les tests statistiques Mann-Whitney et t de Student seront utilisés.

Raffinement

La douleur des animaux sera réduite au maximum par l’utilisation des anesthésiques et l’euthanasie si cela est nécessaire.

Choix des espèces

Les souris possèdent des articulations dont l’inflammation reproduit l’arthrite humaine. Seule l’espèce Mus Musculus possède les souches nécessaires (Transgéniques, KO, KI) Age adulte : 8 à 16 semaines pour l'expérimentation car le système immunitaire est mature. A partir de 8 semaines pour les prélèvements de souris K/BxN car elles sont adultes et que l'arthrite est bien établie.

7 812 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés, ils subissent prélèvement de nageoire pour génotypage, bains chimiques, chocs thermiques et imageries répétées sous anesthésie, pour étudier une malformation du crâne liée au gène Fgfr3. Le porteur indique que des malformations craniofaciales, microcéphalie et scoliose, sont attendues et que les poissons dépassant les points limites seront mis à mort, l'atteinte n'étant pas présentée comme systématique. Il qualifie d'"indispensable" le développement de nouvelles thérapies et conclut au recours au poisson zèbre pour reproduire ces mécanismes.

Objectifs

Les craniosynostoses sont des maladies génétiques qui résultent d’un défaut du processus d'ossification et entrainent une fusion prématurée d’une ou plusieurs sutures crâniennes associées à des malformations crâniofaciales. Outre les problèmes esthétiques ces malformations sont responsables de troubles fonctionnels majeurs dus aux conflits de croissance entre crâne et encéphale qui provoque une hypertension intracrânienne. Aujourd’hui les traitements des craniosynostoses consistent en des interventions chirurgicales lourdes et répétées. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est indispensable et nécessite une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeux au cours de l’ossification dans des conditions normales et pathologiques. Les objectifs du projet seront de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la formation de la voûte crânienne en utilisant des poissons zèbres génétiquement modifiés. Les modèles de poisson zèbres utilisés et développés au cours de ce projet présenteront des malformations crâniofaciales mimant la pathologie humaine (microcéphalie, défaut des sutures) dont le caractère dommageable ne sera présent que tardivement au cours du développement environs 2 mois après la naissance. Les modèles de poissons zèbre développés permettront également de tester l'efficacité de différents composés pharmacologiques qui sont susceptibles de corriger ces malformations au cours de la formation de la voûte crânienne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’un point de vue fonctionnel de mieux définir le rôle de Fgfr3 dans l’ossification membranaire. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les osteochondrodysplasies liées à des mutations de fgfr3. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des craniosynostoses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients. L’établissement de ces modèles de poissons zèbres permettra d’effectuer le criblage de molécules.

Procédures

Procedure 1 à 8: Les animaux génétiquement modifiés subiront une fois dans leur vie des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour génotypage. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte par bain rapide de benzocaïne (1min), puis un segment de 2-3mm de la nageoire caudale est coupé. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Procédure 3: Les animaux seront baignés une fois dans du rouge alizarine et une fois dans de la de la calcéine pendant une nuit chacun. Procédure 4: Les poissons seront baignés 1 fois dans du tamoxifène pendant 7 heures Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 30 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 5: Les poissons seront baignés 1 fois dans de l'actiflash pendant 7 heures. Ils seront irradiés avec un laser UV 1 fois pendant 200fs sous anesthésie générale et maintenues dans de l'hydrogel durée 5 min. Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 10 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésie générale dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L) Procédure 6: Les poissons seront imagés 4 fois en 4 semaines pour cela ils seront maintenues sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 3 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 7: les poissons subiront une seule fois dans leur vie une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (benzocaïne 75mg/L) , l'anesthésie durera 5 min maximum. Procédure 8: les poissons seront soumis à un traitement pharmacologique par balnéation pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation Fgfr3 pPro262Arg, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lesion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis dans le projet seront euthanasiés. D'autre part les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs aux anesthésies répétées, aux chocs thermiques à 37°C, aux isolements nécessaires pour les acquisitions et pour le génotypage des poissons.

Devenir

l'ensemble des poissons de ce projet seront mis à morten fin de procédure

Remplacement

Pour la procédure 8, la sélection des molécules les plus spécifiques et efficaces permettant potentiellement d'améliorer le phénotype pathologique des poissons fgfr3P262R se fera au préalable in vitro afin de ne pas utiliser de poissons lors de cette étape de sélection.

Réduction

Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Les procédures d'imagerie in vivo se feront de maniere longitudinale (Un même individu est analysé à différents temps) ceci permettant d'augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d'individus analysés.

Raffinement

Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Afin d’effectuer le suivi des poissons ceux-ci seront regroupés par génotype et un dénombrement des poissons affectés par symptôme sera effectué quotidiennement. Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation fgfr3 pPro262Arg ; l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. La majorité des procédures seront pratiquées à des stades précoces (environs 6 à 10 semaines post fécondation du développement de la voûte crânienne), stade où les malformations crâniofaciales dommageables sont nulles ou très légères et ne sont pas susceptible d'induire de la souffrance. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Les poissons dont le score dépasse les points limites définis dans le projet seront euthanasiés par surdosage de benzocaïne à une concentration dans l'eau de nage de 375mg/L pour une durée de 15 min. La mort des poissons est visualisable par la perte de flottaison qui suit une période d'anesthésie qui est observée en moins de 2 minutes. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un confocal de type spinning disk permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie qui sera réalisée dans une solution de benzocaïne tamponnée à 75mg/L. Lors de l'acquisition d'images ou de l'irradiation des poissons avec un laser UV, les poissons seront maintenus dans de l’hydrogel. Ce milieu aqueux permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations. Enfin des tests préalables seront réalisés pour réduire au maximum la dose et la durée d’exposition des poissons à des composés pharmacologiques.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette crâniofacial et de la voûte crânienne. La voûte crânienne présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires (ossification membranaire) et moléculaires (conservation des principales voies de signalisation régulant l'ostéogénèse) impliqués au cours de son développement. De plus l’accessibilité du crâne chez le poisson zèbre et l'existence de nombreuses lignées transgéniques permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. Enfin chez le poisson zèbre, Fgfr3 est conservé et exprimé fortement au cours de la formation de la voûte crânienne, contrairement à la souris. L’analyse du phénotype squelettique se fera du stade larvaire (5jpf ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 2 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois). Une grande partie des procédures seront réalisées entre 4 semaines et 8 semaines pendant la formation de la voûte crânienne.

12 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sonde télémétrique est implantée par chirurgie dans un muscle de leur patte, puis l'activité musculaire est enregistrée plus de trente jours avec des séances de marche sur tapis, avant la mise à mort pour prélèvements musculaires. Le porteur décrit une simple étude de faisabilité visant à valider la tenue de l'implant, sans test statistique prévu. Il affirme qu'un tel suivi sur la durée ne peut être mené par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une étude internationale portant sur l'inactivité physique et ses effets sur les propriétés électriques musculaires. Il s’agit d’une étude de faisabilité pour valider la capacité à mesurer sur une longue période l’activité musculaire de la patte postérieure chez la souris grâce à des sondes télémétriques. La méthode télémétrique permet d’enregistrer des paramètres physiologiques ici l’électromyogramme chez un animal vigil, non contraint et dans son environnement habituel. Ce protocole a pour objectif la vérification du maintien de la sonde électromyogramme (EMG) sur le muscle avec récupération d’un signal exploitable sur plus de 30 jours. Ce suivi longitudinal permettra également de caractériser l’activité musculaire grâce à des mesures de marche rapide sur tapis de course et d’évaluer l’impact d’un implant dans un muscle de la patte postérieure sur le métabolisme de l’animal.

Bénéfices attendus

Le projet s’inscrit dans le cadre de l’étude du système musculaire squelettique et ses altérations lors de situations de dysfonctionnement ou de non-utilisation. Parmi les critères permettant de déceler les altérations musculaires, l’étude de l’activité électromyographique peut fournir des indications précieuses sur le bon fonctionnement ou non du muscle squelettique. Notre projet consiste à affiner une technique d’enregistrement électromyographique par télémétrie chez la souris en évaluant l’impact des implants sur le métabolisme de l’animal et en validant leur tenue sur plus de 30 jours. De plus, nous souhaitons proposer un référentiel pour l’analyse électromyographique avec l’étude de faisabilité sur tapis de course. Ces avancées sur la technique d’électromyographie par sondes télémétriques, permettront d’étudier plus finement les mécanismes impliqués dans l’atrophie musculaire, conséquence liée au vieillissement, à l’immobilité prolongée de certains patients ou dans des pathologies comme le cancer.

Procédures

Les animaux seront équipés par voie chirurgicale d'une sonde télémétrique permettant d'enregistrer l'électromyogramme, caractéristique de l'activité électrique musculaire. La procédure chirurgicale pour implanter la sonde sera d’une durée d’une heure environ sous anesthésie générale avec une prise en charge de la douleur par des analgésiques pendant l’opération et les 2 jours suivants. La souris recevra 3 injections sous-cutanées (SC) le jour de la chirurgie puis 1 injection SC/jour pendant 2 jours. Durée de l’injection SC 30 secondes maximum. Les animaux seront isolés le jour de la chirurgie puis 5 min les 3 jours suivants pour vérifier la présence du signal EMG puis 30 min/jour pendant 42 jours pour la mesure de l’activité musculaire. L’étude du métabolisme par calorimétrie indirecte nécessitera 2 x3 jours d’isolement. Les mesures de marche rapide sont réalisées sur un tapis de course 15 min pendant 2 jours. Les animaux seront manipulés à l’aide d’un tube de transfert pour les changements de cages.

Impact sur les animaux

Notre expérience du modèle nous permet d’avancer qu’aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’implantation des sondes électromyogrammes grâce à l’utilisation d’anesthésique et analgésiques adaptés. La sonde utilisée est constituée d’une partie contenant le module électronique et la batterie (transmetteur) et de 2 électrodes souples pour la mesure des biopotentiels. L’implantation du transmetteur de la sonde en sous cutané permet une meilleure récupération de l’animal (moins invasif qu’une implantation intra-péritonéale) et évite des tensions sur les électrodes placées sur le muscle.Le stress lié à l’isolement (mesures de calorimétrie, mesures de l’EMG) sera réduit au maximum tout en permettant une exploitation correcte des résultats. Les vitesses utilisées pour le tapis de course sont proches de la marche et n’engendreront pas d’effort intense pour la souris. Ces éléments permettent d’estimer des nuisances et effets indésirables modérés pour ce projet. Pour comparaison, cette chirurgie est similaire à celle d’un pacemaker réalisé chez l’homme sauf qu’ici, l’implant permettra seulement l’enregistrement et aucune stimulation ne sera faite sur le muscle.

Devenir

Les 12 animaux seront mis à mort selon une méthode réglementaire pour prélèvements musculaires post mortem. Ces prélèvements seront utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires et partagés avec nos différents collaborateurs pour compléter nos connaissances sur la fonctionnalité du muscle.

Remplacement

Il s'agit d'un projet portant sur un suivi longitudinal de mesures d’activité électrique musculaire qui, en plus de caractériser l’activité musculaire permettra d’évaluer l’impact d’un implant dans un muscle de la patte postérieure sur une longue période (>30jours). Un tel projet ne peut être mené avec des méthodes alternatives in vitro ou in silico.

Réduction

Ce protocole a pour objectif la vérification du maintien de la sonde électromyogramme (EMG) sur le muscle avec récupération d’un signal exploitable sur plus de 30 jours. Il n’est pas envisagé de tests statistiques pour cette étude de faisabilité. Le nombre d’animaux (12) a été réduit au minimum en tenant compte des pertes de la qualité du signal tout en permettant l’obtention de résultats satisfaisants. La méthode télémétrique contribue à limiter le nombre d’animaux utilisés en permettant un suivi continu chez un même animal.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe de 3 dans une cage standard utilisé en élevage et hébergement avec un enrichissement dans la cage (coton, igloo, paillage). Les animaux seront anesthésiés par un mélange gazeux et recevront une analgésie adaptée au préalable de la chirurgie et en post-opératoire afin de limiter la douleur liée à l’implantation des sondes. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence du réflexe oculopalpébral et du réflexe de retrait de la patte au pincement. En fin de chirurgie, les animaux seront réhydratés et surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet et dans les 4 heures suivantes. Pour limiter les risques de blessures, les ongles seront coupés sous isoflurane avant le début de la chirurgie et les points de suture seront internalisés puis sécurisés avec de la colle chirurgicale. Un gel lubrifiant sera déposé sur les yeux pour la chirurgie. Les animaux seront en cage individuelle après chirurgie avec des croquettes et de l’eau gélifiée au sol pour faciliter l’accès puis remis en groupe le lendemain limitant le stress lié à l’isolement. Les souris seront surveillées et pesées quotidiennement. Elles seront remises en cage individuelle uniquement pour le suivi des enregistrements télémétriques (30min/jour) et pour les enregistrements de calorimétrie indirecte (2 x 3 jours). Pour les enregistrements télémétriques quotidiens, nous utiliserons la même cage par groupe de 3 souris. De cette façon, les souris retrouveront les mêmes odeurs que dans leur cage d’hébergement. Au cours de la procédure, seule la litière souillée sera changée pour préserver au maximum l’odeur de la cage. Les animaux seront manipulés à l’aide d’un tube de transfert pour les changements de cages Après l’implantation des capteurs et le suivi post-opératoire, les animaux ne sont plus soumis à aucune intervention susceptible d’induire de la souffrance ou de la douleur grâce à la méthode télémétrique qui permet de suivre l’électromyogramme en continu chez l’animal vigil et non restreint.

Choix des espèces

Afin de pouvoir comparer les résultats avec les études antérieures, il est important de conserver la même espèce animale, à savoir la souris. La souche choisie : C57BL/6J est un modèle polyvalent utilisé dans de nombreux domaines d’application. Les animaux utilisés seront uniquement des mâles. Le sexe mâle a été choisi dans la mesure où ces travaux viennent en prolongement d’études antérieures. Il est donc important de conserver le même sexe pour comparer ces différentes études. Le choix d’animaux adultes de même sexe exclut toute variation possible des résultats suite à des fluctuations ou différences hormonales. Les animaux utilisés seront des mâles adultes, matures au niveau du développement, soit des souris âgées de 9 semaines au début de la phase expérimentale.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne créant un défaut osseux sous anesthésie, puis un suivi par imagerie avant mise à mort échelonnée jusqu'à 60 jours, pour étudier le rôle d'une molécule de l'inflammation dans la cicatrisation osseuse. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, hémorragie et rarement une hypertension intracrânienne constituant un point limite. Il affirme que les modèles in vitro et ex vivo ne reproduisent pas la complexité cellulaire ni l'apport vasculaire, rendant le recours à un modèle in vivo nécessaire.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de caractériser le rôle d’une molécule clé de l’inflammation (interleukine 33) dans la réparation osseuse. En effet l’interleukine 33 est une cytokine (protéine soluble jouant un rôle de signal) jouant un rôle important dans le maintien de l'éauilibre des tissus et dans la défense contre les infections parasitaires. Le dérèglement de cette cytokine est impliqué dans de nombreux phénomènes allergiques et inflammatoires chroniques. Cette molécule est plus présente dans l’os ostéoporotique et joue un rôle protecteur chez la femme ménopausée1. En revanche son rôle dans la cicatrisation osseuse après une fracture ou une chirurgie orthopédique reste inconnu. Cette étude scientifique nous permettra de mieux comprendre son rôle dans la réparation osseuse pour pouvoir moduler ses effets lors de la phase inflammatoire de la cicatrisation osseuse et pour, in fine, améliorer la réparation osseuse. Enfin, nous voulons connaitre l’influence de l’âge sur l’expression de cette molécule pour pouvoir améliorer la prise en charge clinique de la cicatrisation osseuse chez les patients âgés et affiner la prise en charge pour une médecine plus personnalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le contexte des recherches en immuno-ostéologie. En effet, ces expérimentations permettront, dans un premier de temps, de mieux comprendre l’influence de l’âge sur le profil inflammatoire après des résections osseuses de différentes tailles. Par ailleurs, ces études vont permettre d’améliorer nos connaissances sur l’influence d’IL33 dans ce processus de cicatrisation osseuse. Enfin, les bénéfices à long terme d’un tel projet sont l’amélioration de la prise en charge des patients jeune et âgés souffrants de pertes osseuses importantes et une meilleure prise en charge de la cicatrisation osseuse chez les patients jeunes et âgés.

Procédures

Tous les animaux (320 souris) seront soumis à J0 à une chirurgie de la calvaria (procédure 1), conduite sous anesthésie générale de 30-45 minutes. Une analgésie pré- et post-opératoire (3 jours) sera fournie. Les animaux seront mis à mort à J2, J9, J14, J30 et J60 post-opératoires. La moitié des souris mises à mort à J60 (32 souris) sera également soumise à une analyse en bioluminescence de l’inflammation (procédure 2) à J2, J9, J14, conduite sous anesthésié gazeuse de 30 minutes. Il s’agit d’une procédure indolore. L’autre moitié des souris mises à mort à J60 (32 souris) sera soumise à une analyse au microscanner de la formation osseuse à J2, J9, J14, J30 et J60, conduite sous anesthésié gazeuse de 30 minutes. Il s’agit d’une procédure indolore.

Impact sur les animaux

La chirurgie sur calvaria de souris peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, hémorragie, stress, ou un comportement anormal causé par une hypertension intracrânienne. Ces effets indésirables seront potentiellement observés en per-opératoire ou post-opératoire immédiat (jusqu’à 3 jours). L’hypertension intracrânienne est une complication rare et constitue un point limite. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire immédiat peut-être également observé occasionnellement. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire), qui constitue également un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs dans notre étude (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). Les anesthésies nécessaires à l’imagerie non invasive en micro-CT et en BLI vont également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil.

Devenir

Suite à la chirurgie sur la calvaria tous les animaux seront gardés en vie. Les animaux seront mis à mort aux temps terminaux de l’étude : J2 (64 souris), J9 (64 souris), J14 (64 souris) J30 (64 souris) J60 (64 souris). Suite à l’analyse en bioluminescence (procédure 2, 32 souris) à J2, J9 J14, ou en microscanner (procédure 3, 32 souris) à J2, J9 J14, J30 les animaux seront réveillés et gardés en vie. A J60, les animaux seront mis à mort juste après l’examen (sans réveil).

Remplacement

La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénoués de système vasculaire. Or la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier le rôle d’IL33 dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Compte tenu des écarts constatés pour les différents paramètres de la réparation osseuse étudiés par notre équipe, le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir un test statistique significatif (puissance de test 90%, seuil de signification < 0,05) est de 6 /groupe /temps / type d’analyse, mais le nombre d'animaux inclus dans les expérimentations sera de 8/groupe /temps / type d’analyse, afin de conserver une puissance statistique malgré la perte inopinée de certains animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux, l’os de calvaria prélevé lors de la chirurgie à J0 sera utilisé comme contrôle T0. De plus, la réparation osseuse et l’inflammation seront étudiées par différentes techniques (biologiques, imagerie multimodale) au sein du même animal, permettant de maximiser la contribution scientifique de l'animal mis à mort. Afin de réduire le nombre de procédure subies par les animaux, seuls les animaux mis à mort à J60 seront soumis l’imagerie non invasive en micro-CT J2, J9, J14, J30 et J60 et en BLI à J2, J9, J14. Les variables quantitatives seront testées pour leur normalité (test de Kolmogorov-Smirnov). Si les variables suivent une loi normale, elles seront analysées par des modèles de régression linéaire générale basés sur l’analyse de variance et les effets significatifs testés par un test post-hoc (LSD-Fisher). Sinon, un test non-paramétrique de Kruskal-Wallis sera utilisé pour une comparaison globale entre les groupes et un test de Mann-Whitney pour une comparaison de groupes deux par deux.

Raffinement

L’état général de l’animal et du site chirurgical seront évalués grâce à un tableau scoré. Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. Suite à la procédure chirurgicale des points surveillés et scorés (feuille de score) sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques cette procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Des soins et une médication analgésique appropriés post-opératoires seront mis en place pour s’assurer de l’absence de douleurs ou d’inconfort. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si les points limites sont atteints, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), papier et dôme cartonné afin de contribuer au fouissement des animaux. Les souris initialement hébergées ensemble (3 ou 4 souris/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. Les animaux seront également observés visuellement quotidiennement par les zootechniciens.

Choix des espèces

Souris C57/BL6 : Modèle de défaut de calvaria de référence dans la littérature internationale, fiable, reproductible, peu couteux ; souche la plus décrite dans la réparation osseuse et l’analyse de l’inflammation 1 Souris adultes de 8 semaines (jeunes) : âge optimal pour analyser la réparation osseuse ; à ce stade aucune influence de la croissance sur le crâne. Souris adultes 18 mois (âgées) : âge optimal pour analyser l’effet du vieillissement sur la réparation osseuse.

1890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de dystrophies musculaires, elles reçoivent des injections répétées et des gavages plusieurs fois par semaine, ainsi que des vecteurs de thérapie génique, avant une évaluation de la force musculaire sous anesthésie terminale. Le porteur soutient que les traitements, "tous de nature bénéfique", ne justifient pas de points limites, tout en décrivant des modèles sévères au phénotype avancé. Il affirme que l'effet ne peut être obtenu que dans un organisme "entier" et qualifie ces expériences d'"absolument indispensables".

Objectifs

L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches de thérapie génique médiées par des vecteurs viraux pour les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Ces maladies sont caractérisées par des cycles de dégénérescence/régénération du muscle entrainant une perte des fibres musculaires au profit de tissu fibrotique ou adipeux. Ce processus dégénératif provient de défauts génétiques et conduit à des conséquences délétères sur la fonction motrice, la qualité et la durée de vie des patients. Il peut impacter les capacités de réversion du phénotype myopathologique. En raison de la progressivité du processus dégénératif, le diagnostic et le traitement se réalisent alors que la dégénération est engagée déjà depuis des années chez les patients. Il semble que ceci soit à l’origine de la faible efficacité des approches de thérapie génique observée dans les essais cliniques dans les dystrophies musculaires où la restauration fonctionnelle dépasse rarement 15%. De plus, les essais cliniques soulignent la possibilité d’apparition d’effets adverses liés aux doses utilisées. Il apparait donc nécessaire d’adjoindre au transfert de gène des traitements agissant sur le mécanisme physiopathologique dystrophique afin d’obtenir un effet thérapeutique probant et une meilleure sécurité. Le but est d’évaluer l’effet de traitements thérapeutiques agissant sur les différentes composantes du processus dystrophique en combinaison avec un produit de thérapie génique pour évaluer leur synergie sur les modèles murins des pathologies incluses dans le projet à un stade précoce et avancé de la maladie. Les résultats obtenus devraient permettre une meilleure efficacité de la thérapie génique et une réduction des possibilités de toxicité par une diminution des doses à administrer chez les patients. Les animaux utilisés sont des souris modèles et leurs contrôles normaux. Le nombre nécessaire est de 1890 animaux. Les traitements associés peuvent être de petites molécules qui seront administrées soit par gavage, soit par administration intrapéritonéale, sur une durée variable. Ils peuvent également être réalisés par transfert de gène. Dans ce cas, ils seront co-administrés avec le traitement de thérapie génique. Un suivi de biomarqueurs sériques permettra de suivre l’effet au cours du temps. L’évaluation de l’effet thérapeutique sera réalisée par des études de la fonction du muscle, et après sacrifice par des études moléculaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de combinaisons associant soit une petite molécule, soit une modulation génique, à un traitement de thérapie génique d’intérêt pour un groupe de maladie humaine sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour. La combinaison de traitement permettra d’augmenter la correction chez les patients et d’améliorer la sécurité de produits de thérapie génique par la réduction des doses requises.

Procédures

Toutes les molécules pharmacologiques seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Elles seront administrées soit par voie orale, soit par injection intra péritonéale (durée injection moins de 1 minute), sur animaux vigiles. L’administration par voie orale se fait par gavage à l’aide d’une canule souple en plastique à bout arrondi afin de ne pas blesser l’animal (durée : entre 30 secondes et 1 minute). Les traitements adjoints administrés par AAV et le traitement de thérapie génique se font par injection intraveineuse en une seule fois, soit sur animaux vigile avec injection dans la veine caudale (durée : moins de 1 minute en injection rapide et entre 3 à 10 minutes pour les injections lentes), soit sur animaux anesthésiés au sinus (durée : moins de 1 minute). Dans ce cas l’anesthésie est une anesthésie gazeuse de courte durée. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée. (Durée de l’intervention : moins de 10 minutes entre l’anesthésie et le réveil de l’animal. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. En fin de protocole, les animaux sont soumis à une évaluation fonctionnelle sur muscle semi-isolé sur animaux analgésiés et anesthésiés. L’analgésique est injecté 30 minutes avant l’anesthésie qui est une anesthésie par voie intra-péritonéale profonde sans réveil de l’animal. L’évaluation fonctionnelle dure en moyenne 30-45 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : - Piqûres intrapéritonéales d’un volume maximum de 100µl pour l’administration de molécules (5 fois par semaine sur animaux vigiles) ou d’anesthésique une seule fois en fin de protocole. Pour réduire les nuisances, les animaux seront traités 30 minutes avant la procédure avec un analgésique. - Gavage pour administration de molécules (maximum 200µl, 5 fois par semaine) - Intraveineuse caudale ou au sinus pour injection AAV (soit en bolus de 100µl/20g, soit en IV lente 500µl/20g, une fois au cours du protocole) * Possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies (utilisation de gel pour réduire cette nuisance). En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils sont porteurs d’une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères (SGCA et SGCG) au stade avancé de la pathologie. Cependant, même dans ce cas, les nuisances possibles n’ont pas d’impact sur la survie et ne sont pas de nature à nécessiter la mise en place de points limites. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale.

Remplacement

Afin de valider l’effet thérapeutique in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne nous permet d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires. De plus, afin d’estimer l’efficacité de nos approches expérimentales, il est nécessaire d’administrer les vecteurs dans un organisme entier capable de répondre physiologiquement aux traitements administrés. Ceci ne peut être obtenu in vitro et justifie notre recours à des animaux.

Réduction

Un effort de réduction a été réalisé en amont de ce projet. En effet, les molécules pharmacologiques utilisées dans ce projet ont toutes déjà démontré leur efficacité sur la souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne. Nous savons donc qu’elles ont un effet bénéfique, reste à savoir maintenant si, combinées à la thérapie génique, elles pourront augmenter la correction et permettre une réduction des doses de vecteurs. La dose administrée a déjà été validée chez la souris. Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 1890 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes. Tous les modèles sont sur le même fond génétique., nous pouvons donc utiliser les mêmes souris contrôles pour tous les modèles. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les différentes conditions seront testées en premier lieu sur les modèles les plus sévères. Pour les conditions ne montrant pas d’effet positif, les traitements ne seront pas testés sur les modèles les moins sévères, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le raffinement du projet inclus la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Le souci de raffinement est une préoccupation permanente tout au long de la vie des animaux et pendant les différentes étapes des protocoles expérimentaux. Les souris étant des animaux sociaux, elles sont hébergées par groupes. Une phase d’adaptation de 7 jours est mise en place avant l’entrée en protocole. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris reçoivent un traitement analgésique, et si cette douleur persiste, les animaux sont sacrifiés pour éviter toute souffrance. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi, ils sont observés quotidiennement pendant les jours ouvrés. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures de sacrifice appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés dans ce projet sont des souris modèles de la pathologie étudiée. Dans cette étude, les animaux seront utilisés à partir de leur sevrage jusqu’à un stade tardif de la pathologie (variable selon les modèles mais entre 6 mois et 1 an) afin de refléter au mieux la maladie humaine puisqu’il s’agit de pathologies progressives. Les signes cliniques peuvent apparaitre dès l’enfance, mais également à l’âge adulte pour certaines dystrophies. Après le sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer la fonction musculaire et présentent déjà des signes histologiques pour les modèles les plus sévères. Des animaux plus âgés (entre 6 mois et 12 mois) seront également utilisés, afin d’évaluer l’effet thérapeutique sur des animaux où le phénotype dystrophique est installé, ce qui permettra d’évaluer la réversion du phénotype au stade tardif. En effet, il est indispensable de savoir si le traitement est efficace lorsque la maladie est installée afin de pouvoir proposer un traitement à des patients qui sont à un stade avancé de la maladie.