Organes sensoriels

1 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont anesthésiés puis rasés à deux semaines, reçoivent une application quotidienne sur le dos pendant quatorze à vingt-cinq jours, portent ensuite un patch occlusif deux semaines et sont isolés vingt minutes pour la récolte de leurs fèces. Une dermatite atopique est déclenchée à quatre semaines, avec démangeaisons, rougeurs, œdème et excoriations, et les gavages peuvent enflammer l'œsophage. Le produit testé est un émollient enrichi en sucre du lait maternel, dont le porteur espère qu'il ouvrira la voie à un essai clinique, alors que les essais menés chez des nourrissons ont déjà montré que les émollients trilipidiques ne préviennent pas la maladie.

Objectifs

La dermatite atopique (DA) est une allergie, touchant 10 à 15 % des enfants en Europe. Elle est associée à une barrière et un microbiote cutanés altérés et à un dysfonctionnement du système immunitaire.70 % des enfants guérissent naturellement et 30 % souffrent de symptômes persistants avec un risque accru d’autres allergies (asthme, rhinite ou allergies alimentaires :marche atopique). Il n’existe pas de stratégies préventives efficaces pour la DA. Plusieurs essais cliniques ont appliqué des émollients ou des huiles végétales sur la peau des bébés pour renforcer la barrière cutanée afin de limiter l'interaction entre les allergènes et le système immunitaire de la peau. Ils ont observé que les émollients trilipides ne prévenait pas la DA mais améliorait l'intégrité de la barrière cutanée en réduisant la perte d'eau transépidermique (TEWL). À l'inverse, les huiles végétales entravent la formation de structures lipidiques lamellaires dans la barrière et favorisent le développement de l'allergie alimentaire. Même si les émollients renforcent la barrière cutanée, cette approche seule semble insuffisante pour prévenir la DA. Les stratégies thérapeutiques qui ciblent la barrière cutanée, mais aussi le microbiote et le système immunitaire pourraient offrir des approches plus efficaces pour prévenir la DA. Certains sucres du lait maternel (oligosaccharides), peuvent moduler le microbiote intestinal en favorisant l'émergence de bactéries bénéfiques et en réduisant l'abondance des bactéries nocives. Ils peuvent renforcer la barrière intestinale et induire un environnement immunitaire tolérogène. Nous avons démontré chez la souris gestante, l’efficacité d’une supplémentation anténatale avec un sucre du lait maternel sur abrogation complète des symptômes de l'allergie alimentaire chez les petits. Nous disposons également de données préliminaires sur des modèles de culture peau humaine, montrant que l'exposition à un sucre du lait maternel sur des cellules de peau humaine dans des conditions inflammatoires renforce l'expression de l'involucrine (une protéine de la barrière cutanée réduite chez les patients atteints de DA)et de la substance P (ayant des fonctions anti-inflammatoires et de réparation des tissus). Notre hypothèse est que l'ajout de sucres du lait maternel aux émollients pourrait constituer une stratégie efficace pour cibler le microbiote cutané, le système immunitaire et la barrière cutanée et, par conséquent, pour prévenir l'apparition de la DA.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de valider une nouvelle stratégie thérapeutique préventive visant à prévenir l'apparition de la DA à un stade précoce par une intervention cutanée. A l'heure actuelle, il n'existe pas de stratégie préventive efficace pour la DA. L'approche ambitieuse du projet se concentre sur une méthode thérapeutique externe non invasive, facile à utiliser et sûre. Ce projet permettra également de comprendre la physiopathologie de la DA, lors de sa mise en place et de sa prévention. Nous focaliserons principalement notre recherche sur les 3 grands systèmes biologiques dysfonctionnels dans l’allergie : le microbiote (cutané et intestinal), le système immunitaire et les barrières (cutanées et intestinales). Valider cette stratégie chez la souris permettra d’ouvrir la voie à un futur essai clinique.

Procédures

- procédure 1 =souriceaux : anesthésie (15 minutes), rasage (5 minutes) et application journalière d’un traitement topique dorsale (5 minutes) pendant 14 jours puis d’un patch occlusif (5 minutes) pendant 14 jours, isolement pour la récolte des fèces (20 minutes). - procédure 2 = idem procédure 1 + gavage oral (2 minutes). - Procédure 3 : = souriceaux : anesthésie (15 minutes), rasage (5 minutes) et application journalière d’un traitement topique dorsale (5 minutes) pendant 25 jours, isolement pour la récolte des fèces (20 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la gêne liée la présence d’un patch sur le dos qui peut induire des grattages, les symptômes liés à la mise en place de la DA (prurit, érythème, œdème et excoriations), les anesthésies gazeuses peuvent induire une hypothermie, une hypotension, une hypoventilation ou une hypoxémie, les gavages oraux peuvent induire une inflammation de l’œsophage, l’isolement pour la récolte des fèces ainsi que la prise de poids répétée des mères gestantes peuvent induire un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis a morts à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de la DA ou de l’allergie alimentaire et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude de la dermatite atopique (DA), il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum et calculé pour être statistiquement pertinent pour la mesure du score clinique mais aussi avoir assez de matériel biologique pour effectuer non seulement des coupes histologiques mais aussi les mesures des biomarqueurs immuns de la DA dans la peau et dans le sérum. De plus, en effectuant un test de puissance, il nous faut au moins 12 animaux dans chaque groupe pour observer des effets statistiques au niveau du microbiote et du système immunitaire.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Cependant, si nous observons que les souris enlèvent le patch des autres souris présentes dans la cage, alors elles seront séparées et hébergées à 1 souris par cage pour ne pas fausser les résultats du protocole mais aussi pour éviter les risques de blessures et d’ingestion de plastique et de l’allergène.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur la dermatite atopique (DA) en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la barrière cutanée, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de la DA, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris sensibilisées avec des allergènes spécifiques permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Les souris BALB/cJRj femelles reproductrices seront âgées de 6 semaines et les mâles reproducteurs seront âgées de 10 semaines car c’est à ces âges là que nous avons observé la meilleure efficacité de reproduction. L’application topic des émollients se fera chez le souriceau de 2 semaines pour reproduire les applications topics d’émollients chez les bébés dès le plus jeune âge. La DA sera induite chez les souriceaux âgés de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à la DA chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie.

Abrasion de la cornée, instillation d'endotoxines, ablation des glandes lacrymales et instillations d'un conservateur de collyre deux fois par jour pendant une semaine : 168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend les mêmes symptômes que chez les patients humains, picotements, brûlures, larmoiements, sensation de corps étranger et sensibilité accrue à la lumière. L'analgésie s'arrête vingt-quatre heures après la chirurgie, parce qu'au-delà, écrit-il, elle "inhiberait l'évolution du modèle expérimental". La douleur oculaire que le projet veut comprendre est donc aussi celle qu'il faut laisser s'installer chez les souris pour que l'expérience fonctionne.

Objectifs

La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant particulièrement la cornée, la sclérotique et la conjonctive. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pourcents des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. Diverses maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. Dans les cas pathologiques graves, les lésions des nerfs cornéens peuvent entraîner une sensibilité accrue à la lumière et/ou des douleurs, une altération des fonctions physiques et sociales, une privation de sommeil, une anxiété et une dépression. Le poids des maladies de la surface oculaire, associant des symptômes douloureux intenses, des comorbidités émotionnelles et des altérations psychosociales, nous a conduit à en étudier les mécanismes sous- jacents. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est un des enjeux cruciaux pour le développement de stratégies de prise en charge et de thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire chronique.

Bénéfices attendus

L’objectif est de définir, le rôle fonctionnel de ces chimiokines dans les interactions entre les cellules immunitaires et les neurones sensoriels et leurs implications spécifiques dans les mécanismes d'initiation et de maintien des syndromes douloureux au cours de la douleur oculaire. Globalement, ce projet apportera le rationnel pour l'utilisation des antagonistes des récepteurs de chimiokines comme traitement contre la douleur oculaire chronique. Ainsi, nous faisons l'hypothèse que ces chimiokines après une atteinte cornéenne pourraient induire, le recrutement et l'activation de cellules immunitaires localement au niveau de la lésion cornéenne et dans le système trigéminal, et ainsi participer aux mécanismes conduisant à la centralisation et à la chronicité de la douleur oculaire.

Procédures

Trois modèles seront mis en œuvre dans le cadre de ce projet. Le modèle douleur inflammatoire est obtenu par des instillations 2 fois par jour pendant 7 jours d’un conservateur de collyre ; il nécessite la contention pendant quelques secondes de l’animal. Le modèle de douleur lié à une infection est induit par l’abrasion de la cornée effectuée sous anesthésie et analgésie (1 fois, 10 minutes) associé à l’instillation d’endotoxines le jour de l’abrasion lors de la même anesthésie (quelques secondes) et une seconde fois 3 jours après sur animal vigile par simple contention (quelques secondes). Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie et dure au maximum 15 minutes. Ces modèles reproduisant le contexte de la maladie étudiée sont réalisés sous anesthésie et analgésie dans le respect des normes et recommandations concernant le bien-être animal et l’éthique en vigueur

Impact sur les animaux

Modèles : les nuisances attendues dans les 3 modèles sont celles observées chez l’Homme à savoir, des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, des larmoiements, la sensation de corps étranger dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. Ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. Le modèle d’instillation répétée d'un conservateur correspond classiquement aux traitements (collyres) donnés aux patients en clinique humaine. Son application topique sur le long terme est connue en clinique humaine pour être toxique pour la surface oculaire et engendrer des gènes ou des irritation ou brûlure, d’œil sec voir une inflammation d’intensité variable. Dans le second modèle, l’abrasion de la cornée entrainera une douleur post-opératoire. L’instillation de toxine entrainera une inflammation de la cornée et une rougeur de la conjonctive. Chirurgie : la chirurgie qui permet de mettre en place le modèle de sècheresse oculaire entrainera une douleur post opératoire. L'anesthésie durant la chirurgie peut entrainer une détresse respiratoire ou cardiaque, une hypothermie. Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire en clinique à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure car les prélèvements d'organes pour analyse post mortem par imagerie sont nécessaires.

Remplacement

À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro permet : 1) mimer la pathologie de sécheresse et douleur oculaire qui lui sont liées. 2) la complexité et l’interaction des circuits neuronaux mis en jeu (connectant la cornée, ganglions trigéminés et cerveau) ainsi que l’interaction avec l’activité du système immunitaire inné, ne peuvent également être étudier et remplacer par un modèle d’étude vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 168 souris dans ce projet d’une durée de 5 ans. Afin de respecter la règle de réduction, notre étude portera sur plusieurs structures (cornée, ganglion trigéminal, cerveaux) de chaque animal. Nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Le choix de faire 4 animaux par groupe, repose essentiellement sur un choix volontaire de « réduction » tout en satisfaisant le critère de reproductibilité. Cette étude présente en grande partie un aspect descriptif de la distribution et de la forme des cellules n'impliquant pas necessairement de test statistique. Dans cette approche nous considérons chaque animal de manière pairée avec son control, mais aussi au sein même d’un animal (œil control vs œil lésé). Néanmoins des tests statisitiques pourront être réalisés sur certaines quantifications à l’échelle de la cellule unique. Le nombre d’image peut être plus ou moins augmenté par animal, ainsi le nombre de point comparés étant très grand nous atteignons largement les effectifs minimaux requis par les tests de calcul de puissance. Cependant nous satisfaisons aux critères de reproductibilité de la manip en faisant 4 fois cette quantification (2 males et 2 femelles traités vs 4 contrôles). D’expérience si aucune différence n’est observée sur ce nombre d’animaux il ne sert à rien d’accumuler des tests. Cette étude par microscopie et cette approche statistique nous permet donc de travailler avec un nombre réduit d’animaux.

Raffinement

Dans le cadre d’une démarche de raffinement nous devons chercher à préserver l’animal de la douleur. Pour cela, les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire sur 24h. Au delà de 24h cela inhiberait l’évolution du modèle expérimental et interférerait avec les résultats attendus pour ce projet. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ses différentes constantes. Si un animal anesthésié lors de l'induction du modèle présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours. Au delà des 24h post-op, le bien être animal sera évalué à l’aide de points limites établis. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie afin de limiter au maximum la souffrance prolongée. Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Chaque cage contient au moins un élément d'enrichissement, bâton à ronger ou tunnel en carton. Les enrichissements de nidification (craft, ouate) sont exclus pour réduire les risque de poussière dans les yeux, la litière utilisée a été validée par la structure pour son faible taux de poussière. Les animaux sont hébergés dans les conditions de notre établissement avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 5 animaux par cages. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies à volonté.

Choix des espèces

Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, et que nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Les animaux arriveront à l’animalerie à l’âge de 7-8 semaines et entreront en procédure entre 10 et 12 semaines. Cela permettra de travailler sur des souris adultes tout en évitant des biais liés au changement physiologique de l’animal vieillissant. En effet l’ensemble des procédures de ce projet durant entre 4 à 11 semaines maximum. Les souris auront donc au maximum 23 semaines en sortie de procédure.

Le rat des sables, rongeur diurne dont la rétine compte 40 % de cônes contre 3 % chez la souris, est retenu pour reproduire une maladie de l'œil humaine. 208 individus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une injection sous la rétine pratiquée sur des nouveau-nés de dix à vingt jours, puis trois électrorétinogrammes, trois tomographies et trois fonds d'œil sous anesthésie. Le porteur indique que l'injection n'engendre "en général" aucune lésion, sans écarter une infection, une inflammation ou une douleur transitoire, et signale un stress aigu lié aux transports entre les deux établissements. Tous sont mis à mort pour analyse moléculaire et cellulaire de leur rétine.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite se déroulant dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs. Une modification a été déposé afin d'inclure une cararctérisation électrorétinographique plus fine, sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.

Procédures

Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) réalisée sur animal anesthésié ainsi que des analyses structurales et fonctionnelles de la vision réalisées avec des méthodes non invasives, également sur animal anesthésié. Il s'agit de l'électrorétinogramme (EU1/2), de la tomographie par cohérence optique (EU2/2) et du fond d'oeil (EU2/2). Ces 3 analyses seront réalisées chacune à 3 reprises.

Impact sur les animaux

L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.

Réduction

Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.

Raffinement

Afin de respecter / stimuler les interactions sociales, les animaux sont hébergés avec leur mère et leur fratrie jusqu’au sevrage, puis ensuite par groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe. L’environnement est enrichi (matériel de nidification, bâton à ronger, tunnel) afin de stimuler leur activité motrice. . Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.

Les souris de ce projet portent une mutation qui les rend profondément sourdes et leur donne un trouble vestibulaire : elles tournent en rond et présentent une activité motrice anormalement élevée. 956 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés. Sous anesthésie, elles reçoivent des électrodes sous la peau pour trente minutes d'enregistrement auditif, une incision fine pour l'injection d'un virus dans la cochlée, et une biopsie de quelques secondes. Le raffinement annoncé tient en trois mesures, anesthésie pour les tests auditifs, tatouage des phalanges et nourriture posée dans la litière, quand les bénéfices avancés s'ouvrent sur le milliard et demi de personnes touchées par un déficit auditif dans le monde.

Objectifs

Les cellules sensorielles auditives sont surmontées d’une touffe ciliaire constituée de stéréocils dans lesquels se produit la transmission du signal sonore. Le dysfonctionnement de cette transmission du signal sonore cause une perte auditive sévère. Certains composants responsables de cette transmission ont déjà été identifié. Toutefois, la régulation du fonctionnement de ces composants n’est toujours pas investie. Le projet porte sur une protéine qui fait partie de ce complexe. L’absence de cette protéine cause une surdité profonde d’origine congénitale et héréditaire. La protéine d’intérêt est très particulière dans sa fonction du fait qu’elle est la seule à interagir avec tous les composants de la machinerie de transmission du signal. Il a récemment été montré, que cette protéine pourrait subir une modification dont les conséquences restent encore inconnues. D’ailleurs, dans d'autres systèmes biologiques cette même modification pourrait jouer un rôle important dans la régulation des propriétés des complexes protéiques et dans leur transport au sein de la cellule. Les différents modèles de souris qui miment les mutations chez l’homme, reproduisent le phénotype humain et causent la surdité. Ainsi, nous envisageons par thérapie génique de restituer l’audition chez les souris mutantes pour la protéine d’intérêt. Également nous allons essayer de comprendre l'impact de cette modification sur son transport au sein de l'organisme et dans la régulation de son activité au sein du complexe de transmission du son. Nous souhaitons aussi identifier les protéines qui catalysent cette modification.

Bénéfices attendus

Les surdités sont un problème majeur de santé publique. On estime que 1,5 milliard de personnes dans le monde présentent des déficits auditifs et que ce chiffre devrait atteindre 2,5 milliards d'ici 2050. 1- Proposer une opportunité pour soigner une forme héréditaire de surdité par thérapie génique. 2- Comprendre le rôle d’une modification dans la régulation du complexe de transmission du son. 3- Déchiffrer le code protéique qui régule cette modification. Cette modification pourrait être une cible thérapeutique pour restaurer ou corriger une perte des seuils auditifs.

Procédures

Disposition d’élétrode en sous-cutanée sur animal anésthésié pour un enregistrement qui dure 30 minutes. Une incision cutanée très fine lors de l’injection au niveau de la cochlée sur animal anésthésié. Acte de Biopsie: geste qui dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les souris manifestent un trouble vestibulaire en plus de la surdité. Ils ont donc une activité motrice plus élevée que la normale. Les souris tournent en rond assez souvent. Afin d’injecter les virus, nous allons réaliser une incision très fine. Cette procédure peut provoquer une douleur légère malgré que les souriceaux soient endormis. Aussi, cette procédure et malgré la désinfection cutanée, pourrait causer une infection locale. Également, suite à l’acte de Biopsie, on pourrait avoir une infection locale. Les infections sont des risques rares aussi bien dans la pratique de la biopsie que l'incision lors de l'injection du virus.

Devenir

Pour effectuer le prélèvement des organes et réaliser les expériences, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Pour réaliser cette étude il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale car on ne sait pas mettre en culture les systèmes auditifs. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

- Les 2 oreilles de chaque souris seront utilisées systématiquement afin de ne pas doubler le nombre d’animaux. - Le sexe n’est pas pris en compte dans cette étude car il n’intervient pas jusqu’à preuve du contraire dans l’audition. Nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles dans notre étude.

Raffinement

Réduction de la douleur, souffrance & l’angoisse (raffinement) - Pour les tests auditifs, les animaux seront anesthésiés. - Les animaux seront marqués par tatouage au niveau des phalanges. - Les animaux présentent un trouble vestibulaire de ce fait on leur propose la nourriture dans leur litière.

Choix des espèces

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficit auditif chez la souris et l’architecture de la cochlée du rongeur est similaire à celle de l’homme ce qui permet d’étudier chez ces animaux le mécanisme de l’audition humaine. Pour restaurer l’audition de ces souris et comprendre l’impact des mutations étudiées, nous devons connaître la localisation exacte de la protéine d’intérêt dans son état sauvage et une fois mutée dans l’oreille interne à différents stades (embryonnaire, au cours du développement et adultes). Nous devons mesurer les courants produits par la transmission du son pour se rendre compte de la fonctionnalité des cellules de l’oreille interne.

Des rates gestantes boivent chaque jour une eau additionnée de pesticides organophosphorés ou subissent une exposition quotidienne au bruit, puis l'audition de leurs 294 petits est testée à 21 jours, 3 mois et 6 mois. En parallèle, 90 souris porteuses d'une mutation responsable d'atrophie optique dominante reçoivent une injection dans l'oreille interne, et 45 autres, exposées à un bruit du niveau de ceux rencontrés au travail, reçoivent des injections à travers le tympan. 478 animaux au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur attendant chez les rates gestantes de l'agitation, une baisse d'activité et moins d'interactions sociales. Tous sont tués après les derniers tests, leurs cochlées prélevées.

Objectifs

La surdité représente un enjeu majeur de santé publique, avec des causes multiples telles que des facteurs génétiques, l'exposition au bruit, certains médicaments ototoxiques et le vieillissement. À ce jour, les mécanismes exacts responsables de ces pertes auditives demeurent insuffisamment compris, et aucun traitement curatif n'est disponible. Notre recherche se concentre sur trois axes principaux : 1. Développement de thérapies géniques : Nous utilisons un modèle murin simulant la maladie héréditaire d'Atrophie Optique Dominante, qui entraîne une déficience auditive ou visuelle progressive, liée à l’âge à partir de six mois, en comparaison avec les souris témoins. Nous explorons différentes stratégies visant à ralentir ou stopper l'apparition de la déficience auditive chez ces souris. 2. Utilisation des nanoparticules pour le transport de molécules thérapeutiques dans les cellules de l'oreille interne : Cette approche a pour objectif de favoriser la régénération des fibres nerveuses auditives chez des souris adultes ayant subi des lésions auditives dues à un traumatisme sonore. 3. Étude de l'impact de l'exposition au bruit et aux polluants environnementaux chez les rates gestantes : Nous investiguons les effets de ces expositions pendant la gestation sur l'audition des rats descendants.

Bénéfices attendus

Les implications cliniques, sociales et économiques de ce projet sont importantes. Le développement réussi d’une nouvelle technique innovante basée sur la thérapie génique pourrait être appliqué aux patients, offrant ainsi un nouvel espoir aux personnes souffrant d’atrophie optique dominante. Nous savons aujourd’hui que les synapses reliant les fibres nerveuses auditives aux cellules sensorielles de l'oreille interne sont particulièrement vulnérables aux effets du bruit, du vieillissement ou des substances ototoxiques. En démontrant qu’il est possible de traiter ces lésions précoces, nous pourrions proposer des solutions thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des personnes âgées et favoriser un vieillissement en meilleure santé. Enfin, il n'existe actuellement aucune législation européenne encadrant les risques d'exposition au bruit ou aux polluants sur l'audition du fœtus pendant la grossesse. Nos résultats obtenus de ce projet fourniront des données précieuses sur les troubles auditifs chez les descendants dont les mères ont été exposées au bruit ou aux polluants pendant la grossesse.

Procédures

1. Injection de molécules thérapeutiques génétiques dans l'oreille interne est une technique maîtrisée par notre équipe. Cette intervention, qui durera entre 10 et 20 minutes, nous permettra d'explorer différentes stratégies génétiques pour ralentir ou stopper les troubles auditifs (comme les bourdonnements d’oreille ou les difficultés à comprendre dans un environnement bruyant) causés par une mutation du gène . Pour mener à bien ces tests, nous aurons besoin de 90 souris présentant cette mutation. 2. Injection de traitements pharmacologiques pour traiter les troubles auditifs. Nous allons effectuer des injections intra-tympaniques de molécules thérapeutiques pharmacologiques chez des souris ayant subi des lésions nerveuses auditives, provoquées par une exposition à des bruits fréquemment rencontrés sur les lieux de travail. Cette injection durera environ 5 minutes. Pour cette étude, nous avons besoin de 45 souris exposées à ces bruits. 3. Effets du bruit et des pesticides sur les rats gestants: Des rates gestantes de 5 mois seront exposées quotidiennement à du bruit environnemental ou à des pesticides organophosphorés (dissous dans l’eau de boisson). Ces facteurs de pollution sont courants dans notre environnement quotidien. Nous évaluerons l’audition de leurs petits à l'âge de 21 jours, 3 mois et 6 mois, en utilisant des tests fonctionnels et morphologiques. Pour cette étude, nous avons besoin de 49 rates gestantes. Nous estimons obtenir environ 294 descendants. À la fin de chaque expérience, après les tests auditifs finaux (soit 6 mois après le traitement, soit 6 mois après la naissance), les animaux seront euthanasiés, et leurs cochlées seront prélevées pour des analyses morphologiques et immunocytologiques.

Impact sur les animaux

Lors de l’intervention chirurgicale pour l’administration locale de traitements dans la cochlée, les animaux pourraient éprouver une douleur modérée pendant leur réveil et durant les 12 heures suivant l’opération. Pendant les tests fonctionnels, une douleur légère pourrait être observée en raison de l'injection d'un médicament destiné à endormir l'animal. Selon les données publiées dans la littérature, aucune douleur ni perte de poids n'ont été observées chez les rates gestantes exposées aux doses autorisées de pesticides dans l'eau potable . Cependant, bien que le bruit utilisé dans cette expérience soit un bruit à un niveau conforme aux normes autorisées, il pourrait tout de même influencer la physiologie et le comportement des rates gestantes, qui sont plus sensibles aux changements de leur environnement. Nous nous attendons ainsi à observer des modifications de leur comportement, comme de l’agitation, une baisse de leur activité ou une diminution de leurs interactions sociales.

Devenir

A la fin des derniers tests d’exploration fonctionnelle soit à l’âge de plus 6 mois, tous les animaux participant à l'étude seront euthanasiés.

Remplacement

Dans le cadre de notre démarche visant à respecter la règle des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) en matière d’expérimentation animale, nous avons déjà réalisé des études in vitro sur des cellules de patients atteints d’atrophie optique dominante ainsi que sur des cellules cochléaires provenant des souris, un modèle qui reproduit une perte de synapse de la cochlée. Cependant, pour prouver que nos stratégies thérapeutiques peuvent réellement restaurer la fonction auditive, il est indispensable d’utiliser des modèles animaux in vivo, qui sont plus proches des conditions réelles observées chez les humains. Nous avons également étudié l’effet toxique de certains fongicides sur des cellules cochléaires de souris, mais pour mieux comprendre l’impact de ces polluants sur l’audition, en particulier en lien avec des troubles comme l’autisme ou les maladies neurodégénératives, l’utilisation de modèles animaux plus complexes, tels que le rat, s’avère nécessaire. Ces études in vivo nous permettront de mieux comprendre les relations possibles entre une exposition prolongée au bruit ou à des polluants environnementaux pendant la grossesse et les troubles auditifs observés chez les descendants.

Réduction

Nous nous engageons à utiliser uniquement le nombre d’animaux strictement nécessaire pour atteindre nos objectifs scientifiques. Voici la répartition prévue : • Pour développer des traitements génétiques visant à ralentir ou stopper l’apparition des troubles auditifs liés à un défaut génétique : Nous tiendrons compte des différences individuelles dans la gravité et la progression des symptômes. Grâce à un calcul statistique, nous avons déterminé qu’un total de 90 souris serait nécessaire, réparties en 6 groupes de 15 souris. • Pour évaluer l’effet de deux traitements pharmacologiques contre une surdité induite par l’exposition au bruit : Afin de limiter le nombre d’animaux, un seul groupe témoin sera utilisé. En tout, 45 souris seront nécessaires, réparties en 3 groupes de 15 souris. • Pour étudier l’impact de l’exposition aux polluants de rates gestantes sur l’audition de leurs descendants : Nous réduirons également le nombre d'animaux en utilisant un groupe témoin de 15 rates gestantes non exposées, et deux groupes de 17 rates chacune, exposées soit à un cocktail de polluants, soit au bruit. Cela représente un total de 49 rates gestantes. Nous prévoyons d’obtenir environ 90 jeunes rats dans le groupe témoin, 102 dans le groupe exposé aux polluants , et 102 dans le groupe exposé au bruit. Ces effectifs sont suffisants pour mener à bien l’ensemble des évaluations fonctionnelles et des analyses morphologiques prévues dans le protocole expérimental. Pour les analyses morphologiques, nous envisageons d’inclure environ 5 à 6 jeunes rats par type d’analyse, à chaque point temporel (21 jours, 3 mois et 6 mois), et pour chaque sexe. Cela représente environ : 5 rats × 3 types d’analyse × 3 âges × 2 sexes = environ 90 rats par groupe. Ces choix ont été faits afin de minimiser l’utilisation d’animaux tout en garantissant des résultats scientifiques solides et fiables

Raffinement

Dans les groupes d'animaux utilisés pour développer des traitements génétiques et pharmacologiques : • Les animaux seront observés quotidiennement dès leur inclusion dans le protocole expérimental. • Ils seront hébergés dans un environnement enrichi, avec des copeaux, des rouleaux de cellulose, et des refuges en plastique pour améliorer leur bien-être. • Après l’opération, une injection sous-cutanée d'antibiotiques sera administrée pour prévenir les infections. Si des signes de douleur ou d'inconfort sont détectés, une euthanasie anticipée sera effectuée pour éviter toute souffrance. • Le réveil après l’opération aura lieu dans un espace isolé. Une fois réveillées, les souris seront remises avec d’autres souris qui étaient dans la même cage et opérées le même jour. • Une visite quotidienne, y compris les week-ends, sera assurée pour veiller à leur état de santé. • Les tests auditifs seront réalisés chez les animaux anesthésiés. Ces tests, non-invasifs, sont couramment utilisés chez l’humain sans anesthésie. Dans l'étude de l'impact de l’exposition aux polluants sur l’audition des descendants de rates gestantes : • Les rats gestants seront surveillés régulièrement tout au long de la grossesse et après la naissance de leurs petits. • Une grille de suivi sera utilisée pour évaluer l'état des animaux. • Pour réduire le stress lié à l’exposition au bruit, les femelles gestantes seront maintenues en groupes sociaux, favorisant ainsi les interactions positives entre elles pour diminuer le stress.

Choix des espèces

Pour évaluer la possibilité de restaurer la fonction auditive chez les patients atteints d'atrophie optique dominante (AOD), nous avons choisi d'utiliser des souris mutantes qui présentent une neuropathie auditive et optique, reproduisant la condition humaine AODplus. Nous testerons également des traitements pour favoriser la repousse des fibres du nerf auditif à l'aide de de petites molécules qui imitent le facteur de croissance, protégées dans de très petites particules. Ces traitements seront testés sur un modèle de souris ayant une synaptopathie auditive, causée par une exposition à un bruit rencontré dans le lieu de travail. Enfin, nous étudierons l'impact sur l'audition des jeunes rats dont les mères auront été exposées au bruit ou aux pesticides pendant leur grossesse. Les souris mutantes et les souris sauvages exposées au bruit auront entre 1 et 2 mois, et seront suivies pendant 1 à 6 mois après le traitement afin d'évaluer les effets protecteurs des traitements sur l'audition. Pour examiner l'impact des bruits et polluants sur l'audition fœtale, nous utiliserons des femelles rats gestantes. Les humains et les rats réagissent de manière similaire aux sons de basse fréquence, ce qui permet d’étudier les effets de l'exposition au bruit. L’audition des rats se développe après la naissance, tandis que celle des humains est déjà active avant la naissance. Cette différence permet de mieux comprendre comment le bruit et les polluants influencent le développement et la maturation de l'audition.

84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 72 recevront chacune cent stimulations ultrasonores d'une milliseconde, chaque tir visant une zone de peau différente. Les douze autres reçoivent une injection intrapéritonéale et une injection intradermique, qui peut enflammer le site de piqûre. Le porteur indique que la stimulation peut provoquer une sensation de douleur au réveil de l'anesthésie, l'objectif étant d'activer sélectivement des neurones sensoriels pour préparer de futurs dispositifs contre la douleur chronique. Entre dix minutes et deux heures après la neurostimulation, chaque souris est tuée pour le prélèvement de ses ganglions rachidiens et de sa moelle épinière.

Objectifs

La neurostimulation par ultrasons focalisés est une technique alternative prometteuse pour le traitement de la douleur chronique. Comparé à la stimulation électrique standard nécessitant l’implantation d’électrodes par chirurgie, les ultrasons ont l’avantage d’être non-invasifs, de pouvoir pénétrer jusqu’à plusieurs centimètres dans le corps et de permettre une grande précision spatio-temporelle. Nous avons récemment démontré grâce à des expériences in vitro sur les neurones des ganglions de la racine dorsale (DRG) de souris qu’il était possible d’activer les neurones sensoriels de différents sous-types. En particulier, il a été montré que les neurones nociceptifs jouant le rôle de senseurs de la douleur ainsi qu’une sous-population de neurones sensoriels du toucher identifiés comme de puissants modulateurs de la douleur induite par lésion, sont particulièrement sensibles aux stimulations ultrasonores. L’activation sélective de ces neurones sensoriels du toucher est susceptible de constituer une cible de choix, mais encore inexplorée, pour le traitement des douleurs chroniques pathologiques. L’objectif de ce projet est d’étudier l’activation sélective de neurones sensoriels induite par les ultrasons chez la souris in vivo et d'identifier les voies spinales et cérébrales activées par les stimuli ultrasonores. Ce projet devrait permettre d’ouvrir la voie à une nouvelle génération de dispositifs thérapeutiques à ultrasons pour le traitement de la douleur chronique.

Bénéfices attendus

Les douleurs chroniques touchent jusqu'à 20% de la population mondiale, et sont de fait un problème majeur de santé publique. Une sous-population de neurones sensoriels spécialisés dans le toucher ont été identifiés comme de puissants modulateurs de la douleur induite par lésion tissulaire et représentent par conséquent une cible de choix, mais encore inexplorée, pour le traitement de la douleur chronique pathologique. Comprendre les conditions de stimulation par ultrasons in vivo pourra à long terme ouvrir la voie à de nouvelles modalités de thérapies pour les douleurs chroniques, à la fois non invasives et plus efficaces que les traitements par stimulation électrique. D’autre part, le chemin pris par le signal nerveux lors de la stimulation de ces neurones sensoriels du toucher n’a jamais été identifié.

Procédures

Dans une première procédure, 12 souris recevront une injection intrapéritonéale et une injection intradermique de quelques secondes chacune. Dans une deuxième procédure, 72 autres souris recevront une série de 100 stimulations ultrasonores d’une milliseconde maximum chacune, chaque stimulation ciblant une zone de peau distincte des précédentes. Au total, cette procédure durera au maximum 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’injection intradermique peut causer une légère inflammation au niveau du site d'injection. La stimulation ultrasonore peut provoquer une sensation de douleur lors de la phase de réveil de l'anesthésie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car le prélèvement des tissus (ganglions rachidiens et la moelle épinière) est indispensable pour réaliser des études histologiques permettant de confirmer l’activation des neurones sensoriels après la stimulation par ultrasons.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour appréhender l’étude du système nerveux sensoriel dans sa globalité, de la stimulation en périphérie au niveau de la peau jusqu’à l’intégration du signal nerveux dans le cerveau.

Réduction

Des études préliminaires in vitro ont permis d’identifier une gamme de paramètres ultrasonores pour la stimulation des neurones sensoriels, réduisant le nombre paramètres à utiliser pour l’étude in vivo et donc le nombre d'animaux. Nous mettons en place une première procédure qui est une étude pilote et qui va permettre de localiser la zone à stimuler par ultrasons lors d'une deuxième procédure, permettant une réduction significative du nombre de souris à tester. Lors de la deuxième procédure, nous réaliserons le plus de marquages possibles sur des mêmes tissus afin de minimiser le nombre de souris nécessaires. Nous ne stimulerons par ultrasons qu’un seul côté de la souris afin que l’autre côté serve de contrôle et qu’il n’y ait pas besoin de souris contrôle supplémentaires. Après application de ces stratégies, les effectifs ont été calculés avec un outil informatique de calcul statistique pour être ramenés au minimum tout en permettant d'avoir un effet significatif.

Raffinement

Pour la première procédure, les souris seront anesthésiées avant l'injection pour éviter le stress et leur température sera maintenue constante avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Le protocole prévoit une surveillance quotidienne de leur état de santé par le personnel compétent. Des points limites sont définis pour encadrer la surveillance, s’assurant que toute souffrance excessive est rapidement détectée et prise en compte. En cas de détection d’un signe de détresse, une concertation est menée avec la Structure chargée du Bien-Être des Animaux de l’établissement pour décider de la conduite à tenir (par exemple administration d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien). Si un animal atteint un état de souffrance non compatible avec une amélioration rapide, la procédure sera interrompue et l’euthanasie envisagée. Pour la seconde procédure, les expérimentations seront menées intégralement sous anesthésie générale gazeuse pour éviter le stress de l'animal et pour que la stimulation possible de neurones de la douleur ne provoque pas de sensation douloureuse pendant la stimulation ultrasonore. La température corporelle des souris sera maintenue constante avec un tapis chauffant. Après la neurostimulation, les souris seront replacées dans leur cage et leur état de santé sera surveillé par le personnel compétent de la phase de réveil de l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie qui aura lieu entre 10 minutes et 2 heures plus tard. D’autres points limites sont définis pour encadrer cette surveillance. En cas de détection d’un état de souffrance non compatible avec la poursuite de la procédure, celle-ci sera interrompue et l’euthanasie envisagée.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, différents tissus impliqués dans l'intégration nociceptive sont parfaitement décrits chez la souris : la peau, les neurones sensoriels et la moelle épinière. Nous utiliserons des individus ayant atteint leur maturité sexuelle et âgés de 8 semaines. A ce stade du développement, le système sensoriel primaire arrive à maturation avant tous les autres, aussi c'est à ce stade que nous avons choisi de réaliser nos expériences.

Pour tester un vecteur lentiviral de thérapie génique de la rétine, neuf ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin parce que leurs yeux doivent être prélevés. Un chirurgien ophtalmologue leur injecte le vecteur sous la rétine au cours d'une intervention de une à quatre heures, suivie de quatre à seize séances d'anesthésie de une à quatre heures espacées d'une à deux semaines. Le porteur envisage un traumatisme localisé de l'œil, une hémorragie, et des effets plus graves comme un décollement de rétine ou une endophtalmie, avec douleur, photophobie et baisse de l'acuité visuelle. Il justifie le recours au primate par l'absence de fovéa chez les rongeurs, et prévoit de s'entraîner à l'injection sur des animaux tués dans le cadre d'autres projets.

Objectifs

Les dystrophies rétiniennes génétiques sont des maladies des yeux qui font perdre la vue précocement et ont un impact socio-économique important. La thérapie génique est la solution la plus prometteuse pour soigner ces maladies. Elle consiste à remplacer un gène défectueux par un nouveau gène. Pour cela, on utilise un « vecteur » qui transporte le nouveau gène jusqu'aux cellules de la rétine. L'objectif de cette étude est de tester un nouveau type de vecteur pour améliorer l’efficacité de la thérapie génique de la rétine. Actuellement, il n'y a qu'une thérapie génique pour une maladie des yeux concernant un gène unique (nommé « RPE65 »). Mais il n’est pas possible d’utiliser cette thérapie pour toutes les maladies des yeux d'origine génétique, car les méthodes actuelles ne peuvent pas manipuler des gènes de trop grande taille. La technologie utilisée ici permet de transférer des gènes de toute taille, et serait donc applicable à toutes les maladies rétiniennes. Le gène qui sera utilisé dans cette expérience est de grande taille et ses mutations sont responsables de la plus fréquente maladie génétique de la rétine : la maladie de Stargardt. Des essais cliniques sont en cours concernant cette maladie, cependant les vecteurs utilisés sont inefficaces. Notre projet vise donc à utiliser une nouvelle technologie pour augmenter significativement l’efficacité de la thérapie. Des tests sur la souris avec ce vecteur ont montré une augmentation d’efficacité de ~5 % à ~90 % dans les photorécepteurs, comparé aux thérapies géniques préexistantes. Nous voulons maintenant vérifier si le système fonctionne de la même manière chez les primates non-humain. Nous allons d'abord regarder le taux d’intégration du gène dans les cellules de la rétine, puis nous vérifierons si le fonctionnement de la rétine est modifié après l’intervention.

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus sur les primates non humains sont aussi concluants que ceux observés sur les souris, cela pourrait représenter une avancée majeure pour l’utilisation de ce vecteur chez l’homme, notamment pour les mutations du gène testé dans cette étude, mais aussi pour d’autres gènes responsables des maladies rétiniennes génétiques. Les vecteurs classiquement utilisés, appelés adenoassociated virus (AAV) sont couramment utilisés pour cibler la rétine en raison de leur affinité naturelle pour l'œil. Toutefois, un inconvénient majeur des AAV réside dans leur capacité de charge limitée (taille du matériel génétique), ce qui restreint leur application aux gènes de petite taille. Cette contrainte empêche le développement de traitements pour les nombreuses maladies rétiniennes génétiques causées par des gènes volumineux. Les vecteurs lentiviraux (lentivirus, LV), en raison de leur capacité de charge nettement plus grande, représentent une solution prometteuse. Un autre avantage des lentivirus réside dans la faible réaction inflammatoire qu’ils induisent. Ainsi, ils constituent une option prometteuse pour les thérapies géniques rétiniennes, surmontant les limitations des AAV et offrant de nouvelles perspectives pour traiter de nombreuses maladies rétiniennes génétiques.

Procédures

1 intervention pour des injections sous-rétiniennes de 1 à 4 heures, 4 à 16 sessions d'anesthésie de 1 à 4 heures: il s'agira donc d'anesthésies répétées à 1-2 semaines d'intervalles.

Impact sur les animaux

Le gène lié à cette étude code pour une protéine qui intervient dans le transport de dérivés de la vitamine A au travers la rétine. Une surexpression temporaire de cette protéine chez un animal sain ne causera donc aucun phénotype dommageable mais cette protéine non native pourrait créer une réponse immunitaire inflammatoire. L'injection sous-rétinienne sera effectuée par un chirurgien ophtalmologue. Elle devrait provoquer un léger traumatisme localisé de l'œil, potentiellement une hémorragie localisée. Des effets indésirables plus graves, tels qu’un décollement rétinien ou une endophtalmie, peuvent être attendus, entraînant douleur, photophobie, rougeur, augmentation de la pression intraoculaire et une baisse de l'acuité visuelle. Réponse inflammatoire au vecteur viral : ils sont connus pour déclencher une réponse immune innée et adaptative. Une inflammation locale peut être attendue, généralement transitoire entre ~24-72 heures après la dose. Les signes cliniques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, une fermeture persistante des yeux, une difficulté avec les mouvements oculaires et une augmentation de la pression intraoculaire. Réponse inflammatoire au transgène : L'expression du gène d'intérêt est attendue environ 2 à 3 semaines après l'administration. Cette expression pourrait entraîner une réponse immunitaire anti-transgène. Notre vecteur codera pour le gène natif du tamarin. La production de la protéine transgénique pourrait entraîner une inflammation locale. Les signes cliniques typiques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, la fermeture des yeux, des difficultés avec les mouvements oculaires (de façon similaire à la réponse immunitaire au vecteur viral). Enfin il nous faut mentionner le stress lié à la préhension et aux anesthésies répétées que subiront les animaux.

Devenir

Pour la seule procédure, tous les animaux seront euthanasiés à la fin car les yeux doivent être extraits pour l'analyse physiopathologique.

Remplacement

Les aspects de la technologie qui ne nécessitent pas de modèles de primates non-humains (PNH) in vivo ont été développés à l'aide de méthodes in vitro (organoïdes rétiniens humains) et testés par administration chez la souris. Cependant, il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de simuler l'impact de l'efficacité de la transduction sur l'architecture de l'œil, les mécanismes d'élimination de cette voie d'administration, et la réponse immune innée et adaptative au vecteur. En particulier, la technologie vise à traiter des maladies rétiniennes affectant la fovéa et la macula, des structures oculaires qui ne peuvent pas être modélisées avec précision chez d'autres espèces (sans fovéa, ex : les rongeurs). C'est pourquoi les vecteurs doivent encore être évalués pour leur efficacité et leur sécurité dans des modèles animaux de grande taille avant d'être testés chez des patients humains.

Réduction

Des données préliminaires obtenues sur des organoïdes rétiniens et dans des modèles murins permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir la preuve du concept chez le ouistiti. Les doses utilisées par animal seront étalées de façon à permettre une analyse intermédiaire du tropisme du vecteur. Si la transduction du vecteur s'avère moins variable que prévu, cela pourrait permettre de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre les objectifs de cette étude. Toutefois, ces injections n'ayant jamais été testées chez les primates non humains, un risque de perte animale et/ou de problèmes liés à l'injection est à prévoir. Pour quantifier les conséquences de l’administration du composé sur le bien-être animal, nous commencerons par injecter un œil à la plus faible dose du protocole à un premier animal. Trois doses seront ensuite testées sur les deux yeux de groupes de deux animaux (n = 6). Nous estimons les risques de sortir du protocole à 20 %, ce qui correspond à 7 animaux, soit 8,4 animaux au total, arrondi à la hausse pour tenir compte de la marge d'erreur. Pour limiter encore ce nombre, nous nous entraînerons à l’injection sur des animaux mis à mort dans le cadre d'autres projets. L’approche statistique consistera à comparer, sur des tranches histologiques, le nombre de photorécepteurs présentant le transgène, en comparant « œil sain vs œil injecté » sur le premier animal, puis à comparer ce nombre en fonction des deux constructions virales chez les animaux injectés bilatéralement, et ceci en fonction des trois doses utilisées sur des groupes de deux animaux. Dans ce contexte, une simple analyse de variance permettra d’évaluer la significativité de l’augmentation de la transduction. À noter que si les premières doses s’avèrent efficaces pour prouver l’amélioration de la transduction (> 80 %), les animaux des doses supérieures ne seront pas utilisés.

Raffinement

Les doses du vecteur ont été adaptées à partir de doses bien tolérées chez d'autres modèles mammifères (souris et rats) et ne dépasseront pas celles bien tolérées lors des essais cliniques chez l’homme. Des méthodes de dosage cliniques modifiées seront utilisées pour l'administration du vecteur. Pour l’administration, la vitrectomie sera évitée afin de minimiser le risque de traumatisme rétinien. Des médicaments pour réduire la réponse immunitaire et soulager la douleur seront donnés avant, pendant et après la chirurgie afin de minimiser les risques d'inflammation et de douleur. L'administration sous-rétinienne, réalisée par un chirurgien ophtalmologue, minimise considérablement la bio-distribution du vecteur et limite la probabilité de déclencher une forte réponse immunitaire. Cette réponse ne devrait pas causer de douleur ou de détresse et se résorbera en quelques jour. La protéine générée par le transgène administré ne sera pas secrétée par les cellules rétiniennes et restera liée à la membrane interne des cellules. Ces caractéristiques devraient minimiser le risque de réponse anti-transgène. Le dosage des animaux individuels sera étalé pour surveiller les événements indésirables liés au vecteur ou au transgène, permettant ainsi des modifications des protocoles, des procédures ou des doses si besoin et si ces changements ne modifient pas les objectifs scientifiques de l'étude. En particulier, avant de l’appliquer à tous les animaux, un premier animal sera injecté sur un seul œil pour vérifier par une observation (photophobie, œil fermé, position prostré) et/ou auscultation (œil rouge et inflammé) quotidienne que le protocole ne génère pas d’impact sur le bien-être de l’animal. En cas contraire, qui reste peu probable compte tenu des mesures déjà prises, nous ajusterons la dose pour les prochains et continueront ainsi animal par animal jusqu’à trouver la bonne dose. Cette approche minimisera la douleur ou les dommages potentiels. Tous les tests ophtalmologiques et de santé seront réalisés sous anesthésie afin d'éviter le stress que cela provoquerait si l'on les réalisait à l'état éveillé. Les procédures de surveillance réalisées sous anesthésie seront exécutées de manière séquentielle pour minimiser le nombre total d'inductions requises. Les animaux seront logés par paires dans des volières adaptées enrichies de divers éléments (hamacs, tunnels, nids suspendus, perchoirs, etc.).

Choix des espèces

L'objectif principal de l'étude est d'examiner l'efficacité de transduction d'un nouveau système vectoriel destiné à des applications cliniques en thérapie génique. L'efficacité prédite de la transduction déterminera la probabilité que