Système musculosquelettique
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Etude multiparamétrique de la faiblesse musculaire chez un modèle murin de la myopathie à cores centraux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie, elles subissent des injections, des examens RMN et une électrostimulation musculaire sous anesthésie, certaines recevant un vecteur de thérapie génique quelques jours après la naissance, avant mise à mort pour prélever plusieurs muscles. Le porteur présente ces atteintes comme compatibles avec "une vie tout à fait normale" et met en avant le caractère non invasif de la RMN et de l'électrostimulation. Il conclut qu'aucune culture de cellules musculaires ne reproduit les mesures physiologiques recherchées et revendique une étape "indispensable" avant l'application à l'homme.
Objectifs
Le récepteur à la ryanodine de type 1 (RyR1) est une protéine essentielle à la contraction musculaire. Chez l’homme, une mutation (notée RyR1I4895T) dans le gène RyR1 est à l’origine de la myopathie à cores centraux. Cette affection neuromusculaire génétique et héréditaire se caractérise par la présence de lésions rondes dans les cellules du muscle et par une faiblesse musculaire (réduction de la capacité à produire de la force, fatigabilité accrue) de sévérité variable. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif contre cette pathologie, et la prise en charge des patients se réduit à de la kinésithérapie et à de la corticothérapie, ce qui conduit à une légère amélioration de leur état général. Afin d'étudier le rôle de la protéine RyR1, un modèle de souris portant la mutation RyR1I4895T a été développé. Des études préliminaires ont montré que, comme chez l’homme, ces souris développent une myopathie à cores centraux et une faiblesse musculaire modérée. Ce projet vise à caractériser les muscles de ces souris myopathes d’un point de vue fonctionnel par le biais d’une analyse de leurs performances musculaires en lien avec le métabolisme énergétique. Cette étape est indispensable d’une part pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie mais également pour la mise en place d’approches thérapeutiques chez les patients souffrant de cette myopathie. Ainsi, nous envisageons dans un deuxième temps d'évaluer le potentiel thérapeutique de différents agents pharmaceutiques à rétablir un phénotype sain chez ces souris.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra d’une part de mieux comprendre l’histoire naturelle de la myopathie à cores centraux et d’autre part d’identifier des approches thérapeutiques susceptibles d’engendrer une augmentation de la force musculaire (agents thérapeutiques) voire de restaurer un phénotype sain (par thérapie génique). Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette myopathie, ce projet est une première étape indispensable avant l’application à l’homme.
Procédures
Les animaux subiront : des injections intrapéritonéales de molécules thérapeutiques sur animaux vigiles, des ingestions de croquettes ou de boisson supplémentées en molécules thérapeutiques, des examen RMN sous anesthésie générale, et des contractions musculaires induites par électrostimulation transcutanée sous anesthésie générale. Les injections d’AAV seront réalisées par l'organisme partenaire nous fournissant les animaux, avant le transfert de ces derniers dans nos locaux. Ces injections d'AAV seront réalisées en intrapéritonéal sur animaux vigiles, quelques jours après la naissance pour augmenter l'efficacité du traitement, réduire la quantité de virus à injecter et augmenter l'immunotolérance.
Impact sur les animaux
D’après la littérature, les souris RyR1I4895T hétérozygotes âgées de 4-5 mois présentent une diminution de leur masse corporelle de 15% et une perte de force musculaire de 25% par rapport à des souris contrôles du même âge. Ces modifications n’entraînent pas de signes dommageables et les animaux ont une vie tout à fait normale. Concernant les nuisances associées aux actes expérimentaux, seules les injections IP de molécules thérapeutiques sur animaux conscients pourront entrainer un léger stress et une faible douleur lors de l'acte. L’administration de molécules par le biais de la nourriture (croquettes à façon) ou de l'eau de boisson, ainsi que les examens RMN et l’électrostimulation musculaire sur animaux anesthésiés ne devraient pas entrainer de nuisances particulières si ce n’est un léger stress lors du réveil de l’anesthésie générale. En particulier, le protocole d’électrostimulation musculaire transcutanée que nous mettrons en œuvre (comparable à ceux utilisés chez l’homme en kinésithérapie) est strictement non invasif et ne provoque ni blessure ni séquelle, les animaux retrouvant dès leur réveil leur mobilité initiale.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort une fois qu’elle sera terminée, en l’occurrence 3-4 jours après leur 3ème exploration non invasive du métabolisme énergétique et la fonction musculaire, de manière à laisser aux muscles (qui seront prélevés post mortem afin de réaliser des dosages biochimiques et de l’histologie) le temps de récupérer d’un point de vue métabolique et fonctionnel. Les euthanasies seront réalisées par dislocation cervicale pratiquée sur animaux anesthésiés par inhalation d’isoflurane. Plusieurs muscles (gastrocnémiens, soléaire, EDL, tibialis antérieur) seront prélevés sur les animaux euthanasiés. Ces tissus musculaires seront ensuite conservés à -80°C. Le cœur et les tissus adipeux seront également prélevés pour d’éventuels dosages ultérieurs.
Remplacement
Ce projet a pour objectifs de mieux comprendre le rôle physiologique de RyR1 et de réaliser des essais précliniques afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de différents agents pharmaceutiques à rétablir un phénotype sain. Les critères métaboliques et fonctionnels (mesure des performances mécaniques) que nous allons étudier sont de types physiologiques, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux de manière longitudinale ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours aux techniques RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal des mesures du métabolisme énergétique dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques de biochimie qui auraient nécessité de sacrifier des cohortes d’animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser des dosages métaboliques sur biopsies musculaires.
Raffinement
Les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation (coton), d’abris en plastique permettant aux animaux de se cacher, et de bûchettes de bois destinées à être rongées. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. Par ailleurs, l’utilisation des techniques RMN sur animaux anesthésiés par inhalation gazeuse permettra de par leur caractère non invasif et totalement indolore de réduire le stress des animaux. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation de la douleur par score avec indices pour différents critères physiologiques et comportementaux, et des actions seront à mener en fonction des scores obtenus. A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale induite par inhalation d’isoflurane afin de réduire au maximum leur douleur et leur détresse.
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’Homme pour sa physiopathologie et qui soit génétiquement modifiable. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris seront utilisées entre leur 2ème et 5ème mois d’âge : dès que la force musculaire commence à diminuer, à l'âge de 2 mois d'après les données de la littérature et pendant les 3 mois suivants de manière à suivre de manière non invasive et longitudinale l’évolution de la pathologie et les effets des approches thérapeutiques.
CREATION DE MODELES PATHOLOGIQUES CHEZ LE RONGEUR EN VUE DE MIMER DES AFFECTONS CLINIQUES.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
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Rats : 4000
2500 souris et 4000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, mis à mort ou cédés à des équipes scientifiques. Ils subissent une chirurgie unique pour créer des modèles de diabète, d'insuffisance hépatique, d'arthrose, d'infarctus du myocarde ou de vagotomie, avec des prélèvements sanguins et une récupération post-opératoire de 48 à 72 heures. Le porteur revendique la production et la mise à disposition de ces modèles pathologiques pour la recherche, en assumant le recours à des animaux "surnuméraires". Il affirme qu'il est "impossible de modéliser une maladie dans sa globalité" par des outils informatiques ou cellulaires.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles pathologiques sur les espèces rat et souris dans le but d’étudier les pathologies associées. Les différents modèles pathologiques sont la création par des procédures de chirurgie de modèle de diabète, d’insuffisance hépatique, d’arthrose, d’infarctus du myocarde et de vagotomie.
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles pathologiques permet l’amélioration des connaissances et de la compréhension de la physiopathologie des affections cliniques associées pour la médecine humaine comme vétérinaire dans différents domaines : facteurs de risques, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, recherche fondamentale, prévention …
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique de quelques minutes à une heure sous anesthésie générale ou injection unique d’un produit sur animal vigile. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dus aux contentions, aux procédures chirurgicales et lors de la période de récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Mise à mort ou envoi chez les scientifiques pour tous les animaux.
Remplacement
L’apparition et l’évolution d’une maladie est un phénomène complexe, faisant intervenir beaucoup de types de cellules et d’organes au sein d’un même corps. De plus, le nombre de ces types de cellules et d’organes ainsi que leur façon de communiquer entre eux ou de réagir ne sont pas semblables selon le stade de la maladie. Cette complexité et le côté dynamique d’une maladie fait qu’il est impossible de modéliser une maladie dans sa globalité par des outils informatiques ou cellulaires par exemple et demande de faire appel à des modèles pathologiques sur des espèces animales telles que le rat et la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Le contrôle de la douleur est réalisé avant la chirurgie et lors du post-opératoire ou en cas de besoin par une administration d’analgésique. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectué dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentés ou non pouvant être disposés directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Le choix de l’âge ou du poids des animaux est défini par les scientifiques en fonction de leurs études et des poids et/ou âges minimum pour lesquels les modèles pathologiques peuvent être développés soit : Dès la naissance pour les rats concernant le modèle diabétique. A partir de 25g pour les souris et 125g chez le rat pour le modèle infarctus du myocarde et ligature du canal cholédoque. Dès 125g pour le modèle d’arthrose chez le rat. Dès 175g pour le modèle de vagotomie chez le rat.
Évaluation d’une thérapie peptidique chez le rat R-DMDdel52, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
174 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue par injection létale, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils développent une perte de masse musculaire, une faiblesse croissante et une atteinte cardiorespiratoire, jusqu'à une mise à mort dite compassionnelle entre six et treize mois, et reçoivent jusqu'à plusieurs dizaines d'injections d'une protéine testée. Le porteur décrit un comportement de "freezing" et une surveillance rapprochée, et affirme n'attendre aucune toxicité du traitement. Il retient le rat plutôt que la souris car son modèle "mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle".
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare causée par des mutations dans le gène de la dystrophine porté par le chromosome X. La myopathie est rapidement invalidante. Le déficit en dystrophine induit une perte progressive de force dans les muscles, menant à la perte de l'ambulation à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles de la ventilation et du muscle cardiaque entraine une insuffisance cardiorespiratoire fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune thérapie curative. Cependant, l'utilisation des glucocorticoïdes, traitement de référence largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte d'ambulation et le décès d'environ 2 à 8 ans, avec le désavantage de provoquer un grand nombre d’effets secondaires qui dégradent la qualité de vie des patients. Depuis 5 ans, on assiste à une accélération de propositions d'autorisation de mise sur le marché (composés pharmacologiques, vecteurs de thérapie génique) et on dénombre une cinquantaine d'essais cliniques en cours (clinicaltrials.gov). Sur le plan mécanistique, l'absence de dystrophine dans les cellules cardiaques et les cellules des muscles squelettiques induit d'abord une dysfonction, puis une fragilité et enfin une rupture des membranes cellulaires lors des cycles de contraction/relâchement de ces muscles. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique, l'accumulation de matière fibreuse et une formation de vaisseaux sanguins inappropriée. Cette combinaison empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle. Dans ce contexte, notre objectif scientifique est de proposer une alternative aux traitements existants incluant les glucocorticoïdes en apportant la preuve de principe préclinique de l'efficacité d'une thérapie innovante. En se basant sur une étude précédente réalisée chez la souris, l'hypothèse est qu'une forme non oxydable d'une protéine X serait capable de ralentir la progression de la DMD, en luttant contre l'inflammation et le stress oxydatif impliqués dans la pathologie. L’efficacité de la protéine X sera testée sur les rats DMD seule ou en association avec un traitement aux glucocorticoides.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice du traitement avec la protéine X sur le modèle original et pertinent du rat DMD récemment développé. La protéine X est un nouvel acteur dans la gestion de la progression de la DMD grâce à son nouveau mécanisme d'action. Cette protéine X permet de rééquilibrer la balance vers la regénération aux dépens de l’inflammation dans les muscles dystrophiques. Plus particulièrement, la protéine X devrait améliorer la contribution des cellules souches du muscle à la réparation musculaire. Ce traitement devrait donc permettre de bénéficier simultanément de différentes propriétés thérapeutiques sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. En cas de bénéfice évident chez les rats, les données précliniques robustes produites seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. A long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. La diminution de la dégénération musculaire, aussi bien au niveau des muscles squelettiques qu’au niveau du cœur, retarderait la progression de la maladie et pourrait même prévenir la perte de l’ambulation et l'insuffisance respiratoire ou cardiaque fatale. Cette thérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant ou en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires.
Procédures
Les animaux reçoivent la protéine X par une injection hebdomadaire par voie intrapéritonéale et pour certains lots une injection sous-cutanée ou les deux. Cela correspond à un nombre d'injections compris entre 9 et 18 (9 semaines de traitement, essai préclinique à court terme) et 22-48-69-138 (22 semaines, 48 semaines ou 69 semaines - essai préclinique à long terme). Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbital, 1 fois en procédure 2 ou 4 fois en 17 mois selon les procédures. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus une analgésie. L'évaluation fonctionnelle privilégie les méthodes non invasives. La mesure de force nécessite une anesthésie injectable, réalisée 1 fois avant la mise à mort pour les animaux des deux procédures d'essai clinique à court et long terme. Il n'y a pas de chirurgie prévue.
Impact sur les animaux
Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme, principal acteur de la ventilation de repos, est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Ces défaillances combinées conduisent à la nécessité d'une mise à mort compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvement chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques sont bien connus ce qui permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. L'essai préclinique à court terme de ce projet inclue des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables. L'essai préclinique à long terme de ce projet inclue des animaux au-delà de 6 mois. Nous porterons une attention particulière à ces animaux avec une surveillance quotidienne et une prise de poids hebdomadaire jusqu’à l’âge de 6 mois puis tous les deux-trois jours. En ce qui concerne le traitement, Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection de la protéine X. En effet, il est reconnu que la thérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité.
Devenir
À l'issue des trois procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer à l'échelle microscopique l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés (muscles des membres, diaphragme, cœur). Bien que non attendue, il est également essentiel de prélever les organes sentinels d'une éventuelle toxicité (reins, foie, rate, poumons) et de les soumettre à une expertise anatomopathologique. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par une injection létale de pentobarbital.
Remplacement
Des études antérieures ont montré qu'une version modifiée de la protéine X favorise la régénération sans exacerber l'inflammation en induisant l'expansion des cellules souches musculaires et en mobilisant les macrophages, favorisant ainsi la guérison des tissus. De manière très intéressante, un criblage cellulaire de plus de 5 000 médicaments cliniques et composés médicamenteux a mis en évidence que plus de 50 % des composés qui inhibent les activités pro-inflammatoires de la proténe X étaient des glucocorticoïdes. Ces résultats soulignent l'importance de cibler des isoformes redox spécifiques de cette protéine aussi bien dans des conditions physiologiques que pathologiques. Sur ces bases mécanistiques très robustes, ce projet vise à trouver la réponse à une question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelations constante à savoir quels sont les effets bénéfiques sur l'éventail de mécanismes pathogènes ouvert par le processus dystrophique peut-on attendre d'un traitement précoce, court ou long, sur un modèle animal de dystrophie musculaire de Duchenne.
Réduction
Les expériences déjà menées sur les rats DMD traités avec différents candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique) ont montré que traiter 5-7 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Le problème majeur avec cette lignée est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique (essentiellement), les données de 5-7 animaux arrivés au terme de la procédure puissent être traitées. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6-8 animaux selon le genotype sauvage ou DMD et ce grace à des analayses à l'aide d'un t test non paramétrique de Mann-Whitney entre deux groupes ou un ANOVA entre plusieurs groupes. L'effet âge étant évalué par un test de Friedman par mesures répétées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. La température des locaux est maintenue dans la fenêtre 22 ± 2 °C. Pour le bien-être des rats, ils sont stabulés dans des cages XL ayant une surface de 2080 cm2 et une hauteur de 23 cm sur une moitié de la surface, soit 5 cm de plus que la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début (3-4 semaines, animaux de 100g puis ce nombre est progressivement réduit jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g (animaux sauvages au-delà de 5 mois, les rats DMD non traités n'atteignent jamais cette masse corporelle). L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Nous prêterons attention aux points suivants: - perte de mobilité par atrophie des muscles des pattes, - prostration due à une anomalie cognitive ou à la douleur, - lordose excessive liée à l'atrophie des muscles dorsaux comme chez les patients, - arrêt du toilettage entrainant la dégradation du pelage, - vocalise anormale (hors contention) ou grimaces faciales, la cause de la douleur est recherchée et des antalgiques pourront être prescrits, notamment sur les animaux DMD en fin de vie, nous pourrons utiliser un anti-inflammatoire ou un opioïde après consultation du vétérinaire référent. La survenue de l'un des points ci-dessus associé à une perte de poids sur une semaine dépassant 20% du poids maximal atteint par l’animal et non compensée par la mise à disposition de nourriture humide et d’hydrogel en fond de cage (difficulté à ronger les croquettes sèches, dysphagie possible liée à la dégradation des muscles masticateurs), entrainera la mise à mort compassionnelle de l'animal concerné.
Choix des espèces
Le rat, une espèce de mammifère phylogénétiquement proche de l'homme, constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris myopathe, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin de la myopathie de Duchenne. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle sur le chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).
Etude de la coordination entre la production d’énergie et la synthèse des protéines dans le muscle squelettique soumis à un exercice et atteint de la myopathie de Duchenne.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur un tapis roulant, motivées par de faibles décharges électriques délivrées par une grille en bout de piste, ou sur une roue volontaire, puis reçoivent une injection de puromycine, pour étudier la production d'énergie et la synthèse des protéines dans le muscle sain ou atteint de la myopathie de Duchenne. Le porteur décrit des décharges réglées au minimum et un hébergement individuel pour la roue, qu'il reconnaît sources de stress. Il affirme que la fonction musculaire de la souris est proche de celle de l'humain et que l'étude ne peut se faire ni en culture cellulaire ni par modélisation.
Objectifs
Au sein du muscle squelettique,il existe des compartiments cellulaires qui contrôlent la production d’énergie. Ces centrales énergetiques cellulaires jouent également un rôle important dans les adaptations du muscle en réponse à l’activité physique. Cependant elles ne fonctionnent pas indépendamment au sein de la cellule musculaire et forment notamment des contacts privilégiés avec d’autres compartiments cellulaires contrôlant la synthèse des protéines. Ces contacts dynamiques permettent d’échanger des composés et de contrôler les fonctions de ces deux compartiments cellulaires. Des travaux récents, y compris les nôtres suggèrent l’étendue des contacts entre les centrales énergetiques cellulaires et le site de synthèse des proteines peut moduler la production d’énergie et la production des protéines et ainsi impacter la fonction du tissu musculaire. Dans ce projet, il s’agira d’étudier la relation entre l’étendue de ces contacts, la production d’énergie et la synthèse des protéines dans des muscles soumis à un exercice ou atteints de la myopathie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Aucune étude approfondie n'a encore vérifié dans le muscle squelettique l'importance des interactions entre les centrales énergétiques cellulaires et le lieu de synthèse des protéines dans le maintien de la fonction musculaire. L'ambition de notre projet est de préciser ces interactions au repos et à l'exercice. Enfin, et à notre connaissance, nous testerons pour la première fois si l'exercice physique, en modifiant ces interactions, pourrait améliorer le dysfonctionnement de la production d'énergie identifié dans le modèle murin de la myopathie de Duchenne. Notre projet pourrait donc ouvrir la voie à de futures pistes thérapeutiques pour traiter ces pathologies importantes chez l’homme.
Procédures
Lors des séances d’habituation à la course sur tapis roulant, de faibles stimulations électriques seront administrées à l’aide d’une grille placée en bout de piste de course pour motiver les animaux à la course. L’intensité et la fréquence des décharges au niveau de la grille seront réglées au minimum (0,1mA et 1Hz). Pour le test d’exercice sur tapis roulant, en lieu et place des stimulations éléctriques, une réglette à lamelles sera placée au dessus des pistes pour motiver les animaux à la course. Il suffit d'effleurer le dos de l'animal avec une règlette en plastique pour qu'il se remette à courir. Aucune nuisance n'est attendue pour l’exercice volontaire sur roue. C’est un modèle d’entraînement qui permet un enrichissement du milieu et participe au bien être de la souris qui peut s’adonner de manière volontaire à la pratique physique. Enfin, pour la mesure de la synthèse proteique, les animaux recevront une injection intrapéritoneale unique de puromycine (non irritant aux doses utilisées).
Impact sur les animaux
Pour les séances d’habituation à la course sur tapis roulant, des décharges électriques seront administrées à l’aide d’une grille placée en bout de piste de course pour motiver les animaux à la course. L’intensité et la fréquence des stimulations électriques au niveau de la grille seront réglées au minimum (0,1mA et 1Hz). Pour la procédure de tests d'activité sur roue, les animaux (sur roues et sédentaires) seront hébergés individuellement et garderont le contact olfactif et visuel. Ces deux situations pourraient générer un état de stress chez les animaux.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les animaux seront euthanisiés pour effectuer les prélèvements. Les muscles prélevés nous permettront d’évaluer l’effet de l’exercice aigu et de la période de récupération sur la fonction mitochondriale et la synthèse protéique. A l’issue de la procédure 2, les animaux seront euthanisiés pour effectuer les prélèvements. Les muscles prélevés nous permettront d’évaluer l’effet de l’entrainement sur roue sur la fonction mitochondriale et la synthèse protéique. Ces résultats pourront être comparés à ceux de l’exercice sur tapis. Enfin, l’entrainement des souris mdx nous permettra d’évaluer le potentiel bénéfique de l’exercice sur le muscle myopathique en relation avec la fonction des mitochondries et la synthèse des protéines.
Remplacement
Ce projet se propose d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans les modifications de la fonction et masse du tissu musculaire dans le contexte de l’exercice et de la myopathie de Duchenne. Il ne peut donc pas être réalisé sur des cultures cellulaires ou par modélisation informatique.
Réduction
Pour chacune des procédures, le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base de résultats précédemment publiés par notre laboratoire et d’analyses statistiques. Outre les muscles, les autres tissus issus des animaux ayant participé à ces procédures seront congelés. Ces tissus pourront être par la suite utilisés dans les autres projets du laboratoire pour étudier l’influence de l’exercice sur les interactions entre le muscle et les autres organes.
Raffinement
Pour la procédure expérimentale d’exercice aigu sur tapis roulant, les animaux sont hébergés par 2 dès leur arrivée jusqu'à la fin de l’étude, avec enrichissements (tunnel de contention en plexi rouge et coton). Le change est fait une fois par semaine avec transfert d’une partie du nid et du tunnel pour conserver l’odeur des animaux dans la cage propre. Trois séances d’habituation sur tapis seront effectuées, afin de réduire au maximum le stress. Les séances et le test de course seront également supervisées par le même expérimentateur (habituation à l’expérimentateur). Ces séances d’habituation sont de faible intensité et de faible durée (maximum 10min et jusqu’à 10m/min). Pour motiver les animaux à la course, des stimulations électriques seront administrées à l’aide d’une grille placée en bout de piste de course. L’intensité et la fréquence des décharges électriques au niveau de la grille seront réglées au minimum (0,1mA et 1Hz). Lors du test, en lieu et place des stimulations éléctriques, une réglette à lamelles sera placée au dessus des pistes pour motiver les animaux à la course. Le test est arrêté lorsque l'animal reste sur la grille plus de 5 secondes malgré la règlette et aucun acharnement ne sera effectué pour pousser l'animal au delà de ce qu'il aura décidé. Pour la procédure expérimentale d’exercice volontaire sur roue, les animaux sont hébergés individuellement dès leur arrivée jusqu'à la fin de l’étude, avec enrichissements (roue/tunnel de contention en plexi rouge). Le change est fait une fois tous les 15 jours avec transfert du tunnel pour conserver l’odeur des animaux dans la cage propre. L’exercice volontaire sur roue est un modèle d’entraînement qui permet un enrichissement du milieu et participe au bien être de la souris qui peut s’adonner de manière volontaire à la pratique physique. En cas d’inconfort, on peut supposer que l’animal cessera de lui-même. Les animaux gardent le contact olfactif et visuel puisqu’il s’agit de cages ouvertes. Pour l’injection intrapéritonéale de solution de puromycine, nous respecterons les recommandations en terme de volume (
Choix des espèces
La fonction musculaire chez la souris est similaire à celle de l'homme et nous permettra de transposer facilement nos résultats. De plus, l'utilisation de la souris nous permet également d’avoir accès à des modèles génétiquements modifiés et d'utiliser un large panel de réactifs de biochimie et de biologie moléculaire. Dans cette étude nous utiliserons ainsi les souris mdx, un modèle d’étude de la myopathie de Duchenne. Nous prévoyons des animaux adultes âgés de 6 mois pour la course sur tapis. Pour la course volontaire sur roue les animaux démarreront la course à l’âge de 3 mois afin d’atteindre l’âge de 6 mois à la fin du protocole. Nous pourrons ainsi comparer les effets de différentes modalités d’exercice au même âge. Enfin, pour le contexte pathologique de la myopathie de Duchenne, les animaux seront âgés de 3 mois afin de présenter les signes de la maladie.
Etude des fonctions d’un nouveau gène dans le développement et la régénération musculaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
662 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souris génétiquement modifiées reçoivent des injections de tamoxifène pour inactiver un gène, puis une injection de cardiotoxine, un venin de serpent, dans un muscle de la patte pour provoquer une lésion et suivre la régénération, avec des tests d'activité locomotrice. L'objectif relève de la recherche fondamentale sur le rôle d'un gène dans le muscle. Le porteur affirme que ces interactions cellulaires complexes exigent l'"organisme entier".
Objectifs
Notre projet vise à caractériser le rôle d'un gène x dans la formation et le maintien de la cellule musculaire pour améliorer la compréhension de certaines pathologies du muscle strié squelettique et permettre l’établissement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous savons que ce gène a une fonction cellulaire importante dans la régulation de l'activité métabolique dans le système nerveux. Compte tenu de l'importance de la consommation d’énergie cellulaire par les cellules musculaires, nous pouvons émettre l'hypothèse que ce gene joue un role potentiellement important dans le developpement ou la reparation musculaire. Ce projet vise à tester cette hypothèse.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux impliques dans le développement et la régénération des muscles squelettiques. Les gènes impliques dans ces mécanismes sont généralement impliques dans des maladies du système neuromusculaire comme par exemple les myopathies. Ils peuvent également fournir des cibles pour l'identification de biomarqueurs ou de pistes thérapeutiques potentielles.
Procédures
Des injections d'une molecule (le tamoxifene) seront realisées pour inactiver le gène x pendant 4 jours consecutifs. Une injection d'une toxine extraite du venin de serpent (la cardiotoxine) entrainera une lesion dans un muscle de la patte (posterieur) pour suivre les mécanismes de regeneration musculaire. Des tests d'exploration de l'activite locomotrice, non invasifs, peuvent entrainer un stress lie a la contention et manipulation.
Impact sur les animaux
La création d'une nouvelle lignée peut entrainer des phénotypes persistant toute la vie de l'animal. Sur la base des phénotypes observes pour des gènes proches, nous nous attendons à des perturbations de croissance et des perturbations locomotrices. Leur caractérisation est un des objectifs de ce projet. Les tests de comportement proposés dans la procedure 2 nécessitent la manipulation des animaux mais n'induisent pas de nuisances autres que le stress lie à la manipulation. L'étude de la régénération musculaire nécessite l'injection d'une toxine (cardiotoxine) dans le muscle tibialis anterior, induisant une lésion musculaire limitée a ce muscle.
Devenir
Les animaux proviennent de lignées génétiquement modifiées et ne pourront donc pas être placés hors de l'animalerie. En fin d'expérience il sera procédé à la mise à mort des animaux pour prélever des tissus.
Remplacement
Le recours à l’animal, et notamment aux modèles transgéniques, permet d’identifier le rôle de certains gènes dans les processus de remodelage et de dégénérescence tissulaire. Ces modèles offrent la possibilité de réaliser des analyses de tissus, voire de l’organisme entier et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par ailleurs la physiologie et l’homéostasie du système neuromusculaire implique des interactions complexes entre différent types cellulaires (motoneurones, myofibres, tissus conjonctif, macrophages…) qui ne peuvent à l’heure actuelle pas être reproduits in vitro.
Réduction
Le projet étant réalisé en partenariat entre deux équipes de recherche, chaque fois que ce sera possible les expériences seront réalisées par plusieurs expérimentateurs et dans la mesure du possible, nous procéderons à des prélèvements multiples sur le même individu. Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire de souris. Les analyses statistiques précédentes de l'équipe permettent d'ajuster le nombre d'animaux requis au minimum.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans les conditions standard d’hébergement et l’environnement sera enrichi. Lors des différentes procédures, un suivi régulier des animaux sera réalisé et pour toute manipulation susceptible d’entrainer du stress ou de la douleur, nous aurons recours systématiquement aux techniques d’analgésie et d’anesthésie.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles (évaluation de la fonction contractile du muscle). Certains travaux ont montré que les étapes de la myogenèse, après induction d’une inflammation, sont identiques chez la souris et chez l'homme, rendant pertinent ce modèle pour l'investigation physiopathologique du muscle qui est impossible à réaliser chez l'homme. Ce projet concerne le développement et l’homéostasie du système neuromusculaire chez des animaux adultes. Chez la souris, le muscle termine sa croissance aux alentours de 5 semaines. Les animaux seront considérés comme adultes à partir de 8 semaines, âge auquel les procédures seront initiées. Les tests de fonction motrice seront réalisés sur des souris de 12 semaines, soit 4 semaines après l'inactivation du gène X, ce délai permettant potentiellement l’apparition de déficits fonctionnels. Dans une optique de réduction du nombre de portées générées, les cohortes pourront néanmoins inclure des animaux jusqu’à l’âge de 5 mois (20 semaines), s’il manquait quelques animaux par génotype. Selon la littérature, il n’y a pas de différence liée à un phénotype de vieillissement chez des souris entre 12 et 20 semaines, les animaux seront donc essentiellement comparables.
Exsanguination par perfusion intra-cardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
104 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur décrit un prélèvement de 150 microlitres de sang à la queue sous anesthésie, sur des souris porteuses du génotype Apc qu'il qualifie de dommageable, avec une surmortalité et une demi-vie de 23 semaines, suivies jusqu'à 15 semaines pour étudier la fonte musculaire liée au cancer. Il indique que la mise à mort passe par une exsanguination lors d'une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde, aucun animal n'étant maintenu en vie. Sur le remplacement, il affirme qu'un système in vitro ne reproduirait pas la complexité multi-tissulaire du phénomène et que seul un modèle murin le permet.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peut être observé dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Les travaux antérieurs conduits par notre équipe de recherche chez la souris Apc, un modèle murin de cancer de l'intestin, ont mis en evidence une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien) associée à une augmentation de la concentration en glucocorticoides dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez les souris Apc.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope dans un modèle pré-clinique de cachexie associe au cancer.
Procédures
Un prélèvement sanguin (150 µl) au niveau de l'extrémité de la queue sera réalisé sous anesthésie (kétamine 100 mg/kg + xylazine 10 mg/kg).
Impact sur les animaux
Il s'agit d'une étude non interventionnelle de suivi du développement naturel des animaux jusqu'à l'âge de 15 semaines. Toutefois, la gestion du stress est un point essentiel à la bonne réalisation de cette expérimentation puisque celui-ci active directement l'axe corticotrope et donc la production de glucocorticoïdes. Concernant les souris contrôles, aucune nuisance ou effet indésirable n'est donc attendu à l'exception du prélèvement rétro-orbital sous anesthésie gazeuse la veille de l’expérimentation. Concernant les souris Apc, il s'agit d'un génotype dommageable qui entraine une surmortalité des animaux avec une demi-vie de 23 semaines (le suivi et l'entretien de la lignée Apc est décrit dans la Procédure 1). D'une façon générale et afin de réduire au maximum le stress éventuel que pourraient subir les animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons également particulièrement vigilants à tout signe évocateur de souffrance animale (se reporter à 4.2 pour une description des critères d'évaluation de souffrance animale et d'atteinte des points limites). Dans les cas où ces symptômes évocateurs d'une souffrance animale seraient atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole et une mise à mort éthique sera effectuée par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.
Devenir
S'agissant d'une procédure classe sans réveil, aucun animal ne sera maintenu en vie au terme de la procédure.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en oeuvre.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal, surface de section transversale ds fibres musculaires, à l'aide de l'outil https://www.sealedenvelope.com/power/continuous-superiority. Après avoir intégré différents paramètres statistiques, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour les souris Apc, nous prévoyons des lots de 14 animaux par groupe pour les souris Apc. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R et nous permettra d’évaluer les différences significatives par l’utilisation de tests ANOVA 2 facteurs (time x genotype) pour l'analyse des données.
Raffinement
Le bien être animal est une préocupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
Le déconditionnement musculaire associé au cancer met en jeu un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu. Des analyses immunohistologiques seront réalisées et ne peuvent donc être menés à bien qu’en ayant recours à l’expérimentation in vivo chez la souris. Par ailleurs, la littérature, ainsi que notre expertise dans ce domaine scientifique et technique, nous permettront de réaliser chez la souris ce projet sans étape de mise au point préalable. Afin d'étudier la régulation de l'axe corticotrope chez des souris mâles et femelles lors de la cachexie associée au cancer, les souris seront analysées à un stade pré-cachectique (absence de perte de masse musculaire) à l'age de 11 semaines et à un stade cachectique (présence d'une perte de masse musculaire) à l'âge de 15 semaines. Nos travaux antérieurs ont permis de valider ces 2 points d'analyse. Des souris de type sauvage issues des mêmes portées que les souris Apc seront utilisées comme animaux contrôles. Un dimorphisme sexuel pouvant être à l'origine d'une meilleure résistance à la cachexie des souris femelles, des souris mâles et femelles seront utilisées.
Intérêt d’une viscosupplémentation à base de gel de chitosan dans un modèle d’arthrose expérimentale par injection intra-articulaire de MIA (Mono-iodoacétate) chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une arthrose du genou leur est provoquée par injection d'une substance, la MIA, sous anesthésie, pour tester un gel de chitosan censé limiter les lésions. Le porteur indique qu'il n'est pas possible de soulager la douleur par des antalgiques, ceux-ci fausseraient l'inflammation et les lésions recherchées, et décrit une douleur modérée liée au développement de la pathologie. Les rats sont tués quatorze jours après l'injection pour prélever et analyser les genoux.
Objectifs
L’arthrose du genou est un problème majeur de santé publique à travers le monde. Des études basées sur la population révèlent que l'arthrose symptomatique du genou est présente dans 20 à 30 % de la population âgée de plus de 65 ans et sa prévalence augmente en partie à cause du vieillissement de la population. Des études récentes ont montré que la progression de l'arthrose pouvait significativement être liée au stress oxydatif et aux radicaux libres. En effet, la production de radicaux libres a été trouvée élevée chez les patients atteints d'arthrose. Notre étude vise à cibler la voie de signalisation du stress oxydatif impliquée dans la pathologie de l'arthrose en évaluant l’effet d'une viscosupplémentation par un gel chélateur à base de chitosan (production d’un composé non toxique à partir des radicaux libres) sur le développement de la pathologie arthrosique. Le modèle d’arthrose utilisé est un modèle expérimental d’arthrose chez le rat par injection intra-articulaire de mono-iodoacétate de sodium (MIA). L’injection intra-articulaire de MIA entraine l’apparition rapide en 14 jours de lésions articulaires similaires aux lésions arthrosiques.
Bénéfices attendus
En ciblant la voie de signalisation de ce stress oxydatif impliquée dans la pathologie de l'arthrose, la viscosupplémentation par injection intra-articulaire locale à l'aide d'un gel chélateur de chitosan (permettant la production d’un composé non toxique) pourrait donc permettre de soulager les patients et de retarder voir de supprimer l'apparition des lésions arthrosiques, évitant ou retardant ainsi la mise en place d'une prothèse (seule technique efficace pour le moment).
Procédures
Tous les animaux subiront 2 injections intra-articulaires à J0 et à J3 (d'une durée de moins d'une minute chacune), qui seront réalisées sous anesthésie gazeuse générale, ce qui permettra de supprimer la douleur de l'injection. La première injection de MIA va permettre d'induire l'arthrose expérimentale. Il n’est cependant pas possible de diminuer la douleur par l’administration d’antalgiques, car ces molécules auraient une influence sur l’inflammation et l’apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans ce modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale puis liée au développement de la pathologie arthrosique. L'accès à la nourriture et à l'eau n'est pas impacté et les animaux conservent une mobilité et un comportement social normal. La deuxième injection intra-articulaire de gel à base de chitosan n'induit pas de douleur "post-injection". La formulation du gel de chitosan n'est pas toxique pour l'animal et n'induit aucun signe de douleur.
Impact sur les animaux
Ce modèle animal est indispensable pour évaluer l’intérêt d’une viscosupplémentation dans un modèle d’arthrose expérimentale sur les lésions arthrosiques. Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale, ce qui permettra de supprimer la douleur de l'injection. Ce modèle d’arthrose expérimentale par injection de MIA est un modèle bien connu en termes de douleur. Il n’est cependant pas possible de diminuer la douleur par l’administration d’antalgiques, car ces molécules auraient une influence sur l’inflammation et l’apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans notre modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale puis liée au développement de la pathologie arthrosique. Il pourra y avoir également un handicap moteur d'ordre modéré.
Devenir
A la fin de l'étude, tous les animaux seront mis à mort 14 jours après l'injection de MIA. Chaque genou (droit et gauche) sera ensuite prélevé pour des analyses histologiques pour évaluer les lésions articulaires et osseuses à l'aide de scores quantitatifs en comparaison avec le cartilage natif du genou controlatéral. Le liquide synovial sera récupéré pour la réalisation des dosages des médiateurs de l'inflammation. La synoviale sera également prélevée pour l'analyse du degré d'inflammation via un score de Rooney.
Remplacement
Afin de développer de nouveaux produits dans le traitement des symptômes de l'arthrose (douleur et inflammation), des études pré-cliniques sont requises pour évaluer leur efficacité avant de les tester chez l'Homme. Il n'y a pas de méthode «in silico" permettant de remplacer un organisme vivant pour obtenir un modèle de lésions diffuses qui reproduit les lésions arthrosiques observées chez l'homme. En effet, ce modèle animal est indispensable pour évaluer l’intérêt d’une viscosuplémentation dans un modèle d’arthrose expérimentale sur les lésions arthrosiques.
Réduction
Dans un souci d’éthique, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum et est nécessaire et suffisant pour les études statistiques. De plus, seul le côté droit sera injecté de façon à conserver le genou gauche comme témoin. Pour le traitement de nos données, le test ANOVA est la méthode de référence pour l'analyse statistique. Tous les scores histologiques (MANKIN pour les lésions du cartilage et ROONEY pour l'inflammation de la membrane synoviale) seront réalisés en double aveugle avec moins de 5% d'erreurs entre les deux observateurs expérimentés.
Raffinement
Les rats seront hébergés par 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce (directive 2010/63/EU) au sein de notre animalerie conventionnelle. L'enrichissement se fera par un tunnel dans la cage et la distribution quotidienne de quelques céréales (type miels pops). Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Ce modèle d’arthrose expérimentale par injection de MIA est un modèle bien connu et maîtrisé au laboratoire en termes de douleur. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-érection, cachexie), pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure à 20% sur 3 jours après injection de MIA étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l’animal.
Choix des espèces
Le rat est courament utilisé dans l'arthrose et ce modèle mécanique reste une alternative à l'utilisation du chien. Les animaux utilisés seront livrés à l'âge de 5 semaines (150 - 175 g) et auront une semaine d'acclimatation. L'arthrose sera induite sur des animaux agés de 6 semaines pour être en accord avec la littérature. La mise à mort sera ensuite réalisée en fin d'expérimentation 14 jours après l'induction de l'arthrose pour réaliser des explorations histologiques et immunohistologiques des lésions arthrosiques et pour évaluer le degré d'inflammation.
Protéger les chromosomes pour prévenir l’arthrose
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections de collagénase dans le genou pour provoquer une arthrose, chez des animaux jeunes et âgés, afin de cibler les cellules sénescentes du cartilage. Le porteur reconnaît que l'injection peut induire une douleur articulaire. Il affirme que l'étude de la sénescence dans l'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants.
Objectifs
L’arthrose est la maladie la plus repandue en rhumatologie. Elle consiste en une dégradation progressive du cartilage. Aucun traitement n’est disponible. Il a été montré, dans une récente étude in vitro et in vivo, chez la souris ou sur des prélèvements de patients, que la sénescence cellulaire s’accumule dans le cartilage arthrosique. Cette découverte a permis de proposer une nouvelle approche thérapeutique de l’arthrose en ciblant les cellules sénescentes. Nous proposons ainsi, dans ce projet: d'établir la présence de cellules sénescentes dans un modèle d’arthrose induite à la collagénase chez les souris jeunes et agées, puis de voir si le maintien intégral des extremités des chromosomes permet la protection contre l'accumulation de ces cellules sénescentes et donc la protection contre le développement de l'arthrose.
Bénéfices attendus
Le but est de comprendre les mécanismes moléculaires responsables de l’accumulation des cellules sénescentes articulaires qui entrainent le développement de l’arthrose. A long terme, nous éspérons : soigner l'arthrose chez la souris et proposer des thérapies chez l'Homme qui miment le transgène (télomérase).
Procédures
Procédures chirurgicales : injection intra-articulaire (2 fois avec la collagénase), le temps d'une injection (10-15 secondes).
Impact sur les animaux
L’injection de la collagénase en intra-articulaire peut induire une douleur au niveau du genou.
Devenir
A la fin du projet, une mise à mort sera effectuée pour permettre le prélevement de l'articulation du genou.
Remplacement
L’analyse du rôle de la senescence cellulaire et de son traitement sur un modèle d'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n’est donc pas possible de prévoir une méthode substitutive pour répondre à la question scientifique de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé en tenant compte des pertes éventuelles lors des protocoles et en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrose chez la souris et de mise en évidence d'effet significatif sur les paramètres histologiques mesurés en fin d'expérience.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Les injections intra-articulaires se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter au maximum la souffrance et l'angoisse infligé aux animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement par l'équipe de zootechniciens et par notre groupe 1 fois par semaine. Pour le bien-être animal, il existe une grille de points limites avec un score.
Choix des espèces
Le modèle murin d'arthrose induite à la collagénase présente l’avantage de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’Homme, c’est-à-dire chez le sujet jeune après le traumatisme articulaire ou chez le sujet âgé par une arthrose spontanée. On donc reproduira les mêmes conditions chez les souris jeunes et les souris âgées. Les animaux seront utilisés à 2 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à l’arthrose induite. Chez les souris de 18 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à une arthrose spontanée et naturelle. Sur les 2 modèles (jeunes et âgées), on va étudier l’effet de l’élimination de ces cellules sénescentes par à l'aide de l'expression de la télomérase.
Étude de la plasticité neuromusculaire et cardiaque dans un modèle murin de laminopathie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié tuée sous anesthésie avant tout réveil. Elles portent une mutation qui reproduit une laminopathie humaine et les fait décliner jusqu'à la mort par atteinte cardiaque vers huit mois. Trente-six subissent des électroneuromyographies avec aiguilles intramusculaires et des mesures de force, trente-six une perfusion intracardiaque, pour mieux comprendre la maladie. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro, ex vivo ou in silico n'existe et décrit un modèle qui ne peut pas être remplacé.
Objectifs
Les laminopathies constituent un ensemble très hétérogène de maladies génétiques caractérisées par des mutations dans des gènes codant des protéines nucléaires appelées lamine A et C. Parmi elles, plusieurs sont des maladies à expression préférentiellement neuromusculaire dont l’une d’entre elle se caractérise par une apparition précoce des symptômes souvent associés à une atteinte cardiaque appelée cardiomyopathies. Ce projet a pour but l’exploration des modifications fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et cardiaque permettant une meilleure compréhension de ces maladies et une prise en charge adaptée des patients dans un modèle murin de la pathologie. Le modèle murin de référence utilisé dans ce projet est porteur d’une mutation décrite chez l’homme et récapitulant, à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques musculaire et cardiaques décrites chez l’homme et détectable dès 3 mois allant jusqu’au décès des animaux à 8 mois.
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats obtenus permettront de progresser sur les connaissances physiopathologiques synaptiques et cardiaques dans le cadre de défauts de protéine de l’architecture nucléaire, permettant ainsi une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les laminopathies.
Procédures
Dans ce projet, 36 animaux subiront une étude Electroneuromyographiques (ENMG) sur la patte gauche des souris (gastrocnemius) mutantes et contrôles (d’une durée de 8 minutes/animal) à 3 âges de la pathologie (3, 6 et 8 mois) et une semaine après des mesures de la force musculaire directe et indirecte (d’une durée de 20 à 30 minutes) sur la patte droite des souris mutantes et contrôles à 3 âges de la pathologie (3, 6 et 8 mois). Les 36 autres animaux subiront un acte de perfusion intracardiaque permettant une analyse macroscopique du cœur des souris mutantes et contrôles (d’une durée de 15 minutes) à 3 âges de la pathologie (3, 6 et 8 mois). Tous les actes du projet sont effectués sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Dans chaque acte du projet des risques anésthesiques incluant un possible réveil ainsi qu’une détresse respiratoire peuvent survenir. Pour l'acte d'électromyographie, des nuisances post opératoire dû aux aiguilles intra-musculaire peuvent apparaître tel que une infection, inflammation et une douleur ou incorfort. Le modèle utilisé dans ce projet présente des atteintes cardiaques qui pourraient accentuer le risque d'anesthésie lors de chaque acte.
Devenir
Le protocole compte un lot 72 animaux (souris). Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des 2 procédures du projet. Des prélèvements de nombreux tissus et organes seron prélevés par la suite pour procéder à des analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
Dans ce projet nous anticipons l’utilisation d’un nombre total de 72 animaux respectant ainsi les règles des trois R de remplacement, de réduction et de raffinement. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la pathologie neuromusculaire et cardiaque. Selon les connaissances actuelles, il n’existe aucune alternative in vitro, ex vivo ou in silico pour répondre à la question scientifique à la fois pour l’analyse fonctionnelle et structurelle des jonctions neuromusculaires mais également l’étude macroscopique du coeur.
Réduction
Les souris modèles et contrôles seront étudiées à différents stades allant de 3 mois (stade précoce de la pathologie, 6 mois (forme installée de la maladie) et 8 mois (stade tardif de la pathologie avec mort des animaux causé par une atteinte cardiaque) permettant une analyse aux différents stades de la pathologie. Il y aura 3 groupes de 12 souris selon l’âge des animaux. Les évaluations réalisées dans le cadre de ce projet sont réalisées en routine depuis de nombreuses années dans l’établissement et le nombre d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques est par conséquent bien établis et déjà réduit au strict minimum (n=3 groupes de 12 souris suivant l’âge des souris, soit un nombre total de 72 animaux au maximum).
Raffinement
Les souris seront stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Le milieu est enrichi avec des igloos (maisonnettes) en polypropylène sont disposés dans les cages permettant les jeux et le repos des souris. Au cours des procédures, seuls les animaux sur lesquels il y a une intervention seront amenés dans la pièce d’expérimentation. Les animaux seront anesthésiés avec un mélange d’analgésique et d’anesthésique en intrapéritonéal ou bien par anesthésique gazeux. Pour les deux procédures, une injection d’analgésique sera administrée pour le bien-être de l'animal. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de nécroses ou escarres) et des points limites ont été définis. Cependant, l'expérimentateur référent de l'électroneuromyographie assure une reprise totale de l'animal et n'a observé aucun état de mal-être à la suite de cette acte.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé dans ce projet de recherche récapitule à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la pathologie neuromusculaire et cardiaque étudiée. Les premiers symptômes sont détectés dès 3 mois chez les mâles homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux vers 8 mois provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque. Ce modèle permettra d’étudier les modifications fonctionnelles et structurelles des jonctions neuromusculaires et cardiaques, conséquences des défauts de l’enveloppe nucléaire dans ce modèle murin qui ne peut pas être remplacé.
Evaluation sur la douleur de l’effet d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation aigüe microcristalline.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
181 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent deux à trois injections intra-articulaires provoquant une arthrite microcristalline, un modèle de la crise de goutte, avec gonflement et douleur de la patte, suivies de mesures quotidiennes de la douleur par le test de Von Frey sur neuf jours. Le porteur revendique l'originalité d'évaluer la douleur, rarement étudiée dans ces modèles. Il affirme qu'aucun procédé in vitro ou in silico ne permet cette évaluation.
Objectifs
Les dépôts de cristaux d’urate de sodium, de pyrophosphate de calcium ou de phosphate de calcium au sein des articulations sont fréquents, touchent plus de 17.5% des personnes âgées de plus de 75 ans. Ils peuvent être responsables d’inflammation articulaire aiguë récidivante. Cette inflammation est contrée par la colchicine ; mais celle-ci, utilisée par voie orale et systémique expose à des effets secondaires parfois mortels, en particulier chez des patients avec insuffisance rénale. Ainsi, il existe un réel besoin de traitement local efficace, et rapidement actif sur la douleur, qui est intense au cours d’un accès goutteux. L’efficacité de la colchicine dépend de sa concentration locale. Nous développons un nouveau procédé médicamenteux, avec une molécule que nous encapsulons pour former des microparticules, permettant d’obtenir de fortes concentrations locales avec de faibles concentrations systémiques, devant améliorer l’efficacité locale. Les modèles expérimentaux d’arthrite sont utilisés depuis longtemps pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie. Les études pré-cliniques sont menées principalement pour évaluer la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et la destruction des articulations, et non à inhiber les paramètres de la douleur. La douleur est très rarement étudiée dans les modèles animaux d’arthrite, or c’est d’un intérêt clinique majeur pour les patients. Un élément novateur est que les modèles animaux d’arthrite microcristalline n’ont jamais fait l’objet de ce type d’évaluation. Ainsi, l’intérêt du projet est aussi d’établir un nouveau modèle d’évaluation. Finalement notre objectif est de démontrer : - L’intérêt d’une nouvelle formulation, innovante, utilisant une nouvelle technologie de délivrance de médicament. - D’établir l’effet sur la douleur de cette formulation, de la comparer et l’associer à un antalgique local. - De démontrer l’intérêt d’évaluer la douleur dans un modèle d’inflammation microcristalline.
Bénéfices attendus
La douleur dégrade très fortement la qualité de vie des patients atteints de maladie goutteuse. Dans cette maladie très inflammatoire qui altère progressivement les articulations, la douleur peut être associée à une inflammation en cours (douleur inflammatoire) ou peut survenir durant la phase chronique de la maladie, en dehors des poussées. La douleur est ressentie de façon variable par les patients au cours de la maladie (3). Les médicaments anti-inflammatoires sont efficaces sur l’inflammation et la douleur à condition d’être tolérée. On se heurte la plupart du temps à un seuil d’efficacité faute de pouvoir atteindre une concentration synoviale suffisante. L’utilisation d’un anesthésique local (M2), simultanément à une préparation délivrant M1 de façon continue, serait un progrès significatif dans la prise en charge des malades. Ce projet serait donc susceptible d’apporter la preuve de l’efficacité d’une telle approche sur la goutte et permettrait d’envisager un nouveau traitement efficace sur la douleur pour ces patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 ou 3 injections intra-articulaires (en fonction des groupes) d'une durée de 1 à 2 min sous anesthésie gazeuse ainsi qu'à un prélèvement de sang conservateur d'une durée de 3 min. Ils seront manipulés tous les jours pendant 9 jours pour les mesures de douleur et de score clinique, cette évaluation dure envrion 30 min par rat. Les rats seront également soumis à un prélèvement sanguin terminal d'une durée d'environ 3 min, réalisé sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
L'arthrite microcristalline provoquera un gonflement et une douleur transistoire de la patte postérieure injectée. La manipulation des rats pour les tests de douleur peut provoquer un incofort passager. L'isolement des rats pour le test de Von Frey peut être responsable d'un léger stress temporaire.
Devenir
Tous les animaux (181 rats) seront euthanasiés à l'issue de la procédure. Ceci permettra d'effectuer le prélèvement des pattes postérieures nécessaire à l'étude histologique complémentaire.
Remplacement
Les expériences in vivo dans ce projet sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance de la drogue par un procédé nouveau utilisant des microparticules dans des conditions inflammatoires, d’autre par car l’originalité principale ici consiste à évaluer l’effet antalgique du procédé que nous étudions.
Réduction
Le nombre de rats nécessaires (181) est défini pour obtenir des données statistiquement exploitables. La taille des groupes a été définie grâce à un calcul de puissance. Nous avons tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale ainsi que de la variabilité inter-individuelle pouvant être observé lors des évaluations cliniques. Sur les animaux seront prélevés le sang et les pattes afin d’obtenir un maximum d’information complémentaires sur l'impact de arthrite microcristalline et son traitement au niveau de l'articulation et limiter ainsi la répétition d'expériences.
Raffinement
Les rats sont maintenus en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Ils sont hébergés dans des cages en plastique munies d’une grille, à raison de 4 animaux par cage maximum. L’enrichissement par des tunnels sera effectué pour améliorer leur bien-être. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C.Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. L’euthanasie se fera sous anesthésie générale. Toutes les injections intra-articulaires et les prélèvements de sang se font sous anesthésie gazeuse. Dès les premiers signes cliniques (gonflement de la patte injectée), des aliments sous forme de granulés seront placés directement dans la cage pour faciliter la prise de nourriture des rats.
Choix des espèces
Le rat a été choisi car c’est le plus petit animal chez qui il est fiable d’injecter des volumes bien définis, de l’ordre de 50 µl (moins devient problématique à préparer et à injecter) dans un site anatomique aussi précis qu’une articulation. Des rats de 250 à 300g seront utilisés, soit environ 6 à 7 semaines. Pour l’évaluation de la douleur posturale, des animaux plus gros ont tendance à s’appuyer avec leur corps et non leurs pattes sur le capteur et on perd donc l’information voulue.
Effet thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses par ingénierie tissulaire ou thérapie cellulaire dans l’arthrose
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
4 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit dans le genou des injections de collagénase ou de sang pour induire une arthrose, avec incisions sous anesthésie, une autre partie une implantation de biomatériau suturée sous la peau du dos, pour tester des thérapies cellulaires et d'ingénierie tissulaire. Le porteur indique que les injections de collagénase provoquent une laxité de l'articulation et une douleur modérée. Il annonce des "retombées énormes" à moyen terme pour les patients tout en reconnaissant que ces cellules ne sont encore qu'"en cours d'évaluation" en clinique.
Objectifs
L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative caractérisée par une perte progressive de cartilage au niveau des articulations. Plus de 50% des adultes de plus de 65 ans sont touchés par la maladie. Chez les plus jeunes, une arthrose post-traumatique peut se développer suite à des traumatismes accidentels. Enfin, une incidence croissante d’arthrose hémophilique est observée chez les patients hémophiles jeunes suite à des saignements répétés dans les articulations. Dans tous ces cas d’arthrose, aucun traitement curatif n’est disponible, seuls des anti-douleurs et des traitements de viscosupplémentation locale sont proposés. Le traitement ultime est la pose de prothèses. Cette intervention chirurgicale présente un certain nombre de limitations et n'est pas recommandée chez les patients jeunes. Chez ces patients, la réparation du cartilage et de l’os par thérapie cellulaire ou ingénierie tissulaire pourrait représenter une thérapie alternative. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’intérêt de la thérapie cellulaire et de l’ingénierie tissulaire pour diminuer les signes d’arthrose dans deux modèles expérimentaux murins ou favoriser la formation d’un nouveau tissu de réparation du cartilage.
Bénéfices attendus
Les deux approches de thérapie cellulaire et d’ingénierie tissulaire ont une portée translationnelle pour une utilisation en clinique chez des patients souffrant d’arthrose. Ces cellules médicament sont déjà en cours d’évaluation en clinique et nous espérons valider des cellules plus efficaces que les cellules en cours d’évaluation. En outre, ces cellules pourraient être encapsulées au sein d’un matériau et implantées au sein d’une lésion de cartilage chez les patients afin de remplacer le tissu détruit par la pathologie. Cette double approche permettrait à la fois de protéger et réparer les articulations des dégradations associées à l’arthrose. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de l’arthrose. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire ou d’ingénierie tissulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des injections dans l’articulation d’un genou de patte arrière. Selon la procédure, ils recevront 5µL de collagenase (2 fois) ou de sang (injections tous les 2 jours pendant 3 à 6 semaines) suivi par l’injection de cellules ou de vésicules extracellulaires (1 fois) ou bien 5µL de gel contenant ou pas des cellules (1 fois). Une incision d’environ 2 mm est réalisée au niveau de la peau qui recouvre le genou. Toutes les injections se font sous anesthésie générale gazeuse (maximum 5 min/animal) et locale (application de lidocaïne en pommade) au moment de l’intervention. Une autre partie des animaux recevra une implantation d’un matériau contenant des cellules médicament en sous-cutanée. Une incision d’environ 5mm est réalisée au niveau de la peau du dos et le scaffold sera inséré sous la peau. Une suture sera réalisée après l’implantation. L’impantation se fera sous anesthésie générale gazeuse (maximum 8 min/animal) et locale (application de lidocaïne en pommade).
Impact sur les animaux
Nuisance et effets indésirables : faibles à modérés. Les incisions au niveau cutanée pour les injections intra-articulaires et sous-cutanée sont réalisées sous anesthésie (
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures pour permettre l’analyse du modèle expérimental et des traitements réalisés (histologie).
Remplacement
Avant de proposer une thérapie cellulaire ou une approche d’ingénierie tissulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des traitements proposés dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte complexe d’inflammation et d’altérations tissulaires rencontrés in vivo.
Réduction
Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et une analyse statistique afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour chaque expérience. Nous utiliserons donc 15 souris par groupe expérimental afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle visuel quotidien en se basant sur une grille d’évaluation des signes potentiels de souffrance. Surveillance liée aux procédures : Les souris sont examinées pour vérifier la cicatrisation et l’absence d’infection au niveau des incisions dans les jours qui suivent les gestes opératoires.
Choix des espèces
Le modèle murin d’arthrose induite à la collagénase (CIOA) a été choisi parce qu’il présente l’avantage de reproduire assez fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’homme et est considéré comme une référence de l’arthrose inflammatoire. Les animaux sont utilisés à semaine 10, âge recommandé pour ces modèles d’arthrose ou en ingénierie tissulaire
Etude de biodistribution de vecteurs AAV (visant à traiter des dystrophies musculaires) chez le primate non-humain par injection systémique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie intraveineuse des vecteurs viraux de thérapie génique, subissent des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie, puis sont mis à mort pour prélever organes et tissus. Le projet vise à vérifier chez le primate si un vecteur efficace chez les rongeurs conserve ses propriétés avant un éventuel essai chez l'humain. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à une espèce proche de l'humain et décrit le macaque comme l'"espèce de choix" pour la biodistribution.
Objectifs
Les dystrophies musculaires englobent un groupe hétérogène de maladies neuromusculaires rares. Ce sont des maladies génétiques pour lesquelles plus de trente gènes ont été identifiés à ce jour. Les plus fréquentes sont la myopathie de Duchenne, la myopathie facio-scapulo-humérale et le groupe des dystrophies musculaires des ceintures. Elles se manifestent par une diminution progressive de la force des muscles qui va conduire dans la majorité des cas à la perte de la marche . Elles impactent donc fortement sur la qualité de la vie du patient. Dans certaines formes, l’atteinte des muscles cardio-respiratoires est une cause majeure de mortalité et de morbidité. Il n’existe pas de traitement à l’heure actuelle et uniquement la prévention des complications. Il existe donc un besoin médical important. Au vu du caractère génétique de ces maladies, des pistes de traitement possibles s’orientent vers la thérapie génique en utilisant des virus (vecteur) comme transporteur de gènes correcteurs. Etant donné que le muscle représente plus de la moitié de la masse corporelle, ces approches nécessitent des doses élevées de vecteur afin de pouvoir atteindre de façon efficace le tissu cible. Ces doses posent des questions de sécurité. Il est donc important d’améliorer l’efficacité des vecteurs. Ce projet se place dans cet objectif. Il vise à déterminer si un vecteur nouvellement développé avec une affinité plus grande pour le muscle squelettique chez les rongeurs va conserver cette propriété dans une espèce la plus proche possible de l’homme afin d’évaluer les perspectives d’utilisation de ce vecteur en essai clinique chez l’homme. Dans ce projet, nous voulons comparer la biodistribution d’un de ces nouveaux vecteurs par rapport à un vecteur déjà connu chez le macaque. Un système de « code-barres » a été développé pour pouvoir retrouver séparément les vecteurs lors des analyses moléculaires, les deux vecteurs peuvent donc être injecté dans les mêmes animaux. Cette stratégie a pour intérêt de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concerne le domaine de la santé humaine. Il vise à valider un nouveau support de thérapie génique sous la forme d’un nouveau vecteur dérivé du virus associé à l’adéno-virus, Ce vecteur a été validé chez les rongeurs comme permettant un transfert de gène augmenté dans le muscle. L’objectif du projet est de valider que cette propriété se retrouve chez le macaque, espèce proche de l’homme. La validation de ce vecteur permettra des applications thérapeutiques chez l’homme dans le domaine des maladies musculaires qui n’ont pas de traitement disponibles à ce jour. Ce vecteur permettra une meilleure efficacité et une meilleure sécurité des stratégies de thérapie génique des maladies musculaires
Procédures
Le but de cette étude est d'injecter par voie intraveineuse (IV) les différents vecteurs AAV afin d’en déterminer la biodistribution . L’injection sera réalisée sur animal anesthésié en perfusion lente sur 30 min et au niveau de la veine saphène. Des prélèvements sanguins seront effectués juste avant l’injection du vecteur, mais aussi tout au long de l'étude sous anesthésie légère, pour permettre un suivi hématologique et biochimiques, et pour stock de sérum pour toute analyse ultérieure. Une détermination de la sérologie sera en outre réalisée en pré-injection ainsi qu’au sacrifice de l’animal. Des prélèvements post-mortem seront réalisés en fin de protocole.
Impact sur les animaux
A ce jour, l’administration intraveineuse de vecteurs AAV chez le macaque n’a pas d’effet délétère notable sur l’état de santé général de l’animal (études menées par plusieurs équipes de recherche). La majorité des gestes réalisés sur ces animaux seront non invasifs (injection du vecteur thérapeutiques par voie IV lente, et prélèvements sanguins par ponction veineuse). Ils seront réalisés sur animaux anesthésiés L’euthanasie sera également réalisé sous anesthésie, et une injection de morphine sera réalisée avant l’acte afin de garantir une analgésie. Si besoin, avec accord du vétérinaire de l’UE, un traitement analgésique (ex : Buprénorphine ou Perfalgan si douleur) pourra être mis en place dans les jours suivant la procédure. - Un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute anomalie.
Devenir
A l'issu de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront sacrifiés afin d’obtenir des échantillons de tissus et d’organes et ainsi déterminer la biodistribution, vérifier l’absence de toxicité et l’expression du vecteur. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.
Remplacement
Notre projet s’inscrit dans une démarche translationnelle. Les études nécessitant le recours à l’animal, du rongeur au Primate Non-Humain (macaques fascicularis), correspondent aux étapes précliniques permettant potentiellement de passer aux études cliniques chez l’Homme. Afin d’estimer l’efficacité de nos approches expérimentales, il est nécessaire d’administrer les vecteurs dans un organisme entier capable de répondre physiologiquement aux traitements administrés. Ceci ne peut être obtenu in vitro, et justifie notre recours à des animaux.
Réduction
Quatre animaux seront inclus dans l’étude et seront injectés avec un mélange de vecteur marqué par un « code-barres » à une seule dose. Ce système permet d’injecter en même temps les deux vecteurs et ainsi de diviser par deux le nombre d’animaux nécessaires. Cela permet également la variabilité interindividuelle. Le nombre d'animaux (n=4 animaux) utilisé est donc réduit à son minimum pour une exploitation possible des résultats. Cette répartition permettra d’obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Une analyse statistique ne sera réalisée que pour les mesures où le nombre d’échantillons permettra d'avoir une puissance statistique suffisante. Afin de réduire le nombre d’animaux d’avantage, le groupe témoins injectés avec le véhicule sera celui du projet précédent.
Raffinement
L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement (techniciens animaliers et vétérinaire). Des protocoles anesthésiques seront mis en place selon la procédure à réaliser. Les administrations expérimentales se dérouleront sous anesthésie générale. Les prélèvements sanguins seront effectués sous protocole anesthésique permettant d'obtenir une anesthésie de courte durée (environ 10 min.). Ces actes étant peu douloureux, aucun protocole analgésique ne sera mis en place d'emblée pour ces procédures. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les macaques seront hébergés en cage en post-injection, et en volières dès que possible pour favoriser les déplacements verticaux.
Choix des espèces
L’objectif principal de ce projet étant d’évaluer le tropisme et la biodistribution d’un nouveau vecteur, il est indispensable de choisir en conséquence l’espèce animale adaptée pour en déduire au plus près le comportement du vecteur chez l’homme. Les études chez le primate non-humain apportent les meilleures connaissances transposables à l’homme en terme de ciblage de tissus et de biodistribution du vecteur. Des études préalables ont été menées chez le rongeur avec ce même mélange de vecteurs. Aussi, la capacité de ces vecteurs viraux à pénétrer dans un organe/tissu et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Un vecteur peut être efficace chez le rongeur mais pas chez l'homme. Le macaque fascicularis représente l’espèce animale de choix dans le modèle pré-clinique de par sa morphologie, sa physiologie, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. 4 singes (Macaca fascicularis) mâles (2-3 ans, 2-4 kg) seront inclus dans l’étude. Il s'agit donc de jeunes adultes, matures sur le plan immunitaire notamment. Les dystrophies musculaires des ceintures se manifestent généralement chez l’adulte jeune