Organes sensoriels

250 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection de gel dans l'œil pour provoquer une hypertension intraoculaire maintenue pendant vingt et un jours, puis des traitements et des prélèvements de liquide intraoculaire, pour tester de nouveaux composés contre le glaucome. Le porteur indique que l'augmentation de pression "ne devrait pas générer de douleur excessive" et prévoit des points limites en cas de douleur non tolérée. Il retient l'œil du lapin comme "modèle de référence" pour sa taille proche de l'œil humain, et met à mort les animaux faute de pouvoir les réutiliser.

Objectifs

L'objectif du projet est d'évaluer chez le lapin sur une durée de 7 à 21 jours les effets de nouveaux composés sur une hypertension intraoculaire chronique induite par une injection d'un gel dans l'oeil.

Bénéfices attendus

La cause principale du glaucome (diminution irréversible du champ visuel, 2ème cause de cécité) est une augmentation de la pression intraoculaire à l’origine de la destruction des cellules du nerf optique. Les traitements existants (β-bloquants, analogues des prostaglandines…) ont une efficacité limitée et peuvent présenter des effets indésirables. Ainsi, le bénéfice attendu de ce projet est le développement d’une nouvelle classe thérapeutique pour traiter le glaucome qui touche plus de 800 000 personnes en France.

Procédures

Les lapins vont recevoir sous anesthésie (durée maximale de 45 minutes) une injection dans l'oeil d'un gel qui va provoquer une augmentation progressive de la pression intraoculaire qui va se maintenir pendant 21 jours. Avant l'injection intraoculaire, les animaux sont habitués pendant au moins 5 jours aux expérimentateurs et au dispositif de mesure de la pression intraoculaire : plusieurs mesures de la pression seront effectuées à l'aide d'un tonomètre vétérinaire sur l'animal éveillé. Des nouveaux composés ou des traitements de référence seront administrés de manière aigüe ou répétée (maximum 2 administrations par jour) afin de tester leur efficacité sur l'augmentation de pression intraoculaire. Des prélèvements sanguins et des du liquide intraoculaire (sous anesthésie) pourront être réalisés afin de vérifier les expositions aux différents traitements effectués.

Impact sur les animaux

Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -Le stress lié à la contention et à la réalisation des mesures de pression intraoculaire (geste non invasif et non douloureux) : pour limiter cet effet, les animaux auront une période d’habituation à la préhension, manipulation des yeux et des mesures de pression. - L’augmentation de la pression intraoculaire : selon la technique utilisée, l’augmentation de la pression devrait être modérée (50 mmHg) et ne devrait pas générer de douleur excessives. Cependant, nous avons mis en place un protocole de suivi et d’identification de points limites permettant de mettre en place des actions en cas d’apparition de douleurs non tolérées ou d'anomalies oculaires.

Devenir

A la fin de l'expérimentation chronique, les animaux sont mis à mort. En effet la procédure ne peut pas être répétée plusieurs fois sur un même œil. De plus au sein du laboratoire ces lapins ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.

Remplacement

Les modèles in vitro modélisant le fonctionnement d'un oeil ne permettent pas de tester les efficacités des molécules thérapeutiques : en effet le maintien de la pression intraoculaire fait intervenir l'interaction de nombreux mécanismes (production/élimination de l'humeur acqueuse, inflammation...).

Réduction

En raison de la variabilité liée au modèle, de la variabilité liée aux mesures de pression, un nombre de 8 à 10 lapins par groupe est nécessaire afin de mettre en évidence un effet éventuel d'un produit. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les 2 yeux de chaque lapin pourront être inclus dans la procédure. Les analyses statistiques pourront être de trois types : soit en comparant les données après administration du produit à tester aux données mesurées en conditions basales, soit en comparant les données sous traitement à celles recueillies aux mêmes temps dans le groupe contrôle, soit en comparant les données obtenues sur l'oeil d'un lapin en comparaison à l'autre oeil du même lapin qui n'aura pas reçu de traitement ou qui ne recevra pas d'injection intraoculaire afin d'obtenir des valeurs basales et faire des comparaisons appariées.

Raffinement

Les animaux sont hébergés individuellement à leur arrivée jusqu’au jour de l'expérimentation. Pour le bien-être des animaux et limiter le stress inhérent à cette espèce, nous veillons à mettre à disposition dans les cages d’hébergement une buchette à ronger et une hutte en polycarbonate rouge dans laquelle le lapin peut venir se réfugier s’il ressent le besoin de s’isoler. Pendant une phase d’habituation d’au moins 5 jours, du foin est mis à disposition de manière journalière ce qui permet de créer un contact régulier avec le lapin et de le familiariser avec l'expérimentateur. A la fin de cette période d’habituation, des mesures de pression à l'aide d'un tonomètre seront effectuées afin de familiariser l'animal avec le dispositif. La mesure de pression à l'aide d'un tonomètre n'engendre aucune souffrance chez l'animal. Chaque mesure de la pression intraoculaire sera associée à une récompense (friandise). L'injection intraoculaire sera effectuée après administration sous forme de gouttes d'un anesthésique local chez un lapin au préalable sédaté. Des points limites stricts et spécifiques ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille relativement proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de nouvelles molécules sur la pression intraoculaire. De plus, cette taille de l'oeil facilite la précision du geste d'injection intravitréenne et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. L'expérimentation sera réalisée sur des lapins adultes. Le glaucome est une pathologie apparaissant avec l'âge, il n'y a aucune raison de travailler sur des individus en cours de développement.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placées dans un dispositif générant des ondes 5G, elles subissent des dépilations et des anesthésies générales répétées pour des mesures cutanées, dont une exposition de la patte à une chaleur montant jusqu'à 44 degrés, afin d'évaluer l'effet des ondes de 3,5 et 26 GHz sur la peau saine et vieillissante. Le porteur qualifie les techniques de non invasives et indolores, la principale nuisance étant le risque de détresse respiratoire lié à la répétition des anesthésies. Il situe l'étude dans un contexte où "les enjeux commerciaux et financiers de la 5G sont importants" et où les autorités "souhaitent une mise en œuvre rapide".

Objectifs

La téléphonie mobile est en perpétuelle évolution pour répondre à une demande croissante des usagers. La cinquième génération (5G) d’infrastructures de communication est en phase de déploiement en France malgré un certain nombre de questions auxquelles la communauté scientifique tarde à apporter des réponses. Alors que la bande de 26 GHz couvrira les besoins de communication pour les objets connectés, ou des « hot spots » à très haut débit (arrêt de bus, quai de métro …), c’est la bande de fréquence autour de 3,5 GHz qui assurera la couverture en téléphonie mobile 5G (contre 2,6 GHz pour la 4G). L’effet sur les systèmes biologiques de ces fréquences de 3,5 GHz reste très mal connu et il n’est pas possible d’extrapoler de façon rigoureuse les résultats d’études scientifiques menées dans d’autres gammes de fréquence. L’augmentation de fréquence lors du passage de la téléphonie 4G à la 5G pourrait en théorie moduler d’éventuels effets biologiques. En effet, si la pénétration de l’onde dans les tissus est d’autant plus superficielle que sa fréquence est élevée, la puissance associée à l’onde augmente avec sa fréquence. Il est donc nécessaire d’évaluer précisément les conséquences biologiques d’une augmentation de fréquence sur les tissus exposés. Il est nécessaire d’étudier les effets des ondes électromagnétiques (OEMs) sur la peau, premier organe touché par les stress environnementaux et dont la fonction barrière est essentielle au maintien de l’intégrité de l’organisme. De plus, pour les fréquences à partir de quelques GHz, l’énergie des OEMs est presque entièrement absorbée dans les premières couches cutanées, notamment dans l’épiderme, et pénètre très peu en profondeur. Les données ne sont pas non plus suffisantes pour conclure à l’existence ou non d’effets sanitaires dans la bande de 26 GHz, aucune donnée d’exposition n’étant disponible à ce jour car les applications de type objets connectés sont encore à l’état de projet. L’objectif de ce projet est d’étudier les conséquences sur la peau d’une exposition chronique aux OEMs de 3,5 GHz, associée à une exposition ponctuelle aux OEMs de 26 GHz afin de mimer la situation que pourront rencontrer les populations utilisant la téléphonie mobile 5G dans leur vie quotidienne ainsi que, plus ponctuellement, des objets connectés dans leur vie professionnelle ou des stationnements sous la couverture de « hot spots ».

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de l’exposition aux OEMs 5G dans la population générale, y compris chez des personnes dont la peau est fragilisée par le vieillissement, ce qui représente une part importante et croissante de la population française. Les enjeux commerciaux et financiers de la 5G sont importants et les autorités souhaitent une mise en œuvre rapide pour offrir des débits bien supérieurs à ceux actuellement disponibles avec le réseau 4G. Dans un contexte général de grande défiance des populations vis-à-vis des nouvelles technologies et d’inquiétude concernant leur potentiel impact sur la santé, l’attente de la société est forte envers les experts. Nous devons donc répondre à l’attente des populations en évaluant de façon rigoureuse et avec des modèles pertinents les effets biologiques de ces nouvelles fréquences. Il est donc d’un grand intérêt à la fois scientifique et de santé publique d’étudier les effets des OEMs, en particulier dans la gamme de fréquences de la 5G.

Procédures

Après une période d’acclimatation d’une semaine minimum dans une cage standard avec un enrichissement adapté à leurs besoins, les souris seront hébergées en groupe à l’intérieur d’un dispositif capable de générer des ondes de type 5G. Une période d’habituation à leur nouvel environnement (dispositif éteint sans ondes) sera ajustée à l’âge des souris (1 semaine minimum). Pour étudier les effets des ondes sur la peau, une dépilation de la partie basse du dos sera réalisée sous anesthésie générale induite par un gaz (1 à 3 min) 1 à 3 jours précédant les mesures fonctionnelles nécessitant une nouvelle anesthésie générale (anesthésie par injection pour une durée de 30 à 45 min). Afin de limiter le nombre d’animaux, ces 2 anesthésies consécutives seront répétées une deuxième fois pour dépiler à nouveau la zone si besoin et réaliser une 2ème série de mesures en respectant un minimum de 3 semaines entre les deux séries de mesures. L’anesthésie générale par injection (30-45 min) permettra de prélever du microbiote cutané en frottant un écouvillon sur les faces interne et externe des 2 oreilles (moins de 1 min/oreille) puis de réaliser séquentiellement des mesures non invasives pour évaluer la fonction barrière (moins de 1 min), les propriétés viscoélastiques (moins de 1 min), la perfusion sanguine (moins de 2 min) et la capacité des vaisseaux à se dilater en réponse à l’application locale d’une drogue vasodilatatrice (20 à 30 min) de la peau au niveau du dos. En même temps que la mesure vasculaire au niveau dos, une autre mesure vasculaire sera réalisée lors d’une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) au niveau d’un coussinet arrière pour évaluer les capacités de thermorégulation. Toutes les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin de comparer l’effet des OEMs de type 5G sur la peau saine ou fragilisée par le vieillissement chronologique, nous étudierons des souris à l’âge jeune (15 mois). La principale nuisance est liée à la répétition d’anesthésies générales, qui pourrait augmenter le risque de détresse respiratoire au réveil. Pour cela, chaque souris aura au maximum 2 séries qui nécessitent 1 anesthésie à l'isoflurane (dépilation environ 2 min) et 1 au thiopental (mesures fonctionnelles 45 min au maximum). Les deux anesthésies au thiopental seront espacées au minimum de 3 semaines.

Impact sur les animaux

Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 coussinet (patte arrière) ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. Les souris prévues dans cette étude ne sont pas des souris transgéniques (pas de phénotype dommageable). Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.

Devenir

Mise à mort. En effet, plusieurs prélèvements terminaux seront réalisés à différentes durées d’exposition pour permettre des analyses tissulaires et moléculaires approfondies.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant d'étudier les effets des OEMs sur plusieurs aspects fonctionnels de la peau (fonction barrière, fonction vasculaire, propriétés viscoélastiques), il est nécessaire de travailler sur un organisme entier, car il est actuellement impossible de reproduire l’intégrité fonctionnelle dans un modèle de peau in vitro, en particulier la réactivité vasculaire cutanée qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 288 afin d'étudier 16 souris à 3 types d'expositions, des 2 sexes, à 3 âges différents. Ce nombre maximal inclut la possibilité d’étudier un âge intermédiaire. L’étude débutera en comparant les effets des OEMs entre les souris âgées et les souris jeunes. En absence de différences, les souris d’âge intermédiaire ne seront pas utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux, 5 mesures (4 sur le dos et 1 sur une patte arrière) seront réalisées au cours d’une seule anesthésie et 2 séries de mesures par souris. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles. Nous avons prévu d’utiliser des tests statistiques adaptés aux petits groupes pour évaluer les différences intra- ou inter-individuelles pour toutes les mesures. Nos expériences précédentes nous ont amené à conclure que 8 mesures au minimum étaient nécessaires pour chaque phase étudiée.

Raffinement

Une période d’habituation à leur changement d’environnement lié au dispositif qui va générer les ondes 5G sera respectée et adaptée en fonction de l’âge des souris (1 sem pour les souris jeunes, 2 sem pour les souris matures, et 3 sem pour les souris âgées). Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée et mesure de la température rectale hebdomadaires). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Toutes les interventions et les mesures sur la peau seront réalisées sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste largement utilisée pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède en effet une physiologie cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes approches techniques (laser Doppler, iontophorèse) ainsi que les autres explorations cutanées (propriétés viscoélastiques, perte insensible en eau, perfusion sanguine, microbiote), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier l’impact des OEMs sur la peau saine ou fragilisée par le vieillissement chronologique, les souris seront utilisées à 3 âges différents : à l’âge jeune (15 mois). La durée maximale de la procédure sera de 20 semaines, et l’âge des souris les plus âgées ne dépassera pas 22 mois en fin de procédure.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome humain, des gavages quotidiens pendant trois semaines et des injections d'anticorps, pour tester une cible thérapeutique contre le mélanome métastatique. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que les métastases pulmonaires peuvent provoquer perte de poids et troubles respiratoires, la mise à mort intervenant à 2 cm³ de tumeur. Il vise une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la tumorigenèse.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que cibler une protéine exprimée de façon non conventionnelle par les cellules tumorales peut altérer la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour démarrer des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre la validation préclinique d'une nouvelle approche thérapeutique pour le mélanome cutané. Si les résultats obtenus confirment ceux des précédentes expériences in vitro, des essais de xénogreffes de tumeurs provenant de patients humains dans un modèle murin, pourront être envisagées. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d’immunothérapie lors d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.

Procédures

Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections se font sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections d'anticorps (2 fois par semaine, 100 microlitres) ou de produit luminescent (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages (1 fois par jour pendant 3 semaines maximum). L’introduction d’une aiguille pour les différentes injections entraine une légère douleur au point d’injection mais qui est brève. L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés notamment problèmes respiratoires liés aux métastases sur les poumons.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par un anticorps spécifique sur la croissance tumorale in vivo. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 200 réparti comme suit : 4 cohortes de 20 animaux injectés avec 4 lignées de cellules tumorales puis traités ou non avec l'anticorps et 3 cohortes de 40 animaux injectés avec 3 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec l'anticorps en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Les paramètres étudiés seront la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance et le développement des métastases pulmonaires. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes dont les cellules ont un potentiel d’invasion plus ou moins important. Leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique : il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires par différentes voies d'injection.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives que les mâles, elles seront hébergées en cohorte pour conserver l’interaction sociale. Les expérimentateurs établiront le contact avec les souris 8 jours avant le début de l’expérimentation les habituer à la manipulation et réduire leur angoisse. Les cages seront enrichies. Nous surveillerons quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine pour suivre la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. Nous adapterons la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées en fonction de la vitesse de croissance tumorale. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d’imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. La souris est un modèle reconnu dans la communauté scientifique pour la greffe de lignées cancéreuses humaines afin de tester des traitements potentiellement transférables en médecine humaine. Pour éviter le rejet des cellules humaines de mélanomes après injection, nous utiliserons des souris immunodéprimées NOD/SCID/IL2GammaR. Ces souris présentent un système immunitaire déficient et nécessitent des conditions d'élevage stériles. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétro-orbitale. La croissance tumorale ne devrait pas être impactée par l'âge des souris. Il est cependant préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes n'entravent pas leur capacité de mouvement.

1 155 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés et leurs mères allaitantes sont exposés pendant 14 jours à des concentrations variables d'oxygène pour reproduire la rétinopathie du prématuré, puis les ratons sont anesthésiés pour un examen de la rétine avant d'être tués pour prélever leurs yeux. Le porteur indique que les mères sont elles aussi mises à mort et signale des lésions cérébrales possibles sans surmortalité observée. Sur le remplacement, il affirme que la complexité de la rétine rend les études in vitro insuffisantes et l'animal "nécessaire".

Objectifs

La rétinopathie du prématuré est une des principales causes de cécité infantile. Son incidence est en augmentation en lien avec des changements de pratiques récents visant à administrer l’oxygène à une saturation plus élevée afin de favoriser la survie des grands prématurés. Cependant, l’excès d'oxygène est délétère pour la rétine immature du prématuré et un des principaux facteurs de risques pour le développement de la rétinopathie du prématuré. L’excès d’oxygène induit un stress oxydant qui conduit à un arrêt du développement de vaisseaux et à la mort de neurones de la rétine. De plus, plusieurs facteurs non associés à l’excès d’oxygène favorisent le développement de la maladie par l'intermédiaire d'un stress oxydant. Cependant, le lien entre certains de ces facteurs et la rétinopathie du prématuré n’a pas été clairement établi. Les traitements actuels de la rétinopathie du prématuré reposent sur des interventions invasives et/ou destructrices pour les tissus rétiniens intervenant de façon tardive dans le développement de la maladie et se limitent à diminuer le risque de cécité par décollement de rétine. Il n’existe aucun traitement pharmacologique préventif à l’heure actuelle. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle d'un ion métallique dans la physiopathologie de la rétinopathie du prématuré et l’effet bénéfique des molécules fixatrices de cet ion dans la prévention de la rétinopathie du prématuré et/ou dans la sévérité de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont importants pour plusieurs raisons. La rétinopathie du prématuré est l'une des principales causes de déficience visuelle dans la population pédiatrique. Sa prise en charge vise à lutter contre les complications tardives de la maladie, mais il n'existe actuellement aucun traitement pharmacologique préventif. Ce projet ouvrira des perspectives pour des études translationnelles visant à lutter contre le handicap visuel lié à la ROP. Nous espérons montrer 1) un lien entre une concentration élevée d'un ion métallique et la survenue et/ou la sévérité d’une rétinopathie du prématuré en utilisant un modèle animal répandu et connu pour mimer la pathologie du nouveau-né prématuré 2) un effet bénéfique des molécules fixatrices de cet ion dans la prévention de la rétinopathie du prématuré et/ou dans la sévérité de la maladie. • Les avantages à court terme comprennent une meilleure compréhension de la rétinopathie du prématuré ainsi que la détermination des cibles thérapeutiques potentielles dans cette maladie • Les bénéfices à moyen terme comprennent la traduction clinique des cibles thérapeutiques potentielles dans la rétinopathie du prématuré, ainsi que le développement de collaborations internationales dans le domaine. • Les avantages à long terme comprennent la réduction du handicap visuel lié à la rétinopathie du prématuré et les coûts économiques qui en découlent. Le coût estimé aux États-Unis pour un enfant déficient visuel suite à une rétinopathie du prématuré est d'environ 1 260 000 $ incluant les coûts directs et indirects (perte de productivité à l'âge adulte et perte de productivité parentale).

Procédures

Les expériences seront menées chez des ratons nouveau-nés, dont le développement rétinien postnatal est superposable à celui d’un bébé prématuré, grâce à un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène qui mime la rétinopathie de l’enfant prématuré. Des rongeurs nouveau-nés et leur mère allaitante seront soumis à des concentrations oscillantes d’oxygène, pendant 14 jours, avant de les ramener à l'air ambiant. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale une seule fois pour des examens de la rétine et de la fonction visuelle pendant 20 minutes, puisimmédiatement après ils seront euthanasiés pour l’analyse ex vivo des tissus rétiniens. Afin d'analyser les différentes phases physiopathologiques de la maladie trois temps seront étudiés: à 14 jours (1er phase), à 18 jours (2ème phase) et à 28 jours (phase de régression) après la naissance. L’administration des traitements étudiés sera faite par voie orale (gavage, 3-5 minutes), en injection intrapéritonéal (1-3 secondes) ou en injection périoculaire (1-3 secondes). En cas d'inefficacité de la voie péri-oculaire, des injections intraoculaires seront effectuées sous anesthésie générale (1-3 secondes), dans ce cas les animaux aurons 2 anesthésies générales. Il n'y aura pas de prélèvements sur animaux vivants. Aucune procédure chirurgicale n'est prévue.

Impact sur les animaux

Le modèle de rétinopathie induite par l'oxygène, consiste à exposer des rongeurs nouveau-nés et leur mère allaitante à des concentrations variables d'oxygène pendant 14 jours. Le retentissement sur l’état général des animaux est habituellement faible. Le modèle néonatal de supplémentation ionique n’a pas de retentissement sur l’état général des animaux. Il a été observé des lésions cérébrales mais ces lésions n’ont pas été associées à une incidence augmenté de mort, convulsions ou apnées. Les nuisances associées aux explorations in vivo et aux traitements administrés sont liées à la nécessité d’effectuer une anesthésie générale (douleur légère de courte durée due à a réalisation d’une injection intra-péritonéale). L’injection intraoculaire d’un agent thérapeutique est utilisé en pratique clinique courant chez les nouveau-née prématurés. Les effets indésirables sont rares : infection, cataracte, hémorragies.

Devenir

Les analyses seront effectuées sur les rétines ce qui nécessite de prélever les yeux en post-mortem. Cela implique que tous les animaux devront être euthanasiés par une méthode réglementaire afin d'effectuer ces prélèvements tissulaires. Les mères seront euthanasiées par une méthode réglementaire.

Remplacement

La rétine est un tissu complexe composé de nombreux types cellulaires qui fonctionnent en réseau, et interagissent en permanence avec les autres tissus oculaires et la circulation (vaisseaux rétiniens et choroïdiens). Des études in vivo dans des modèles animaux mimant la rétinopathie du prématuré humaine sont nécessaires afin d’établir une preuve de concept thérapeutique, car les études in vitro ne permettent pas de prendre en compte la multiplicité de ces interactions, ni la physiopathologie complexe de cette maladie. Le recours à l'expérimentation animale pour la recherche de traitements efficaces est justifié par les conséquences visuelles graves de la rétinopathie du prématuré. Nous avons prévu des analyses immunohistochimiques des rétines des fœtus humains après interruption de grossesse et chez des enfants prématurés afin de vérifier que nos observations chez l’animal sont concordantes avec les données chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux impliqués est de 989 ratons et 166 mères, soit un total de 1155 animaux. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum, sans toutefois grever la possibilité d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Nous avons ainsi calculé un minimum de n=5/ groupe pour des analyses comparatives. Pour minimiser le nombre d'animaux, les deux yeux d'un même animal seront utilisés pour les expériences ex vivo, ce qui divise par 2 le nombre d’animaux nécessaires. Afin d'éviter les doublons un seul œil/animal sera analysé par chaque technique en en immunohistochimie et en biologie moléculaire. Aussi, nous avons choisi de réaliser des coupes rétiniennes (à la place des montages à plat) permettant l'utilisation de plus d'anticorps par rétine pour explorer plusieurs marqueurs tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires. Le même groupe d’animaux témoins sera utilisé pour l’analyse de l’efficacité des différentes posologies ou voies d’administration des molécules chélatrices.

Raffinement

Les femelles gestantes seront reçues à l’animalerie au moins 8 jours avant la date présumée de mise bas pour leur permettre de s’acclimater, et hébergées en conditions stables et adaptées à l'espèce, en stabulation conventionnelle, avec un régime alimentaire spécial femelles gestantes/allaitantes. Les cages seront enrichies de nids végétaux. Afin de limiter stress, angoisse et douleur, les nouveau-nés seront manipulés lentement et doucement sous lampe chauffante. Les injections intrapéritonéale d’anesthésiantes seront effectuées en les contenant doucement dans la paume de la main. Ces anesthésies générales seront effectués lors des explorations in vivo et en cas d’effectuer des injections intraoculaires. Une anesthésie locale sera également effectuée en cas d’injection intraoculaire. Le comportement des ratons et de leur mère sera observé tous les jours. Dans le cas où les traitements ou explorations effectués seraient à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit/absence de réplétion gastrique, perte de poids, changement d’aspect physique, hypothermie, isolement) le traitement sera interrompu et le raton sera euthanasié.

Choix des espèces

Le développement rétinien de rongeurs à la naissance correspond à celui d’un enfant prématuré né vers 6 mois 1/2 de grossesse : la rétine est largement avasculaire et très susceptible à la rétinopathie du prématuré. Chez les rongeurs, l'angiogenèse rétinienne commence peu après la naissance, les capillaires superficiels atteignent les bords de la rétine 9 jours après, et la vascularisation rétinienne est terminée à 15 jours. Les différentes caractéristiques de la rétinopathie du prématuré peuvent être reproduites en exposant des rats ou des souriceaux nouveau-nés à une hyperoxie. Les rats et les souris sont donc particulièrement adaptés pour étudier l'angiogenèse rétinienne dans des conditions tant normales que pathologiques; la très grande majorité des modèles animaux de rétinopathie du prématuré utilisent ces espèces. Nous avons préféré d’utiliser les rats aux souris car grâce à la taille des yeux plus importante les injections des molécules est plus facilement effectué avec moins de complications pour l’animal. Les expériences utiliseront de ratons nouveau-nés de J1 à J28 postnatal. La fenêtre pour étudier le développement rétinien, dont l’angiogenèse rétinienne normale et pathologique, est courte chez le rongeur et correspond à la période post-natale immédiate. De plus, le stade de développement rétinien des rongeurs à la naissance correspond à celui d’un prématuré né à environ 6 mois 1⁄2 de grossesse. Il est possible de reproduire chez les rongeurs nouveau-nés des lésions de rétinopathie semblables à celles observées dans la rétinopathie du prématuré par hyperoxie.

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la patte des injections d'agents pro-inflammatoires comme l'adjuvant complet de Freund ou la formaline, puis leur douleur est mesurée par l'observation des léchages, morsures et secouements pendant quatre-vingt-dix minutes, et par le test des filaments de von Frey. Le porteur décrit ces modèles de douleur comme des standards de la littérature et indique vouloir confirmer in vivo le rôle d'un gène repéré sur des neurones en culture. Les retombées annoncées, des traitements contre les douleurs mécaniques de l'arthrose ou de la polyarthrite, restent une perspective.

Objectifs

Notre projet a pour but d’identifier des acteurs moléculaires impliqués dans la sensibilité mécanique douloureuse afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres liés à la perception exagérée des douleurs d’origine mécanique. Nous avons identifié des gènes candidats impliqués dans la transduction mécanique, i.e. la conversion des stimulations mécaniques en signaux biologiques, dans les neurones sensoriels dont font partie les neurones nociceptifs impliqués dans la douleur. Nous avons ensuite testé ces candidats in vitro et identifié un gène dont l'inhibition diminue significativement les réponses des neurones nociceptifs aux stimulations mécaniques. Nous voulons confirmer ces résultats in vivo en testant l’impact de ce gène sur la perception de la douleur par la réalisation de tests comportementaux. Ces tests seront réalisés en conditions inflammatoires (induites par injection d’adjuvent complet de Freund (CFA) ou de Formaline), qui sont des modèles de douleur établis dans la littérature scientifique, sur des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait être à l’origine du développement de traitement ciblant des types de douleurs mécaniques qui interviennent dans de multiples maladies et syndromes chroniques ou inflammatoires, telles que la polyarthrite rhumatoïde ou l’arthrose qui touche 10 millions de français.

Procédures

Les animaux recevront des injections d'agents proinflamatoires dans la patte ou dans la zone tibio-tarsale. Les animaux ayant reçu une injection dans la patte seront ensuite placés en box d’observation afin de mesurer la durée de comportements douloureux spontanés (léchage, morsure, secouements de la patte) sur une durée maximum de 90 minutes. Les animaux ayant reçu une injection dans la zone tibio-tarsale seront testés avec des fialments de von Frey aux jours 7, 10 et 21 post-injection afin de determiner leur sensibilité mécanique. Le test dure environ 15 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les modèles inflammatoires utilisés dans ce projet constituent les standards de ce type d'étude et sont très bien établis dans la littérature. Ils produisent des phénotypes de douleur légère ou modérée chez l'animal, ce qui est l'objectif du projet de tester l'implication du gène cible dans la douleur. Les procédures de test comportemental (box d'observation ou test de sensibilité mécanique) peuvent induire un stress limité chez l'animal, qui sera minimisé par les temps d'acclimatation.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car ne pouvant plus servir dans de nouvelles procédures. Un certain nombre d'animaux seront utilisés pour le prélèvement des ganglions rachidiens (DRG) pour l'enregistrement électrophysiologique in vitro.

Remplacement

La sensibilité / douleur mécanique et thermique ne peuvent s'évaluer in fine que sur des animaux vivants. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit donc dans la continuité de nos expériences et des résultats que nous avons obtenus in vitro.

Réduction

Réduction du nombre d’animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude est paramétré afin de pouvoir effectuer des tests statistiques afin d’observer des différences significatives sur les paramètres étudiés. Lors de la réalisation des protocoles, le maximum d’informations sera récolté afin de restreindre le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : le nombre de souris par cage respectera les directives européennes du 1er février 2013, sachant que le projet utilise de jeunes adultes entre 20 et 25g, nécessitant 70 cm2 par individus dans les cages, soit 5 animaux par cage de 374 cm2. Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des animaux permettra d’éviter la souffrance des animaux. Ils permettront de définir la nécessité d’un traitement symptomatique (analgésique, modification du protocole expérimental). Les expériences de comportement ont été choisies afin de limiter au maximum la contention de l’animal (animal libre de ses mouvements), et l’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes en cartonainsi que des nids de papier kraft (sizzle pad).

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris, du fait de l'existence de souris transgéniques dont le gène d'intérêt a été éteint (souris KO), et pour lequel les tests comportementaux évaluant la perception à la douleur d’origine mécanique et thermique sont établis et documentés dans la littérature scientifique. Nous pourrons ainsi déterminer l’effet spécifique de ces gènes dans la sensibilité mécanique et thermique dans des modèles de douleur. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 8 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ont ainsi fini leur croissance et présentent une sensibilité mécanique et thermique assez stable entre 6 et 8 semaines.

242 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles inhalent du styrène ou des isomères du xylène six heures par jour, cinq jours par semaine, pendant une à quatre semaines, et une partie subit une chirurgie du crâne pour implanter un système de contention à vis destiné à mesurer les mouvements oculaires, avant la mise à mort et le prélèvement des oreilles. Le porteur indique que les fortes concentrations peuvent déprimer le système nerveux et provoquer des effets narcotiques et des troubles de l'équilibre. Il présente l'étude comme la validation in vivo d'une toxicité déjà suggérée in vitro, en vue d'un éventuel test de criblage des polluants industriels.

Objectifs

Ce projet vise à étudier la potentielle toxicité de quatre solvants aromatiques présents dans l’industrie, le styrène et les trois isomères du xylène, sur l’organe périphérique de l’équilibre, le vestibule, situé dans l’oreille interne. Il s’agit également de comparer cette potentielle toxicité à celle décrite avec ces solvants sur la cochlée, organe périphérique de l’audition, également situé dans l’oreille interne.

Bénéfices attendus

La toxicité vestibulaire de certains solvants aromatiques a été suggérée précédemment par une étude in vitro. La présente étude permettra de valider (ou d’infirmer) ces informations grâce à une approche in vivo. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro, alors ce test pourra potentiellement être proposé comme test de criblage afin d’identifier les polluants industriels susceptibles de perturber l’équilibre des salariés.

Procédures

Les animaux seront exposés par inhalation à différentes doses de styrène ou d’un des 3 isomères du xylène. Cette exposition durera entre une et quatre semaines, à raison de 6 heures / jour, 5 jours par semaine. Afin de déterminer les effets de ces différentes substances sur l’oreille interne, l’audition et l’équilibre des animaux seront testées avant exposition, à la fin de l’exposition puis 4 semaines après. L’audition sera estimée par la mesure des produits de distorsion, une méthode non invasive utilisée pour le dépistage des surdités chez les nouveaux nés. Chez le rat, elle nécessite une anesthésie médicamenteuse légère. L’équilibre sera estimé par des tests comportementaux et par la mesure de la persistance des saccades oculaires après rotation (nystagmus post-rotatoire). Cette dernière mesure demande une contention de la tête, qui nécessite l’implantation à demeure d’un système de contention (pas de vis). Cette chirurgie crânienne est réalisée, une seule fois, 4 semaines avant le début de l’exposition. Chez la moitié des animaux, un prélèvement sanguin à la queue sera réalisé sous anesthésie gazeuse en sortie d’exposition. Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort et les oreilles prélevées pour observer les dommages causés par les expositions aux solvants.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront opérés afin de recevoir un dispositif de contention pour mesurer les mouvements oculaires. Afin d’éviter les douleurs post-chirurgicales, un antalgique morphinique sera délivré avant de réaliser l’anesthésie. Par ailleurs, il n’est pas exclu, que les animaux recevant une anesthésie par voie générale ou gazeuse, dans le but de réaliser des tests auditifs ou des prélèvements sanguins, ressentent du stress. Néanmoins, celui-ci devrait être mineur car les animaux sont habitués à être manipulés et les gestes sont opérés par du personnel qualifié. Les tests comportementaux, mais également la mise en rotation des animaux lors de la mesure des saccades oculaires, pourraient générer chez les animaux, pendant un court instant, un désagrément se traduisant par des troubles de l’équilibre. Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études sur l’animal et par des approches épidémiologiques en entreprise. En revanche, les effets de ces substances sur le vestibule (récepteur de l’équilibre), qui se trouve également dans l’oreille interne, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle de culture de l’organe récepteur, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. La présente étude se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène par inhalation. L’évaluation de la toxicité se fera par des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui permettront de comparer de manière objective les effets toxiques sur la cochlée et sur le vestibule. Des analyses histologiques seront également réalisées post mortem. Cette étude évalue donc la fonction de deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être appliquées que sur des organismes vivants. D’autre part, pour modéliser la toxicité de ces agents chimiques chez l’Homme, il est nécessaire qu’ils soient métabolisés par des organismes vivants

Réduction

La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures des saccades oculaires après rotation ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure des saccades oculaires après rotation et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques...). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie). Aucune expérimentation ne sera réalisée lors de la première semaine afin de laisser le temps aux rates de s’habituer à leur nouvel environnement. Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de réaliser les expérimentations pendant leur phase d’activité. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage pour permettre les liens sociaux de s’établir. Les animaux seront habitués à être manipulés en amont des expérimentations. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Ils seront hébergés en cage individuelle pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignées à cet effet.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle recommandé pour les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Des femelles ont été choisies pour réaliser les expérimentations car celles-ci grossissent moins avec l’âge que les rats mâles et le dispositif pour enregistrer le mouvement oculaire après mise en rotation de l’animal ne permet pas de faire ces mesures sur des animaux de plus de 300 g. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les enzymes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.