Système immunitaire

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules tumorales directement dans le pancréas, ce qui provoque un adénocarcinome, puis les euthanasie cinq semaines plus tard alors que toutes ont développé un cancer avancé. Il indique que ce stade terminal, marqué par une ascite et des changements de comportement, entraînerait une grande souffrance si la mort n'était pas donnée, une grille de score pouvant avancer la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la relation entre système immunitaire et tumeur.

Objectifs

Cette étude permettra de déterminer le rôle exact du TNFR2 sur l’activation du système immunitaire au sein du microenvironnement tumoral et ainsi en voir l'effet sur la croissance tumorale. Cette étude fait partie d’un projet de recherche translationnelle pour la détermination des meilleurs protocoles de traitement des tumeurs du pancréas.

Bénéfices attendus

Le TNFR2 participe à l'activation et au maintien de l'activité des lymphocytes T régulateurs. Son absence permettrait de diminuer, voir d'abroger, l'inhibition de la réponse immunitaire antitumorale au sein du micro-envonnement immunitaire. Le bénéfice potentiel est que la réponse immunitaire anti-tumorale soit plus efficace, et permette un ralentissement, voir un arrêt de la croissance tumorale.

Procédures

Il n'y a qu'une intervention effectuée. Les animaux vont subir une opération chirurgicale afin d'effectuer une greffe orthotopique. Ce type de greffe vise à introduire des cellules au sein d’un tissu de même nature. Ainsi les cellules tumorales pancréatiques sont directement injectées dans le pancréas. Cette intervention dure 5 minutes sur un animal sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Cette intervention est accompagnée par l'administration d'analgésiques, Rimadyl et Vetergesic, ceci le jour (Rimadyl et Vetergesic) et le lendemain (Vetergesic) de l'opération. Cette administration est faite par injections intra-péritonéales pour le Rimadyl et en sous-cutanée pour le Vetergesic.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales dans le pancréas va générer l'apparition d'un adénocarinome pancréatique canalaire. Les animaux ont dans les stades terminaux de l'expérimention une déficience pancréatique associée à diiférents autres symptômes (apparition d'ascites, changements comportementaux,...). Les symptômes sont bien sur suivis via une grille de suivi, nous servant à dertiminer quand le point limite de l'expérimentation est atteint.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure par dislocation cervicale (ou par asphyxie au dioxyde de carbone le cas échéant), 5 semaines après la greffe des cellules tumorales. A cette date, la mort est donnée car l'ensemble des animaux a developpé un cancer du pancréas avancé. Ce stade peut entrainer une grande souffrance dans les jours qui suivent si la mort n'est pas donnée. Il s'agit d'un point limite de la procédure. Cependant les souris peuvent être sacrifiées avant suivant la grille de suivi de souffrances décrite auparavant et rattachée en annexe 2. En effet si le score de souffrance atteint 4 avant la ciquième semaine, la ou les souris sont mises à mort.

Remplacement

Sur la question du « Remplacement », les expérimentations in vitro ne rendent pas compte de toute la complexité rencontrée dans la relation entre le systeme immunitaire et la tumeur, notamment à cause de differents types cellulaires impliqués. A l’heure actuelle il n’existe pas des modèles experimentaux in vitro ou ex vivo qui permettent de suivre la réponse anti-tumorale. L’expérimentation animale reste dans ce cas la meilleure solution pour étudier l’effet de l’absence du TNFR2 sur les cellules immunitaires, nous ne pouvons donc pas élaborer une stratégie de remplacement efficace.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris nécessaires pour que les résultats soient signifiants. Ce nombre, impliquant les 2 groupes, est estimé à 40 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans ce cadre. Ce calcul est détaillé sur un document rattaché à ce projet nommé annexe 1

Raffinement

Pour les strategie de « Raffinement », nous allons donner tous les produits nécessaires au bien-être animal, réduisant au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Au niveau de l’hébergement au cours de l’expérimentation, des produits d’enrichissement sont utilisés comme différents types de neslets, des tubes de carton et des dômes de carton. Au cas où la souffrance animale apparait sans que nous puissions la résoudre, nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques de notre modèle. Cette grille nous permet d’évaluer la souffrance de l’animal, et ainsi de définir des points limites. Si ces points limites sont atteints, nous sacrifions l’animal. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille qu’à partir du jour 10 après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille n’apparaissent qu’à partir du jour 18 après la greffe tumorale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort. Nous donnons également deux produits analgésiques différents, dispensés avant, pendant et après l’opération pour réduire au maximum la souffrance physique

Choix des espèces

La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer du pancréas décrit dans la littérature, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’homme. De plus les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires important qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation impliquées. Ainsi les souris sélectionnées pour cette étude qui sont immunocompétentes et donc présentent une réponse immunitaire complète, pourront être comparées dans leurs réponses immunitaires aux souris ayant des modifications génétiques. Les souris sont âgées de 8-10 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux.

255 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie pour accéder au pancréas et y créer une tumeur, ainsi que trois injections intrapéritonéales, pour étudier le stroma de l'adénocarcinome pancréatique. Le porteur indique des risques d'infection, d'hypothermie liée à la durée de la chirurgie et d'effets digestifs de la tumeur. Toutes les souris sont tuées pour prélever des organes vitaux.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (ADK) qui a un taux de survie global de 2-9%, est actuellement la quatrième cause principale de décès liés au cancer dans le monde industrialisé et d’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunités de traitements thérapeutiques. La plupart des approches thérapeutiques jusqu’à présent se sont intéressées à cibler directement les cellules tumorales et ont jusqu’à récemment, ignoré les réactions stromales adjacentes qui sont une des caractéristiques importantes des cancers pancréatiques humains. Depuis quelques années, le dépôt de ce stroma massif a émergé en tant qu'acteur nouveau et contributeur dans l'initiation et la progression pancréatique de la tumeur. Il a été mis en évidence la présence d’une sous-population cellulaire souche péricytaire dans le stroma du pancréas de souris atteintes d’ADK. Ces cellules ont été isolées et mises à proliférer en culture pour établir une lignée permettant son étude. Par ailleurs, il a été montré une augmentation significative de macrophages spécifique dans différents modèles de cancer pancréatique. Cette population a été décrite comme pro-tumoral dans le cancer du sein et du poumon. Nous pensons que ces macrophages spécifique jouent un rôle important dans la mise en place de l’immunosuppression présente dès le début du cancer pancréatique en étant recrutés et programmés par les cellules entourant le cancer, notamment les cellules stromal. Nos objectifs seront 1) de dépléter ces macrophages spécifiques via l’utilisation de souris génétiquement modifiées 2) D’étudier cette déplétion au niveau de la masse tumorale mais aussi de l’infiltrat immunitaire.

Bénéfices attendus

On estime à environ 10.000 le nombre de nouveaux cas de cancer du pancréas en France. L'incidence dans le monde, varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 personnes et reste globalement stable dans le temps mais en croissance dans les pays développés. D’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Le cancer du pancréas est difficile à diagnostiquer et particulièrement compliqué à traiter. Il résiste en effet à plusieurs traitements antitumoraux (Thérapie ciblée, immunothérapie, chimiothérapie). L’accès des traitements antitumoraux au sein de la tumeur est empêché par la nature du microenvironnement qui soutient les cellules cancéreuses mutées. Ce microenvironement est modifié par les macrophages. Ces derniers représentent près de 40% des cellules immunitaires infiltrées, comprendre le rôle d’une population potentiellement immunosuppressive de macrophages permettrait de développer de futur traitement contre le cancer du pancréas.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéale ainsi qu’une procédure chirurgicale de laparotomie permettant d’accéder au pancréas. Chaque souris sera soumise à 3 injections intra-péritonéale 1 avant la chirurgie, 2 après la chirurgie, chacune dure environ 1 minute. Chaque souris sera soumise à une laparotomie permettant d’accéder au pancréas. La durée estimée est entre 15 et 20 minutes.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables dues à l’injection intra-péritonéale peuvent être ressentis. Les autres principaux risques sont l’infection due à la chirurgie ainsi que l’hypothermie due à la durée de l’acte chirurgicale. Également, la tumeur peut avoir des effets sur la souris, notamment sur son système digestif.

Devenir

L’ensemble des animaux étant soumis aux procédures seront mis à mort car notre projet nécessite le prélèvement d’organes vitaux pour analyse.

Remplacement

Des études in vitro ont préalablement été effectué afin de déterminer le rôle des cellules stromal dans la différenciation des macrophages spécifique ainsi que le rôle de ces macrophages spécifique. Ainsi, l'utilisation d'un modèle murin afin de vérifier si ces observations ont lieu dans un environnement complexes ne peut être remplacé.

Réduction

Le nombre de souris sera réduit à minima pour permettre une analyse statistique et l’obtention de conclusions interprétables qui conduiront à ne pas répéter les expériences que nous mettons en place sur les animaux.

Raffinement

Afin de respecter le bien-être animal, les souris sont dans des cages avec un milieu enrichi et du coton pour qu’elles se fassent un nid (quotidien de l’animalerie). Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Les animaux seront observés au minimum 3 fois par semaine durant la durée de l’expérience afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse et ainsi améliorer leur bien être Afin de maximiser l’obtention des données scientifiques et raffiner nos approches expérimentales, nous établirons un suivi attentif des souris et fixerons des points limites pour réduire au maximum la souffrance des animaux et éviter l’apparition de tout signe de souffrance Dans ce cadre, un analgésique sera également utilisé dans les procédures de chirurgie afin d’enrayer la douleur chez l’animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études en cancérologie du fait de l’existence de nombreux modèles bien caractérisés. Spécifiquement, il n’existe pas d’autre espèce que la souris permettant une déplétion conditionnelle des macrophages spécifique. Les souris adultes de 6 semaines ayant un système immunitaire compétent et un pancréas développé et fonctionnel seront utilisées pour ce projet.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections de virus, une souche atténuée candidate au vaccin puis la souche pathogène, et subit jusqu'à sept prises de sang. Le porteur indique que l'infection par le virus du Nil occidental peut provoquer paralysie, prostration, dos voûté et perte de poids d'au moins 20 %, l'animal étant tué dès l'apparition d'un signe sévère. Il affirme que l'étude d'une réponse protectrice "ne peut être effectuée qu'in vivo".

Objectifs

Le virus du Nil Occidental (West Nile Virus) est un flavivirus pouvant conduire à des cas sévères d’encéphalite virale (dans 1 infection sur 150 environ chez l’homme). Cela pouvant conduire à la mort de la personne infectée. Il n’existe à ce jour que des traitements symptomatiques et il n’existe aucun vaccin efficace chez l’homme. La mise en place d’un vaccin atténué contre le WNV est donc d’intérêt clinique. Nous avons décrit dans les dernières années différentes mutations permettant d’atténuer le virus WNV. Ainsi des mutations dans la protéine de membrane réduisent significativement la production virale par rétention réticulaire. De plus une mutation dans la protéine d’enveloppe abrogeant la glycosylation de la protéine E conduit également à une souche atténuée. Cependant ces virus ne sont pas complètement atténués, et la probabilité de réversion est théoriquement importante. Notre objectif est de générer un virus vivant atténué comportant simultanément plusieurs des mutations décrites, et tester la capacité de ce virus à répliquer, et à éliciter une réponse immunitaire protectrice contre une infection d’épreuve. En un premier temps, nous testerons l’atténuation du virus in-vivo, i.e. l’absence de symptômes sévères et l’absence de mortalité. Nous confirmerons que chez l’animal aucun virus révertant n’émerge (i.e. les mutations sont maintenues). Enfin nous testerons l’efficacité de ce virus à induire une protection contre une infection secondaire par le virus WNV sauvage (challenge).

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’étudier un triple mutant du virus WNV (1 mutations dans la protéine E, deux mutations dans la protéine M) qui pourrait constituer un virus atténué, sûr et au potentiel vaccinal. Les 3 mutations étudiées dans ce projet ont déjà été décrites indépendamment dans la littérature mais mis en évidence une atténuation partielle ou pourraient muter et redevenir pathogène.

Procédures

Chaque animal sera soumis à deux injections de virus (souche vaccinale puis souche pathogène ; quelques minutes par injections), et à 7 prises de sang au maximum (alternance veine caudale et rétro-mandibulaire ; quelques minutes par prise de sans).

Impact sur les animaux

Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort.

Devenir

Les souris ont reçu du virus et un traitement potentiellement vaccinal, elles ne peuvent donc ni être réutilisées ni replacées ni adoptées, et sont donc mises à mort.

Remplacement

L’étude de la capacité d’un virus atténué à induire une réponse protectrice ne peut être effectuée qu’in vivo. Nous aurons au préalable confirmé que le virus est capable de réplication efficace et incapable de réverter in vitro. Le modèle souris (Balb/c) est un modèle précédemment utilisé pour les essais vaccinaux précliniques contre les infections à WNV.

Réduction

Nous commencerons par une expérience préliminaire sur 18 souris femelles, qui permettra de valider le nombre d’animaux à utiliser dans les expériences suivantes pour atteindre la significativité. Les groupes contrôles pour lesquels on connait bien la mortalité en réponse au virus WT, est nécessaire pour tester l’inoculum viral ; nous aurons dans ce groupe 3 animaux. Les expériences ne seront réalisées sur les mâles que si les résultats sont concluants chez les femelles. Nous commencerons par travailler chez les femelles car elles sont plus faciles à gérer. Bien que des différentes immunologiques entre mâles et femelles peuvent être décrits dans certains, cas, il n’y a eu aucune différence observée au cours les études antérieures.

Raffinement

Les souris seront suivies 3 fois par semaine (quotidiennement à partir de J7 post challenge). Pour réduire les risques de souffrance inutile, les animaux seront mis à mort selon les critères de suivi. Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort. En cas de problèmes de motricité, la nourriture et du gel d’hydratation seront déposés directement dans cage. En cas de symptômes légers, davantage de coton dentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris Balb/c est un modèle à la fois simple et bien décrit de mammifère pour évaluer la capacité vaccinale de virus atténués WNV. S’ils sont positifs, les résultats chez la souris constitueront une première preuve de l‘efficacité vaccinale de ce virus atténué, permettant alors d’envisager la conduite d'autres essais précliniques. En règle générale, les jeunes animaux sont plus sensibles aux Flavivirus neurotropes et sont donc préférentiellement utilisés. Nous utiliserons dans cette étude des animaux âgés de 3 à 4 semaines, afin que les souris soient âgées de 8 à 9 semaines au moment de l’épreuve.

180 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus transgéniques pour exprimer deux gènes de canard, ils sont infectés par le virus de la grippe aviaire H7N1, subissent jusqu'à neuf prises de sang et de nombreux écouvillons, puis sont euthanasiés pour prélever leurs organes. Les animaux infectés peuvent développer détresse respiratoire, prostration et immobilité, l'euthanasie étant déclenchée quand au moins trois signes cliniques sur six apparaissent. Le porteur affirme que l'étude de la réponse immunitaire adaptative "n'est possible que par des études in vivo" et présente ces poulets comme un "modèle unique".

Objectifs

Les virus de la grippe aviaire (AIV) représentent une menace majeure pour la santé humaine et animale. Les AIV, sont susceptibles d'acquérir des mutations dans les protéines virales, ce qui augmente le risque de transmission de l'oiseau à l'homme. Les oiseaux aquatiques sauvages, dont les canards, représentent le réservoir naturel des AIV. Il a été suggéré que les caractéristiques génomiques de ces espèces aviaires étaient associées à une résistance virale naturelle contre les maladies induites par le virus AIV. Chez le canard, le RIG-I (retinoic acid inducible gene 1) est considéré comme un gène de résistance naturelle contre la grippe aviaire. RIG-I est impliqué dans le déclenchement de la réponse antivirale caractérisée par une production des interférons (IFN) de type I et de type III, suivie de la production de gènes stimulés par l'IFN. Alors que les poulets sont très sensibles à l'infection grippale et présentent des symptômes cliniques, les canards ne développent pas de symptômes cliniques lors de l'infection par plusieurs sous-types de virus de la grippe aviaire, ce qui est peut-être dû à la présence de RIG-I, mais pourrait aussi être lié à la protéine 135 du doigt d'encoche (RNF-135). RIG-I et RNF-135 sont absents du génome du poulet, ce qui pourrait être à l'origine d'une plus grande sensibilité à certaines infections virales. Ce projet permettra d'expliquer pour la première fois le rôle des gènes de canards capables de maitriser les AIV en utilisant des poulets transgéniques. Les objectifs du projet sont de répondre à deux questions principales : 1) Les poulets transgéniques qui expriment le RIG-I et le RNF-135 de canard sont-ils protégés contre l'infection par des virus virulents de la grippe aviaire? 2) Quel est le rôle de RIG-I et RNF-135 de canard dans les réponses immunitaires adaptatives aux virus de la grippe aviaire ? Le nombre total d’animaux est de 180.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de répondre à des questions relatives à l'aviculture, à l'immunologie et à la virologie qui n'ont pu être résolues jusqu'à présent en raison de l'absence de poulets transgéniques. Nous obtiendrons de nouvelles informations sur le rôle des gènes du canard chez la volaille. Cela permettra de mieux contrôler le virus de la grippe aviaire chez les volailles en développant de nouvelles thérapies qui conduisent à l'activation de certaines voies immunitaires. En outre, les résultats de ce projet contribueront à la compréhension de l'oiseau aquatique en tant que réservoir du virus et expliqueront le rôle exact de RIG-I ainsi que de RNF-135 du canard. De plus, nous espérons fournir une compréhension approfondie des interactions virus-hôte d'une importante infection potentiellement zoonotique, ce qui bénéficiera à la santé des humains et des animaux.

Procédures

- Inoculation par voie intra-trachéale et intra-choanale de 100 µL virus (144 animaux) ou de 100 µL de PBS (36 animaux) : vigile, soit 180 animaux, à raison d’une administration pour 150 animaux (120 animaux avec le virus et 30 animaux avec le PBS) et 2 administrations pour les 30 autres (24 infectés et 6 témoins). Les inoculations durent moins de 30 sec en moyenne par animal. - Prélèvements de sang au sinus occipital : vigile, quelques µL à 100 µL à naissance, jour 1, 3, 7, 11, 14, 18 et 22 post-inoculation) soit 9 prises de sang par animal pour ceux euthanasiés à J22 (60 animaux), 5 prises de sang pour ceux euthanasiés à J7 (60 animaux) et 3 prises de sang pour ceux euthanasiés à J1 (60 animaux). - Ecouvillons oropharyngés et cloanaux : vigile, sur tous les animaux, un écouvillon de chaque à raison de 8 fois par animal (à 1, 3, 7, 11, 14, 18 et 22dpi) pour ceux euthanasiés à J22 (60 animaux), 4 écouvillons de chaque pour ceux euthanasiés à J7 (60 animaux) et 2 écouvillons pour ceux euthanasiés à J1 (60 animaux). Le prélèvement ne dure que quelques sec.

Impact sur les animaux

Les poulets transgéniques non infectés n'ont présenté aucun phénotype anormal. Au cours de l’infection, certains animaux qui ne sont pas génétiquement modifiés peuvent presenter dès 24h des signes cliniques modérés qui sont liés à la réponse de l’organisme à l’infection virale, mais ne présagent pas toujours d’une issue fatale. Il n’existe pas actuellement de grilles de scores cliniques adaptées à l’influenza aviaire expérimental. Cependant, en nous inspirant des études de bien-être du Welfare Quality® chez le poulet, nous mettrons en place le système d’évaluation de l’état clinique de l’animal suivant: Les animaux seront observés deux fois par jour par un animalier expérimenté, connaissant parfaitement les signes cliniques de l’influenza aviaire. Les animaux qui présenteront au moins 3 des 6 paramètres suivants seront euthanasiés par injection létale de barbiturique: - difficulté respiratoire visible - fermeture anormale de l'oeil (mi-fermé, fermé) - position anormale de la tête et de la queue - posture anormale des ailes (écartées, tombantes) - plumage ébouriffé - Absence de réponse à la stimulation (immobilité). Ce modèle d’infection de grippe (souche H7N1) chez les vollailes de type PA12 de statut EOPS ou axéniques est bien connu et maitrisé au sein de nos équipes. Les signes cliniques sont bien connus du personnel technique.

Devenir

Le projet est de réaliser un challenge infectieux (inoculation de la grippe) avec un suivi clinique de la maladie sur des prises de sang et écouvillons. Les animaux à la fin du projet (procédure) seront tous euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organes afin de quantifier le virus. Les animaux infectieux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés sur le plan sanitaire pour l’environnement, pour la santé animale et publique. Pour les animaux témoins, ils seront également euthanasiés afin de réaliser les prélèvements d’organes, ils serviront de témoins dans les dosages de cytokines et l’identification des cellules immunitaires.

Remplacement

L'étude du rôle du RIG-I et du RNF-135 du canard dans la protection contre le virus de la grippe aviaire ainsi que dans la réponse immunitaire adaptée n'est possible que par des études in vivo. Nous utilisons des poulets transgéniques qui représentent un modèle unique pour de telles études.

Réduction

Le nombre d'animaux sélectionnés répartis sur deux expériences pour répondre à deux questions spécifiques concernant la susceptibilité des animaux à l'infection virale ainsi que le rôle de la réponse immunitaire adaptative dans la prévention des réinfections. Statistiques : Si p est inférieur à 0,05, l'hypothèse nulle est rejetée et l'hypothèse alternative est acceptée. Le nombre d'animaux requis a été calculé à l'aide du logiciel G*Power 3.1. La base de calcul de la taille des groupes est le nombre d'animaux par groupe qui est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement évaluables lors de l'autopsie et des tests de laboratoire ultérieurs (Tests F – ANOVA). Avant la production des poulets transgéniques, notre collaborateur en Allemagne a mené plusieurs expériences in vitro sur des fibroblastes et des cellules germinales de poulet qui nous ont permis de comprendre la fonction des gènes RIG-I et RNF-135. Toutes les expériences préliminaires ont éliminé la nécessité d'utiliser des animaux vivants pour comprendre le rôle du RIG-I dans la réponse immunitaire innée. Les données préliminaires in vitro nous ont permis de formuler des hypothèses spécifiques et de poser de nouvelles questions scientifiques qui ne peuvent être abordées que par des études in vivo, telles que le rôle de l'immunité adaptative et l'effet physiologique de l'expression de RIG-I sur l'animal pendant l'infection.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe dans des isolateurs adaptés en nombre et en taille, dans des conditions environnementales contrôlées (température, hygrométrie, éclairage), avec nourriture et boisson à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement social (élevés en groupe) et du milieu avec des jouets à picorer et des petits perchoirs. Les surfaces d’hébergement seront respectées. Le nombre d’isolateurs sera adapté (surface de 0,84 m²/isolateur). Une surveillance clinique quotidienne des animaux sera réalisée avec des observations physiologiques et comportementales pour ne pas dépasser le point limite. Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié. Pour les points limites, il n’existe pas actuellement de grilles de scores cliniques adaptées à l’influenza aviaire expérimental. Cependant, en nous inspirant des études de bien-être du Welfare Quality® chez le poulet, nous mettrons en place le système d’évaluation de l’état clinique de l’animal suivant : Les animaux seront observés deux fois par jour par un animalier expérimenté, connaissant parfaitement les signes cliniques de l’influenza aviaire. Les animaux qui présenteront au moins 3 des 6 paramètres suivants seront euthanasiés par injection létale de barbiturique: - difficulté respiratoire visible - fermeture anormale de l'oeil (mi-fermé, fermé) - position anormale de la tête et de la queue - posture anormale des ailes (écartées, tombantes) - plumage ébouriffé - Absence de réponse à la stimulation (immobilité). Ce modèle d’infection de grippe chez les vollailes de type PA12 de statut EOPS ou axéniques est bien connu et maitrisé au sein de nos équipes. Les signes cliniques sont bien connus du personnel technique.

Choix des espèces

L’espèce cible de la maladie est le poulet. Les questions abordées dans ce projet nécessitent l'utilisation de poulets transgéniques pour deux raisons principales : la première, il n'existe pas de poulets qui expriment les gènes du canard. Nous supposons que le poulet a perdu les gènes étudiés à un moment donné au cours de l'évolution et que la seule façon possible de ré-exprimer ces gènes dans le poulet est d'utiliser la transgénèse. Deuxièmement, notre objectif est d'étudier en détail la réponse immunitaire adaptative, ce qui n'est pas possible en utilisant des modèles in vitro qui ne permettent pas d'étudier les réponses immunitaires cellulaires telles que les lymphocytes T. Sur la base d'études antérieures ayant utilisé le même virus H7N1, les animaux seront utilisés à l'âge de trois semaines et conservés pendant 22 jours supplémentaires après l'infection initiale. Les œufs reçus de notre partenaire (environ 200 par expérience) seront incubés et éclos dans nos installations, les poussins seront élevés dans les isolateurs de 0 à 3 semaines. Ce seront les mêmes isolateurs que ceux de l’expérimentation.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunisées avec un allergène, une partie recevant ensuite des injections de toxine diphtérique destinées à détruire un type de cellules immunitaires, avant d'être euthanasiées au dixième jour pour prélever la rate et les ganglions. L'objectif est de valider une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiées, un outil qui sera ensuite mis à disposition d'autres équipes. Le porteur affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend l'expérimentation in vivo "nécessaire" et écarte les méthodes sans animaux.

Objectifs

Les cellules Tfh (lymphocytes T folliculaires helper) sont des cellules immunitaires impliquées dans différentes réponses immunitaires. En effet, elles aident à la mise en place des réponses immunitaires impliquant la production d'anticorps, ce qui en fait des cellules clés de la défense immunitaire. Elles sont par exemple impliquées dans la réponse immunitaire suite à une vaccination mais aussi suite à une infection comme dans la réponse anti-VIH. Cependant, si ces cellules sont dérégulées, ceci peut conduire à différentes maladies comme des maladies auto-immunes (lupus érythémateux disséminé, la polyarthrite rhumatoïde) ou encore les allergies. Ces exemples permettent de comprendre l'intérêt pour ces cellules dans l'étude des pathologies actuelles. Comprendre leur fonctionnement pourrait permettre de renforcer l'efficacité des vaccinations ou de prévenir ou soigner ces maladies. Toutefois, les outils classiques de biologie ou modèles de souris actuels ne permettent pas de visualiser ces cellules in vivo ou de les éliminer sans impacter d'autres cellules, ce qui rend leur étude difficile actuellement. C'est pourquoi notre équipe a développé un nouveau modèle de souris permettant de visualiser les cellules Tfh et de les éliminer. En effet, au sein de ces souris, les cellules Tfh produiront une molécule fluorescente, ce qui permettra de suivre ces cellules. De plus, ce modèle permettra aussi d'éliminer les cellules Tfh grâce à une technique communément utilisée en biologie. En effet, les cellules Tfh seront modifiées génétiquement pour produire le récepteur de la toxine diphtérique (DTR) à leur surface. Par conséquent, l'injection de toxine diphtérique induira uniquement l'élimination des cellules Tfh. Cette toxine n'induit pas de réponse néfaste chez la souris comme chez l'homme car les autres cellules de la souris ne produisent pas le DTR. Cet outil pourra être utilisé par différentes équipes pour étudier le rôle des Tfh dans différentes pathologies, soit en suivant les cellules Tfh, soit en les éliminant spécifiquement. Néanmoins, l'utilisation de ce nouveau modèle est soumise à validation de celui-ci. Pour ce faire, il nous faut montrer que les cellules Tfh de cette lignée produisent bel et bien la molécule fluorescente. Dans un second temps, il nous faut démontrer l'élimination des cellules Tfh suite à l'injection de toxine diphtérique. Nous étudierons ceci en conditions inflammatoire (suite à une immunisation avec un allergène et un adjuvant) ou non.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider un nouveau modèle murin permettant de suivre les cellules Tfh avec une molécule rapportrice, la BFP, ou permettant la déplétion de ces cellules suite au croisement avec des souris exprimant Cre et à l'injection de toxine diphtérique. Ce modèle sera mis à disposition et pourra permettre l'étude des cellules Tfh dans différents contextes, comme les allergies, l'auto-immunité, les infections ou la vaccination, pour contrer les pathologies ou améliorer la vaccination.

Procédures

Tous les animaux (270) seront anesthésiés puis immunisés avec deux injections de CFA/OVA ou de PBS au jour 0 (durée de la procédure : 5 minutes). Parmi les 270 animaux, 198 animaux seront également injectés au jour 8 et jour 9 (durée de la procédure : 10 secondes par injection, soit 20 secondes au total sur deux jours) avec de la toxine diphtérique pour induire l'élimination des cellules Tfh. A jour 10, les 270 animaux seront euthanasiés par exposition à une dose croissante de CO2 pour pouvoir prélever la rate et les ganglions dans le but de voir le nombre de cellules Tfh dans nos différents groupes d'animaux pour valider notre modèle.

Impact sur les animaux

Les animaux devraient initier une réponse immunitaire dans les ganglions iliaques et la rate contre l'allergène utilisé suite à l'immunisation. L'injection étant locale, nous n'attendons pas d'effet indésirables autre qu'une inflammation locale, cependant si certains devaient survenir, ils seront traités selon les points limites établis pour limiter la souffrance de l'animal. Ayant déjà pratiqué les injections de toxine diphtérique dans d'autres modèles de souris et n'ayant observé aucune souffrance ou changement de comportement, nous n'attendons pas d'effet indésirable.

Devenir

Après injection de CFA/OVA, les animaux non concernés par la procédure expérimentale "Injection de toxine diphtérique" seront euthanasiés selon la procédure autorisée pour prélèvement et analyses des ganglions et de la rate, soit 72 souris. Tous les animaux concernés par la procédure expérimentale "Injection de toxine diphtérique" seront euthanasiés après celle-ci selon la procédure autorisée pour prélèvement et analyses des ganglions et de la rate, soit 198 souris

Remplacement

L'étude de la réponse immunitaire, et en particulier au cours de l'allergie, met en jeu différents organes et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse immunitaire et le rôle de chaque cellule impliquée.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 270 souris, permettant de caractériser les cellules exprimant la molécule rapportrice, ainsi que la déplétion des cellules Tfh. L'effectif par groupe est de 11 souris, ce qui permettra d'avoir des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales, avec un nid comme enrichissement. L'injection pour l'immunisation est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter la souffrance / stress des animaux. Après ce traitement, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Tout au long du protocol, les animaux seront surveillés de manière visuelle avec un suivi de l'aspect général des animaux, de leur posture et de leur comportement et déplacement. Une grille évaluant la douleur sera utilisée. Si celle ci est importante, ils seront retirés de l'étude et bénéficieront de soins. Si le cas est plus grave, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La lignée à caractériser est une lignée de souris. La souris a été choisie comme modèle car cette lignée sera ensuite utilisée dans l'étude du système immunitaire et en particulier de l'allergie. Le système immunitaire murin est proche de celui de l'homme avec une immunité innée mais également une immunité adaptative, ce qui permet l'étude spécifique de l'antigène et de la réponse mémoire. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.

424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées avec de la peau humaine et injectées de cellules immunitaires humaines, elles reçoivent un traitement quotidien pour tester une combinaison de molécules contre le rejet de greffe. Le porteur indique que l'injection de cellules humaines déclenche une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et mise à mort au-delà de 20 % du poids initial. Il présente ces souris humanisées comme une alternative à l'usage de primates non-humains.

Objectifs

En transplantation d’organes solides, les inhibiteurs de la calcineurine permettent de prévenir efficacement le risque de rejet aigu précoce. Néanmoins après quelques années survient une dysfonction chronique du greffon due d’une part à la néphrotoxicité des inhibiteurs de la calcineurine et d’autre part à un mauvais contrôle de la réponse allo-immune (humorale avec l’apparition d’anticorps anti-donneur et cellulaire matérialisé par l'apparition de plage de fibrose). Ainsi l’amélioration de la survie des greffons nécessite le développement de nouvelles stratégies immunosuppressives contrôlant mieux la réponse allo-immune et la progression de la fibrose. Dans cette optique les inhibiteurs de MEK sont une piste encourageante. La voie MAPK classique étant située en aval du TCR, les inhibiteurs de MEK ont un effet immunosuppresseur. Dans le cadre de la transplantation, cet effet a été rapporté dans un modèle murin de Graft versus Host Disease (GVHD), dans un modèle murin de greffe cardiaque et dans un modèle de transplantation pulmonaire chez le rat. Dans ces différents modèles les inhibiteurs de MEK bloquent l’activation des CD8 et favorisent l’épuisement des lymphocytes CD4 allo-réactifs. Par ailleurs les inhibiteurs de MEK favorisent l’essor des lymphocytes T régulateurs. Enfin il a été montré dans des modèles murins que les anti-MEK permettent de prévenir la fibrose rénale. Nous avons montré que les inhibiteur de MEK permettent de prolonger la survie des greffes de peau humaine allogéniques de façon significative comparativement aux contrôles non traités dans un modèle de peau greffée chez la souris NSG humanisée mais les inhibiteurs de MEK n’empêchent pas un rejet à long terme. Notre objectif est maintenant d’évaluer l’inhibition de la voie MEK en combinaison avec un traitement d’induction avec un inhibiteur de la calcineurine. Les inhibiteur de MEK, avec un bon profil de tolérance, pourraient être une alternative aux immunosuppresseurs classiques une fois la phase de rejet aigu maîtrisé avec un inhibiteur de la calcineurine.

Bénéfices attendus

Les inhibiteurs de MEK ont montré une bonne efficacité pour prévenir le rejet de greffe et un effet anti-fibrotique dans des modèles murins. Cependant, ces modèles ne peuvent valider l’efficacité d’une molécule sur les cellules du système immunitaire humain. Nous avons montré dans le modèle de greffe de peau allogénique humaine chez la souris NSG humanisée que l’inhibition de la voie MEK permet d’augmenter de façon significative la survie des greffons mais ne permet pas d’éviter le rejet. Les inhibiteurs de la calcineurine sont efficaces pour prévenir le rejet aigu mais leur utilisation au long cours n’empêche pas le rejet chronique et est associé à de nombreux effets indésirables. Cette étude vise à évaluer l’efficacité des anti-MEK combiné à un inhibiteur de la calcineurine pour prévenir le rejet de greffe d’organe dans le modèle bien validé de greffe de peau humaine chez la souris NSG humanisée par injection de PBMCs humain. En cas de résultats encourageants, cette combinaison de molécules pourrait être évaluée dans un modèle pré-clinique encore plus relevant (primates non humains par exemple). A plus long terme, cela pourrait aboutir à une diminution de l’utilisation des inhibiteurs de la calcineurine, dont la toxicité est reconnue, dans le traitement des patients transplantés

Procédures

Une greffe de peau sous anesthésie générale, durée de l’opération 1 heure. Une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, 5 min. Administration quotidienne du traitement par voie orale et/ou administration intrapéritonéale, 5 min. Prélèvement de sang , 1 fois par semaine.Jusqu'à J56 puis une fois par mois. 5 min.

Impact sur les animaux

La greffe de peau humaine chez la souris NSG n’entraîne pas de signe clinique chez la souris. L'humanisation des souris avec des cellules hPBMC entrainera des signes cliniques liés à l’apparition d’une xéno-GVHD (graft versus host disease) lorsque la quantité de cellules humaines sera suffisamment importante, notamment des lymphocytes T. Les souris seront surveillées quotidiennement au niveau comportemental et pesées 3 fois/semaine puis tous les jours lorsque les premiers signes cliniques apparaîtront ; chute de poids notamment. L'animal sera euthanasié si le poids atteint une perte de poids de 20% du poids initial. Le comportement général de la souris sera observé et l’animal sera euthanasié si un comportement anormal est constaté (par exemple, animal isolée du reste de ses congénères, dos vouté, poils hérissés).

Devenir

Toutes les souris de la procédure 1 seront utilisées pour la procédure 2. A l’issue de la procédure 2, les souris seront euthanasiées.

Remplacement

La molécule que nous souhaitons tester chez la souris NSG humanisée a déjà été étudiée in vitro et in vivo dans des modèles murins. Le passage dans un modèle in vivo mimant la situation complexe que constitue le système immunitaire humain apportera des arguments supplémentaires quant à son efficacité pour prévenir le rejet de greffe chez l’homme.

Réduction

Les données issues de ce projet devront donc être suffisamment robustes (c'est-à-dire validées avec tests statistiques). Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques (Test de Mann- Whitney) car nous ne pourrons pas nous assurer d’une distribution normale (n < 30. Nombre total d’animaux 424). Chaque groupe sera constitué de 5 souris .

Raffinement

Lors des manipulations pouvant générer une douleur, les animaux bénéficieront en amont d’une analgésie. Les souris seront hébergées sur des portoirs ventilés avec un accès libre à la nourriture et à l’eau de boisson, un cycle jour/nuit au niveau de la lumière et un enrichissement adapté. Les animaux seront suivis quotidiennement lorsque les cellules humaines seront injectées et les signes cliniques notables et sévères décrits dans le tableau en annexe de cette saisine seront notés. Lorsque 3 signes cliniques notables ou un seul signe clinique sévère seront notés alors les animaux seront sortis du protocole et euthanasiés. Tous les animaux seront analysés post-mortem avec des prélèvements d'organes en vue d'études immunohistochimiques ou histologiques permettant de caractériser au mieux l’effet des molécules testées.

Choix des espèces

Les souris immunodéficiences NSG sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre. Il est possible de reconstituer un système immunitaire humain dans ces souris par injection de PBMC humains. Ces souris ainsi humanisées offrent une alternative à l'utilisation de primates en recherche clinique. Cependant, si nous constatons que la fenêtre de lecture expérimentale n’est pas suffisamment longue avant la survenue de la GvHD nous changerons de souche de souris et prendrons des NSG déficientes pour les molécules de CMH de classe I et II. En effet, ces souris montrent une GvHD nettement retardée voire inexistante. Les cellules immunitaires humaines injectées dans ces souris survivent et prolifèrent. Ce modèle pourra donc servir d’alternative. Lors des greffes de peau les souris NSG seront adultes (âgées de 6 à 8 semaines). Au moment de l’humanisation avec des hPBMC elles seront agées de 11 à 13 semaines pour permettre à ces cellules humaines de se développer .