Organes sensoriels
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Effets d’une perte auditive sur les centres auditif et activation du système auditif à partir d’une stimulation ultra-sonore
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
310 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont une partie menée sous anesthésie sans réveil et d'autres impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Ils subissent des mesures de potentiels auditifs, l'induction d'une surdité par traumatisme sonore ou substances ototoxiques, et une chirurgie avec électrophysiologie pouvant durer jusqu'à douze heures. Le porteur indique que la surdité chronique s'accompagne de déficits vestibulaires et auditifs, et que la lourdeur de la craniotomie rend improbable la survie des animaux. Il affirme que le cobaye est l'espèce "de choix" en audition et que l'étude in vivo est "indispensable", la restauration de l'audition par ultrasons restant une preuve de concept lointaine.
Objectifs
La perte auditive s’accompagne de deux conséquences majeures. La première est que l’intelligibilité de la parole est altérée. Dans les cas de surdité sévère, l’intelligibilité de la parole est même nulle. La deuxième conséquence d’une perte auditive est un remaniement plastique des centres auditifs, ce dernier pouvant être associé à des perceptions aberrantes, telles que les acouphènes et l’hyperacousie. Le premier but de ce projet est de comprendre plus avant les mécanismes plastiques mis en jeu après une perte auditive et en particulier d’étudier les effets de différentes pertes auditives sur cette plasticité centrale (sur l’activité spontanée corticale, notamment). Le deuxième but de ce projet, qui est étroitement associé au premier, est d’étudier la possibilité de stimuler le système auditif à partir de stimulation ultra-sonore (SUS). Cet aspect du projet vise à confirmer que la SUS peut restaurer l’audition, en excitant directement les neurones du système auditif dans une préparation in-vivo, en court-circuitant la cochlée (qui n’est plus fonctionnelle). En outre, la SUS peut également servir à moduler l’activité neuronale spontanée.
Bénéfices attendus
…. Dans une vision à long-terme, le projet est important dans la mesure où la stimulation ultra-sonore pourrait restaurer l’audition chez des sujets sourds. Il s’agit donc d’une preuve de concept pour cette approche originale. On note ici que la SUS permet théoriquement de stimuler les neurones avec une résolution spatiale beaucoup plus importante que la stimulation électrique. La stimulation électrique est actuellement utilisée dans les implants cochléaires (et les implants du tronc cérébral). Si elle permet de restaurer une intelligibilité de la parole en milieu favorable (non bruité), elle échoue en revanche à donner de bonnes performances en milieu défavorable (bruité). Enfin, en permettant de stimuler directement le système auditif, la SUS permet également de tester directement les propriétés des neurones auditifs centraux, sans passer par la cochlée qui présente une perte auditive, voire qui ne joue plus son rôle de transducteur (surdité profonde). Les SUS offrent donc un moyen pour appréhender directement l’état d’excitabilité des neurones centraux après une perte auditive, autrement dit leurs réponses modifiées après mise en jeu d’une plasticité. En outre, la SUS permet a priori de moduler l’activité des neurones centraux. Cette approche pourrait être utilisée pour réduire ou supprimer l’activité neuronale reliée à l’acouphène et/ou à l’hyperacousie, et ceci de façon non invasive et inoffensive.
Procédures
Les animaux sont soumis à 3 types d’intervention : -potentiels évoqués auditif précoces : durée 30 minute environ -induction d’une surdité par traumatisme auditif ou administration de substances ototoxiques : durée de 1h à 4h - procédure chirurgicale et électrophysiologie : durée maximale pouvant aller jusqu’à 12h
Impact sur les animaux
…. Lors de l’hébergement des animaux à l’animalerie, ils ne subissent aucune nuisance particulière excepté un léger stress possible lors de leur manipulation (limitée au minimum). Lorsque les animaux sont utilisés pour les enregistrements électrophysiologiques corticaux, ils rentrent alors dans une procédure sans réveil et sont anesthésiés de bout en bout du protocole. Les manipulations avec réveil après anesthésie sont 1) le recueil des potentiels évoqués auditifs précoces et 2) la perte auditive chronique par ototoxicité. Le réveil après le recueil des potentiels évoqués auditifs précoces ne posent pas de problème, excepté des effets secondaires toujours possibles de l’anesthésie (déshydratation, détresse respiratoire) mais qui sont très rares. En revanche, les animaux traités par furosémide et kanamycine peuvent montrer plusieurs effets indésirables. Tout d’abord, l’injection intraveineuse par la jugulaire nécessite une chirurgie pour exposer la veine et peut potentiellement entraîner des hémorragies et infections. Deuxièmement, les animaux montrent des problèmes vestibulaires (troubles de l’équilibre, tête penchée, déplacements maladroits) pendant quelques jours après le traitement, qui sont liés à la destruction des cellules sensorielles du système vestibulaire. Ces problèmes sont cependant atténués au bout de 4-5 jours. Ces effets secondaires n’empêchent cependant pas les animaux de se nourrir. Enfin, la perte auditive peut engendrer des acouphènes chez l’animal. A ma connaissance, on ne sait pas si les acouphènes sont un facteur de gêne chez l’animal.
Devenir
Nous devons réaliser une craniotomie, la procédure chirurgicale est relativement lourde et nos expérimentations (électrophysiologie) sont très longues. Il est peu probable que les animaux survivent à ce traitement, et de surcroit sans souffrance. Pour ces raisons, tous les animaux sont mis à mort à la fin des 6 procédures.
Remplacement
Les recherches sur animaux vivants sont indispensables aux types de questions que nous posons. Concernant les effets de la stimulation ultrasonore, ce domaine de recherche est relativement récent et les mécanismes d’excitation peu connus. Il est donc indispensable de « passer » par de l’expérimentation chez l’animal pour comprendre plus avant les mécanismes de cette stimulation et si la stimulation sonore peut restaurer l’audition en cas de surdité. Des tests ont été réalisés en amont du projet (sur tranches de cerveau) pour déterminer les paramètres efficaces de la stimulation ultra-sonore et ainsi épargner des animaux. Concernant notre recherche sur l’effet de pertes auditives sur le système auditif central, nos travaux pourront en revanche « nourrir » les modèles computationnels futurs du cerveau et de ses modifications après une perte auditive de sorte que des vies d’animaux pourront être épargnées.
Réduction
Notre volonté est de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans notre projet est calculé au plus juste, en fonction de notre expérience, des contraintes expérimentales qui sont les nôtres, et des effets attendus, notamment sur l’état d’excitabilité des neurones corticaux après une perte auditive (calcul de puissance à partir des résultats déjà obtenus par notre équipe sur le cobaye). Il est important de noter que nous avons démontré par des expériences in vitro que les neurones du ganglion spiral sont sensibles aux ultrasons. Cela signifie que nous connaissons déjà les paramètres de stimulation nécessaires pour produire des réponses et que donc, moins d’animaux seront utilisés dans des expériences pilotes (pour balayer la gamme des paramètres de stimulation qui peut être conséquente). Après calcul de puissance, notre projet nécessitera 310 animaux au total.
Raffinement
Tout est mis en jeu dans notre projet pour minimiser la souffrance animale avec une utilisation systématique de l’anesthésie, doublée d’une analgésie locale avant chirurgie. Nous insistons sur le fait que toutes nos procédures sont maitrisées depuis plusieurs années et que la souffrance animale est minimisée. Les procédures 1, 2 et 4 sont sans réveil, ce qui minimise énormément les risques que les animaux souffrent (comparés aux préparations chroniques). Les procédures avec réveil sont les procédures 3 et 5 (surdité chronique). Une attention particulière sera donnée à ces animaux qui, comme dit précédemment, montrent des déficits vestibulaires et auditifs. Des aliments hydratés seront placés au fond de la cage et une surveillance quotidienne (2 fois par jour) durant les 5 jours suivant la chirurgie sera opérée. Nous utiliserons une échelle des points limites et engagerons si besoin la réaction adéquate en fonction de la situation.
Choix des espèces
Le cobaye est l’espèce de choix en audition (même si d’autres espèces sont utilisées) pour deux raisons. La première est que l’audition des cobayes (100 Hz – 32 kHz) est globalement déplacée d’une octave vers les hautes fréquences par rapport à l’audition humaine (50 Hz – 16 kHz). L’audition des cobayes est donc relativement proche de l’audition humaine. La deuxième raison est que l’oreille moyenne et en particulier la fenêtre ronde est aisément accessible chez cette espèce, permettant d’accéder facilement à la cochlée pour différentes applications (stimulation électrique ou ultrasonore de la cochlée, enregistrement de l’activité du nerf auditif, administration de substances ototoxiques etc.). En conclusion, pour les raisons listées ci-dessus, un grand nombre de laboratoires en audition dans le monde utilisent le cobaye. Les données disponibles chez cette espèce représentent donc la justification de l’utilisation de cette espèce pour nos recherches. Les animaux sont adultes et pèsent généralement autours de 250-300g à leur arrivée. Nous préférons réaliser nos expériences sur des animaux relativement jeunes mais matures car ils nécessitent moins d’anesthésie et sont donc plus stables lors de l’enregistrement de l’activité cérébrale.
Implication du récepteur TRPV1 dans l’inflammation cutanée liée au psoriasis chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1600 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par les établissements partenaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après tonte et dépilation sous anesthésie, un produit est appliqué sur leur dos jusqu'à vingt-quatre fois pour induire un psoriasis, avec des injections sous-cutanées et des pesées répétées. Le porteur attend une perte de poids pouvant atteindre 20 %, un érythème, une desquamation et un épaississement de la peau, et précise que l'élevage préalable conduit aussi à tuer les animaux non sélectionnés. Il affirme ne pas pouvoir se passer de l'expérimentation animale pour cette maladie multifactorielle.
Objectifs
Le psoriasis est une maladie pro-inflammatoire chronique et multifactorielle de la peau (démangeaisons, plaques inflammatoires, …), touchant 2 à 4% de la population française, principalement bénigne et actuellement sans traitement curatif définitif. Dans 20% des cas, des formes sévères sont relevées montrant l’augmentation des risques cardiovasculaires et métaboliques chez ces patients. Le récepteur TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloide 1) est un acteur majeur dans la perception et l’intégration des sensations douloureuses (nociception), et est impliqué dans l’inflammation des couches superficielles de la peau (épiderme externe et derme plus profond), dans de nombreuses maladies, mais son rôle précis au niveau vasculaire local et/ou dans les échanges entre les différents types cellulaires, n’est pas clairement démontré à ce jour. Aujourd’hui, parallèlement à des études pharmacologiques en biologie cellulaire (in vitro sur cultures cellulaires) ou par des analyses biochimiques et de biologie moléculaire sur organes isolés (ex vivo, explants de peau ou prélèvements tissulaires de patient), notre objectif est de caractériser in vivo l’implication du récepteur TRPV1 dans un modèle induit de psoriasis chez des souris génétiquement modifiées. Ce projet inclus 2 procédures expérimentales. La procédure 1, de sévérité legère, est une procédure d'élevage permettant de générer 3 nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées « Knock-Out tissu-spécifique », où l’expression du gène TRPV1, soit le complexe protéique constitutif du récepteur TRPV1 exprimé à la membrane cellulaire, est spécifiquement invalidée dans l’un des 3 compartiments cellulaires suivants : vasculaire (microcirculation vasculaire locale), épidermique (relations entre les cellules constitutives de l’épiderme) ou nerveux (relations entre cellules sensitives), et de sélectionner au maximum de 1600 animaux d’intérêt. Ces animaux seront tous inclus dans la procédure 2, de sévérité modérée, permettant d’induire un modèle psoriasique selon 3 modalités : très court terme / précoce – 3 jours, court terme / aigüe – 6 jours et long terme / chronique – 9 semaines. Au terme de l’induction du modèle pathologique, des analyses fonctionnelles et biochimiques permettront de caractériser finement l’implication du récepteur TRPV1 au niveau des 3 compartiments précédents, de proposer une nouvelle approche de développement de traitements du psoriasis et/ou des pathologies dermatologiques similaires.
Bénéfices attendus
Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif définitif, seuls des traitements symptomatiques aux résultats transitoires sont proposés aux patients étant atteint d’un psoriasis. L'idée novatrice de ce projet est d'étudier l'implication fine du récepteur TRPV1 et de le placer au centre de la dérégulation de l'équilibre homéostatique (constantes fonctionnelles régulées et maintenues à des valeurs bénéfiques pour l’organisme), incluant l'ensemble des acteurs, et d'identifier si possible le site d'inflammation privilégié (épithélial, neuronale, vasculaire) permettant d'envisager une possible nouvelle voie de développement d’un traitement diminuant le nombre et l’intensité des poussées.
Procédures
Les souris issues des 3 nouvelles lignées KO tissu-spécifique TRPV1, soit au maximum 1600 animaux, obtenues par la procédure 1 – élevage et obtention des 3 lignées de souris LoxP-Cre Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, seront incluses dans la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris et seront donc soumises à 3 types d’interventions : I – en amont du protocole d’induction (procédure 2), chaque souris sera tondue et dépilée (crème VEET « peaux sensibles »), sous anesthésie gazeuse ; intervention réalisée 1 fois et d’une durée maximale de 5 minutes, II – durant le protocole d’induction (procédure 2), chaque souris vigile recevra une application externe / topique de Vaseline® (condition contrôle) ou d’Aldara™ 5% (condition induite), sur la zone dépilée ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce – 3 jours », 5 fois pour la modalité « aigüe – 6 jours » et 24 fois pour la modalité « chronique – 9 semaines » et d’une durée de moins de 5 minutes, III – Durant la procédure 2, chaque souris vigile recevra une injection sous-cutanée préventive de NaCl 0,9% (300µL), après contention manuelle, pour limiter déshydratation générale liée à la procédure d’induction ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce », 3 fois pour la modalité « aigüe » et 6 fois pour la modalité « chronique », d’une durée d’environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont : I – du stress lors des pesées régulières (entre 2 et 7 fois par semaine, durée inférieure à 30 secondes) diminuant avec l’habituation, II – du stress lors des anesthésies gazeuses générales de préparation (tonte, dépilation) des animaux en amont de l’induction du modèle, de faible intensité (maximum 5 minutes), III – du stress et de l’inconfort lors des manipulations des animaux vigiles pour induire le modèle (application dorsale de crème, injection sous-cutanée préventive, observations comportementales, …), de faible intensité, et se réduisant avec l’habituation à la répétition journalière des opérations (5 minutes par animal et par jour), IV – une perte de poids corporel transitoire, attendue durant les premières 48 heures après début du traitement d’induction et pouvant atteindre 20% maximum, due à une déshydratation générale, soit d’une intensité modérée (maximum durant une semaine), V – L’apparition des « symptômes » induits, caractéristiques du psoriasis (rougeur / érythème, desquamation, épaississement cutané), d’intensité faible à modérée (durée totale de l’expérimentation) et VI - du stress lors de la réalisation des transferts des animaux vers nos partenaires (préparation, conditionnement, nouvel environnement transitoire, vibrations lors du transport, …), de faible intensité, sur 24-48h.
Devenir
Ce projet comporte 2 procédures expérimentales. Lors de la procédure 1 – Elevage et obtention des 3 nouvelles lignées de souris Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, l’apparition éventuelle d’un phénotype dommageable mettrait fin au projet et l’ensemble des animaux seraient mis à mort. Les animaux présentant les génotypes d’intérêt, ainsi que les géniteurs d’intérêt pour la cryoconservation de leurs gamètes, seront gardés en vie. Les animaux non-sélectionnés seront mis à mort. Les animaux sélectionnés en procédure 1, intègreront la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris, où ils seront transférés immédiatement vers nos partenaires (modalité « précoce – 3 jours » et « aigüe – 6 jours ») ou intègreront la modalité « chronique – 9 semaines », où ils débuteront le protocole d’induction du psoriasis, avant d’être transférés, à leur tour, vers nos partenaires, qui se chargeront de finaliser l’induction et de réaliser les expérimentations finales, puis mettrons à mort l’ensemble des animaux. Ils seront donc tous conservés en vie dans notre établissement.
Remplacement
Le psoriasis est une maladie multifactorielle, dont la physio-pathologie implique différents intervenants et composantes au sein de la peau (vasculaires, nerveux, barrière cellulaire, …), ne pouvant être reproduits et étudiés uniquement par le développement de modèles cellulaires et/ou l’utilisation de méthodes alternatives. Nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale et de la mise en place de protocoles in vivo pour prendre en compte l’ensemble de ces aspects.
Réduction
L’ensemble du projet a été conçu afin de réduire au maximum le nombre d’animaux sans compromettre l’interprétation statistique des résultats. De par la variabilité interindividuelle dans les tests fonctionnels finaux, nous devons inclure 20 animaux par double analyse fonctionnelle pour obtenir des résultats robustes. Si les variations des résultats expérimentaux sont « significatives », nous envisagerons de réduire le nombre d’animaux par groupe et ainsi diminuer le nombre global d’animaux nécessaire. De plus, nous limiterons le nombre de groupes « contrôle » dans les 3 modalités d’induction du modèle (précoce - 3 jours, aigüe - 6 jours, chronique - 9 semaines), en utilisant les animaux contrôles de la modalité d’induction « aigüe - 6 jours » pour la réalisation des analyses de la modalité « précoce - 3 jours ».
Raffinement
Les responsables du projet s’assureront du bien-être de l’ensemble des animaux au quotidien, par la réalisation d’observations comportementales et d’évaluations du poids corporel, au minimum 2 par semaine. Si nécessaire et en suivant une échelle de cotation adaptée, les responsables prendront en charge la gestion de la douleur ou du mal-être par une analgésie adaptée, et si un point limite est atteint, pratiqueront la mise à mort immédiate de l’animal concerné.
Choix des espèces
L’utilisation de souris comme modèle d’étude in vivo est courant en immuno-dermatologie. Son système immunitaire, humoral et cellulaire est largement décrit depuis de nombreuses années et font référence, ce qui nous permettra d’expérimenter sans avoir recourt à des espèces de mammifères plus proches de l’homme. Dans notre contexte, il nous semble d’autant plus pertinent d’induire un psoriasis sur cette espèce, car, commercialement, nous pouvons obtenir des animaux génétiquement modifiés d’intérêt (mutant KO total TRPV1, souris LoxP-TRPV1, souris Cre-tissu spécifique), et créer des souris Cre-LoxP KO spécifique TRPV1 par les méthodologies d’inactivation Cre-LoxP développées dans les années 2000. Le modèle inductible d’inflammation cutanée / psoriasis est documenté depuis plus de 10 ans, utilisé par de nombreuses équipes mondialement et nos partenaires sont rompus à son utilisation. Les 3 nouvelles lignées produites permettront de caractériser l’implication du récepteur TRPV1 au sein de 3 compartiments cellulaires impliqués dans le psoriasis induit chez la souris. Le psoriasis touche l’ensemble de la population, du jeune à l’adulte, avec un pic d’apparition de la maladie chez l’homme se situant entre 20 et 30 ans. Notre étude souhaite évaluer les phases précoces d’apparition du psoriasis, puis l’installation de la pathologie à court terme (phase aigüe) et l’évolution à long terme (phase chronique) dans un modèle induit de dermatite psoriasiforme chez la souris. Nous utiliserons donc des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et dont le poids variera entre 20 et 30g au moment de débuter le protocole d’induction du modèle.
Mesure par IRM de la présence des désordres auditifs dont les acouphènes sur les dispositifs pré-cliniques chez les rongeurs EU2/2
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 200
200 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection de manganèse à travers le tympan puis une IRM d'une heure et demie, pour mettre au point une imagerie des acouphènes servant à tester des candidats médicaments. Le porteur signale un inconfort de l'oreille après l'injection et indique que les animaux sont tués juste après l'IRM parce que le manganèse, toxique à forte dose, est incompatible avec leur maintien en vie. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de mesurer les acouphènes chez l'animal.
Objectifs
Développer des techniques IRM comme marqueur des acouphènes chez le rongeur en vue de développer et tester des médicaments traitant ce trouble.
Bénéfices attendus
Consolidation scientifique de cette technique d’imagerie pour évaluer l’efficacité de candidat médicament sur les acouphènes.
Procédures
Tous les animaux vont subir une imagerie IRM pendant 1h30 maximum.
Impact sur les animaux
Inconfort au niveau de l'oreille après l'injection trans-tympanique du manganese.
Devenir
Les animaux sont tous euthanasiés en fin de procédure afin d'éviter les effets du marqueur nécessaire pour détecter les acouphènes (MnCl2). Une forte dose de MN2+ peut produire de signes cliniques qui représentent des points limites, donc l'incompatibilité avec le maintien des animaux au-delà de l'acquisition IRM.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour mesurer la présence d'acouphènes chez l'animal et l'activité cérébrale in-vitro. Il reste nécessaire de vérifier l’efficacité des principes actifs avant de poursuivre le développement chez l'Homme.
Réduction
Le développement d’une technique IRM du sodium permettra à l’avenir de garder les animaux dans le temps. Cette technique sera complètement non invasive et permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés en les gardant pour qu’ils puissent être leurs propres contrôles dans le temps.
Raffinement
Nous avons choisi d'utiliser l'IRM comme methode quantitative de mesure des acouphènes afin d'éviter une approche par électrophysiologie neurochirurgicale avec l'implantation d'électrodes dans le cortex auditif. Cette méthode, moins invasive, ne nécessite pas un point limite associé à la technique de'IRM en elle même. Les animaux sont euthanasiés directement après la mesure IRM sans réveil après l'IRM. L'approche de l'anesthésie sous isoflurane, nous permet de conserver une anesthésie constante et régulière pour éviter le stress d'un réveil de l'animal. Nous conservons les animaux sur un plateau chauffant à température nécessaire pour éviter l'hypothermie de l'animal.
Choix des espèces
Le modéle des acouphénes chez le rat et la souris est validé dans la litérature. Selon les données préliminaires de pharmacologie obtenues sur le traitement des acouphénes, le choix de l'espace s'orientera vers la souris ou le rat. Les animaux utilisés sont des adultes avec une oreille interne complètement formée et fonctionnelle. Cela implique l’utilisation d’animaux âgés au minimum de 4 semaines.
Evaluation in vivo de nouveaux composés sur l’hypertension intraoculaire dans un modèle de glaucome chez le lapin
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur injecte dans un œil, puis dans l'autre une semaine plus tard, une solution salée concentrée qui fait monter la pression intraoculaire pendant près de quatre heures, pour tester des molécules candidates contre le glaucome. Le porteur mesure la pression au tonomètre et pose un cathéter dans l'artère de l'oreille pour des prises de sang, et affirme que la hausse de pression 'ne devrait pas' provoquer de douleur. Il décrit l'œil du lapin comme le 'modèle de référence' et conclut qu'aucune méthode in vitro ne peut le remplacer.
Objectifs
L'objectif du projet est de tester chez le lapin les effets de nos molécules sur une hypertension intraoculaire transitoire provoquée par une injection dans l'oeil d'une solution saline hypertonique.
Bénéfices attendus
La cause principale du glaucome (diminution irréversible du champ visuel, 2ème cause de cécité) est une augmentation de la pression intraoculaire à l’origine de la destruction des cellules du nerf optique. Les traitements existants (bêta-bloquants, analogues des prostaglandines…) ont une efficacité limitée et peuvent présenter des effets indésirables. Ainsi, le bénéfice attendu de ce projet est le développement d’une nouvelle classe thérapeutique pour traiter le glaucome qui touche plus de 800 000 personnes en France.
Procédures
Les lapins vont recevoir sous anesthésie locale une injection d'une solution saline concentrée dans un seul oeil qui va être à l'origine d'une augmentation de la pression dans le globe oculaire. Cette augmentation de pression intraoculaire va durer moins de 4 heures. Plusieurs mesures de la pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre vétérinaire vont être effectuées : 5 avant l'injection et 6 durant les 4 heures suivant l'injection. Ces mesures sont non invasives et indolores. Le lapin recevra avant l'injection intraoculaire une administration (par gavage, par application locale sous forme de collyre, par injection intrapéritonéale) des molécules à tester. Après une semaine de récupération, une autre session pourra être réalisée en utilisant le 2ème oeil. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à des fins de pharmacocinétique. Un cathéter sera mis en place au niveau de l'artère centrale de l'oreille. Sur une durée de 24 heures maximum, pas plus de 8 prélèvements de 1 mL seront effectués.
Impact sur les animaux
Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -Le stress lié à la contention et à la réalisation des mesures de pression intraoculaire (geste non invasif et non douloureux) : pour limiter cet effet, les animaux auront une période d’habituation à la préhension, manipulation des yeux et des mesures de pression -L’augmentation de la pression intraoculaire : selon la technique utilisée, l’augmentation de la pression devrait être modérée (aux alentours de 40 mmHg) et ne devrait pas générer de douleur. Cependant, nous avons mis en place un protocole de suivi et d’identification de points limites permettant de mettre en place un traitement en cas d’apparition de douleurs ou d'anomalies oculaires.
Devenir
Après que chaque œil a fait l’objet d’une injection intraoculaire de solution saline hypertonique, les animaux sont mis à mort. En effet la procédure ne peut pas être répétée plusieurs fois sur un même œil. De plus au sein du laboratoire ces lapins ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.
Remplacement
L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de nouvelles molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. De plus il n’existe pas actuellement de méthode alternative.
Réduction
L'amplitude et variabilité des réponses obtenues sur le(s) paramètre(s) d'intérêt selon des résultats précédemment publiés indiquent un effectif compris entre 5 et 8 lapins par groupe expérimental comme étant raisonnable et suffisant pour effectuer une analyse statistique pertinente des données. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, l'expérimentation sera réalisée sur un oeil puis sur l'autre oeil du même lapin à une semaine d'intervalle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés individuellement à leur arrivée jusqu’au jour de l'expérimentation. Pour le bien-être des animaux et limiter le stress inhérent à cette espèce, nous veillons à mettre à disposition dans les cages d’hébergement une balle en plastique, une buchette à ronger et une hutte en polycarbonate rouge dans laquelle le lapin peut venir se réfugier s’il ressent le besoin de s’isoler. Du foin est mis à disposition de manière journalière ce qui permet de créer un contact régulier avec le lapin et de le familiariser avec l'expérimentateur. Sans traitement particulier, les animaux ne doivent pas présenter de signes de douleur à ce stade expérimental. Toutefois, le personnel zootechnicien est sensibilisé pour communiquer directement à l’expérimentateur tout comportement « suspect » d’un animal anxieux, soit observé durant la période d’acclimatation (un animal qui tape systématiquement fortement du pied lors d’une entrée dans la pièce ou lorsque l’on s’approche près de sa cage), soit le jour même de l’expérimentation au moment de sa manipulation pour la sortie (comportement excessif de fuite, vocalisation…). Une semaine avant l'injection intravitréenne, des mesures journalières de pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre seront effectuées afin de familiariser l'animal avec le dispositif et l'expérimentateur. Les mesures de la pression intraoculaire sont effectuées à l'aide d'un tonomètre "à rebond" qui n'engendre aucune souffrance chez l'animal. Chaque mesure de la pression intraoculaire sera associée à une récompense (friandise "mini treats" goût fruité, Plexx, Hollande). La souffrance liée à l'injection intravitréenne d'une solution saline hypertonique va être limitée par l'administration sous forme de gouttes d'un anesthésique local chez un lapin au préalable sédaté.
Choix des espèces
Les modèles in vitro modélisant la chambre oculaire et la physiopathologie des hypertensions oculaires ne permettent pas de tester les efficacités des molécules thérapeutiques. L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. L'expérimentation sera réalisée sur des lapins adultes. Le glaucome est une pathologie apparaissant avec l'âge, il n'y a aucune raison de travailler sur des individus en cours de développement.
Rôle des récepteurs PIR-A et PIR-B dans la pathogénèse de la DMLA et de l’Uvéite dans des modèles expérimentaux murins
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une uvéite ou une inflammation sous la rétine par injections et photocoagulation au laser sous anesthésie, avec un suivi par imagerie de l'œil, pour étudier deux récepteurs immunitaires dans la DMLA et l'uvéite. Le porteur qualifie l'atteinte visuelle de légère au motif que la vision ne serait pas 'indispensable à la souris pour se déplacer'. Il affirme que ces mécanismes d'inflammation ne peuvent être étudiés que dans un 'organisme entier'.
Objectifs
La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une maladie de la rétine provoquée par une dégénérescence progressive de la macula, partie centrale de la rétine. Il existe deux formes de DMLA : atrophique et exsudative. Les traitements existants permettent seulement de ralentir l’évolution de la formation et la croissance de nouveaux vaisseaux et donc uniquement la forme humide de la pathologie alors qu’aucun traitement n’est disponible pour la forme sèche de la DMLA. Les uvéites sont des maladies inflammatoires oculaires d’étiologie diverse, principalement auto-immune, pouvant être très invalidantes voire cécitantes, généralement traitées par des corticoïdes responsables de nombreux effets secondaires au long cours. Les causes précises de ces maladies ne sont pas connues et les mécanismes peu compris. Cependant, dans ces 2 pathologies, un processus inflammatoire est présent, caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Notre projet vise à étudier le rôle de 2 récepteurs surexprimés sur les macrophages activés qui infiltrent la rétine au cours de ces pathologies oculaires : les « paired Ig-like receptors » PIR-A et PIR-B.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'évaluer le rôle des récepteurs PIR-A et PIR-B comme potentiels cibles thérapeutiques chez l’Homme dans le traitement de l’inflammation liée à l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine.
Procédures
Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis aux interventions suivantes afin modéliser une uvéite expérimentale ou une inflammation sous-rétinienne. Toutes les injections (1 injection par animal) sont rapides (moins d’une minute). La photocoagulation laser dure moins de 5 minutes par animal sous anesthésie générale. Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). Le suivi de l’évolution de l’inflammation est réalisé sous anesthésie générale par des actes non invasifs (donc pas de douleur ou de détresse) : imagerie rétinienne (fond d’œil – 5 min - quotidiennement 5 fois par semaine pendant 3 semaines, soit 15 examens au maximum) et OCT (tomographie en cohérence optique – 5 min - 1 fois par semaine pendant 3 semaines, soit un maximum de 3 examens par animal). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie de l’animal par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet. La totalité des procédures sont de gravité légère. Les modèles expérimentaux n’entraînent seulement qu’un phénotype léger : nuisance visuelle mais vision non indispensable à la souris pour se déplacer. Aucune douleur perceptible n’est à prévoir. Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie).
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’études des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Dans nos études nous nous intéressons aux mécanismes d’inflammation sous-rétinienne qui impliquent l’interaction de nombreux types cellulaires qui ne peut être étudié qu’au sein d’un organisme entier et ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.
Réduction
Les souris PIRA et PIRB KO seront étudiées en comparaison avec des souris sauvages dans des modèles d’inflammation sous-rétinienne. Nous devons induire plusieurs expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot (sévérité de l’inflammation plus ou moins importante). Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 10 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables.
Raffinement
Les animaux auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation et seront hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Pour éviter toute souffrance ou détresse animale, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lorsque nécessaire. Nous avons fixé des points limites appropriés au-delà desquels des mesures sont prises pour minimiser ou arrêter le processus faisant souffrir ou stresser l’animal. Tout signe d’inconfort, de détresse, ou de comportement anormal fera l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lors de chaque manipulation, un gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant les anesthésies.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour la l’inflammation liée à l‘accumulation de cellules immunitaires dans l’espace sous-rétinien. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée les modèles PIRA et PIRB. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale, âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel l’animal est susceptible de développer la maladie.
Caractérisation d’un modèle souris knock in pour la myopathie myotubulaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système urogénital
32 souris vont être utilisées dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère. La plupart sont tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, seules les femelles porteuses de la mutation étant gardées pour entretenir la lignée. Ces souris knock-in reproduisant une myopathie myotubulaire subissent des tests répétés de force musculaire, dont un où l'expérimentateur tire sur la queue de l'animal agrippé à une grille, puis une mesure terminale des propriétés du muscle sous anesthésie sans réveil. Le porteur décrit une faiblesse musculaire et un poids réduit dès cinq semaines, et affirme que la souris est la 'seule espèce' assez proche de l'humain pour ces mesures.
Objectifs
La myotubularine (MTM1) est une protéine qui est mutée dans une maladie musculaire sévère appelée myopathie myotubulaire. Seuls les patients mâles sont atteints par cette myopathie ; ils présentent une faiblesse musculaire généralisée et des déficiences respiratoires. Plus de 60% d' entre eux ne survivent pas plus de 2 ans. Le but de cette étude est de comprendre plus en détails cette maladie à l' aide d 'un nouveau modèle souris qui possède une mutation importante pour le fonctionnement de la protéine MTM1. Une meilleure connaissance de cette fonction essentielle nous permettra de mieux comprendre cette myopathie et potentiellement de pouvoir proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Bénéfices attendus
Par cette étude nous envisageons d’évaluer les conséquences fonctionnelles, cellulaires et biomoléculaires de cette mutation sur la maladie, dans un nouveau modèle de souris pour la myopathie myutubulaire. Ainsi, une caractérisation globale sur des aspects comportementaux, physiologiques, biomoléculaires et histologiques nous permettrons de mieux comprendre la maladie et de mieux évaluer les effets de la maladie.
Procédures
Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à savoir: 1.Mesurer la force du corps: test réalisé à raison de trois essais d'une minute par souris avec quinze minutes de pause entre chaque essai. 2. Mesurer la force des pattes (sur 2 ou 4 pattes): trois essais par souris avec un temps de repos de quinze minutes entre chaque essai. 3. Mesurer la position des pattes pendant le déplacement: test effectué une fois par semaine. 4. Evaluation de l’activité locomotrice: ce test se déroule sur 2 heures. 5. Mesure de la position des pattes pendant la marche (l’angle des pattes et la longueur des pas): ce test durera une minute au maximum. Les 5 tests cités precédemment seront réalisés une fois par semaine à partir de l âge de 4 semaines et jusqu' à 8 semaines car des données préliminaires ont montré une faiblesse musculaire dès l 'âge de 5 semaines. 6. Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ qui est une procédure expérimentale sans réveil: les souris seront anesthésiées par injection intrapéritonéale d 'un anti douleur et d 'un mélange d'anesthésiques pendant cinq secondes environ. La durée totale de cette procédure sera au maximum d 'une heure.
Impact sur les animaux
Pour cette étude , nous utiliserons un modèle atteint de Myopathie myotubulaire (MTM1). Cette souris développe une faiblesse musculaire et peut montrer des difficultés de locomotion qui apparaissent vers 5 semaines d' âge en moyenne. Ces animaux mutants ont également un poids corporel inférieur aux animaux contrôles (données préliminaires de nos collaborateurs). Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants: pour la mesure de la force du corps, la souris reste accrochée sur une grille retournée pendant maximum 1 minute. Pour la mesure de la force des pattes, l'expérimentateur tire progressivement sur la queue de l'animal agrippé sur la grille du dynanomètre afin d'obtenir la force développée par la souris. Pour les tests de position des pattes et de l activité locomotrice, il n y a pas de nuisance hormis la manipulation de la souris. Ces différents tests peuvent cependant générer du stress physique chez l animal. La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ est réalisée sous anesthésie par une injection d 'anesthésiques et d 'anti douleur , ce qui nécessite de manipuler la souris. Ce dernier test est sans réveil, à la fin de l'expérimentation les animaux sont mis à mort puis les différents muscles et organes sont prélevés pour des analyses ultérieures.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour ce qui concerne les tests de phénotypage. . La dernière expérimentation qui est "sans réveil" consiste à mesurer les propriétés contractiles musculaires in situ sous anesthésie. A l'issue de cette procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever des organes pour de futures expériences. Cela concerne l'ensemble des animaux qui serviront à caractériser la lignée soit 24 animaux. Pour l 'évaluation des symptomes des souris malades, les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car il s 'agit d' une étude pilote, sauf les femelles porteuses de la mutation qui pourront ête réutilisées pour le maintien de la lignée. Pour le suivi des animaux géniteurs, nous conserverons uniquement les femelles porteuses de la mutation et les mâles WT pour de futurs nouveaux croisements de maintien de la lignée, les autres génotypes produits ne seront pas utilisables pour ces croisements et seront donc euthanasiés.
Remplacement
Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse (myotubularine) dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et de précédentes études montrent que 12 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Seuls les animaux mâles seront étudiés soit 24 souris au total pour cette étude (caractérisation de la lignée). Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer la dommagibilité de cette lignée, à savoir 8 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles mutants et femelles porteuses de la mutation.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène MTM1, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la myopathie myutubulaire. Les symptômes de faiblesse musculaire liés à cette mutation ponctuelle apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 5 semaines (données préliminaires de nos collaborateurs) et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette myopathie. Les souris mâles seront utilisées lors des tests de comportement afin d'évaluer la progression des symptômes (entre 4 et 8 semaines d âge). Ces mesures ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements dans des modèles de dégénérescence de la rétine chez la souris ou le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 396
1 452 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection d'iodate de sodium détruit leur rétine pour reproduire une dégénérescence comme la DMLA, puis des molécules candidates leur sont administrées par diverses voies, avec des tests comportementaux mesurant la baisse d'acuité visuelle, avant prélèvement des yeux. Le porteur mène ce criblage pour développer des médicaments et renvoie l'usage chez l'humain à une éventualité. Il qualifie le recours à l'animal de 'stricte nécessité' et d''indispensable', affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit un 'organisme entier'.
Objectifs
Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie in vitro et/ou in vivo, de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de maladies ophtalmologiques avec la mise en place d’un modèle animal de dégénérescence de la rétine chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la baisse d’acuité visuelle et la dégénérescence rétinienne.
Bénéfices attendus
Ce projet se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de molécules thérapeutiques pouvant avoir un effet sur la dégénérescence de la rétine comme observée dans la DMLA ou la maladie de Stargardt. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.
Procédures
tous les animaux subiront une injection systémique de sodium iodate (sauf le groupe 1, sérum physiologique) pour induire la pathologie. l'injection sera unique et se fera par voie intra-péritonéale sur animal vigile. les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 1 mois après l'induction du modèle). selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale ou par voie topique, sur animal vigile. tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Des tests comportementaux pour mesurer l’acuité visuelle seront également réalisés : une fois avant le début des traitements mais après l’injection de sodium iodate afin de confirmer l’induction du modèle et/ou de procéder à l’allocation des groupes (durant la 1ère semaine), puis jusqu’à 1 fois par semaine pendant 4 semaines après l’injection de sodium iodate soit 4 fois maximum pour la durée d’une étude (voir figure en annexe). Le premier type de test dure 5 minutes maximum et chaque animal est testé jusqu’à 10 fois avec un intervalle de 5-10 minutes entre chaque test. Le deuxième type de test dure environ 5 secondes et le test est répété trois fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque répétition.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction du modèle, les animaux vont avoir une diminution de l'acuité visuelle (visible par les tests comportementaux mis en place) qui est liée à une dégénérescence de la rétine sans autre effet indésirable attendu aux doses administrées. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) ni aux tests comportementaux (procédure légère pour tester l’acuité visuelle).
Devenir
euthanasie pour récupérer différents organes, dont les yeux, pour analyses histologiques ou autre
Remplacement
Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ces modèles in vivo permettent de mesurer l’acuité visuelle en reproduisant la physiologie d’un organisme entier. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 6 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (kruskal-wallis test).
Raffinement
Les animaux seront sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement: les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Si les signes persistent au bout de 24h, l’animal sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié.
Choix des espèces
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir en ophtalmologie implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers notre modèle reproduisent au mieux la pathophysiologie de la dégénérescence de la rétine humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’acuité visuelle ou l’histologie de l’oeil, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.
Essai d’une thérapie cellulaire chez le rat avec des précurseurs de photorécepteurs édités génétiquement
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
295 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent sous anesthésie une injection sous-rétinienne de photorécepteurs issus de cellules souches humaines, puis des examens d'imagerie, des électrorétinogrammes et des tests comportementaux de la vision. La mise à mort permet des analyses de la rétine. Le porteur affirme que l'évaluation d'une récupération visuelle ne peut se faire qu'in vivo et décrit une piste thérapeutique pour des cécités aujourd'hui irréversibles.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’un canal ionique. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines, appelées cellules iPS. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une perte visuelle provoquée par une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules modifiées après transplantation. L’utilisation de cellules rendus artificiellement sensible à la lumière vise à contourner les difficultés rencontrées par différents groupes, et rapportées dans différentes études, d’obtenir une restauration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire humaine de ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont obtenu un certain succès en termes de survie et d’intégration dans le tissus-hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d’édition du génome qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante. Les bénéfices attendus sont donc une restauration au moins partielle de la vue chez les animaux modèles aveugles. Ces résultats pourraient permettre à terme de proposer à des patients souffrant de cécité irréversible une thérapie visant à rendre au moins partiellement la vue ; les seuls traitement disponibles à l’heure actuelle permettent au mieux un ralentissement de la perte visuelle avant la cécité complète.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de cellules en suspension (2 groupes pour deux types de cellules différentes), ou de solution tampon (1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisé une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (survie cellulaire ; différenciation et intégration aux tissus de l’hôte ; réponse à la lumière des cellules transplantées ; reconnexion avec les autres types cellulaire ).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 295 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30% (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec éléments d’enrichissement pour toute la durée du protocole ; nourriture et abreuvement à volonté. Les procédures prévoient une surveillance de leur état physique général (et particulièrement du système oculaire). Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue pour certains examens (imagerie, ERG) les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant ces différents actes. Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou une douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique puis un anti-inflammatoire non stéroïdien à durée d’action longue. Les signes de comportement anormal, signe de possible souffrance, seront également surveillés. Les points limites adaptés sont définis de manière adaptée aux procédures mises en œuvres et inclus une surveillance de l’état physique et comportemental de l’animal. L’observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal selon les méthodes adaptées et réglementaires.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.
Evaluation de la fonctionnalité de substitut de peau greffé chez le rat Nude
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
20 rats, 10 mâles et 10 femelles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit sous anesthésie un prélèvement de peau sur toute l'épaisseur du dos puis une greffe de substitut cutané, avec des changements de pansement deux fois par semaine et un hébergement en cage individuelle. L'objectif est de transposer chez le rat un modèle déjà mené chez la souris, pour préparer des études destinées à des substituts cutanés pour grands brûlés et ulcères diabétiques. Le porteur affirme que le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n'est pas envisageable pour caractériser la greffe sur un temps prolongé.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de transposer un modèle de greffe classiquement utilisé chez la souris chez le rat et d’évaluer la fonctionnalité d’un substitut cutané précédemment évalué chez la souris , afin d’envisager d’utiliser par la suite ce modèle de rat greffé pour la réalisation d’études de biodistribution et de tumorigénicité. Ces études sont requises selon les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain et les lignes directrices de l’Agence Européenne du Médicament pour les médicaments à base de cellules souches. Le substitut cutané sera greffé après induction d’une plaie cutanée chez le rat. Cela nous permettra de comparer les résultats obtenus chez des rats mâles et femelles et également de comparer ces résultats avec ceux obtenus lors des études effectuées chez la souris avec un substitut cutané identique. Des analyses identiques à celles effectuées au cours des études menées chez la souris permettront de caractériser la fonctionnalité du substitut cutané évalué et de valider ou non le modèle de greffe chez le rat . Cette étude de faisabilité permettra également la réalisation du prélèvement d’organes et de leur analyse en vue de la préparation des études de biodistribution qui devront être menées à la suite. L’ensemble des résultats obtenus lors de cette étude chez le rat et de ceux obtenus lors des études menées chez la souris permettront de sécuriser la production des unités thérapeutiques de substituts cutanés qui seront utilisées chez les patients souffrant de brûlures sur une grande partie du corps ou de plaies chroniques ne cicatrisant pas ou très difficilement comme les ulcères du pied chez les personnes diabétiques.
Bénéfices attendus
Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée et subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. Les substituts cutanés sont envisagés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies. Les données générées par cette étude chez le rat et celles obtenues par ailleurs chez la souris permettront de sécuriser la production des unités thérapeutiques qui seront utilisées chez les patients.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour la réalisation de la greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau sur toute l’épaisseur de celle-ci sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates. Un traitement analgésique des rats greffés sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes cutanées seront protégées par la mise en place d’un pansement au-dessus du substitut cutané, d’un morceau de compresse stérile par-dessus, d’un pansement de couverture pour protéger la greffe et enfin de 2 bandes de sparadrap pour maintenir le tout en place. Les greffes cutanées seront observées régulièrement tout au long de l’expérimentation lors de chaque change de pansement effectué, 2 fois par sermaine. Un suivi quotidien des rats greffés sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats greffés en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les pansements et surtout le greffon cutané.
Impact sur les animaux
L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique pré- et post-opératoire. Les changes de pansements, effectués 2 fois par semaine, n’induiront pas de nuisance pour les rats, ceux-ci étant placés sous anesthésie gazeuse au préalable. L’hébergement en cage individuelle des rats greffés, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les pansements et surtout le greffon cutané, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères.
Devenir
Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de substitut cutané et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 20 rats greffés, 10 mâles et 10 femelles, seront mis à mort à 2 temps différents après réalisation de la greffe cutanée, 2 semaines et 1 mois après, avec 5 rats par temps de prélèvement pour chacun des 2 sexes, pour réaliser un ensemble d’analyses.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes effectuées chez la souris et selon les recommandations des autorités de régulation sur les médicaments à base de cellules souches. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, lors de chaque change de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés , ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques de bois seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme. Son utilisation est décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des rats âgés de 7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de rats décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle d’acné chez la souris et le hamster
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Hamsters dorés : 150
670 animaux non-humains, 520 souris et 150 hamsters dorés, vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les hamsters reçoivent de la testostérone pour élargir leur organe de flanc, les souris subissent des mesures de peau, et tous reçoivent quotidiennement des molécules contre l'acné avec imagerie sous anesthésie et prélèvements sanguins. Le porteur précise qu'aucune analgésie ne sera employée, car elle risquerait d'interférer avec l'analyse. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle capable de remplacer la peau comme tissu vivant et revendique un projet "nécessaire".
Objectifs
Ce projet est nécessaire pour l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques ayant une activité sur l'acné. Ces tests sont requis pour permettre le choix des meilleures molécules ou traitements thérapeutiques avant essai chez l’homme (tests cliniques).
Bénéfices attendus
L'acné est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus à des moments clés de la vie (l'adolescence, la femme jeune) et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints d'acné de guérir de l'acné et de son inflammation, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.
Procédures
Les Hamsters seront tondus pour identification au niveau des organes de flanc (durée d'intervention < 5 minutes), ils recevront le traitement sur les organes de flanc (durée d'intervention
Impact sur les animaux
L'injection de testosterone chez les Hamsters peut avoir une répercussion sur le comportement (augmentation de l'agressivité, excitation, dominance...). Des effets indésirables peuvent être observés lors de l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance pouvant entraîner une perte de poids, irritation en cas d'application topique.
Devenir
A l'issu des procédures tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale (isoflurane afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo pour l'évaluation de l'efficacité des traitements testés.
Remplacement
Nous n'utiliserons le modèle animal d'inflammation provoquée par l'acné qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles alternatifs qui permettent d’effectuer un premier test d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles alternatifs ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau - L’efficacité ne pouvant être complètement testée dans les modèles alternatifs, des premières preuves d’efficacité chez l'animal doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).
Réduction
Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence commercialisé type bétaméthasone). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés immédiatement. L'utilisation de l'imagerie permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du même animal. Les animaux seront anesthésies lors des prélèvements sanguins et les étapes d'imagerie OCT. Aucune analgésie ne sera employée car cette dernière risquerait d'interférer lors de la phase analytique.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris Rhino et hamster) sont d’excellents modèles d'acné. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de l'acné dans ces espèces. De plus, ces animaux présentent des lésions d'acné très semblables à celles observés chez l’humain. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Tous les animaux auront le même âge. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.
Test de tolérance à la lentille de contact activée chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
3 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants puis replacés ou proposés à l'adoption. Ils sont maintenus en contention environ 45 minutes, trois fois en une semaine, pour tester la tolérance d'une lentille de contact connectée, avec une pose sur l'œil et un contrôle à la lampe à fente, gestes non invasifs mais décrits comme stressants. Le projet accompagne le développement d'un dispositif de suivi du regard déjà testé chez l'humain. Le porteur affirme que l'œil du lapin est proche de l'œil humain et qu'aucune alternative non animale ne permet ce test.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer la tolérance au port de la lentille de contact par le lapin. La lentille développée par la société LCS permet d'avoir un dispositif embarqué qui l'active grâce au port d'une lunette de vue classique. La lentille a déjà été portée sur les premiers tests chez l'homme. Aucune irritation est à prévoir ni modification de performances optiques. La lentille est composée d'un circuit électronique composé de polyimide, d’une capacité et de deux VCSEL encapsulé dans une lentille sclérale. A cette lentille est associée une paire de lunettes embarquant une bobine encastrée autour du « verre » des lunettes et un circuit électronique au niveau de la tempe. Le circuit sur la tempe sert à gérer l’alimentation / le courant traversant la bobine. Lorsque les lunettes sont branchées par un câble micro-USB à une source d’alimentation, un courant traverse alors la bobine sur les lunettes. De ce courant, est créé un champ magnétique qui est alors capté par le circuit sur la lentille. Ce champ magnétique va ainsi alimenter le circuit sur la lentille et permettre aux VCSEL d’émettre de la lumière Infrarouge. Ce laser est ensuite utilisé pour suivre le regard de la personne qui porte les lentilles sans avoir besoin de caméra ou de puissance de calcul.
Bénéfices attendus
La mesure de la direction de regard ("eye tracking" en anglais) est utilisée dans de nombreux domaines, de la recherche sur le système visuel au marketing en passant par la psychologie ou les interfaces homme-machine (IHM). Les dispositifs actuels présentent toutefois un certain nombre de faiblesses (sensibilité aux conditions d'imagerie, encombrement, principe de calibration, performances, etc.) qui limitent leur utilisation pour diverses applications : par exemple en salle d'opération lorsque le chirurgien porte des loupes, ou pour la rééducation visuelle de malvoyants. En matérialisant la direction du regard, le dispositif proposé, permet de résoudre ces difficultés et ouvre de nouvelles possibilités en termes d'IHM. Dans le cadre de ce projet, nous nous intéresserons particulièrement au potentiel d’un pointeur laser encapsulé sur une lentille de contact (CLP) pour la restauration de la vision et la rééducation visuelle (en collaboration avec l’institut de la Vision).
Procédures
Examens sur animaux vigiles : environ 45 minutes 3 fois en une semaine.
Impact sur les animaux
Les animaux seront examinés vigiles. Du stress est à prévoir. La contention des animaux est à prévoir pendant environ 45 minutes, 3 jours en une semaine (lundi, mercredi et vendredi). Cela inclut : - la mise en cage de contention, - l'arrivée en salle de tests puis la pose de lentille, - test pendant 15 minutes, - contrôle à la lampe à fente, - préparation de la lunette à proximité, - 15 minutes de tests avant retour au parc d'hébergement. Tous ces gestes sont non invasifs mais font que les lapins soient stressés.
Devenir
Les lapins seront replacés OU adoptés.
Remplacement
La mise sur le marché d’un nouveau dispositif médical même non invasif oblige à mener une étude préclinique sur au moins une espèce avant de lancer la phase d’étude clinique. Les yeux du lapin sont proches morphologiquement de l’œil humain, ce qui en fait un modèle de choix. Il n'y a pas d'autre alternative non-animale pour tester ce dispositif. Le dispositif prévoit de mesurer la pression intraoculaire, un modèle in-vitro est donc inenvisageable dans ce cas.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est basé sur des données antérieures ainsi que sur des données de la littérature. Les mesures réalisées sur un peil sont comparées à l'oeil controlatéral qui sert de contrôle en cas de doute, réduisant ainsi le biais possible et le nombre final d'animaux à utiliser.
Raffinement
Le bien-être des animaux est pris en charge dès leur arrivée. Une personne habituée au travail avec les lapins est en charge de leur réception et surveillance quotidienne. Les conditions d'habituation et d'hébergement sont prévues pour assurer un maximum le bien-être des animaux. Nous prévoyons l'installation de ces 3 lapins en parcs et non en batteries d'hébergement. Cela permet de garantir une surface plus grande avec un enrichissement supplémentaire et la possibilité de réaliser de l'exercice à souhait. Ce type d'hébergement au sol avec de la paille permet d'avoir les lapins plus détendus. La personne en charge de leur bien-être a une grande habitude des lapins, et s'occupera de les suivre tous les jours. Une période d'habituation est prévue afin de permettre aux lapins de prendre connaissance avec la cage de contention et de s'y rendre plus facilement. Des caresses et récompenses aident à cette habituation qui durera une semaine. Les gestes techniques nécessaires à l'étude sont bien réfléchis et le timing prévu au plus réel afin de ne pas avoir des temps de latence qui imposeraient une contention plus longue que le strict minimum. Des récompenses sont également prévues à la fin des tests.
Choix des espèces
Le lapin est un animal dont l’œil permet d’adapter relativement aisément la lentille « homme » développée par LCS. Les lentilles de contact sont réalisées sur mesure pour le lapin puis à terme pour l’Homme par des fabricants nationaux appliquant un processus de qualité médical certifiés dans les standards qualité. Mâle. La dispersion des rayons de courbure est plus grande. Elle est estimée 3 fois plus grande chez le mâle que chez la femelle.
Etude comparative de la perception de la voix chez les primates – Volet Marmouset
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
20 marmousets vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont mis à jeun de 10 à 18 heures, séparés de leur groupe puis anesthésiés pour subir jusqu'à 20 séances d'IRM, avec injection d'un agent de contraste au fer et d'un chélateur, pour comparer le traitement de la voix entre marmousets, macaques et humains. Le porteur indique que l'anesthésie peut entraîner des complications respiratoires ou cardiaques et que l'agent de contraste affecte le foie. Il revendique un bénéfice de connaissance fondamentale sur les bases cérébrales de la perception vocale, sans application médicale annoncée.
Objectifs
Ce projet vise à utiliser des tests comportements en accès libre ainsi que l'IRMf pour mesurer l'activité cérébrale dans des conditions d'écoute passive et la comparer entre des groupes de sujets de taille comparable entre marmousets, macaques et humains. Les marmousets seront testés grâce à un système de test automatisé accroché à leurs cages et accessible à volonté, et ils seront scannés sous anesthésie en IRM 3T. Pour la partie comportement, deux expériences seront réalisées grâce à des boites de tests automatiques : catégorisation vocalisations par rapport à d'autres sons et discrimination du locuteur. En parallèle deux expériences seront menées dans le box expérimental : l'enregistrement des vocalisations et l'interaction vocale avec des 'singes virtuels' . Pour la partie IRMf, deux expériences seront réalisées: la localisation d'un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des marmousets) et comparaison inter-espèces; puis le codage normalisé de l'identité.
Bénéfices attendus
Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales et comportementales du traitement de l'information vocale chez les marmousets.
Procédures
Des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie. Lors de la préparation: les animaux vont être mis à jeun la veille de l'intervention (pour une durée minimale de 10 h et maximale de 18 h) et séparés de leur groupe le temps de la session (maximum 4h de séparation). L’imagerie dure environ 4h comprenant la capture de l’animal, le transport jusqu’au scanner, l’acquisition (environ 2h30), le retour à l’animalerie et la réintroduction de l’individu dans son groupe familial. Lors de l'acquisition : les animaux seront anesthésiés et pourront avoir une injection d’agent de contraste mais également être intubés si le protocole d'anesthésie ne nécessite. Après la séance : les animaux ayant eu une injection d'agent de contraste auront une injection d'un chélateur pour capturer le fer libéré dans le foie. L’injection se fait à la sortie de l’IRM quand le singe est pris en contention avant de le remettre dans sa boite de transport, elle dure environ 30 secondes. Au maximum chaque animal subira 20 sessions de scan IRM maximum espacés d’une semaine minimum.
Impact sur les animaux
Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu. Cependant des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie lors de la préparation (mise à jeun, séparation de l'animal à son groupe, capture), lors de l'acquisition (l'anesthésie et ses potentielles complications respiratoires et/ou cardiaques, l'injection intraveineuse d’agent de contraste et ses potentiels effets secondaires au niveau du foie, l'intubation si l'anesthésie le nécessite) et après la séance (injection d'un chélateur pour limiter l'effet de l'agent de contraste sur l'organisme et le foie en particulier).
Devenir
A la fin du projet les animaux seront gardés en vie. Ils pourront être réutilisés après avis favorable du vétérinaire désigné.
Remplacement
Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.
Réduction
Un but essentiel de cette étude comparative est de comparer les performances comportementales et les activations cérébrales de macaques, de marmousets et d’humains de manière robuste. Or un problème majeur dans la littérature jusqu’ici est que les rares études publiées sur les marmousets, notamment en IRMf, rapportent des résultats chez un petit nombre de sujets, typiquement 2 ou 3) alors que le standard de publication pour l’IRMf humaine est d’étudier des groupes d’humains d’au moins 12 sujets permettant des analyses de groupe pour des inférences robustes au niveau de la population générale. Nous voulons dans ce projet adresser ce problème et étudier des groupes d’humains et de marmousets de taille comparable. C’est pourquoi nous prévoyons d’étudier un groupe d’une vingtaine de marmousets (les trois couples reproducteurs initiaux et leur descendance), espérant obtenir des données comportementales et IRMf chez au moins une douzaine d’entre eux, pour une comparaison statistique robuste avec une puissance comparable dans une analyse incluant humains et marmousets. Cette stratégie devrait notamment permettre une estimation puissante de la variabilité interindividuelle des performances comportementales et patrons d’activité cérébrale, un but important de ce projet, qui n’a pas encore pu être réalisée de manière adéquate chez les marmousets du fait du trop petit nombre de sujets typiquement étudié. Par ailleurs ces tailles de groupe familiaux, similaires à celles observées dans le milieu naturel, favoriseront des interactions sociales complexes qui sont une condition importante du bien-être du groupe et un facteur important pour le succès des systèmes de test automatiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes familiaux, avec de l'enrichissement structurel et alimentaire renouvelé fréquemment. L’ajout d’agent de contraste permettrait d’améliorer la qualité des images tout en diminuant le nombre de sessions de scan par animal. La réduction du temps d’isolement du singe de sa famille permet de réduire le stress de tous les singes et également de réduire la possibilité de tensions lorsque le singe sera replacé dans son groupe familial. La modification de la mise à jeun n’affectera pas les autres animaux puisque la mise à jeun aura lieu pendant la nuit, période durant laquelle les animaux dorment et ne s’alimentent pas. Le fait de donner la nourriture quand le singe retourne dans sa cage permet de s’assurer qu’il n’y a pas de tensions entre les individus et d’augmenter la cohésion grâce au partage de nourriture entre eux.
Choix des espèces
Cette étude comparative comparera les données du marmouset à celles observées chez l’humain et les macaques. Les raisons justifiant le choix du ouistiti sont les suivantes : Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; Les ouistitis utilisent des vocalisations complexes et variées spécifiques à chaque espèce, bien caractérisées acoustiquement. Il s'agit d’un modèle neuroscientifique hautement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires. Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. La boite de test sera en accès libre pour tous les individus de chaque cage, cependant nous n’effectuerons la procédure IRM que chez les individus jeunes adultes ou adultes (fin de la période juvénile environ 10-12 mois après la naissance). Les trois femelles reproductrices ne seront pas incluses dans la partie IRM afin de ne pas stresser les gestations ni séparer les enfants de la mère. Si un contrôle hydrique doit être mis en place pour encourager l’utilisation des systèmes de tests automatiques les femelles reproductrices et les juvéniles (