Organes sensoriels

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par exsanguination sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent du tamoxifène, subissent des tests sensoriels et moteurs sur animal vigile, une mesure de la conduction nerveuse par électromyographie sous anesthésie et une hyperglycémie provoquée après six heures de jeûne. L'objectif est de comprendre le rôle de l'enzyme PCSK9 dans les nerfs périphériques et d'évaluer un risque possible des traitements anti-cholestérol qui la bloquent. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux animaux vivants et d'"inestimable" le système génétique employé, la neuropathie étant selon lui impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Le projet a pour objectif principal de comprendre le rôle de PCSK9 dans le système nerveux périphérique. PCSK9 est une enzyme fortement exprimée dans le foie où elle joue un rôle clé dans le métabolisme lipidique. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter des patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Nos précédents travaux ont pu mettre en évidence que PCSK9 est également exprimé dans le système nerveux périphérique au niveau des nerfs où son role reste pour l'instant totalement inconnu. Suite à cette observation, il est essentiel de déterminer la fonction de PCSK9 dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des thérapies bloquant son activité sur les fonctions sensorielles et motrices des patients traités. Afin d’étudier la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques, nous utiliserons plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées permettant d'éliminer spécifiquement son expression dans différents tissus. Nous évaluerons les fonctions sensorielles et motrices des animaux en réalisant des tests comportementaux. Nous évaluerons également le bon fonctionnement des nerfs sensoriels en faisant des mesures de la vitesse de conduction par la technique de l'électromyographie.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles données sur la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter les patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques de type 2. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Suite à la mise en évidence de l'expression de PCSK9 dans les nerfs périphériques, il est essentiel de déterminer sa fonction dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des inhibiteurs de PCSK9 sur les fonctions sensorielles et motrices chez les patients traités. Ce projet permettra de déterminer le rôle de PCSK9 dans les nerfs périphériques et de déterminer si son inhibition en clinique peut avoir un impact sur le développement de neuropathie chez les patients traités.

Procédures

Le prélèvement de tissus pour le génotypage des souris et la mise en place d’une bague d’oreille numérotée sera réalisé sous anesthésie générale sur l’ensemble des animaux et la technique sera d’une durée de 5min par animal. Les tests comportementaux seront réalisés sur animaux vigiles sur l’ensemble des animaux et le geste technique sera d’une durée de 20min par animal. La vitesse de conduction nerveuse sera effectuée sous anestéshie générale et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 20 min par animal. L’hyperglycémie provoquée se fera sur animaux vigiles et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 120 min par animal avec des prélèvements à différents temps. L’exsanguination sera effectuée sur l’ensemble des animaux du projet qui seront mis sous anesthésie générale et la procédure durera 5min par animal.

Impact sur les animaux

Concernant les nuisances ou effets indésirables possibles sur les animaux, nous avons identifié certaines manipulations qui pourraient entrainer des nuisances ou des effets indésirables sur les animaux. L’injection de tamoxifène sur animal non anesthésié peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés par des expérimentateurs formés à la préhension et à la contention des animaux de laboratoire. Le tamoxifène est un anti-estrogène administré dans le cancer du sein de la femme. Même si quelques effets secondaires peuvent être observés tels qu'une mortaité embryonnaire, une infertilité temporaire ou un blocage intestinal, en recherche, elle est couramment utilisée chez la souris pour activer la recombinase Cre dans des lignées de souris génétiquement modifiées. Au vu des doses utilisées et de la période d’injection (5 jours), nous ne nous attendons pas à des effets indésirables sévères. Concernant les tests sensoriels et moteurs, l’isolement des animaux pour effectuer les tests peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter ces effets, les animaux seront habitués à la salle de test, à son environnement et au matériel pendant 3 jours consécutifs (30 minutes par jours). Pour l'hyperglycémie provoquée, la mise à jeun de l’animal pendant 6 heures peut entrainer des effets indésirables. Afin de limiter le stress, la mise à jeun se fera pendant la journée afin que les expérimentateurs puissent surveiller le comportement des animaux pendant cette période.

Devenir

L'ensemble des animaux est maintenu en vie au cours des procédures 1 à 7. A la fin de la procédure, l'ensemble des animaux subiront une exsanguination suite à une ponction cardiaque après anhestésie à l’isoflurane.

Remplacement

Les objectifs de cette étude sont de déterminer le rôle de PCSK9 de manière spécifique dans le système nerveux périphérique. Elle nécessite donc l’utilisation de lignées de souris transgéniques dans le but de supprimer l’expression de la protéine PCSK9 dans différents types cellulaires composant le nerf. Par ailleurs, le recours à l’expérimentation sur des animaux vivant est indispensable car la neuropathie est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés (ex : culture cellulaire), de même que les tests de phénotypage sensoriel et moteur. De plus, le système Cre-loxP est un système inestimable pour le contrôle de la délétion de différents gènes au niveau du système nerveux chez la souris et est très fréquemment utilisé chez les modèles de souris transgéniques. Les études seront systématiquement optimisées d’après la littérature et/ou les observations réalisées au laboratoire.

Réduction

L’utilisation des animaux sera réduite au maximum et les expériences seront planifiées et réalisées les unes après les autres afin d’éviter des pertes inutiles. L’application de cette politique de réduction mise en place permettra d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer un maximum d’information d’un minimum d’animaux. Le nombre d'animaux minimum a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les protocoles ont été établis afin de réduire la douleur et la détresse de l’animal. Les animaux seront sous la surveillance de personnes habilitées et la diffusion par ces personnes de leur savoir-faire permettra de réaliser nos expérimentations dans le respect du bien-être animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Pour les tests sensoriels et moteurs, les souris bénéficieront d'une acclimatation à la salle de test (30 minutes/jour pendant 3 jours) afin d’éviter le stress de l’animal. Les tests seront effectués sur plusieurs jours dans le but de limiter le nombre de stimulations (mécaniques, nociceptives et motrices). Si lors d'une procédure des signes de douleur ou de détresse sont observés alors l'animal se verra administré une dose d'analgésique (buprénorphine) à 0,01 mg/kg en sous-cutané. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne des zootechniciens et expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être et de détecter tout signe éventuel de douleur (prostration, isolement, passivité, pelage, respiration, vocalisations)

Choix des espèces

La souris représente une espèce validée dans l’étude des neuropathies. Elle permet l’évaluation des déficits sensoriels et moteurs par la possibilité d’effectuer des tests sensoriels et moteurs non invasifs établis de longue date chez ce modèle animal et récapitulant les tests sensoriels réalisés chez l’homme. Nous utilisons des souris car elles sont déjà à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris transgéniques permettant l’étude de protéines d’intérêt impliquées dans les neuropathies. Nous utiliserons des souris âgées de 10 semaines. Nous avons choisi ce stade de développement car le système somatosensoriel est mature et fonctionnel à partir de 8-10 semaines.

12 macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie oculaire d'une heure puis des anesthésies répétées, mensuelles sur six mois puis tous les deux mois jusqu'à 24 mois pour la moitié d'entre eux, afin d'induire par injection une dégénérescence des photorécepteurs à cônes. Le porteur décrit une inflammation oculaire transitoire et affirme qu'aucune douleur n'est attendue en s'appuyant sur la clinique humaine, sans mentionner de test de la vision. Il indique qu'aucun milieu de culture ne reproduit la complexité de la rétine et qualifie ce modèle d'"indispensable" pour tester ensuite des thérapies chez les patients atteints de rétinite pigmentaire.

Objectifs

La Rétinopathie Pigmentaire (RP) est une maladie oculaire génétique grave qui touche environ une personne sur 3000 au niveau mondial. Cette maladie se caractérise par une perte progressive de la vision. Elle se caractérise sur le plan clinique par une perte progressive des photorécepteurs à bâtonnet suivie de la diminution de fonction des photorécepteurs à cône jusqu’à la cécité. Le système S joue un rôle essentiel dans la protection des photorécepteurs contre le stress oxydant. Nous avons démontré chez le rongeur que le système S jouait un rôle crucial dans la survie des photorécepteurs à cônes, cellules indispensables à la vision centrale et des couleurs. Il n’existe à ce jour, aucun modèle chez le primate non humain de dégénérescence des photorécepteurs à cônes. Un tel modèle est indispensable pour pouvoir tester par la suite des thérapeutiques ciblant la macula (région riche en cônes) et ainsi pouvoir envisager des traitements sur des patients atteints de rétinite pigmentaire. Le but de cette étude est de bloquer le système S par injection d’une molécule inhibitrice chez le primate non humain et de montrer une altération des cellules à cônes. La structure de la rétine sera analysée par imagerie du fond d’œil in vivo et la fonction rétinienne sera évaluée par électrorétinogramme. Nous procéderons par la suite à une analyse histologique de la rétine.

Bénéfices attendus

A ce jour, aucun modèle de dégénérescence rétinienne des photorécepteurs à cônes n’existe chez le primate non humain. Récemment, nous avons démontré chez le rongeur que le système S jouait un rôle crucial dans la survie des photorécepteurs à cônes, cellules indispensables à la vision centrale et des couleurs. Il n’existe à ce jour, aucun modèle chez le primate non humain de dégénérescence des photorécepteurs à cônes. Le but de cette étude est de créer un modèle de dégénérescence des cellules à cônes afin de pouvoir comprendre les mécanismes sous tendant cette dégénérescence et également de pouvoir tester par la suite des thérapeutiques ciblant la macula (région riche en cônes) et ainsi pouvoir envisager des traitements sur des patients atteints de rétinite pigmentaire. Le but de cette étude est de bloquer le système S par injection d’une molécule inhibitrice chez le primate non humain et d’étudier les mécanismes de la dégénérescence des photorécepteurs à cônes. Cette étude sera réalisée sur des temps courts (8 mois) afin de montrer histologiquement les modifications de la rétine et sur des temps plus longs (24 mois) afin de détecter des anomalies tardives. Nous évaluerons les changements structurels et fonctionnels de la rétine.La structure de la rétine sera analysée par imagerie du fond d’œil in vivo, la fonction rétinienne sera évaluée par électrorétinogramme et nous réaliserons une étude histologique. Un tel modèle est indispensable pour pouvoir tester par la suite des thérapeutiques ciblant la macula (région riche en cônes) et ainsi pouvoir envisager des traitements sur des patients atteints de rétinite pigmentaire.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront anesthésiés pour intervention chirurgicale et examens longitudinaux. Chaque animal aura une chirurgie d’une durée de 1h. Les examens longitudinaux, imagerie du fond de l’œil et électrorétinogramme durent respectivement 1 et 2 heures. Les animaux seront anesthésiés une fois par mois pendant 6 mois (n=12 animaux) et tous les 2 mois de 7 à 24 mois pour 6 animaux.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable pouvant se manifester est une inflammation oculaire post chirurgie. Cette inflammation est transitoire et si elle a lieu dure 2 à 3 jours. Nous nous basons sur les effets indésirables constatés en clinique humaine. Aucune douleur n’est attendue. De même, en clinique humaine aucune douleur liée à la dégénérescence rétinienne n’est rapportée. Du stress peut être associé lors de la phase d’initialisation et du réveil des différentes anesthésies (chirurgie et examens longitudinaux). La répétition des anesthésies relativement longues pourrait entrainer des nuisances également pour l’animal (mise à jeun, temps de réveil post anesthésie désagréable).

Devenir

Tous les animaux n=12 seront euthanasiés afin de réaliser des études histologiques.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire, car aucun milieu de culture ou système synthétique ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale des cellules de la rétine, en particulier les interactions structurelles et fonctionnelles de ces cellules, ainsi que la réponse immunitaire potentiellement induite par l'administration sous-rétinienne des photorécepteurs dérivés de cellules souches.

Réduction

La mise en œuvre d’un suivi longitudinal non invasif (imagerie in vivo sur les animaux anesthésié) ainsi que par électrorétinogramme (étude fonctionnelle) permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés ainsi que la contrainte imposée aux animaux. Différents marqueurs de survie des photorécepteurs et des autres cellules rétiniennes, de cellules inflammatoires seront utilisés lors des analyses histologiques sur les 12 rétines traitées comparées aux 12 contrôles.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale renforcée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L’acuité visuelle des animaux sera évaluée par des tests d’électrorétinogramme (ERG). Plusieurs marqueurs indiqueront l’état inflammatoire, la qualité des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires. Leur état de santé sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille d’observation postopératoire, cela nous permettra d’intervenir immédiatement s’il y a signe de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le macaque est retenu comme modèle d'étude sur les critères suivants : - cette étude fait partie d'un projet qui vise à valider un modèle de dégénérescence des photorécepteurs à cônes Elle ne peut pas être menée chez le rongeur car l’organisation de l’œil n’est pas comparable à celle de l’Homme. Seul le primate non-humain possède une anatomie de l'œil proche de l'homme, avec notamment la présence d'une région maculaire dans la rétine centrale. - le macaque permet d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelle, telles que l'imagerie du fond de l’œil, et l'électro-rétinographie, qui peuvent être directement extrapolées à l'homme dans une démarche translationnelle. Uniquement des animaux adultes entre 2 et 15 ans seront utilisés. La rétine de ces animaux est comparable à celle de l’homme à l’âge adulte.

1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée qui devient aveugle par dégénérescence de la rétine, elles sont exposées à une lumière bleue jusqu'à huit heures par jour pendant une à quatre semaines et soumises à un test de préférence entre compartiment éclairé et compartiment sombre, pour étudier la photophobie. Le porteur indique que les souris adoptent un comportement de fuite face à la lumière bleue, et qu'elles sont mises à mort pour prélever la rétine et des structures cérébrales. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ni in silico ne peut reproduire la complexité des circuits neuronaux en jeu.

Objectifs

Les rétinopathies pigmentaires affectent environ 1,5 million de personnes dans le monde et se traduisent par une diminution progressive de la vue aboutissant à la cécité. Les patients perdent les bâtonnets puis les cônes dans un second temps avec l’apparition fréquente d’une photophobie. L’exposition chronique à la lumière artificielle de type LEDs pourrait jouer un rôle délétère dans l'épidémiologie et l'évolution des symptômes de la photophobie. Les cellules ganglionnaires rétiniennes photosensibles (ipRGCs) seraient capables de transmettre l’information douleureuse avec le complexe trigéminé via le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP). Bien que la découverte des cellules ganglionnaires rétiniennes semble aider à la compréhension de la photophobie, les mécanismes physiopathologiques de la photophobie liée à la rétinopathie pigmentaire restent encore de nos jours largement méconnus. Nous proposons donc dans ce projet d’élucider par quels mécanismes ce peptide lié au gène de la calcitonine et les cellules ganglionnaires rétiniennes photosensibles participeraient à la photophobie associée à une rétinopathie pigmentaire. Ainsi, nous proposons de combiner des études anatomiques et comportementales d’exposition des souris mâles à diverses bandes spectrales afin mieux comprendre ces mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans la photophobie liée à une dégénérescence rétinienne et d’évaluer la participation du peptide lié au gène de la calcitonine et des cellules ganglionnaires rétiniennes. Ces résultats pourraient conduire au développement de nouvelles évaluations d’étude de la prise en charge thérapeutique de la photophobie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’élucider par quels mécanismes le peptide lié au gène de la calcitonie et des cellules ganglionnaires rétiniennes participerait à la photophobie associée à une dégénérescence de la rétine. Pour ce faire nous disposerons d’un modèle murin qui développe naturellement une cécité par la perte progressive des cellules dela rétine, que l’on comparera à un modèle sain. Nous souhaitons montrer que ces animaux pathologiques présentent 1/un comportement aversif lorsqu’ils sont exposés à une lumière bleue. 2/ Quel(s) rôle(s) le peptide lié au gène de la calcitonie et les cellules ganglionnaires rétiniennes joue dans la réponse à l’exposition à une lumière bleue et 3/ mettre en évidence comment le le peptide lié au gène de la calcitonine et les cellules ganglionnaires rétiniennes modulent des marqueurs d’activation et souffrance neuronales ainsi que des marqueurs d’inflammation chez la souris aveugle. En retraçant les différentes voies impliquées dans la photophobie depuis la rétine jusqu’au cerveau, nous espérons ainsi pouvoir non seulement mieux comprendre et décrire ce phénomène pathologique mais également identifier de potentiels marqueurs/voies à visée thérapeutique pour la prise en charge de la photophobie.

Procédures

Dans le cadre de ce projet les animaux développant la pathologie de dégénérescence rétinienne ou leur contrôle seront exposés à différentes conditions de lumière (jaune ou bleu) durant des périodes de 8h/jour durant 7 jours (exposition aigue) ou 28 jours (exposition chronique). Certains groupes seront injectés avec différentes molécules/agents par injection intra-péritonéale sur animal vigile : 3 fois pour les groupes « exposition aiguë » (J5 à J7) ou 3 x 3 jours pour les groupes « exposition chronique » (de J5 à J7, de J12 à J14, de J19 à J21) Les animaux seront ensuite euthanasiés pour réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

Exposition à la lumière bleue : Les souris pathologique et sauvage devront être exposées individuellement à la source lumineuse afin d’éviter toute interaction avec leur congénaires. Elles adoptent un comportement d’isolation/fuite face à la lumière bleue. L’injection des antagonistes et anesthésiques sera réalisée en intraperitoénale et l’analgésique en sous cutannée, cela induira une douleur mineure au niveau du site d’injection.

Devenir

Les animaux seront analgésiés et anesthésiés puis euthanasiés en fin d’expérimentation comportementale afin de récolter les différents tissus qui serviront aux études neuroanatomiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro ne peut 1) mimer la pathologie de dégénérescence rétinienne et la photophobie qui lui est liée. 2) la complexité et l’intéraction des circuits neuronaux mis en jeu (rétine, ganglions trigéminés et système nerveux central) ne peuvent être étudiées et remplacées par un modèle in vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la photophobie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à l’aide d’un modèle experimental realisé sur les rongeurs (souris). De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre étude étude sera longitudinale et utilisera plusieurs structures (rétine, ganglions trigéminés, tronc cérébrale, hypothalamus) de chaque animal soit les 1280 animaux compris dans cette étude. Nous avons également estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données des résultats obtenus dans une étude précédente. Le nombre d’animaux sera gardé le plus petit possible tenant compte de 1/ la variabilité préssentie des résultats expérimentaux et 2/ de la nécessité de valider statistiquement les résultats obtenus afin de les publier dans des journaux scientifiques. Pour chaque étude et test réalisés, nous comparerons statistiquement les lots de souris de taille raisonable entre eux.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : enrichissement dans les cages (maison, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 21°C et suit un cycle d’éclairage non inversé (12h /12h). Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur, qui seront évalués à l’aide de points limites validés en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie, nous permettant de modifier la procédure en cours en procédant à l’euthanasie de l’animal. Pour les sessions d’illuminations, afin de minimiser le stress et la variabilité lors du test de boite illuminée/noir les animaux suivront une session d’habituation au test durant 5 jours avant le début de l’exposition à la lumière bleue ou jaune. L’animal aura libre accès à l’ensemble du complexe dans une période de 5 minutes, c’est-à-dire les deux compartiments (illuminé ou sombre) et le couloir central reliant les deux compartiements. Dans sa globalité le projet ne présente pas de gestes très invasifs, seulement une injection en i.p pour l’administration des traitements (antagonistes) et l’analgésie/anesthésie en sous cutanné avec une douleur minime ressentie au site d’injection. Enfin les points limites suivant seront suivis de près afin de déterminer l’état général de l’animal et des traitements/mesures à appliquer : Apparence physique, comportement, changement du poids corporel.

Choix des espèces

La souche Rd1 est un choix privilégié car ces souris développent naturellement une cécité par la perte progressive de leurs photorécepteurs, ce qui fait de cette souche un modèle parfait pour mimer la pathologie de rétinodégénérescence avec photophobie induite. La souche Rd1 étant naturellement mutante, nous somme contraint de la comparer à une souche sauvage comme les souris C57BL/6. De plus, le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Les deux souches de souris seront utilisées aux stades de développement à 30 et 90 jours car les souris pathologiques Rd1 sont complètement aveugles à 90 jours et nous souhaitons voir l’effet du vieillissement dans la réponse aux traitements effectués.

10 chèvres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque femelle subit une ovariectomie chirurgicale d'environ une heure, puis est tuée pour prélever les organes olfactifs, l'utérus, les ovaires et le cerveau. Le porteur décrit un risque de douleur, d'hématome et d'infection postopératoires, ainsi qu'une irritation respiratoire possible liée à l'intubation. Il affirme que la question n'est "pas modélisable" autrement et rattache le bénéfice attendu à la gestion de la reproduction dans la filière caprine.

Objectifs

La chèvre est une espèce à reproduction dite "saisonnée", ce qui signifie que son activité de reproduction est naturellement restreinte à une période de l'année. C'est une espèce dite de "jours courts", c'est-à-dire que son activité sexuelle se déclenche en automne lorsque la durée du jour diminue. Cette saison sexuelle est suivie d'une période de repos sexuel (ou "anœstrus saisonnier") pendant laquelle les variations hormonales responsables des chaleurs et de l'ovulation sont stoppées lorsque la durée du jour augmente au printemps. La durée du jour n'est cependant pas le seul facteur environnemental pouvant impacter la reproduction de la chèvre. En effet, plusieurs études décrivent une modification de l'activité sexuelle de la femelle en fonction des contacts sociaux entretenus avec le mâle. Un phénomène nommé "effet mâle" a notamment été caractérisé chez cette espèce ainsi que chez les ovins. Ce phénomène permet, par l'introduction d'un mâle parmi des femelles en période de repos sexuel, une reprise des mécanismes hormonaux menant à l'ovulation. Les indices sensoriels, notamment olfactifs, pourraient jouer un rôle important dans le déclenchement de ce type de phénomène. Chez la souris, l'exposition à un mâle ou à son odeur déclenche une puberté précoce chez les femelles exposées. Chez la chèvre, l'exposition de femelles pendant l'anœstrus saisonnier à des stimuli olfactifs de mâle permet de stimuler les mécanismes hormonaux, pouvant mener à l'ovulation (50% des femelles adultes dans le cadre de l'effet mâle). Pour étudier la sensibilité des chèvres aux composés olfactifs de boucs, notre équipe a développé une approche basée sur une culture cellulaire, produite à partir de la récupération des tissus olfactifs de chèvre après euthanasie. Chez la souris, le statut hormonal influence le seuil de détection des odeurs et leur discrimination. Puisque la chèvre subit des variations hormonales drastiques au cours de l'année, nous aimerions explorer l'hypothèse que le statut physiologique de la femelle va modifier la sensibilité de ses tissus olfactifs aux composés de mâles.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension de l'influence des hormones sexuelles sur la sensibilité olfactive des femelles aux composés odorants de mâles chez un modèle à reproduction saisonnée. A terme, cette étude pourrait apporter des bénéfices à la filière d'élevage caprine via une meilleure gestion de la reproduction par les interactions sociales mâles/femelles et l'utilisation des indices sensoriels olfactifs, tout en limitant l'apport d'hormones exogènes.

Procédures

Les 10 femelles du lot OVX subiront une unique procédure chirurgicale d'ovariectomie (retrait des ovaires). La réalisation de cette procédure nécessite environ une heure.

Impact sur les animaux

Pour les animaux des lots SAISON et ANOESTRUS, les seuls effets indésirables attendus sont du stress lors des manipulations précédant l'enthanasie. Pour les animaux du lot OVX : stress possible lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible (hématome au niveau de la plaie), ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais ce cas reste rare. De plus, les différentes injections en intraveineuse peuvent engendrer un hématome.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les 10 femelles du lots OVX retourneront en élevage. Dès que possible, ces femelles seront euthanasiées afin de récupérer les organes sensoriels olfactifs (épithélium olfactif principal et organe voméronasal) pour mesurer l’activité cellulaire sur des neurones en culture. L'organe voméronasal est un organe tubulaire du nez présent chez la plupart des mammifères et permettant la détection de molécules odorantes. Les résultats seront comparés à ceux obtenus sur les lots SAISON et ANŒSTRUS (non concernés par la procédure expérimentale faisant l'objet de cette saisine). Ceci nous permettra d'évaluer les effets des variations hormonales saisonnières sur la sensibilité olfactive des chèvres aux stimuli de mâle. Le tractus reproducteur (utérus/ovaires) et le cerveau seront également récupérés pour d'autres types d'expériences.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé dans ce projet étudiant les effets de la saisonnalité sur la réponse des neurones olfactifs aux stimuli de mâle chez la chèvre car ceci n'est pas modélisable par des modèles alternatifs.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés (34 femelles) a été rationalisé dans le but de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. La taille de nos effectifs (10 à 13 individus par groupe) a été choisi grâce à un outil statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sur paille et bénéficieront d'enrichissement comme des caisses en bois et des ballons. Afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. Pour les animaux du groupe OVX, la douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivie du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours malgré le traitement sera euthanasié. Une fiche de suivi individuel est mise en place, renseignée tous les jours. Les animaux seront surveillés quodtidiennement sur 6 paramètres. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante : en ce cas ces animaux recevront des injections sous cutanées de morphine - Fièvre, abattement, polypnée en cas d’infection post opératoire : en ce cas, les animaux recevront des antibiotiques et des anti inflammatoires non stéroïdien en fonction de la gravité des symptomes.

Choix des espèces

Chez la chèvre, la présence d'un mâle sexuellement actif impacte la physiologie de la reproduction et les comportements sexuels de la femelle. Les indices olfactifs du mâle pourraient jouer un rôle assez important dans le déclenchement de ces divers phénomènes décrits, notamment dans le cadre de l'"effet mâle". Le statut hormonal d'un individu semble influencer le seuil de détection des odeurs et leur discrimination (données rongeurs). Ainsi, il serait donc intéressant de comprendre si les variations hormonales causées par la saisonnalité de reproduction de la chèvre conduisent également à une modification de la sensibilité de ses organes olfactifs aux stimuli de bouc. Nous utiliserons des femelles sexuellement matures (nées entre janvier et février 2021) pouvant donc afficher les variations hormonales saisonnières attendues pour comparaison.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées, sous anesthésie ou à l'état vigile, à une chaleur croissante de 33 à 44 degrés mimant une canicule, avec une contention en tube que le porteur reconnaît stressante, pour étudier la thermorégulation de la peau au cours du vieillissement. La mise à mort se fait par dislocation cervicale pour des prélèvements terminaux. Le porteur qualifie les techniques d'indolores et proches de celles utilisées chez l'humain, tout en classant les procédures en gravité modérée.

Objectifs

Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la thermorégulation vasculaire de la peau. Avec le réchauffement climatique et le vieillissement de la population, les vagues de chaleur vont avoir un effet critique grandissant sur notre système de santé. En effet, la population âgée est particulièrement vulnérable aux épisodes caniculaires dû à une altération de la thermorégulation conduisant à une incapacité à dissiper la chaleur et pouvant entraîner de graves complications voire un décès. Bien que ces défauts soient rapportés au cours du vieillissement depuis longtemps, les mécanismes qui sous-tendent ces défauts fonctionnels ne sont pas encore connus, ce qui limite fortement les approches thérapeutiques envisageables pour les personnes âgées. Les thermorécepteurs TRPV3 exprimés dans la peau sont mis en jeu dans les processus de sensation de température et dans la thermorégulation vasculaire cutanée. Ce projet vise à caractériser le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de l’épiderme (couche superficielle de la peau) dans les mécanismes neurovasculaires cutanés de la thermorégulation au cours du vieillissement, en utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de bloquer la fonction de TRPV3 ou ayant un défaut d’innervation cutanée.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes de la thermorégulation au cours du vieillissement permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de thermorégulation qui peuvent affecter la population âgée.

Procédures

Les lignées de souris nécessaires pour ce projet sont déjà disponibles et présentent à l’âge adulte jeune un défaut de réponse vasculaire au chauffage local mais ne présentent pas de trouble susceptible d'affecter leur bien-être dans les conditions d’hébergement standard. Les souris seront anesthésiées (durée environ 45 minutes) afin d’effectuer des mesures non invasives pour caractériser la fonction barrière et leur capacité vasculaire cutanée lors d’une exposition à un chauffage local ou un chauffage global mimant un épisode de canicule. Une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) sera également envisagée chez des souris vigiles afin de mesurer leur capacité à maintenir leur température interne stable dans ces conditions thermiques mimant une canicule. Les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de la peau au cours du vieillissement nous étudierons des souris d’âge différents (jeunes, matures et âgées).

Impact sur les animaux

Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Pour les mesures sur souris vigiles, l’utilisation de tubes de contention peut générer un stress qui sera minimisé grâce à une habituation préalable. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention pendant 10 minutes, deux jours différents dans les 7 jours précédents. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 des pattes ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. L’exposition à un chauffage globale de la souris va déclencher des mécanismes de thermorégulation périphériques et centraux, induire une sudation afin de préserver une température interne le plus stable possible. Notre étude précédente a montré que les souris exposées à un chauffage passif de 33 à 44°C à raison de +1°C/min induisait une augmentation de la température rectale d’environ 3°C (en vigile et sous anesthésie). Afin de limiter les effets indésirables, l’exposition à la chaleur sera immédiatement arrêtée si l’augmentation de la température rectale atteint +4°C (en vigile ou sous anesthésie). Les souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.

Devenir

Mise à mort par dislocation cervicale. Cette étude vise à comprendre le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet du vieillissement sur la réactivité vasculaire (mesures ex vivo sur vaisseaux isolés) et l'expression de TRPV3 dans la peau.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la réactivité vasculaire cutanée en réponse au chauffage qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 360. Ce nombre maximal inclut la possibilité de reproduire les expériences en cas d'imprévu, donc il est très vraisemblable que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée hebdomadaire). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Choix des espèces

Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les même approches (laser Doppler, iontophorèse), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique au cours du vieillissement, les souris seront utilisées à 3 âges différents (18 mois).

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasées puis enduites d'une crème à l'imiquimod provoquant des lésions cutanées, elles reçoivent des injections sous-cutanées et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale, avant la mise à mort pour prélever la peau et divers organes. Le porteur indique une perte de poids d'environ 10 %, une peau rouge, squameuse et lésée après 48 heures, et un stress lié à la contention quotidienne. Il vise à comprendre le rôle d'une hormone du fer dans le psoriasis et à tester des pistes thérapeutiques.

Objectifs

Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique qui affecte principalement la peau et est associée à des comorbidités importantes. C'est une maladie courante qui touche 2 à 3 % de la population mondiale, sans distinction d'âge, de sexe ou d'ethnie. Les différents types comprennent notamment le psoriasis en plaques (ou psoriasis vulgaire), le plus répandu et le psoriasis pustuleux (PP), considéré comme plus résistant. Le PP, caractérisé par des pustules riches en cellules immunitaires, ne représente qu'une petite fraction des cas, mais peut mettre la vie des patients en danger lorsqu'il est étendu. Malgré des avancées majeures dans la compréhension de sa pathogenèse et dans son traitement, le psoriasis reste une maladie chronique courante dont les causes ne sont pas encore totalement élucidées. Le PP est particulièrement difficile à traiter. Des études ont montré une augmentation des niveaux de fer dans la peau de patients atteints de psoriasis. Le fer est indispensable au niveau cellulaire mais peut être toxique lorsqu’il est en excès. Il existe une hormone, principalement produite par le foie, qui régule les niveaux de fer dans l’organisme. Ce petit peptide est, de manière inattendue, exprimé dans la peau de patients atteints de psoriasis. Des données montrent que l'accumulation du fer et de "l'hormone du fer" dans la peau de patients souffrant de psoriasis est néfaste. Le projet visera à comprendre les mécanismes par lesquels cette hormone induit des effets délétères chez ces patients, mais également visera à tester différents agents thérapeutiques (médicaments ciblant le fer ou l'hormone) dans un modèle murin de psoriasis.

Bénéfices attendus

Dans la peau, l’hormone de régulation du fer pourrait avoir un rôle pro-inflammatoire en induisant d’une part la rétention de fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus physiopathologiques du psoriasis) mais également en recherche appliquée en porposant de cibler l’hepcidine ou le fer comme alternative thérapeutique au traitement du psoriasis.

Procédures

Les souris seront rasées au dos avec une tondeuse sous anesthésie (1 minute par souris). Une crème est appliquée (temps d’application : 30 secondes) sur des animaux vigiles suite à une prise en contention 1 fois/jour pendant 1 à 5 jours. Le poids des animaux est pris chaque jour après l’application de la crème. Une injection en sous-cutané (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes) est réalisée 2 fois (Jour 0 et jour 3 suivant l’application de la crème).30 minutes avant le prélèvement de sang, les souris seront injectées avec un analgésique (temps de réalisation impliquant la contention : 30 secondes); 500µl de sang seront prélevé par voie rétro-orbitale. (1 minute par souris).

Impact sur les animaux

Les animaux perdent du poids jusqu’au 3ème jour (environ 10% de leur poids) puis commencent à récupérer à nouveau. La peau traitée par l’imiquimod devient rouge après 48h avec des lésions et des écailles. Un stress est généré par la contention quotidienne et les injections.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort pour prélever la peau et d'autres organes à des fins d'analyse immunohistochimique, d'expression génique, d'expression protéique et de cytométrie en flux.

Remplacement

Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de psoriasis.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Pour respecter le principe des 3R, la durée et la dose de traitements utilisée seront réalisées selon les protocoles préétablis. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance quotidienne et des soins adaptés. Le raffinement comprend l'utilisation d'anesthésie (pour rasage et avant exsanguination) et d'analgésie (avant exsanguination) et la surveillance quotidienne des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoires et pour évaluer l’infiltrat immunitaire. Seule cette espèce possède des modèles murins génétiquement modifiés permettant l’étude de ce gène au cours de ces pathologies. De plus, la peau murine est similaire à la peau humaine (consituée de 3 parties : épiderme, derme, hypoderme). Des souris adultes de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge la repousse du poil est la plus lente, donc adéquate pour le rasage du dos des souris. De plus, à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude du psoriasis.

1170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par mutation génétique ou par instillation quotidienne d'un conservateur allergène, puis des tests de douleur et des échographies sont menés, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique qu'aucun analgésique ne peut soulager cette douleur oculaire, c'est le paramètre évalué. Il présente les résultats obtenus chez le rat comme "très encourageants" et défend une molécule sous brevet.

Objectifs

La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’oeil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Une simple goutte de cette molécule dans les yeux de rats augmente la production de larmes pendant 24h au moins. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons deux modèles de souris complémentaires, validés pour l’étude du DED : l’un, pharmacologique, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome, et l’autre, génétique, présentant une anomalie des glandes lacrymales pouvant mimer une sécheresse oculaire modérée. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans chaque modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement du DED par notre molécule. Au total ce projet utilisera au maximum 1170 animaux dans le respect de la règle des 3R. Grâce à nos études préalables in vitro, nous avons déjà caractérisé le mode d'action de la molécule et ses effets (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des animaux (raffinement). Enfin, les prévisions obtenues avec l'utilisation de logiciels statistiques nous permet d'anticiper le nombre optimal d'animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles et nous réduirons en cours de projet ce nombre dès lors que nos résultats nous indiqueront que nos données sont suffisamment robustes (réduction).

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. La molécule que nous avons caractérisée représente donc une stratégie thérapeutique prometteuse: en effet, une expérience pilote menée sur le rat a montré clairement que l'administration de cette molécule permet de restaurer une production de larmes équivalente à celle des rats contrôles, ce qui nous permet d'envisager que cette molécule soulagera efficacement la sécheresse oculaire. Le protocole mené chez la souris sera similaire à celui utilisé chez le rat, à la simple différence que rats et souris sont caractérisés par des seuils de sensibilité légèrement différents mais très bien caractérisés que nous prendrons en compte. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire et un premier pas vers la création du médicament et l'industrialisation de ce traitement.

Procédures

Un phénotype de sécheresse oculaire modérée sera induit chez les animaux soit génétiquement soit pharmacologiquement par administration quotidienne dans l'oeil pendant 7 jours d'un produit conservateur allergène. Chaque procédure dure 5 à 6 semaines. Le test d'évaluation de la gêne/douleur associée à la sécheresse oculaire dure environ 1h. Les tests de mesure du volume et de la stabilité des larmes et l'échographie Dopler seront réalisés sous anesthésie légère (15-20 minutes). Les groupes d'animaux étudiés subiront entre 1 et 4 fois fois la série de tests (avec une semaine d'intervalle entre chaque série de tests).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera induite soit par le BAC (conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l'homme et décrit pour induire une sensibilisation) soit par la mutation Tabby qui induit une réduction de la taille des glandes lacrymales et donc une réduction de la production de larmes. Ces deux modèles murins présentent donc une sécheresse oculaire d'intensité modérée. Cette sécheresse oculaire engendre potentiellement un inconfort voire une douleur (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Nos résultats pilotes obtenus sur le rat indiquent clairement que notre molécule soulage efficacement cet inconfort et nous laissent envisager des résultats très positifs pour ce projet puisque nous utiliserons le même protocole. Nous compenserons et limiterons l'inconfort et les nuisances infligées aux animaux par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Les effets du traitement seront évalués sur 28 jours puis les animaux seront mis à mort. Les animaux auront 3 mois lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances et effets indésirables auxquels ils seront exposés sera donc de 6 semaines maximum pour les souris BAC (habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, 1 semaine d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests) et de 4,5 mois pour les souris Tabby (à l'âge de 3 mois, habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

Nos études préalables ont permis de caractériser et de breveter la molécule d'intérêt, de déterminer sa structure et son mode d'action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. De plus, nous avons établi une première collaboration qui nous a permis de montrer que l'administration de cette molécule dans l'oeil de rat wild-type induit la sécrétion naturelle de larmes et qu'elle restaure un volume normal de larmes dans un modèle de rats atteints de sécheresse oculaire. Ces résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet et sa prématuration pour développer et industrialiser la molécule comme stratégie thérapeutique novatrice. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l'oeil.

Réduction

Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires. Les rares médicaments utilisés pour réduire la sécheresse oculaire sont peu efficaces et nécessitent des administrations quotidiennes répétées (3 à 6 fois), ce qui représente un inconvénient majeur pour les patients. Nous avons donc décidé d'administrer notre molécule 1 ou 2 fois par jour maximum, et d'évaluer son effet après 1 ou 2 applications. Cependant, l'effet après 1 application sera évalué en 1ere intention, l'effet après 2 applications étant évalué seulement si les résultats avec 1 application montrent une efficacité partielle. Si l'étude après 1 seule application donne les résultats escomptés, nous ne procèderons pas à l'analyse de 2 applications et le nombre d'animaux sera donc réduit de moitié. Au total, nous utiliserons 1170 animaux maximum.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront hébergés et manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test et nous réaliserons certains de ces tests sous anesthésie gazeuse légère. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant de mettre en oeuvre des points limites précoces et un arbre décisionnel: utilisation de solutions analgésiques oculaires en fonction de l'aspect de l'oeil (oeil fermé, sécrétions) et du comportement de l'animal (démangeaisons...) ou mise à mort en cas de souffrance. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les deux modèles murins reproduisant le syndrome de l’œil sec (DED, Dry Eye Disease) sont des modèles validés et classiquement utilisés dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l'efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.