Recherche appliquée

Privées de défenses immunitaires par sélection génétique pour que les greffons humains prennent, 384 souris reçoivent par chirurgie des fragments de tumeurs de poumon et de vessie prélevées sur des patients. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et la tumeur peut gêner la locomotion, ulcérer voire nécroser la peau qui la recouvre. Pendant jusqu'à 180 jours, chaque animal est pesé deux fois par semaine et sa tumeur mesurée au pied à coulisse, avec une sensibilité que le porteur reconnaît au moment de la mesure. Toutes sont tuées, celles chez qui aucune tumeur n'a poussé au bout de six mois comme les autres, et le porteur écrit qu'il n'a pas été possible de justifier statistiquement l'effectif de 384.

Objectifs

Le cancer reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde. En particulier, les cancers de la vessie et les cancers du poumon représentent un lourd fardeau pour les patients et les systèmes de santé. Malgré les progrès de l’immunothérapie, les taux de réponse restent faibles (20–30 %) et les coûts de traitement très élevés (30 000 à 200 000 € par patient). Une des principales limitations à l’efficacité de ces traitements est liée aux systèmes de délivrance peu efficaces de l’agent thérapeutique. Il est donc urgent de développer de nouveaux outils de délivrance ciblée permettant d’optimiser l’efficacité tout en limitant les effets indésirables. Les objectifs du projet sont de développer des modèles de tumeurs dérivées de patients de cancers de la vessie et du poumon, représentatifs de l’hétérogénéité des tumeurs humaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra de développer de nouveaux modèles pertinents afin d'obtenir par la suite des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patients atteints de cancer du poumon et de la vessie, étant peu ou non répondeurs aux traitements de référence.

Procédures

Implantation de morceaux de tumeurs par chirurgie (5 minutes). Mesures tumorales au pied à coulisse 1 à 2x/sem et pesées 2x/semaine (quelques secondes) jusqu’à 180 jours après implantation. Administration d’analgésique pendant quelques secondes pouvant être réalisée jusqu’à 4 fois.

Impact sur les animaux

Pousse tumorale : nuisance possible si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite, gêne. Une perte de poids peut être envisagée suite à la pousse tumorale. Les animaux vont subir une intervention chirurgicale sous anesthésie afin d’implanter les fragments de PDX en sous-cutané qui peut entrainer un stress. La tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion, et la peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. Aucune métastase n’est attendue dans ces modèles chez la souris avant atteinte d’un volume tumoral constitutif d’un point limite, mais les animaux seront surveillés de manière adéquate. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs pour les analyser et caractériser les modèles ou au bout de 180 jours si aucune tumeur n’a pris.

Remplacement

Plusieurs études préliminaires ont été menées in vitro pour s’assurer de l’efficacité prometteuse du traitement sur des lignées cancéreuses en culture ainsi que plusieurs étapes de vérification de caractéristiques valides pour un candidat médicament, cependant les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de mener le but de la procédure à bien. Il n’a pas été possible de justifier statistiquement les effectifs au vu de la portée exploratoire de ce développement, cependant nous nous sommes appuyés sur une revue extensive de la littérature et notre expérience pour déterminer que nous aurions besoin de ce nombre d’animaux pour mener le projet à bien.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet qui les pèseront plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements appropriés à la souche de souris (coton de nidation, tunnels pour jeux, maisonnette).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développés, et qui permet de manipuler facilement le système immunitaire : ici une déficience pour une meilleure prise de nos PDX. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Deux injections trois fois par semaine pendant quatre mois : c'est le traitement imposé à 280 des 1 058 souris de ce projet, toutes utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime riche en graisses et en sucres jusqu'à devenir obèses et résistantes à l'insuline, puis des prises de sang mensuelles, des tests de tolérance à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie et des mesures hebdomadaires de composition corporelle. L'objet est de savoir si une hormone greffée sur des vésicules prolonge l'effet d'un antidiabétique du marché après son arrêt, les essais chez l'humain restant conditionnés aux résultats. Chaque souris finit anesthésiée à l'isoflurane, saignée au niveau du sinus rétro-orbital, puis tuée par dislocation cervicale.

Objectifs

Le Diabète de Type 2 est une maladie chronique qui touche 463 millions d'adultes dans le monde, représentant 90% des cas de diabète. Ce chiffre pourrait atteindre 700 millions d'ici 2045. Le diabète cause environ 1,5 millions de décès par an. Un des facteurs de risque majeur est l’obésité. Les médicaments utilisés dans le traitement de l’obésité et dans le diabète de type 2, présentent des limites. Ils ne sont pas efficaces chez tous les patients, et entraînent souvent un regain de poids après arrêt du traitement, ce qui représente un traitement à vie. Il y a donc nécessité de développer de nouvelles solutions pour surmonter les insuffisances et problèmes associés à l'utilisation de cette classe de médicaments. Une hormone abondante dans le sang, a des effets anti-inflammatoires et bénéfiques sur nos organes. Chez les personnes atteintes de diabète de type 2 ou obèses, son taux est fortement diminué. Il faudrait donc donner à ces personnes un médicament constitué de cette hormone. Or, à ce jour, personne n’a réussi à la fabriquer. Ce défi a été relevé en greffant l'hormone sur des vésicules, sortes de transporteurs présents dans le corps et qui assurent la communication entre les organes. Notre projet vise à étudier les effets thérapeutiques de ces transporteurs d’hormone chez des souris sous régime gras et d’évaluer leur impact thérapeutique après arrêt du médicament du marché. Ainsi, nous saurons si la perte de poids induite par le médicament du marché est maintenue grâce à l'hormone. Nous évaluerons aussi l’effet thérapeutique de l’hormone, combinée ou pas au médicament du marché lorsqu’elle est administrée sous forme de virus thérapeutiques. Nous comparerons également l'efficacité du traitement entre les femelles et les mâles.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre comment utiliser un nouveau traitement qu’il soit à base de virus thérapeutique ou à base de vésicule transportant l'hormone pour prolonger les effets bénéfiques d’un médicament anti-diabétique existant, même après son arrêt. Cela pourrait permettre à l’avenir de réduire les effets secondaires liés à un traitement à vie, notamment chez les jeunes patients. Nous étudierons aussi si les femelles et les mâles réagissent différemment au traitement, ce qui pourrait aider à adapter les futurs traitements selon le sexe des patients. À moyen terme, les résultats obtenus contribueront à valider notre traitement expérimental avant son test chez l’humain. Si les résultats sont positifs, ce traitement innovant pourra entrer dans une première phase d’essai clinique. À long terme, ce nouveau type de traitement, basé sur des vésicules naturelles transportant un médicament, pourrait offrir une alternative plus efficace et mieux tolérée que les médicaments actuels, avec des applications dans d’autres maladies comme les maladies du foie, les problèmes cardiovasculaires, certaines atteintes de la rétine ou encore des maladies inflammatoires.

Procédures

Les animaux vigiles seront pesés 1 fois avant le début des traitements puis 1 fois par semaine pendant la durée du protocole. Le traitement consiste à 2 injections 3 fois par semaine pendant 4 mois et concerne 280 souris. 2 prélèvements de sang (sur 15 jours d’acclimatation) avant la période de traitement seront faits sur animaux vigiles puis 1 fois par mois pour mesurer les transaminases. L’analyse corporelle est une approche non invasive, qui se fait sur animaux éveillés en moins de 2 minutes. Elle sera faite 1 fois par semaine ou 1 fois par mois, selon la procédure. Les tests de glycémie (sous insuline ou non) seront faits 1 fois par mois à 5 jours d’intervalle. Différentes combinaisons de traitements seront injectées (quelques secondes) à 674 souris vigiles par voie sous-cutané ou par voie intra-veineuse pendant 1 mois. 360 souris recevront 1 injection sous-cutanée d’un traitement 3 fois par semaine pendant 1 mois et 1 seule injection en intra-veineuse. 72 souris recevront 1 injection sous-cutanée d’un traitement trois fois par semaine pendant 1 mois. 242 souris recevront 1 seule injection en intra-veineuse pendant 1 mois. 648 souris seront pesées et subiront des tests d’analyse de la composition corporelle avant le début du traitement et 1 fois par semaine, au cours du traitement pendant 1 mois. Elles subiront également un test d’analyse du métabolisme de base avant le début des injections et en fin d’étude. 26 animaux seront prélevés (30 µL de sang), moins d’une minute, avant le début des injections et une fois par semaine pendant 1 mois. Enfin, tous les animaux (1058) seront anesthésiés à la fin de l’étude et du sang sera prélevé (quelques secondes) une fois l’animal endormi. Les animaux seront euthanasiées et des organes seront récoltés.

Impact sur les animaux

Les animaux sous régime gras présentent des caractéristiques comparables aux personnes souffrant d’obésité (diabète, résistance à l’insuline). Les manipulations répétées pour les injections du traitement et les prélèvements de gouttes de sang peuvent entrainer un stress transitoire. Nous prévoyons d’alterner le site d’injection pour limiter la douleur induite lors des injections hebdomadaires. L’injection d’insuline peut entrainer une hypoglycémie.

Devenir

Toutes les souris sont mises à mort afin de prélever du sang et différents organes permettant de répondre aux questions sur les effets métaboliques des vésicules, car ces organes seront analysés par la suite par des techniques de biochimie et d’histologie.

Remplacement

Des méthodes alternatives ont déjà été utilisées, notamment sur des cellules en culture in vitro au laboratoire. La procédure expérimentale a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude métabolique globale dans un contexte d’obésité, dépendant du métabolisme et de la communication entre différents organes ne peut se faire que sur animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint à son minimum, sans compromettre les objectifs du projet et l’interprétation statistique des résultats expérimentaux. Le nombre de souris par lot a été déterminé par un logiciel d’analyse statistique en tenant compte de la taille d’effet basé sur des données pilotes. Nous prévoyons d’utiliser un total de 1058 souris sur une durée de 5 ans, dans 6 procédures.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront réparties dans les cages en fonction de leur poids et de certains critères métaboliques afin d’avoir des groupes équilibrés. Elles resteront 10 jours sans manipulation pour s’habituer à leur nouvel environnement. Elles recevront une alimentation riche en graisses et en sucres, changée deux fois par semaine pour garantir sa fraîcheur. Les litières seront changées plus souvent que la normale, car les souris sont diabétiques. Les souris seront pesées une fois par semaine et surveillées quotidiennement pour détecter rapidement tout signe de douleur ou de stress lié aux injections. Plusieurs signes seront observés : poids, apparence, comportement, réactions aux stimuli. Des scores seront attribués selon une grille définie afin de determiner le besoin d'un suivi renforcé, un traitement antidouleur ou une euthanasie. Les sites d’injection seront changés régulièrement pour limiter la douleur. Lors du test de tolérance à l’insuline, une solution de sucre (dextrose) sera préparée à l’avance afin d’intervenir rapidement en cas de signes d’hypoglycémie. Le jour de la mise à mort, une anesthésie sera réalisée sous isoflurane afin de récupérer le sang au niveau du sinus rétro-orbital (après dépôt d’une goutte d’analgésique local). Chaque animal sera ensuite euthanasié par dislocation cervicale afin de confirmer la mort de l’animal.

Choix des espèces

Afin de tester l’effet métabolique des vésicules transportant l'hormone, combinées ou pas avec l'anti-diabétique du marché, nous travaillerons avec des modèles murins d’obésité pertinents à savoir des souris sous régime gras qui développent des insulino-résistances sévères et présentent des phénotypes métaboliques basaux différents pour mimer l’obésité. Dans ce projet, des mâles et des femelles obèses âgés de 5 mois seront utilisés, car c’est à stade que se mettent en place des altérations métaboliques conduisant au développement de complications métaboliques qui pourraient donc être prévenues par l’injection de l'hormone. Pour étudier le devenir après injections (stabilité dans le temps et dans les organes) des traitements à base de virus transportant l'hormone, nous utiliserons des souris plus jeunes (10 semaines) qui auront un régime alimentaire standard.

Fournir des anticorps monoclonaux pour des tests de diagnostic rapide suppose ici d'immuniser 200 souris, toutes tuées pour prélever leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois à quatre injections d'antigènes, à raison d'une par mois, et subit trois prises de sang. Les effets annoncés vont de l'infection au point d'injection à l'abcès, avec fièvre, perte de poids et douleur modérée liée à l'inflammation. Le porteur indique avoir sorti l'animal de la production d'anticorps à grande échelle, et affirme que l'immunisation in vitro ne donne pas des affinités suffisantes, ce qui rend selon lui le recours à la souris "toujours nécessaire".

Objectifs

Les tests « rapides » de détection et de diagnostic de microorganismes pathogènes ou de toxines responsables de maladies infectieuses sont d’un intérêt croissant non seulement dans le domaine de la maitrise et de la détection des risques biologiques mais plus largement en santé publique. Ce type de tests est particulièrement adapté à un suivi précoce de l’émergence ou de la ré-émergence de certaines maladies infectieuses responsables de pandémies mondiales pouvant avoir des conséquences extrêmement graves en santé humaine ou d’un point de vue économique (ex : Ebola, ZIKA, Covid-19, Variole du singe, etc.). Ils sont basés sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux, des protéines du vivant capables de reconnaitre de manière très spécifique des pathogènes ou toxines. Notre projet vise au développement d’anticorps monoclonaux dirigés contre différentes cibles notamment des antigènes de microorganismes pathogènes ou de toxines dans le cadre de multiples programmes de recherche, visant à suivre les émergences des maladies infectieuses responsables de différentes pathologies humaines ou animales. Le développement de nouveaux tests antigéniques nécessite donc la génération de nouvelles lignées cellulaires sécrétrices d’anticorps monoclonaux spécifiques pour répondre à ces besoins importants pour la santé publique. Bien que l’animal ne soit plus du tout utilisé dans notre laboratoire pour la production d’anticorps à grande échelle, il reste néanmoins encore indispensable pour la partie immunisation permettant in fine l’obtention des anticorps d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de générer des anticorps monoclonaux sur le territoire national pour garantir la souveraineté et la sécurité des approvisionnements dont nous avons pu mesurer l’importance lors de la pandémie de COVID19. Cela permettra la mise au point, la validation et la fourniture de moyens diagnostiques appropriés, performants et répondant aux préconisations des autorités de santé.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 ou 4 injections (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) d’antigènes pour les immuniser à la fréquence d’une injection par mois : Trois prises de sang seront réalisées par animal (durée de l’intervention environ 30 à 40 secondes) à la fréquence maximale d’un prélèvement par mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévisibles sont : - une infection au point d’injection, abcédation, risque de fièvre - une perte de poids - une douleur modérée transitoire due à l’inflammation

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. L’obtention d’anticorps monoclonaux nécessite en effet de prélever la rate des animaux immunisés.

Remplacement

L’obtention d’anticorps monoclonaux à des fins diagnostiques ou de détection nécessite d’atteindre un niveau d’immunisation très élevé. Bien que la production d’anticorps monoclonaux ait connu de grands progrès depuis quelques années, démarche dans laquelle notre laboratoire est pleinement engagé (avec une forte réduction du nombre d’animaux à plusieurs étapes et notamment celle de la production), les technologies actuelles de remplacement pour l’étape d’immunisation ne sont pas complétement satisfaisantes notamment en termes d’affinité et de spécificité des anticorps obtenus. Ces méthodes d’immunisation in vitro ne permettent pas, en l’état actuel des connaissances, d’obtenir des réponses immunitaires suffisantes pour garantir la performance de tests de diagnostic et actuellement, le recours à l’immunisation d’animaux afin d’obtenir des anticorps monoclonaux spécifiques est toujours nécessaire.

Réduction

Les immunisations sont réalisées par lots de 4 souris, un lot correspondant à une condition d'immunisation. Il est communément admis de tester 2 conditions d’immunisation par antigène (concentration ou type de solution véhicule) soit 8 animaux. La réponse immunitaire est évaluée et les animaux ayant les meilleures réponses sont sélectionnés pour réaliser les fusions lymphocytaires. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous ne testerons qu’une condition à la fois (4 animaux) ; si cette dernière ne donne pas les résultats escomptés lors des tests d’affinité, nous en testerons une deuxième. Il est à noter que dans la plupart des cas, la première condition est suffisante. Il est prévu 200 souris maximum pour les immunisations pour l’ensemble de la saisine sur 5 ans. Ce chiffre est un maximum et le nombre de lots est étroitement corrélé au nombre de sujets de recherche que nous aurons à traiter et du niveau de réponse immunitaire des animaux vis-à-vis de chaque antigène. Tous les efforts seront faits pour diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les études statistiques ne sont pas adaptables. Les résultats sont évalués en nombre d’hybridomes développés.

Raffinement

Une analgésie continue sera pratiquée avant tout acte potentiellement douloureux. Les animaux seront observés quotidiennement et un ensemble d’indicateurs prédictifs de douleurs ou stress éventuels a été mis place. En cas d’atteinte d’un point limite établi (prostration, dépilation, refus de s’alimenter…), une évaluation précise de l’état général de l’animal, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris est rendu inévitable pour l’obtention des hybridomes sécréteurs d’anticorps monoclonaux spécifiques. En effet, l’hybridome étant le résultat de la fusion cellulaire entre des lymphocytes issus des souris immunisées et des cellules de myélome de souris (lignée cellulaire établie et approvisionnée auprès de collections internationales de cellules), il est de ce fait techniquement impossible de réussir cette étape si les lymphocytes et le myélome ne sont pas issus de la même espèce (souris en l’occurrence). Toutes les souris que nous utiliserons seront de jeunes adultes (6 à 8 semaines). A cet âge, les animaux ont la maturité immunologique nécessaire pour obtenir de bonnes réponses immunitaires.

Tués sous anesthésie 113 jours après l'injection pour que leurs organes soient récoltés, trois macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un candidat médicament différent contre le diabète de type 2, puis subit seize prélèvements sanguins sur dix-sept semaines et quatre biopsies du quadriceps sous anesthésie. Les prises de sang se font sur animal vigile, avec des contentions de trois à quinze minutes, le porteur expliquant que l'anesthésie modifierait les paramètres étudiés. L'étude sert à désigner lequel des trois produits poursuivra son développement, et le porteur affirme que seul un "organisme entier", où tous les organes interagissent, permet d'y répondre.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de comprendre comment trois nouveaux candidats médicaments contre le diabète de type 2 agissent dans le corps : comment ils circulent, combien de temps ils restent actifs, quels effets ils produisent et dans quels organes ils s’accumulent. Les candidats médicaments testés bloquent sélectivement certains gènes impliqués dans la résistance à l’insuline, mécanisme central du diabète de type 2. Contrairement aux traitements qui contrôlent principalement la glycémie, ces candidats médicaments visent donc à corriger la cause physiopathologique sous-jacente de la maladie. L’hypothèse est qu’une administration unique de ces médicaments permettra d’induire une amélioration durable de la sensibilité à l’insuline des patients et, par conséquent, un meilleur contrôle métabolique. Cette étude préliminaire sur primate est nécessaire pour déterminer les caractéristiques principales des produits une fois administrés dans un organisme entier, avant de futurs études précliniques et cliniques. Les résultats de cette étude permettront de comparer les trois candidats médicaments afin de sélectionner le produit leader qui poursuivra son développement avant d’être mis sur le marché. L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, les dosages utilisés dans ce projet sont efficaces mais a priori non toxiques (d’après des études toxicologiques préliminaires).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont à terme la validation et la mise sur le marché du traitement innovant le plus efficace contre le diabète de type 2, qui pourrait être administré en une seule injection et offrir des effets durables. Ce médicament pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients en réduisant les contraintes liées aux traitements chroniques.

Procédures

Après plus de deux semaines d’acclimatation et d’habituation, les 3 animaux inclus dans le projet recevront une injection intra-veineuse lente du candidat médicament (perfusion d’un produit différent pour chaque animal durant 5 à 10 minutes). Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration sur animal vigile afin d'étudier la concentration du produit dans le sang au cours du temps et de mesurer certains paramètres physiologiques des animaux (16 prélèvements sanguins seront réalisés sur une période de 17 semaines). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. 4 biopsies de muscles seront réalisées au niveau des quadriceps des animaux (prélèvements réalisés à minimum un mois d’intervalle). L’intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun) et durera environ 20 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée sera réalisée chaque semaine. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x le jour de l’administration, et 1x/jour 3 jours après administration. Le projet prendra fin 113 jours après administration des candidats médicaments et les 3 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes.

Impact sur les animaux

L’administration intra-veineuse par perfusion lente peut provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les biopsies de muscles sous anesthésie et analgésie pourront provoquer des douleurs légères ainsi que des réactions locales au niveau du site de ponction ou une infection post-opératoire. L'anesthésie des animaux dans le cadre de ces interventions (biopsies) pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les 3 animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter leurs organes pour déterminer la biodistribution des produits testés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de comprendre comment trois nouveaux candidats médicaments agissent dans le corps : comment ils circulent, combien de temps ils restent actifs, quels effets ils produisent et dans quels organes ils s’accumulent. Ce type d'étude in vivo chez l’animal est indispensable au développement de nouvelles thérapies. Les données issues de ce projet ne pourraient être obtenues in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, les paramètres étudiés dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 3 animaux seront utilisés (1/groupe). Chaque animal recevra un candidat thérapeutique différent, il est donc impossible de réduire d’avantage le nombre d’animaux utilisé par groupe. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, elle ne nécessite pas d’utiliser de grandes cohortes d’animaux pour réaliser des tests statistiques.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant minimum deux semaines avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les biopsies seront réalisées sous anesthésie et analgésie et un traitement analgésique post-opératoire sera mis en place. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les primates sont utilisés comme modèle de recherche avant de tester certains traitements chez l’Homme. Leur système immunitaire réagit de façon très semblable au nôtre, ce qui permet de prévoir d’éventuelles défenses du corps contre le traitement. Leur grande proximité génétique et physiologique avec l’Homme les rend aussi très utiles pour étudier combien de temps le traitement reste actif, comment il agit et dans quels organes il se diffuse. Ainsi, son emploi est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. À ce stade de développement, les animaux présentent un système immunitaire pleinement fonctionnel, comparable à celui d’un patient adulte, ce qui est indispensable pour évaluer la réponse du corps vis-à-vis du candidat médicament testé. Leur organisme a atteint la maturité physiologique et métabolique, mais ne subit pas encore de variations néfastes liées au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes permet de réduire les facteurs associés à des pathologies liées à l’âge qui pourraient interférer dans l’analyse des résultats et la qualité des échantillons prélevés. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Chacun des 180 macaques à longue queue de ce projet peut subir une quarantaine d'anesthésies générales, autant de prélèvements sanguins, une trentaine d'écouvillonnages nasaux, trachéaux et rectaux, quatre ponctions de moelle osseuse, quatre biopsies de ganglions et jusqu'à dix lavages broncho-alvéolaires, le tout classé en souffrance modérée. Une puce de télémétrie est implantée sous la peau, et les animaux exposés au SARS-CoV-2 ou à la grippe passent jusqu'à huit semaines seuls en cage. La modification déposée pour cette version ajoute quatre biopsies de peau, quatre biopsies de muqueuse rectale ou buccale et quatre prélèvements de liquide séminal, pour "avoir accès à plus de compartiments". 108 macaques sont tués pour prélever leurs tissus, les 72 autres gardés comme modèles de réinfection ou comme convalescents, avec une réattribution à d'autres études que le porteur n'exclut pas.

Objectifs

La grippe et le Covid sont des maladies respiratoires causés respectivement par les virus influenza et le SARS-CoV-2. La transmission interhumaine de ces virus se fait principalement par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration).Les personnes à risque et les stratégies thérapeutiques de ces deux maladies étant assez similaires, nous avons choisi de mener nos recherches à l’intérieur d’un seul projet. Actuellement, aucun traitement spécifique ne permet d’atténuer efficacement et systématiquement les maladies causées par le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. De nombreuses personnes notamment les personnes immunodéprimées (personne au système immunitaire fragile) ou âgées sont encore lourdement impactées par la Covid-19 ou la grippe avec des effets secondaires qui demeurent importants. De plus, dans le cas du SARS-CoV-2, l’émergence continuelle de variant d’intérêt (VOC) et l’absence de vaccins efficaces contre l’ensemble de ces variants anciens ou émergents nécessite le développement permanent de nouveaux traitements par immunothérapie. Dans le cas de la grippe, les souches qui circulent en hivers sont différentes d’une année sur l’autre. Cette diversité impose d’ajuster chaque année la composition du vaccin pour y introduire les souches les plus récentes en circulation et qui circuleront aussi probablement dans les mois suivants. De plus, ces virus saisonniers diffèrent en termes d’impact sur la population et de sévérité. Le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nous permettrait de mieux faire face à une épidémie de grippe en cas de faible efficacité du vaccin. Dans ce contexte, nous testerons différentes types de traitements comme des anticorps permettant d’améliorer la réponse adaptive ou ciblant directement les virus du SARS-CoV-2 ou les virus grippaux. La mise en place de traitements par immunothérapie efficaces contre ces virus respiratoires pourrait aussi représenter une alternative capable de stimuler la réponse immunitaire en cas de baisse d’efficacité des vaccins (population immunodéprimée, apparition d’une souche génétiquement très éloignée…). Ces traitements sont en phase de développement préclinique et la démonstration d’une efficacité dans notre modèle macaque permettrait une avancé en phase clinique. MODIFICATION : Nous avons effectué des modifications pour pouvoir prélever plus de type d’échantillons différents lors des étude de biodistribution pour avoir accès à plus de compartiments.

Bénéfices attendus

Les molécules thérapeutiques qui auront montré des résultats satisfaisants chez le primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’Homme. Elles pourront notamment, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre les virus respiratoires tels que le SARS-CoV2 ou la grippe.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Anesthésie générale (40 fois environ, 30min, tous les groupes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (4 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus de la grippe ou de la covid (1 fois, 15 minutes, groupes exposés) - Prélèvement de sang (40 fois environ, 5 minutes, tous les groupes). - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Biopsie de ganglions lymphatiques (4 fois environ, 30 minutes, groupes exposés) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux ET RECTAUX (30 fois environ, 2 minutes, tous les groupes) - Lavage broncho-alvéolaire (10 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Prélèvement de LCR (liquide cérébrospinal) (4 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Imagerie in vivo (10 fois environ, 45 minutes, tous les groupes) - Pléthysmographie (mesure de l'ensemble des volumes pulmonaires) (10 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Hébergement individuel (1 fois, 8 semaines maximum, groupes exposés) - MODIFICATIONS : -Biopsie de peau (4 fois maximum, 30 minutes)-Biopsie de muqueuse rectale ou buccale (4 fois maximum, 20 minutes). -Prélèvement de liquide séminal (4 fois maximum, 20 minutes, animaux de l’étude pilote)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux traitements: Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza ou le SARS-CoV2 : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux traités. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélever différents tissus et procéder à des analyses (charge virale, lésions pulmonaires…). L’autre partie des animaux sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents. Il n’est pas exclu que ces animaux soient réattribués à d’autres études après avis vétérinaire.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer la protection induite par différents traitements par immunothérapie contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. Ce type d’évaluation nécessite un modèle expérimental proche de l’Homme, permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite au traitement et à l’infection virale. A ce jour, le macaque est le modèle qui représente le mieux ces infections respiratoires chez l’Homme. Du fait de sa proximité génétique avec l’Homme, les cibles des immunothérapies sont aussi exprimées chez le macaque, et pas nécessairement dans le modèle des petits animaux. Toutefois, les traitements par immunothérapie évalués ont été préalablement testés in vitro et dans un modèle de petits animaux avant d’être testés chez le PNH.

Réduction

Les études pilotes de distribution et persistance du traitementse font sur 2 animaux et nous permettent de sélectionner les traitements par immunothérapie les plus pertinents, la dose et la voie d’administration. Nous maitrisons les modèles de grippe et de SARS-CoV-2, cette expérience nous permets d’utiliser des contrôles historiques dans les études d’efficacité ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux contrôles tout en permettant une analyse statistique robuste. Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

L’ensemble des interventions et les prélèvements seront réalisés regroupés au maximum et sous anesthésie générale des animaux. Une diversification de l’alimentation et complémentation de celle-ci pourra être instaurée en cas d’une baisse de l’alimentation due à des anesthésies répétées Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être appliquée par une désinfection et une analgésie locale. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de la température peut induire une réaction tel qu’un gonflement et un suintement de la plaie. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique comme une désinfection et une analgésie locale. L’administration des traitements pouvant entrainer une réaction locale comme des démangeaisons et douleurs, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. L’exposition aux virus influenza et SARS-CoV2 peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. Si apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé.. Une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Les modèles d’infection par le SARS-CoV2 ou par les virus grippaux chez le macaque sont déjà mis au point dans notre département. Des grilles de score avec des points limites ont déjà été établis et utilisés au sein de notre département lors de différentes infections avec ces virus. L’hébergement se fera en groupe pour les études pilotes. Pour les études d’efficacités, les animaux seront mis en individuel pour la période d’adaptation avant l’exposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée, ils seront remis en groupe. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition virale.

Choix des espèces

Les modèles de petits animaux comme la souris ne sont pas un hôte naturel du SARS-CoV-2 et des virus influenza et leur le système immunitaire est très différent de celui de l’humain. Toutefois, la majorité des candidats sont déjà testés dans un modèle petit animal ou in vitro avant d’être testés chez le macaque PNH. Le macaque a été choisi comme modèle animal, car il présente une réponse immunitaire et physiopathologique semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires similaires. A ce jour, a été mis au point un modèle d’infection efficace des macaques cynomolgus par voie respiratoire. Les macaques sont d’excellents modèles pour reproduire la forme non sévère des maladies COVID19 et grippes, ils sont donc pertinents pour tester des molécules thérapeutiques. Ces espèces représentent le modèle le plus pertinent réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de traitements par immunothérapie contre les virus respiratoires : la réponse immunitaire et la réponse aux traitements sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire est maitrisés chez ces espèces contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires comme le furet. La grippe et le Covid infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum 2 ans. Enfin, les traitements candidats pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

Injectées de cellules tumorales sous anesthésie, traitées à six reprises et pesées trois fois par semaine, 1 836 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, dont la rate, les ganglions drainants et la moelle osseuse. Le projet cherche à savoir si une protéine recombinante associée à des immunothérapies fait mieux régresser les tumeurs que chaque traitement seul, les essais cliniques restant renvoyés à un avenir non daté. Sur le régime anesthésique des injections de traitement, le RNT dit trois choses différentes : anesthésie générale dans la description des procédures, animal vigile dans celle des effets indésirables, anesthésie locale dans le raffinement.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer in vivo l'efficacité thérapeutique et les mécanismes immunologiques associés à l'administration combinée d'une protéine recombinante avec des immunothérapies dans des modèles murins de cancer. Les objectifs spécifiques sont de déterminer si la combinaison thérapeutique proposée améliore la régression tumorale, la survie globale, ainsi que la fréquence et la qualité des réponses immunitaires antitumorales comparativement aux traitements monothérapeutiques. Deuxième objectif : Caractériser l'infiltration immunitaire intratumorale induite par les traitements combinés en analysant la présence, la répartition et l'activation des sous-populations cellulaires. Troisième objectif : Étudier les effets systémiques des traitements sur les populations lymphocytaires dans les la rate et les ganglions drainants, ainsi que dans la moelle osseuse afin de déterminer l'impact global du traitement sur l'immunité adaptative. Ces objectifs permettront de clarifier le potentiel thérapeutique et les mécanismes immunologiques sous-jacents à l'utilisation combinée de ce traitement combiné, en vue d'optimiser les stratégies d'immunothérapie contre le cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet incluent : 1.L'identification d'une nouvelle combinaison thérapeutique potentiellement supérieure aux traitements actuels en termes d’efficacité antitumorale, avec une amélioration notable des taux de régression tumorale et de la survie. 2.Une meilleure compréhension des mécanismes immunologiques impliqués, notamment concernant l’activation et l'infiltration des sous-populations lymphocytaires clés, ainsi que la formation de structures lymphoïdes tertiaires au sein des tumeurs, pouvant servir de biomarqueurs prédictifs d’efficacité thérapeutique. 3.La possibilité d'élargir ces résultats précliniques vers des essais cliniques futurs, en fournissant une base solide pour le développement de stratégies innovantes et plus efficaces d’immunothérapie en oncologie humaine. Ainsi, ce projet pourrait avoir un impact significatif sur l’amélioration des traitements du cancer des patients traités par immunothérapie .

Procédures

L'injection tumorale sera réalisée chez les animaux sous anesthésie générale (durée de 2 minutes, une fois par souris). Nous effectuerons également des injections chez les animaux sous anesthésie générale (durée de 2 minutes, 6 fois par souris). Des prélèvements sanguins seront également effectués sous anesthésie générale (durée de 2 minutes, un prélèvement par souris).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables dus à l'induction de la croissance tumorale sont une légère gène mécanique, et une possible diminution modérée de poids . Les injections (une par souris) de cellules tumorales seront effectuées sur animal anesthésié (une par souris, durée maximale 2 minutes). Les injections de traitements provoquent une douleur légère et transitoire et seront effectués sur l’animal vigile (6 par souris, durée 2 minutes). es manipulations des animaux pour les injections, le suivi de croissance tumorale ou les pesées 3 fois semaine pourront induire un stress.

Devenir

Afin de caractériser l'effet de nos traitements; notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les organes des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder a euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire et métabolique des organes , ainsi que celles des tissus est indispensable pour évaluer les effets anti tumoraux mais également la toxicité éventuelle des traitements testés.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, le microbiote, l’immunité anti-tumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse anti-tumorale dans un contexte tumoral, avec toutes les interactions nécessaires. Il est impossible de reproduire toutes ces intéractions in vitro ou ex vivo.

Réduction

Dans cette étude, nous allons faire en sorte d’utiliser le moins de souris possible. Pour cela, nous allons organiser les expériences par étapes, en avançant seulement si les résultats de l’étape précédente sont conformes aux attentes. Chaque expérience sera répétée indépendamment deux fois pour s'assurer que les résultats sont fiables. Si la première ne donne pas les résultats attendus, nous arrêterons là, ce qui évitera d’utiliser plus d’animaux. Nous avons aussi calculé à l’avance combien de souris sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables, en nous basant sur les expériences déjà faites dans notre laboratoire. Cela nous permet de ne pas en utiliser plus que nécessaire. Enfin, pour analyser ce que nous observons (comme l’évolution des tumeurs ou la durée de vie des souris), nous utiliserons des méthodes statistiques.

Raffinement

Une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début de l’expérimentation afin de réduire le stress des animaux et d'assurer leur adaptation à l'environnement de laboratoire. Une surveillance quotidienne permettra d’observer tout changement comportemental et, si nécessaire, de mettre en place des adaptations ou des traitements. Toutes les injections seront administrées sous anesthésie locale afin de minimiser la douleur. Les souris seront pesées régulièrement, au moins une fois par semaine. Les points limites précoces seront strictement respectés et des soins adaptés seront prodigués, en consultation avec le vétérinaire, pour garantir le meilleur bien-être possible des animaux tout au long de l'étude.

Choix des espèces

La génétique de la souris est proche de celle de l’Homme et bien décrite au niveau de la littérature scientifique, ce qui rend comparable les voies de signalisation immunologiques des tumeures entre l'Homme et la souris. Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Aussi, les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et l’immunité intestinale. Toutes ces raisons scientifiques, pratiques et éthiques font de la souris un animal indispensable dans la réalisation de ce projet. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines, ce qui correspond à leur maturité sexuelle et assure une stabilité hormonale. Cet âge est optimal pour garantir une réponse biologique cohérente et réduire les variations liées aux fluctuations hormonales. De plus, leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour l’étude de la progression tumorale et des réponses aux traitements, tout en permettant des interventions expérimentales sur une période prolongée.

Ligature de l'uretère, chirurgie de 30 à 60 minutes, administrations jusqu'à trois fois par jour pendant six mois, prises de sang hebdomadaires et 24 heures en cage métabolique : 5886 souris et 2736 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour la collecte des tissus. Le porteur décrit perte de poids et d'appétit, déshydratation, démangeaisons, prostration et tremblements dans les jours qui suivent l'induction de l'insuffisance rénale. Il prévoit environ 1710 animaux par an pour tester une trentaine de candidats médicaments, avec 15 animaux par groupe parce qu'il anticipe 30 % de pertes ou de non-réponses. Le projet est justifié par l'échec fréquent des essais cliniques, attribué à des modèles animaux peu représentatifs des pathologies humaines, auxquels le porteur répond par d'autres modèles animaux.

Objectifs

Environ 10 % de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique, pathologie progressive marquée par des lésions du tissu rénal entraînant une perte de sa fonction. Divers facteurs, notamment les maladies cardiovasculaires et métaboliques (comme l'hypertension et le diabète), ainsi que certains traitements médicamenteux, aggravent l'évolution vers l'insuffisance rénale chronique après des lésions aiguës. Toutefois, les mécanismes biologiques précis responsables de cette progression restent mal compris. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales. Les recherches pour développer de nouveaux médicaments se heurtent à un taux d’échec élevé en essais cliniques, en grande partie à cause de modèles expérimentaux peu représentatifs des pathologies humaines. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique notament par l'absence de pathologies associées comme l'obésité, le diabètes ou le vieillissement. Ainsi, ce projet vise à mettre en place de nouveaux modèles animaux (chez le rat et la souris) d’insuffisance rénale aiguë à chronique afin de mieux évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans des contextes pathologiques spécifiques. Les modèles développés mimeront des maladies rénales humaines comme la néphropathie diabétique, la fibrose rénale, lésion rénale induite par l'hypertension artérielle ou médicamenteuse.

Bénéfices attendus

La mise en œuvre et la réussite de ce projet permettront de développer de nouveaux modèles expérimentaux chez l'animal, reproduisant plusieurs troubles physiologiques similaires à ceux observés chez l’être humain. Ce modèle servira à évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments contre les maladies rénales, dans des conditions plus proches de la réalité humaine. L’objectif est d’améliorer la pertinence des tests précliniques et de réduire le taux d’échec des candidats médicaments lors des essais cliniques.

Procédures

Le projet se déroulera en deux phases expérimentales : - Phase 1 : Validations des conditions expérimentales. Cette étape vise à optimiser les paramètres du modèle sur un nombre limité d’animaux (n=18 par procédure, 4 procédures, soit 72 animaux au total), en s’appuyant sur des protocoles établis dans la littérature. La durée dépendra de la procédure (3 jours à 6 mois). - Phase 2 : Evaluation pharmacologique. Elle consistera à tester environ 38 candidats médicaments par an, répartis en 3 groupes de 15 animaux par molécule, soit un total d’environ 1 710 animaux/an. Tous les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant le début des expérimentations. Les interventions prévues incluent : 1) Administrations de traitements (0.5 - 1 min par administration) réalisées sur animaux vigiles, jusqu’à trois fois par jour selon le protocole, pendant une période variant de 3 jours à 6 mois ; 2) Prélèvements sanguins (3 - 5 min par prélèvement, effectués au moins deux fois (avant et après l’induction du modèle d’insuffisance rénale). Pour les études prolongées (>7 jours), des prélèvements hebdomadaires pouurront être réalisés ; 3) Collectes d’urine, réalisée au moins une fois (jusqu'à 3 fois sur un protocole supérieure à 1 mois) par cage métabolique sur 24 heures (2 - 5 min pour la mise en cage) ou directement depuis la vessie au moment du sacrifice (1 - 2 min par animal) ; 4) Procédures chirurgicales (30 - 60 min, réalisées une fois) : effectuées sous anesthésie générale et analgésie, suivies d’un monitoring biquotidien jusqu’à la fin du protocole (5 - 10 minutes par visite/animal) ; 5) Mesures fonctionnelles rénales : incluant la diurèse sur 24h et/ou la filtration glomérulaire sur 1h30 par capteur transdermique ; 6) Euthanasies (5 - 20 min par animal) : réalisées sous anesthésie profonde, suivies du prélèvement de tissus et fluides biologiques pour analyses histologiques, biochimiques et moléculaires. Ces procédures permettront une évaluation complète et rigoureuse des effets des traitements sur la fonction rénale dans un modèle expérimental validé.

Impact sur les animaux

Les animaux impliqués dans ce projet pourront présenter différents effets indésirables liés aux procédures expérimentales : 1) Stress lié à la contention lors des manipulations répétées ; 2) Altération de la fonction rénale, se traduisant par une modification du volume urinaire (augmentation ou diminution), une perte de poids, voire une altération de l’état général (diminution de la vigilance visuelle) ; 3) Douleurs transitoires associées aux interventions chirurgicales ou aux injections médicamenteuses répectées. Au cours des premiers jours suivant l’induction du modèle d’insuffisance rénale, les signes cliniques suivants pourront être observés : perte de poids et d’appétit, déshydratation, démangeaisons, réduction de l’activité locomotrice, prostration ou tremblements. Enfin, certains effets indésirables additionnels (modification du comportement, aspect anormal des fèces, prostration) pourront apparaître lors de l’administration et de l’évaluation toxicologique des candidats médicaments.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de permettre la collecte des fluides biologiques et des tissus nécessaires aux analyses complémentaires.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux utilisant des animaux (rats, souris), des modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines sont en cours de développement. Cependant, ces approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité physiologique et les réponses systémiques observées chez l’animal. Elles constituent donc un outil complémentaire, mais ne peuvent remplacer totalement les expérimentations in vivo, indispensables pour évaluer les effets globaux et la tolérance des candidats médicaments.

Réduction

Les procédures expérimentales seront établies sur la base de protocoles déjà décrits dans la littérature. Le nombre d’animaux par groupe sera limité au strict nécessaire, tout en permettant de prendre en compte la variabilité interindividuelle et de réaliser des analyses descriptives et quantitatives robustes. La première phase de ce projet, dédiée à la validation des modèles et la mise en place des conditions expérimentales, sera menée sur un nombre restreint d'animaux (n=18). Chaque modèle inclura trois groupes de 3 animaux (groupe contrôle, groupe groupe "induit" et groupe traité avec une molécule de référence), soit 18 animaux par espèce, pour un total de 72 animaux (2 espèces, rat et souris). Cette première phase permet également de s’assurer de la robustesse et la reproductibilité de la procédure, d'habituer les expérimentateurs aux gestes techniques (notamment chirurgicaux) et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires aux phases ultérieures. Lors de la seconde phase, dédiée aux tests des candidats médicaments, 15 animaux par groupe seront utilisés pour chaque composé testé. Ce nombre a été déterminé en tenant compte d’un taux de perte ou de non-réponse estimé à 30 %. Ainsi, il est prévu qu’en fin d’expérimentation, environ 9 animaux par groupe puissent être exploités pour les analyses, ce qui reste suffisant pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement pertinents. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes témoins traités par le solvant seul. Les animaux seront randomisés afin d’éviter les biais expérimentaux et les données obtenues feront l'objet de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures strictes seront mises en œuvre pour garantir le bien-être des animaux. Le personnel en charge assurera un contact régulier durant la période d’acclimatation afin de familiariser les animaux avec la présence humaine et les manipulations, réduisant ainsi leur stress. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables de 2 à 5 individus, selon l’espèce, dans le respect de la réglementation en vigueur. Certaines procédures pourront être réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées afin de limiter toute douleur ou inconfort. Pendant les interventions chirurgicales, les paramètres physiologiques (température, fréquence cardiaque et respiratoire, coloration des muqueuses) seront surveillés en continu. Les animaux seront installés sur un tapis chauffant pendant et après la chirurgie afin de prévenir l’hypothermie. Un suivi clinique rapproché (2 à 3 fois par jour) sera effectué après l’induction du modèle. Un traitement analgésique pourra être administré par voie sous-cutanée ou via l’eau de boisson durant les jours suivant l’intervention pour atténuer la douleur. Afin de favoriser l’alimentation post-opératoire, des aliments facilement accessibles (croquettes humidifiées, gels nutritifs) seront disposés au fond des cages pour limiter les déplacements. Une réhydratation sous-cutanée sera également réalisée si nécessaire. Un système de scoring clinique et des points limites spécifiques à chaque procédure seront appliqués afin d’évaluer l’état des animaux et de déterminer les seuils de retrait. Les conditions d’hébergement respecteront les standards de bien-être animal : propreté des cages, accès permanent à l’eau, à la nourriture et à des éléments d’enrichissement (tubes, matériaux de nidification, papier absorbant, friandises). Pendant le traitement avec les candidats médicaments, une surveillance quotidienne de la masse corporelle et de l’état général (sutures, pelage, respiration, locomotion) sera assurée. Toutes les observations seront consignées et analysées. En cas de dégradation persistante de l’état général pendant trois jours consécutifs (isolement, apathie, altération du pelage, troubles respiratoires), l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié conformément aux règles éthiques et aux procédures validées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont couramment utilisés pour l’étude de la fonction rénale et le développement de modèles d’insuffisance rénale, en raison de leur excellente transposabilité aux pathologies humaines. Les lignées de souris sélectionnées répondent de manière fiable aux procédures d’induction, notamment la ligature de l’uretère, permettant de reproduire la fibrose rénale observée chez l’Homme. Leur statut immunitaire spécifique limite le risque d’infection post-opératoire. Certaines lignées génétiquement modifiées développent spontanément un phénotype d’insuffisance rénale, permettant d’évaluer l’efficacité des traitements sans recourir à des procédures invasives supplémentaires. Les animaux proviendront d’élevages agréés et seront utilisés à l’âge adulte (≥ 7 semaines pour les souris, ≥ 6 semaines pour les rats). Les souris diabétiques seront un peu plus âgées (environ 12 semaines) afin de présenter des atteintes rénales établies, nécessaires à l’évaluation des effets thérapeutiques.