Recherche appliquée
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Caractérisation de la réponse immunitaire et de l’implication des neurones sensoriels dans un modèle murin de nécrolyse épidermique – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Les souris sont plongées quinze secondes dans un bain à 52 °C pour tester leur sensibilité à la chaleur, rasées sous anesthésie, puis soumises chaque jour à une pression du doigt sur la peau destinée à voir si l'épiderme se décolle. 190 souris vont être utilisées, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour reproduire une nécrolyse épidermique toxique, réaction médicamenteuse mortelle dans environ 30 % des cas humains. Le porteur écrit que le test à la chaleur est "perçu comme sensiblement douloureux" tout en affirmant qu'il n'induit aucune brûlure ni douleur persistante, et annonce œdème cutané, grattages, perte de poids puis détachement de l'épiderme. Toutes sont mises à mort dès ce détachement, pour analyser les cellules qui infiltrent la peau.
Objectifs
Les réactions d’allergie médicamenteuse sont des effets secondaires fréquents chez les patients hospitalisés (1‐3%), dont la prise de médicament est l’élément déclencheur. Ces réactions allergiques peuvent être de sévérité très variée mais la plus sévère est la nécrolyse épidermique toxique. Il s’agit d’une réaction rare (2-4 patients/million d’habitants/an) mais extrêmement sévère, avec décollement et nécrose de la partie supérieure de la peau. Ces réactions sont potentiellement mortelles (~30%) ou entraînent fréquemment de graves séquelles (>50% des patients). L’un des premiers symptômes de la nécrolyse épidermique toxique est une douleur cutanée perçue par des neurones sensoriels spécialisés dans la peau. Des recherches récentes ont mis en évidence que les interactions entre les neurones sensoriels et le système immunitaire participent activement au développement des maladies de la peau. Pour mieux comprendre la sévérité de cette maladie, un modèle très récemment mis au point par l'équipe et mimant les symptômes chez la souris sera utilisé. L’objectif de ce projet sera dans un premier temps de mieux caractériser la réponse immunitaire dans la peau et dans un deuxième temps, d'évaluer le rôle potentiel des neurones sensoriels dans le développement de la nécrolyse épidermique toxique dans ce modèle de souris.
Bénéfices attendus
1/ Caractérisation de la dynamique de la réponse immunitaire d’un modèle de souris de nécrolyse épidermique au cours du temps 2/ Existence d'interactions entre les neurones sensoriels et les cellules immunitaires qui participent au développement de la nécrolyse épidermique toxique.
Procédures
Les souris sont génotypés avec une biopsie de queue de 1mm entre 10 et 15 jours. Les souris seront rasées sur le dos et le ventre, cette procédure est réalisée sous anesthésie à l'isoflurane et dure 30s. Le test à la chaleur réalisé avec un bain marie chauffé à 52°C pendant 15s est perçu comme sensiblement douloureux par la souris mais n'induit aucune brûlure ou douleur persistante chez l'animal. 1ère partie des animaux : Les animaux seront injectés en vigiles par injections à plusieurs reprises (selon les animaux = entre 2 et 7 injections au total, durée 30sec). La déplétion chimique des neurones sensoriels sera faite par injection sous cutanée (3 injections, 30sec). La déplétion des CD4 sera faite par injection intra-péritonéale (1, 2 ou 3 injections, 30sec). Le transfert des cellules sera fait par injection sur des animaux anesthesiés (1 injection, 40sec). Des tests de Nikolsky (legère pression de la peau avec le doigt) seront réalisés sur les animaux quotidiennement sous anesthésie (30 sec). Les animaux seront pesés quotidiennement et la température rectale sera prise de manière bi-hebdomadaire (45sec). Les oreilles des animaux seront également mesurées quotidiennement 5jours/7 sous anesthésie (durant 21 jours maximum, durée 30 sec). 2ème partie des animaux : Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre au début des procédures. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles et le dos, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 1h.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue réalisé pour le génotypage peut entrainer une douleur légère de courte durée. Les souris seront rasées sur le dos et le ventre pour observer les atteintes cutanées, ce qui n'entraine pas de douleur mais un léger inconfort durant la procédure. Les anesthésies peuvent entrainer du stress chez les animaux. Les injections génèrent un stress et une légère douleur. La déplétion des neurones sensoriels entraine une baisse de la température et de faibles démangeaisons lors de la première injection dans les 60min suivant l'injection. Sur le long terme, elle entraine une perte de sensibilité mais pas de changement de comportement des animaux, possible dépigementation du poil (taches blanches). Pour les animaux qui vont développer une réaction mimant les symptômes de la nécrose épidermique toxique avec des atteintes cutanées : on s'attend à ce que les premiers symptômes arrivent 9 jours après le début de la procédure, et a ce que les animaux développent dans un premier temps un léger œdème cutanée (qui sera suivi par l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille) ce qui pourra engendrer de l'inconfort, peux être des grattages chez ces animaux. On pourra aussi observer une perte de poids. Puis dans un deuxième temps on devrait observer un détachement de l’épiderme par endroit. Celui-ci sera suivi quotidiennement par la réalisation d’un test de Nikolsky sur des animaux anesthesiés (en exerçant avec un doigt une très légère pression / frottement sur la peau afin de voir si l’épiderme se détache). A noter que des atteintes des muqueuses, et des conjonctivites sont possibles ainsi qu’une modification significative de l’activité. Le modèle d'eczéma induit chez la souris est parfaitemenent maitrisé dans l'équipe ; l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'eczéma peut conduire les souris à se gratter, mais dans notre expérience, nous n'avons jamais observé de signe excessif de grattage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en vue de réaliser des analyses sur la peau. Ces analyses permettront d'analyser les populations de cellules qui infiltrent le tissu au cours du temps afin de caractériser la réponse immunitaire de notre modèle et également d’évaluer l’implication des nocicepteurs dans le développement de la nécrolyse épidermique toxique.
Remplacement
La finalité du projet est de mieux comprendre la réponse immunitaire qui se met en place et qui aboutit au développement des symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique. Cette compréhension au niveau du modèle murin pourra permettre de mieux comprendre l’origine de cette sévérité et ouvrir la voie au développement de nouvelles thérapies. Le signe clinique clé de la pathologie est le détachement de la membrane basale suite à l’activité cytotoxique de cellules spécifiques qui vont infiltrer le tissu. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour caractériser cette pathologie.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience. Il a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Le contrôle d'une pathologie moins sévère où les acteurs cellulaires sont les mêmes (eczéma de contact), ne sera réalisé qu'une seule fois.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront maintenus à 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, pour prévenir tout stress et limiter la survenue de symptômes douloureux ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 7jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dès l’apparition des premiers symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique (décollement de l'épiderme), les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour explorer les maladies immunologiques, telles que l’allergie ou l’inflammation cutanée, en raison des nombreux outils qui ont été développés pour caractériser les réponses immunitaires. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. Les souris entrent dans les procédures à l’âge de 5-22 semaines, période correspondant à l’âge de maturité du système immunitaire.
Évaluation préclinique d’un vecteur innovant de thérapie génique ciblant spécifiquement les cellules musculaires dans la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les rats utilisés portent une mutation reproduisant la dystrophie musculaire de Duchenne, maladie qui affaiblit progressivement les muscles jusqu'aux atteintes respiratoires et cardiaques. 112 d'entre eux vont être utilisés, dont 16 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour tester un vecteur de thérapie génique injecté dans le muscle ou dans la veine. 80 rats subissent trois injections sous la peau, deux prélèvements derrière l'œil, une injection intramusculaire et une injection intraveineuse. La plupart sont tués avant l'apparition des symptômes les plus graves, deux groupes étant au contraire suivis jusqu'aux stades avancés de la maladie pour mesurer leur survie.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique rare et grave qui touche environ un garçon sur 3 500. Elle est causée par des anomalies du gène codant la dystrophine, une protéine essentielle au bon fonctionnement des muscles. En l'absence de dystrophine, les muscles s’affaiblissent progressivement, entraînant une perte de la capacité à marcher, puis des difficultés respiratoires et cardiaques. Cette maladie conduit malheureusement, le plus souvent, à un décès prématuré à l’âge adulte jeune. Actuellement, aucun traitement curatif n’existe. Plusieurs pistes thérapeutiques sont à l’étude dans le monde. L’une d’elles consiste à utiliser des vecteurs viraux, c’est-à-dire de petits « transporteurs » dérivés de virus, pour introduire dans les cellules musculaires une version corrigée ou adaptée du gène. Le défi est particulièrement important, car le gène de la dystrophine est le plus long connu chez l’être humain et présente de nombreuses formes de mutations. Une approche prometteuse consiste à concevoir des versions plus courtes, mais fonctionnelles, de la dystrophine, telles que la microdystrophine. Ces protéines peuvent compenser, au moins partiellement, l’absence de la forme complète. Jusqu’à présent, les recherches ont principalement utilisé des vecteurs viraux classiques, obtenant des résultats encourageants chez l’animal, mais sans bénéfice clinique démontré chez l’humain. Ce projet propose d’explorer une autre approche : l’utilisation de vecteurs viraux capables de transporter de longues séquences génétiques et de s’intégrer de manière stable dans le génome des cellules. Dans des études préliminaires menées sur un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), cette stratégie a permis la production de microdystrophine et a démontré un potentiel d’amélioration de la fonction musculaire. L’objectif est désormais de tester cette approche en un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Pour ce faire, la proposition est de : 1) mesurer l’efficacité de cette stratégie à court, moyen et long terme dans les muscles squelettiques ; 2) vérifier si elle permet non seulement de prévenir, mais aussi d’atténuer les symptômes à différents stades de la maladie. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le potentiel des vecteurs lentiviraux dans la thérapie génique de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et d’ouvrir la voie à de futures applications chez l’être humain.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à confirmer l’efficacité et la sécurité d’une approche thérapeutique contre la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif est de démontrer que cette protéine, la microdystrophine, peut assumer une partie des fonctions de la dystrophine normale, renforçant ainsi la structure et le fonctionnement des muscles. Si cette approche s’avère efficace, les bénéfices attendus toucheront directement deux aspects essentiels pour les patients : la mobilité et la fonction respiratoire, qui constituent les principales complications de la maladie. Si les résultats sont positifs, cette thérapie pourrait être proposée, dans des études ultérieures, à des patients à différents stades de l’évolution de la maladie, et pas seulement à ceux diagnostiqués précocement : très tôt (avant l’apparition de symptômes sévères) ou plus tard (lorsque les signes sont déjà installés). Les bénéfices attendus de ce projet sont nombreux : Un renforcement musculaire pourrait contribuer à retarder la perte de la capacité à marcher. Une amélioration de la fonction respiratoire, visant à réduire l’un des principaux risques vitaux associés à la DMD. Une applicabilité plus étendue, avec un potentiel d’efficacité à différents stades de l’évolution de la maladie. Bien qu’il s’agisse encore d’une recherche préclinique, ce projet constitue une étape majeure vers le développement d’une thérapie génique pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). S’il s’avère concluant, il pourrait ouvrir la voie à de futurs essais cliniques chez l’humain, dans l’espoir d’améliorer la qualité de vie et l’espérance de vie des patients ainsi que de leurs familles.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront soumis à différents types d’interventions selon la procédure. - 16 animaux recevront une injection sous-cutanée (s.c.) et une injection intramusculaire (i.m.) dans chacune des pattes arrière (soit 2 injections i.m. par animal). - 16 animaux recevront une injection s.c. et une injection intraveineuse (i.v.). - 80 animaux recevront 3 injections s.c., 2 prélèvements par voie rétro-orbitaire (r.o.), 1 injection i.m. et 1 injection i.v. Les injections sous-cutanées (s.c.) et intramusculaires (i.m.) sont effectuées en moins d’une minute, tandis que les prélèvements rétro-orbitaires (r.o.) et l’injection intraveineuse (i.v.) prennent chacune moins de cinq minutes. Les injections sous-cutanées (s.c.) sont réalisées pour l’administration des anesthésiques, tandis que les traitements par des vecteurs lentiviraux sont effectués par voie intramusculaire (i.m.) ou intraveineuse (i.v.).
Impact sur les animaux
Des études antérieures réalisées avec ce type de vecteur lentiviral sur d’autres modèles animaux n’ont révélé ni toxicité ni effets secondaires significatifs. Sur cette base, aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans le cadre de ce projet. Deux types d’injections seront réalisés : la première consiste en une injection unique directement dans un muscle de chaque patte. Comme toute injection intramusculaire, elle peut provoquer une légère douleur locale. Cependant, ces injections seront effectuées chez des rats encore jeunes (4 semaines), à un stade précoce de la maladie où les muscles sont peu affectés. L’impact négatif attendu est donc très limité. La seconde consiste en une injection dans la veine de la queue, comparable à une prise de sang, et elle ne devrait pas entraîner de gêne particulière. La plupart des animaux seront suivis jusqu’à un âge compris entre 10 semaines et 4 à 9 mois, puis mis à mort avant l’apparition des symptômes les plus graves de la maladie, afin de limiter autant que possible leur souffrance liée à l’évolution naturelle de la pathologie. Seuls deux groupes (un groupe traité et un groupe témoin non traité) seront inclus dans une étude de survie. Ces animaux recevront leur traitement à l’âge de 4 semaines et seront suivis jusqu’aux stades avancés de la maladie. Ils pourront alors présenter des symptômes importants, mais bénéficieront d’une surveillance quotidienne attentive ainsi que de mesures de soutien appropriées pour atténuer leur inconfort. Aucun test supplémentaire susceptible de provoquer douleur ou stress ne sera réalisé durant cette période. L’ensemble du protocole a été conçu pour minimiser au maximum les nuisances pour les animaux, tout en permettant d’obtenir des données scientifiques essentielles à l’évaluation de cette approche thérapeutique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les échantillons nécessaires aux analyses génétiques, histologiques et moléculaires.
Remplacement
Les dystrophies musculaires de Becker et de Duchenne touchent plusieurs organes interconnectés (muscles, cœur, cerveau, tube digestif). Préalablement aux essais précliniques sur les animaux issus de nos lignées modèles, l’efficacité des thérapies testées a été démontrée sur des cultures de cellules musculaires. Aucun produit n'est testé chez nos animaux sans connaissance d'un mécanisme biologique robuste, préalablement établi. L'approche innovante de la stratégie proposée ici consiste à cibler spécifiquement le muscle plutôt que tout autre organe, permettant de réduire la dose administrée et la toxicité virale sur certains organes tels que le foie. Le développement de la stratégie est à l'étape de la validation in vivo, incluant l'analyse de la biodistribution du vecteur qui doit être mené à l'échelle de l'organisme entier. Une partie de la démonstration de l'efficacité ciblée de la stratégie a été validée sur un modèle animal de plus petite taille et le présent projet est la dernière étape chez l'animal visant à confirmer l'innocuité de ce vecteur viral de dernière génération et son efficacité en condition réelle, c'est-à-dire sur un organisme mammifère sévèrement atteint par la maladie que le traitement vise à corriger, y compris dans la complexité de la réponse de l'organisme à l'administration du traitement.
Réduction
L'équipe de recherche qui a généré les animaux a accumulé beaucoup d'expérience sur cette lignée. Lors des essais précliniques, traiter moins de 10 individus permet d'obtenir des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur d'un candidat médicament sur l'évolution de la maladie. Des tests statistiques ont été réalisés et ont permis de réduire le nombre moyen d'animaux nécessaires pour répondre à la plupart des questions biologiques posées lors des expérimentations. Pour les objectifs de ce projet, nous avons mis en place en place une série de procédures en cascade qui permettra de n'utiliser que les animaux nécessaires selon la progression réelle du projet.
Raffinement
Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés en douceur très régulièrement. Les animaux sont hébergés à deux ou plus et le milieu est enrichi. La douleur est prise en charge tout au long des procédures, y compris de manière préventive avant les traitements, grâce à l’utilisation de molécules destinées à la sédation et anti-douler. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la même classe que l'être humain. Cette proximité évolutive en fait un modèle apprécié. Il partage de nombreux aspects anatomiques et physiologiques avec l’humain, notamment pour la constitution et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Les récents outils génétiques ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculaires. Les modèles de rat miment ce type de maladies humaines de manière très fidèle, tout en conservant les atouts des rongeurs avec une courte durée de gestation, une taille raisonnable et une longévité compatible avec l'étude dans un temps raisonnable d'effets à long terme des médicaments testés sur des individus âgés. Il est un excellent complément aux autres modèles.
Impact de la qualité des protéines de la ration sur les émissions de méthane d’agneaux en croissance et interaction avec le parasitisme digestif
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Pour mesurer combien de méthane émettent des agneaux nourris de légumineuses riches en tanins, 80 moutons mâles en croissance sont infestés pour moitié par un parasite sanguicole pendant deux mois. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance léger, avec perte d'appétit, anémie légère et ralentissement de la croissance attendus chez les animaux parasités. Chaque agneau subit une prise de sang et une fouille rectale par semaine, plus deux périodes de quinze jours en cage individuelle avec un sac de collecte fixé sur lui. Tous rejoignent ensuite le troupeau expérimental, le porteur estimant qu'aucune altération n'empêche leur réintroduction, l'enjeu déclaré étant de réduire l'empreinte climatique des élevages du Sud.
Objectifs
Les récentes données de la FAO montrent que les élevages les moins productifs du monde (pays du Sud, petites îles, etc.) sont paradoxalement de forts émetteurs de gaz à effet de serre, notamment de méthane, par kg de lait ou de viande. Ceci est lié à la part élevée des besoins d’entretien dans les besoins totaux, en raison notamment de la régulation thermique des animaux en climat chaud et de la forte proportion d’animaux au pâturage. En effet, les animaux au pâturage consomment une ration riche en fibres, ce qui favorise la fermentation entérique et donc la production de méthane. Par ailleurs, le pâturage expose les animaux aux parasites digestifs. Les petits ruminants sont parasités par les nématodes gastro-intestinaux, qui entrainent une inflammation de la paroi intestinale, réduisant l’absorption des nutriments, augmentant les pertes protéiques et les besoins énergétiques pour combattre l’infestation. Une diminution de l’ingestion et de l’efficacité alimentaire est observée en fonction des espèces de parasites, augmentant ainsi les émissions de méthane par unité de production. Certaines légumineuses contenant des métabolites secondaires comme les tanins présentent un intérêt pour réduire les émissions de méthane. Les tanins qui sont des composés polyphénoliques naturellement présents dans certaines plantes, peuvent en effet moduler la fermentation ruminale en inhibant la croissance des microorganismes producteurs de méthane, réduisant ainsi les émissions de GES. Ils peuvent également avoir un effet anthelminthique réduisant ainsi l'infection par des vers intestinaux et améliorant la santé digestive des ruminants. Ainsi, un régime alimentaire contenant une quantité suffisante de tanins pourrait inhiber la production de méthane en régulant la fermentation ruminale mais aussi en réduisant les effets négatifs du parasitisme sur la digestion. Cette étude cherche donc à mieux comprendre les mécanismes d’interaction alimentation x statut parasitaire et leurs effets sur les performances zootechniques (ingestion, digestion, croissance) et les émissions de méthane entérique des ruminants. Pour cela, nous avons choisi d’étudier ces mécanismes sur des agneaux en croissance parasités ou non par Haemonchus contortus, très répandu en milieu tropical, et recevant ou non une alimentation incluant une source de protéine végétale tropicale (pois de Vigna Unguiculata) contenant des tanins condensés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet résident dans une meilleure compréhension des interactions entre la qualité des protéines de la ration, la présence de tanins, et le parasitisme chez les ruminants en milieu tropical (qui exerce une pression continue en raison de contions favorables toute l'année), ainsi que de leurs effets sur les performances de croissance et les émissions de méthane entérique. Ces connaissances permettront d’identifier des leviers nutritionnels, comme l’utilisation de légumineuses riches en tanins, pour améliorer la santé digestive des animaux et réduire leur impact environnemental, tout en s’appuyant sur des ressources locales (animal et végétal).
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à une infestation contrôlée par Haemonchus contortus pendant 2 mois afin de simuler le parasitisme des ruminants en milieu tropical. Des prélèvements sanguins seront effectués chaque semaine sur tous les animaux pour évaluer l’impact physiopathologique de l’infestation en fonction des régimes alimentaires. En parallèle, des échantillons de fèces seront collectés une fois par semaine sur tous les animaux par fouille rectale pour mesurer la charge parasitaire. Ces prélèvements par fouille rectale dureront moins de 3 minutes par animal. Enfin, lors de la présence des animaux en cages individuelles (2x 15 jours par essai), un bilan digestif sera réalisé sur tous les animaux et impliquera un prélèvement de fèces pendant 5 jours consécutifs afin de mesurer la digestibilité des régimes alimentaires.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables, bien que limités et encadrés, sont à prévoir : - Infestation parasitaire : Les animaux seront volontairement infestés par le parasite H. contortus. Cette infestation peut induire une dégradation transitoire de l’état général (perte d’appétit, légère anémie, ralentissement de la croissance). Toutefois, elle restera modérée car la race de mouton Martinik est connue pour sa résistance au parasitisme digestif, et sera traitée efficacement à l’aide d’un anthelminthique à la fin de chaque période de 42 jours. Par ailleurs l’état clinique des animaux infestés sera surveillé quotidiennement afin de réagir rapidement en cas de dégradation trop importante de l’état de santé des animaux. - Isolement temporaire : Lors des phases de digestibilité, les animaux seront logés en cage individuelle pendant 42 jours. La taille des cages respecte les normes préconisées par le ministère de l’agriculture et le bâtiment est semi-ouvert permettant un éclairage naturel. Cependant, cette mise en cage individuelles entraînera une réduction des possibilités de déplacement ainsi que des interactions sociales entre les animaux. Les conditions d’hébergement des animaux seront adaptées : cages permettant le contact physique avec les congénères à travers les barreaux et des enrichissements sont présents dans les cages (brosses). - Manipulations répétées : Les pesées hebdomadaires de sang et de fèces par fouille rectale, ou via des sacs de prélèvements individuels, sont susceptibles d’occasionner un stress ou un inconfort. Afin de réduire cet inconfort, les pesées sont réalisées sans manipulation (chaque cage est ouverte en donnant accès à l’animal sur un couloir conduisant au plateau de pesée). De retour dans leur cage, lorsqu’un prélèvement sanguin est prévu, il est réalisé à la veine jugulaire en maintenant l’animal entre les jambes du technicien. Après chaque manipulation, l’animal reçoit une poignée de concentré (prélevé dans sa ration journalière pour respecter le plan expérimental). Les interventions seront réalisées par du personnel expérimenté, selon les procédures standardisées, en minimisant le temps de contention et de prélèvement (moins de 3 minutes par animal et par prélèvement). - Changements d’environnement : Les alternances entre hébergements collectifs et individuels occasionnent un stress adaptatif qui sera anticipé par une période d’adaptation de deux semaines à chaque début de phase.
Devenir
Les animaux n'auront subi aucune altération physiologique ou physique empêchant keur réintroduction au sein du troupeau expérimental de l'unité expérimentale
Remplacement
L’étude des effets croisés entre l’alimentation et le statut parasitaire sur les performances zootechniques et les émissions de méthane des ruminants nécessite le recours au modèle animal. En effet, ces interactions complexes requièrent une approche systémique, permettant d’appréhender, au sein d’un même organisme, l’expression simultanée de mécanismes biologiques interdépendants tels que la fermentation ruminale, la production de méthane et les réponses physiopathologiques induites par le parasitisme. Une telle complexité ne peut être reproduite de manière fiable sans recourir à un modèle animal vivant.
Réduction
Un total de 40 animaux par essais est requis pour ce projet (soit 40 animaux au total, en comptant la répétition). Ce calcul repose sur une analyse statistique basée sur notre connaissance de la variabilité individuelle rapportée dans la littérature concernant les mesures de performances zootechniques et les émissions de méthane des animaux parasités et non parasités en milieu tropical, notamment dans des essais utilisant des ressources alimentaires riches en tanins dans l’alimentation. Pour détecter un effet fort à modéré des facteurs alimentation en interaction avec le statut parasitaire, avec un seuil de significativité de 5 % et une puissance statistique de 80 %, un effectif minimum de 10 animaux par modalité de facteur est nécessaire, soit un total de 40 animaux par essai. Les comparaisons entre traitements seront réalisées avec des tests statistiques utilisés habituellement pour ce type de plan expérimental.
Raffinement
Depuis leur naissance jusqu’au début de l’expérimentation, les animaux seront élevés dans des conditions d’élevage classiques. Par la suite, ils seront transférés dans leur environnement expérimental, et une période d’adaptation de 14 jours sera mise en place. Cette phase a pour but de permettre aux animaux de s’habituer à leur nouveau mode d’hébergement ainsi qu’à l’alimentation expérimentale. Elle leur permettra également de se familiariser avec les manipulations hebdomadaires (prélèvements), afin de réduire le stress induit par ces interventions. De plus, cette période d’adaptation offrira au personnel animalier l’opportunité de surveiller de près l’évolution de l’infestation chez les sujets volontairement infestés. Afin d’améliorer leur bien-être, les animaux logés en cages individuelles bénéficieront d’enrichissements de milieu, notamment des blocs à lécher et des brosses suspendues, destinés à stimuler leur activité et à compenser la restriction de leur liberté de mouvement. Pour réduire les effets de l’isolement social, les cages permettent les interactions physiques entre congénères. Des tapis de couchage seront également installés pour améliorer le confort thermique et postural des animaux. Concernant la collecte individuelle des fèces, les sacs seront fixés sur les animaux 4 à 5 jours avant le début des 8 jours de collecte, afin de leur permettre de s’y habituer progressivement. Par ailleurs, des mesures continues permettront de détecter d’éventuels signes d’inconfort tout au long de l’expérimentation. Les animaux feront l’objet d’une observation quotidienne assurée par du personnel formé au bien-être animal, attentif à tout signe physiologique ou comportemental anormal, et prêt à intervenir en conséquence.
Choix des espèces
Cette étude cherche à mieux comprendre les mécanismes d’interaction entre une alimentation riche en tanins et le statut parasitaire, ainsi que leurs effets sur les performances zootechniques et les émissions de méthane entérique des ruminants. Le mouton a été choisi pour cette étude en raison de sa sensibilité aux tanins et à la prévalence de 100% des infestations parasitaires digestives lorsque les animaux sont élevés au pâturage. Comme tous les ruminants, il émet également une quantité significative de méthane entérique, ce qui permet d’évaluer l’impact des tanins et du parasitisme sur ces émissions. Son gabarit réduit, sa phase de croissance courte et sa manipulation aisée le rendent plus adapté que les bovins aux contraintes expérimentales. Les animaux utilisés seront des moutons mâles en croissance, âgés de 6 mois d’âge au début de l’essai et 10 mois en fin d’expérimentation. En effet, les jeunes moutons de 6 mois sont dans une période de croissance , durant laquelle les performances zootechniques (ingestion, digestion, croissance) sont particulièrement sensibles aux effets de l’alimentation et du parasitisme. Ce choix nous permettra ainsi d’évaluer de manière précise l’impact des régimes alimentaires et du statut parasitaire sur l’efficacité alimentaire et les émissions de méthane entérique. Par ailleurs, à cet âge, les animaux sont physiologiquement stabilisés mais pas encore influencés par des phénomènes liés à la maturité sexuelle complète, ce qui limite les variations hormonales susceptibles d’interférer avec les mesures expérimentales.
Supplémentation en oméga-3 en fin de gestation, effets sur la santé du couple mère-jeune et sur le transfert d’immunité
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Réutilisées ensuite dans d'autres expériences, 30 juments et pouliches sur les 40 équidés du projet subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les 10 mâles étant placés dans des établissements adaptés. Les juments subissent dix prises de sang à la jugulaire et des traites manuelles répétées, les poulains six prises de sang sous contention légère. Le porteur cherche à savoir si des oméga-3 donnés en fin de gestation passent au poulain par le placenta et par le lait, et il mesure la croissance des jeunes jusqu'à un an. Il justifie l'espèce en rappelant que le cheval est le seul gros herbivore d'élevage monogastrique et juge "indispensable" d'étudier la supplémentation directement chez la jument.
Objectifs
En premier lieu, nous souhaitons étudier l’effet d’une supplémentation en oméga-3 en fin de gestation sur le transfert d’immunité. Les effets directs seront étudiés via les profils en acides gras circulants chez la jument, puis leur transfert au poulain. Pour ce faire, les profils en acides gras placentaire, des sécrétions lactées et sanguins chez le poulain seront étudiés. En parallèle, la mesure de la concentration en immunoglobulines sera aussi étudiée au sein de ces différents compartiments biologiques. Dans un deuxièmes temps, nous nous intéressons aux effets à long terme chez le jeune via l’étude de ses performances de croissance. La croissance sera mesurée au travers de plusieurs indicateurs (poids vif, hauteur au garot, largeur des épaules/hanches/canons) qui seront mesurés de la naissance jusqu'à 1 an.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons étudier l’effet d’une supplémentation en oméga-3 en fin de gestation sur le transfert d’immunité. Les effets directs seront étudiés via les profils en acides gras circulants chez la jument, puis leur transfert au poulain en utilisant une méthode similaire. Les transferts au niveau du placenta et des sécrétions lactées seront aussi étudiés. Les effets à long terme seront étudiés chez le jeune via l’étude de ses performances de croissance. L’apport de connaissances sur l’assimilation des acides gras par les juments en fin de gestation et leurs mobilisation vers différents compartiments permettront d’être mieux à même de comprendre dans quelle mesure une supplémentation en lipides est intéressante pour les élevages.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine jugulaire. Pour les juments 10 prises de sang seront réalisées (environ 1 minute par prise de sang), pour les poulains 6 prises de sang seront réalisées (2 à 3 minutes par prise de sang, tenant compte de la mise en place de la contention légère).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress léger lors de certaines manipulation comme lors des traites pour les juments ou lors des prises de sang pour les poulains. Pour ces derniers, bien que les maintenir immobiles puisse engendrer une contrainte, cela permet de limiter la douleur liée à l'aiguille qui est minimisée lorsque le geste est réalisé dans de bonnes conditions. Pour les juments, une douleur légère est associée aux prises de sang mais aucune contention n'est nécessaire et le geste réalisé par le personnel formé. Un stress léger peut être visible sur les juments non-habituées à la traite. Pour le limiter, le poulain est conservé à proximité de la jument tout au long du prélèvement et une période d'habituation est mise en place pour réduire le stress. La pesée des animaux se fait dans un environnement connu et maîtrisé par les mères qui restent en contact permanent avec leur jeune, ainsi cette étape n'engendre par de stress. Bien que l’alimentation soit le sujet central de l'étude, elle restera majoritairement à base de fourrages, la part d’aliment concentré n’excèdera pas les 10% de la rations, comme conseillé pour l'espèce. La concentration en immunoglobulines dans le colostrum sera contrôlée via l’utilisation d’un Colotest. Cela nous permettra d’apporter du colostrum d'une autre jument ou un colostro-remplaceur aux poulains le nécessitant. Ces derniers seront retirés de l’étude mais n’encoureront pas de risques liés à une mauvaise acquisition de l’immunité.
Devenir
Les juments et les pouliches seront toutes conservées à l'issue des procédures afin d'être réutilisées à d'autres fins expérimentales. Les mâles seront replacés dans des établissement adaptés.
Remplacement
Cette étude a pour but de comprendre les mécanismes du transfert des lipides, et plus précisément de oméga-3, de l’alimentation à la jument, de la jument au placenta puis de la jument au poulain via les sécrétions lactées. Pour se faire, nous devons nous placer in vivo puisque recréer l’environnement gestationnel n’est actuellement pas possible.
Réduction
Le nombre d’individus inclus dans l’étude a été limité au maximum. En effet, les mécanismes étudiés étant très méconnus chez le cheval, cette étude pilote servira à déterminer quels indicateurs de la santé mère-jeune peuvent être mesurable en fonction des différents substrats prélevés (sang, placenta et sécrétions lactées). Des études plus poussées, impliquant davantage d’animaux, pourront être envisagées par la suite afin d’affiner les résultats préliminaires issues de la présente étude.
Raffinement
L’ensemble des manipulations sur les animaux seront réalisées par des personnes qualifiées et connues des animaux. L’ensemble des juments seront surveillées de manière bi-quotidienne lors de la distribution de l’alimentation. Les aliments offerts seront pesés mais aussi les aliments refusés, ce qui permet un suivi longitudinal précis de la consommation et de détecter précocement un éventuel problème de santé impliquant une perte d’appétit. Durant la période de poulinage, les juments seront équipées d’un bracelet de queue permettant de détecter le poulinage et placées sous vidéo surveillance. A cela s’ajoutera la présence d’un agent formé qui assurera les astreintes afin d’être présent sur place pour chaque poulinage. Les prises de sang seront réalisées dans une cage de contention qui sert aussi à la pesée des animaux. Cet environnement est connu des animaux et permet donc de limiter tout stress lié à la procédure. Les prélèvements de sécrétions lactées se feront elles aussi dans un endroit connu des animaux. Une personne formée et connue des animaux se placera à la tête (sur laquelle sera placée un licol) tandis qu’un second opérateur réalisera le prélèvement en traite manuelle . Toutes les juments incluses dans le protocole sont multipares et ont déjà été traites au moins une fois lors d’une précédente saison de poulinage. Les prélèvements sur le placenta n’engendreront pas de stress particulier puisqu’ils seront réalisés après expulsion dudit placenta par la jument. Nous serons malgré tout particulièrement vigilants à ce qu’il n’y ait pas de rétention placentaire. Si la délivrance ne survient pas dans les 4h suivant le poulinage, le vétérinaire référent de la strucutre sera contacté et les dispositions nécessaires seront prises. Cela pourra engendrer la sortie du protocole du couple mère-jeune du protocole en fonction du traitement appliqué.
Choix des espèces
Le projet traite des effets d’une supplémentation en oméga-3 sur la jument gestante et sur sa descendance. Nous nous intéresserons notamment à la question du transfert d’immunité, indispensable pour le poulain qui naît sans défenses immunitaire et qui dépend complètement de l’apport en colostrum pour ne pas être immuno-déprimé. De plus, le cheval est le seul gros herbivore d’élevage à être monogastrique. Les résultats ayant pu être obtenus chez les ruminants ne sont pas directement transposable. De même, les résultats obtenus chez le porc, omnivore, ne peuvent être directement appliqué aux équidés. Ainsi, il est indispensable d’étudier la supplémentation en oméga-3 directement chez l’espèce d’intérêt pour comprendre les mécanismes sous-jacents et leurs effets sur le couple jument-poulain. Les animaux qui seront utilisés sont des juments âgées de 6 à 16 ans dans le dernier tiers de gestation jusqu’à 20 jours post-poulinage. Le dernier tiers de gestation correspond à la période où les besoins nutritionnels des juments sont maximaux mais aussi à la période de plein développement du fœtus. Les effets d’une supplémentation alimentaire à ce stade est donc pertinent, notamment lorsque cela se fait via des acides gras. Ces derniers sont plus denses en énergie (4cal pour 1g) que les protéines ou les sucres (1cal pour 1g) ce qui permet de fournir de l’énergie à la jument tout en tenant compte de la diminution de la capacité d’ingestion. Seront aussi intégrés leurs descendants au cours de la première année de vie. Le suivi longitudinal de ces animaux permettra d’étudier les effets d’une supplémentation de la mère sur la croissance des jeunes. Dans ce cadre, nous nous intéressons aux principes de la DOHaD (Developmental Originis of Health and Diseases) qui cherche à mesurer les effets de l’environnement gestationnel chez les descendants.
Évaluation des effets comportementaux de molécules pour le traitement des troubles cognitifs.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
4 320 rats vont être utilisés, chacun pouvant subir jusqu'à 32 tests comportementaux et 184 prélèvements sanguins sur seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent jusqu'à quatre administrations par jour, dont des perturbateurs de la mémoire provoquant désorientation et hyper-locomotion, et de la scopolamine qui peut déclencher des convulsions. Le porteur indique tester des molécules candidates contre les troubles cognitifs ainsi que des molécules déjà commercialisées, afin de mesurer la prédictivité de ses propres modèles. Tous sont tués à la fin, une partie pour prélèvement, l'autre parce que le porteur écrit ne pas pouvoir garantir les conditions de placement prévues par le code rural.
Objectifs
Le trouble cognitif est un trouble mental fréquent au cours du vieillissement normal puisqu'il touche jusqu'à 50 % des sujets âgés de plus de 55 ans. Les principaux types de troubles cognitifs marqués sont le délire, la démence, la perte d’attention et l'amnésie. Les cas les plus sévères sont associés aux maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington. A l’heure actuelle, il y a seulement quatre médicaments (donepezil, rivastigmine, galantamine et memantine) reconnus officiellement pour le traitement des symptômes cognitifs. Les effets de ces molécules restent modestes et ne sont pas dénués d’effets secondaires dont les plus courants sont des troubles gastro-intestinaux. Ainsi, la recherche vise à trouver des médicaments plus efficaces sans effets secondaires majeurs et à disséquer les mécanismes conduisant aux troubles cognitifs. A l’heure actuelle, la recherche de nouvelles molécules améliorant la cognition peut se faire sur les modèles basés sur la capacité d’apprentissage et de mémoire chez le rat non transgénique ayant un dysfonctionnement lié au vieillissement ou induit pharmacologiquement; le recours au modèle pharmacologiquement induit permet de reproduire de façon contrôlée, réversible et reproductible des déficits ciblés, facilitant l’évaluation précise du potentiel thérapeutique des composés. En effet, en fonction de la situation considérée les troubles peuvent résulter de la modification de différents phénomènes. Dans ce projet, nous nous proposons de tester des traitements en développement pour leur efficacité à améliorer la cognition. Dans ce but, des rats seront soumis à un ou plusieurs tests mimant différentes situations pathologiques. Nous prévoyons la mise en œuvre de 15 études sur une période de 5 ans.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter les troubles cognitifs. De plus, comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité des modèles, c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de leur utilisation chez l’Homme.
Procédures
Les animaux de ce projet inclus dans la procédure 1 peuvent être amenés à réaliser au maximum 12 tests comportementaux d’évaluation de leur capacité cognitive et/ou de motricité (10-30 min). Ils auront un maximum de 4 administrations par jour et un maximum de 84 prélèvements sanguins sur la période de 6 semaines, en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les animaux de ce projet inclus dans la procédure 2 peuvent être amenés à réaliser au maximum 32 tests comportementaux d’évaluation de leur capacité cognitive et/ou de motricité (10-30 min). Ils auront un maximum de 4 administrations par jour et un maximum de 184 prélèvements sanguins sur la période de 16 semaines en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.
Impact sur les animaux
Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os (passage accidentel d’aliments ou de liquide dans les voies respiratoires (au lieu de l’œsophage). Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaître. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun de courte durée, cela peut induire un stress chez l’animal. Dans le cas d’utilisation de perturbateur de la mémoire, une désorientation et une hyper-locomotion passagère des animaux peuvent être observées. Dans le cas de traitement avec de la scopolamine, il peut en plus y avoir de rares cas de convulsions.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience. Une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou réutilisée car nous ne sommes pas en mesure de garantir les dispositions de l'article R214-112 du code rural et de la pêche maritime permettant le placement.
Remplacement
Ainsi, vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse de la fonction cognitive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique interindividuelle et d'une éventuelle différence interindividuelle à l’exposition aux traitements. Des analyses statistiques finales sont réalisées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu : un tunnel afin de permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de matériel de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Le prélèvement de sang trans-thoracique est réalisé sous anesthésie. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en œuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Le choc électrique appliqué (phase d’acquisition du test d’évitement passif) a été calibré pour être le plus faible possible. De plus, nous avons établi des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si le traitement par le composé à tester induit des souffrances, nous envisagerons, en accord avec notre client, la modification des doses ou l’arrêt du traitement. Si aucune solution n’est possible, l’animal sera euthanasié. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation en interne sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les atteintes cognitives sont des phénomènes qui peuvent être liés à l’âge mais cela n’est pas systématiquement le cas. Ainsi, dans ce projet, nous utilisons des rats de 6 à 7 semaines au début du projet.
Evaluation des effets pro ou anticonvulsivants de candidats médicaments par le test d’inhibition ou potentialisation des convulsions induites par le pentylènetétrazole (PTZ) chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les rats sont tués dès la première crise convulsive, ou à la fin de la perfusion si aucune crise n'apparaît. 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun recevant une molécule qui déclenche des convulsions. S'y ajoutent jusqu'à deux administrations par jour sur 28 jours, jusqu'à cinq prélèvements sanguins par 24 heures, trois mises à jeun de vingt heures et un hébergement isolé pouvant durer deux semaines. Le test répond à une exigence du développement pharmaceutique, et le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que l'animal constitue un "passage obligatoire" avant l'humain.
Objectifs
L’épilepsie est une maladie neurologique chronique caractérisée par des crises convulsives déclenchées par une hyperexcitation des neurones. Elle touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Bien que des traitements existent, environ 30 % des patients présentent une épilepsie résistante aux traitements, soulignant l’importance du développement de nouvelles molécules thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients. Parallèlement, dans le cadre du développement préclinique d’un médicament, il est indispensable d’identifier d’éventuels effets pro convulsivants indésirables. Selon les données disponibles, les autorités sanitaires peuvent ainsi exiger l’étude du profil convulsivant d’une molécule d’intérêt, afin de s’assurer de l’absence d’effets délétères susceptibles de compromettre ou d’interrompre son développement. Le projet consiste à évaluer l’effet d’un candidat médicament sur l’excitabilité neuronale à l’aide du test de convulsions induites par une molécule de référence pro-convulsivante. L’administration de cette molécule provoque chez le rat des convulsions de manière dose-dépendante, reproduisant certains mécanismes des crises épileptiques humaines. En coadministrant la molécule d'intérêt, il est alors possible de mesurer une augmentation (effet anticonvulsivant) ou une diminution (effet proconvulsivant) de la latence d’apparition visuelle des crises induites par la molécule de référence. Ce modèle largement décrit dans la littérature scientifique, est reconnu par les autorités de santé comme un outil pertinent pour la détection d’effets potentiels pro- ou anticonvulsivants des candidats-médicaments.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter l'épilepsie, une pathologie humaine touchant plus de 50 millions de personnes dans le monde. A court terme, les bénéfices attendus sont d'évaluer les éventuels effets secondaires du composé testé avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rats) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.
Procédures
Les rats de ce projet subiront au moins une administration de molécule de référence pro-convulsivante (durée 5 min max). Ils pourront subir des administrations (max 2 administrations /24h, durée max 2 min, sur une période de 28 jours max) des prélèvements sanguins (maximum 5 prélèvements /24h, durée: moins de 30 sec/prélèvement), une anesthésie gazeuse (1 à 5 fois max, environ 10 min/prélevement). Ils subiront au moins 1 mise à jeun, pouvant être répétée, jusqu' à 3 mises à jeun maximum (durée maximum de la mise à jeun de 20h, avec un minimum de 72h d'intervalle entre 2 mises à jeun). Ils pourront être hébergés idividuellement (maximum une fois, avec une durée maximale de 2 semaines).
Impact sur les animaux
L’administration des composés à l'essai ou de référence pourra entrainer un stress mineur de courte durée et une douleur équivalente à la piqure d’une aiguille. Lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. Dans le cas d’une anesthésie pour un prélèvement, celle-ci peut induire un stress à l’endormissement. De plus, les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture la veille de l'administration du composé d'intéret ou de la molécule pro convulsivante de référence, et un stress mineur en cas d'hébergement individuel. De par le modèle, ils subiront lors de l'administration de la molécule pro convulsivante de référence une douleur et stress modérés et brefs entrainés par l'apparition de crises convulsives.
Devenir
Euthanasie des animaux dès l'apparition de la première crise convulsive ou dès la fin de la perfusion de la molécule pro convulsivante de référence si aucune convulsion n'est détectée, afin d’éviter une douleur ou une détresse prolongée, non maitrisables, liées aux convulsions.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les convulsions. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament ou d'un dispositif. A ce jour, le rat est l'espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 8 / par groupe.
Raffinement
Le raffinement de la procédure expérimentale sera obtenu par : - Avant expérimentation, habituation des rats à la chambre expérimentale afin de réduire le stress lié à un nouvel environnement. - La mise à jeun sera limitée à la durée minimale nécessaire, sans cumul des périodes de jeûne, et respectera un intervalle minimal entre deux mises à jeun afin d’éviter tout effet indésirable et stress supplémentaire pour l’animal. - En cas de mise à jeun nécessaire pour l’administration des composés d’intérêt, et si celle-ci n’est pas simultanément requise avant l’administration de la molécule pro convulsive de référence, une supplémentation en glucose sera ajoutée dans l’eau du biberon. - En cas d’hébergement individuel, l’animal restera en contact olfactif et visuel avec ses congénères (cages transparentes et ouvertes). En plus de l’enrichissement classique, un sur-enrichissement sera spécifiquement mis en place (lanières de papier Kraft pour accentuer son besoin de cachette). - L’état des animaux sera évalué quotidiennement lors du suivi sanitaire. - Les boîtes expérimentales sont dimensionnées pour permettre à l’animal de se mouvoir librement et de se retourner, réduisant ainsi le stress lié à la contention. - Les animaux seront observés dans des boîtes transparentes, permettant une intervention rapide dès l’apparition de signes cliniques. - Limitation des effets indésirables induits par la molécule pro convulsive de référence : la perfusion sera interrompue immédiatement après la première crise, et l’euthanasie sera pratiquée sans délai afin de limiter la sévérité et la durée des convulsions et d’éviter le retour à la conscience après celles-ci. - Les prélèvements sanguins et tissulaires seront réalisés selon la méthode la moins invasive compatible avec les exigences scientifiques, et optimisés afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires.- Mise en place de points limites adaptés et spécifiques au modèle expérimental.
Choix des espèces
La structure et l’organisation des régions cérébrales chez le rat présentent de fortes similitudes avec celles de l’homme, notamment celle des circuits impliqués dans l’excitabilité neuronale. Cette homologie permet de transposer les résultats expérimentaux obtenus chez le rat à des pathologies humaines, notamment les crises d’épilepsie. L’administration d'une molécule pro convulsive de référence chez le rat est un modèle robuste et largement validé et reproduit dans la littérature scientifique pour induire des convulsions comparables aux crises d’épilepsie humaines et refléter la réponse pharmacologique aux traitements anticonvulsivants chez l’homme. De plus, son utilisation historique dans la recherche sur l’épilepsie et les effets des médicaments sur les convulsions a généré une base de données importante sur cette espèce, facilitant l’interprétation des effets observés et la comparaison avec d’autres études. Animaux adultes : ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement. Le choix d'animaux adultes est justifié par la nécessité d'un cerveau pleinement développé afin d'obtenir des résultats pertinents concernant l'effet des substances testées sur les fonctions neuronales.
Etude par imagerie de l’état physique et fonctionnel de la Barrière-Hémato Encéphalique dans un modèle de dépression.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
Douze semaines sans aucun enrichissement physique dans la cage, pour installer un état d'anxiété-dépression : 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 924 subissent quatre semaines de stress chronique léger, 564 reçoivent quatre séances d'ultrasons crâniens sous anesthésie, et chacune passe deux séances d'imagerie pouvant durer deux heures. Six tests comportementaux mesurent ensuite la motricité, la dépression et l'anxiété ainsi induites. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes et vérifier que les signaux vus en imagerie correspondent bien à des altérations réelles de la barrière hémato-encéphalique.
Objectifs
Les traitements actuels contre la dépression restent insuffisants pour une partie des patients, et les rechutes sont fréquentes. Pour développer de nouvelles approches plus efficaces, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans cette maladie. Notre projet de recherche s’intéresse à un élément encore peu exploré dans ce contexte : la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est une structure qui agit comme un filtre protecteur, en contrôlant les échanges entre le sang et le cerveau. Des études récentes suggèrent qu’elle pourrait être altérée dans certaines maladies psychiatriques, comme la dépression, et ainsi contribuer à certains symptômes. De plus, des travaux montrent qu’il est possible de moduler temporairement la perméabilité de cette barrière, ce qui permettrait de faire passer dans le cerveau des substances actives susceptibles d’agir sur les symptômes dépressifs. Ces découvertes ouvrent des perspectives nouvelles, à la fois pour mieux comprendre la maladie et pour envisager de nouvelles voies d’administration de traitements ciblés. Notre projet repose donc sur deux grands objectifs complémentaires : 1. Étudier l’état de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle animal (des souris) présentant des caractéristiques proches de la dépression humaine. Pour cela, nous utilisons des techniques d’imagerie non invasives permettant d’observer le cerveau (IRM) et son fonctionnement (TEP). 2. Tester la possibilité d’agir sur la barrière, en modifiant transitoirement sa perméabilité. Cela permettra d’évaluer si des composés potentiellement utiles contre la dépression peuvent franchir cette barrière et avoir un effet thérapeutique. Cette modulation sera testée par deux méthodes : l’utilisation d’ultrasons ciblés (FUS) et l’administration de substances spécifiques. L’ensemble de ces investigations vise à mieux comprendre le rôle de la BHE dans la dépression et à évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques en s’appuyant sur l’imagerie et la modulation ciblée de cette barrière.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dépression afin d’ouvrir la voie à des traitements plus efficaces et mieux ciblés. À court terme, il s’agit : • d’évaluer l’état de la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre naturel du cerveau, chez des animaux présentant des comportements similaires à la dépression, pour identifier d’éventuelles altérations ; • d’étudier comment des ultrasons ciblés ou certaines substances influencent la perméabilité de cette barrière et le passage de composés vers le cerveau, afin d’optimiser l’administration de médicaments ; • d’analyser les effets cellulaires de ces modulations pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ; • d’explorer un éventuel effet bénéfique des ultrasons sur le comportement de ces animaux ; • et de renforcer l’usage de l’imagerie TEP pour étudier, de manière non invasive, la BHE et les processus cérébraux associés à la dépression. À long terme, ces recherches devraient permettre : • une meilleure compréhension des mécanismes complexes de la dépression, essentielle au développement de traitements plus performants et durables ; • l’évaluation d’une approche innovante reposant sur les ultrasons ciblés, potentiellement capable d’agir à la fois sur la BHE et sur les symptômes dépressifs ; • des avancées vers des stratégies thérapeutiques non invasives, précises et personnalisables ; • une meilleure connaissance des effets des ultrasons sur le cerveau, nécessaire à leur future utilisation clinique ; • et des retombées méthodologiques utiles à la recherche en imagerie et en neuropharmacologie. En résumé, ce projet combine neurosciences, imagerie et technologies innovantes pour explorer de nouvelles voies thérapeutiques dans la dépression, avec l’ambition d’améliorer à terme la prise en charge des patients.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie (2 imageries par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum ; 1224 animaux) • Induction du modèle dépressif : la dépression sera induite par un protocole standardisé de stress chronique léger, réalisé sur une période de 4 semaines (924 animaux) • Réalisation de sessions d’ultrasons (4 sessions d’ultrasons par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes au maximum ; 564 animaux) • Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux (6 tests par animal) afin de mesurer l'activité motrice (durée = 30 minutes), la dépression (durée = 5 minutes) et l’anxiété (durée = 5 minutes). • Administration 2 fois par semaine d’un candidat médicament par injection i (réalisée en 10 secondes ; 528 animaux) pendant 28 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Induction d’un phénotype dépressif • Administration de médicaments par injection, ce qui induit une douleur suite à la piqure inférieure à 3 secondes. • Absence d’enrichissement physique dans les cages afin de favoriser le modèle d'anxiété-dépression (12 semaines), les enrichissements environnementaux de type sensoriel et social sont maintenus. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les organes, d’en analyser leur composition aux niveaux cellulaires et tissulaires. Ces analyses permettront d’obtenir des informations supplémentaires sur les mécanismes biologiques en jeu, notamment la distribution des biomarqueurs d’intérêt. Elles serviront surtout à valider et à interpréter les résultats obtenus par imagerie, en s’assurant que les signaux observés reflètent bien des altérations réelles et spécifiques de la barrière hémato-encéphalique. Cette étape est essentielle pour confirmer la pertinence de l’imagerie comme outil fiable d’investigation de la BHE.
Remplacement
En amont de ce projet, des études ont été menées en laboratoire, notamment en utilisant des matériaux simulant le cerveau (des "fantômes") et des cultures de cellules. Ces travaux préliminaires ont servi à tester et à ajuster les paramètres techniques, en particulier ceux liés à l'utilisation des ultrasons et à l'effet de certaines substances sur la barrière qui protège le cerveau (la Barrière Hémato-Encéphalique ou BHE). L'objectif était précisément de limiter le recours aux animaux. Cependant, ses recherches portent sur des pathologies complexes comme la dépression et sur les interactions fines entre le cerveau, sa barrière protectrice, et des interventions comme les ultrasons ou l'administration de substances. Actuellement, la complexité d'un organisme vivant, avec son environnement cérébral unique et l'interaction de ses différents systèmes, ne peut pas être reproduite fidèlement par des études en laboratoire sur des cellules isolées, des organoïdes ou par des simulations informatiques. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour étudier ces maladies complexes et pour évaluer la variabilité de la réponse à des approches potentielles de traitement.
Réduction
Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences pharmacocinétique au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et toute forme d'inconfort chez les animaux, conformément au principe de Raffinement. Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 1 à 4 semaines avant toute procédure, afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social, et manipulées de manière douce et progressive pour réduire leur stress. Un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé, qui observera leur comportement, leur aspect général, leur poids, ainsi que leur consommation d’eau et de nourriture. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de mal-être. Toutes les procédures pouvant causer une gêne (examens d’imagerie, injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Pendant l’anesthésie, leur respiration et leur température seront surveillées. Le réveil se fera dans leur cage habituelle ou avec leur propre litière pour limiter le stress. Un système d’observation rigoureux des animaux a été mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance, bien que toutes les précautions soient prises pour les éviter. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Enfin, les différentes étapes expérimentales sont espacées dans le temps pour permettre aux animaux de récupérer entre les procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de cette étude, il a été décidé d'utiliser des souris. Ce choix repose sur des raisons scientifiques importantes. Premièrement, le modèle de dépression utilisé dans ce projet, qui est induit en donnant une substance (la corticostérone) dans l'eau de boisson pendant une certaine période, a été spécifiquement développé et validé chez la souris. L'utilisation de cette espèce nous permet donc de travailler avec un modèle dont les caractéristiques liées à la dépression sont bien établies. De plus, un type particulier de souris présente des avantages techniques pour les méthodes d'imagerie non invasives que nous allons utiliser, comme une meilleure transmission des ultrasons à travers le crâne. Ces souris sont également très similaires les unes aux autres, ce qui rend les résultats plus fiables et reproductibles. Concernant le stade de développement, nous utiliserons uniquement des animaux adultes. Ce choix est essentiel car la dépression est une maladie qui se manifeste principalement chez l'adulte. En travaillant sur des souris adultes, nous nous assurons que les mécanismes biologiques et les comportements que nous étudions sont pertinents par rapport à la maladie chez l'homme. Enfin, certaines des techniques d'imagerie non invasives employées nécessitent que le crâne soit complètement développé pour obtenir des données précises et comparables. Cela est généralement atteint à l'âge adulte chez la souris. En résumé, l'utilisation de souris adultes est la plus appropriée et la plus pertinente pour étudier les mécanismes de la dépression et évaluer de nouvelles approches dans ce projet.
Évaluation d’un composé thérapeutique incluant un dispositif d’activation par la lumière sur des animaux porteurs de tumeurs intracrâniennes
- Recherche appliquée
- Cancers
Des cellules tumorales sont greffées dans le cerveau de 250 rats, qui reçoivent ensuite trente minutes de traitement par une source laser, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit aussi une administration par voie orale sous contention et deux prélèvements sanguins sous anesthésie. Dix rats par groupe sont gardés jusqu'au bout pour mesurer leur survie, quatre autres subissent des prélèvements à trois temps, et tous sont tués pour récupérer organes et sang. Le porteur affirme que les méthodes sans animaux ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo et que les reconstructions de tumeurs en trois dimensions restent "marginales".
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle de tumeur intracrânienne (tumeur implantée dans le cerveau des animaux, = tumeur stéréotaxique), déjà mis en place dans nos laboratoires chez le rat afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer une nouvelle approche thérapeutique pour traiter ce type de cancer. L’évaluation de ce traitement potentiel chez l’animal permettra d’étudier cette nouvelle approche thérapeutique, dans un contexte physiologique le plus proche possible de la pathologie humaine et d’arriver, avant les essais cliniques, à réaliser une réelle évaluation de l’efficacité de cette molécule et du dispositif d’activation par la lumière destinés à traiter les cancers chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité d’évaluer l’efficacité d’une molécule thérapeutique associée à un dispositif thérapeutique innovant grâce à un modèle préclinique le plus prédictif possible afin de pouvoir transposer leurs utilisations chez l’homme lors d’essais cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, représentant un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent la première évaluation de l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de ces nouvelles approches. Au cours des expériences, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur ou mimer l’apparition de sites métastatiques dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance/échappement après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme des moyens de défense.
Procédures
-Greffe des cellules tumorale dans le cerveau, sous anesthésie et antalgie (fréquence :1 fois, durée : 30 minutes) -Traitement par une source photonique type laser (fréquence :1 fois, durée : 30 minutes) -Traitements par voie orale, sur animaux vigiles sous contention (fréquence :1 fois, durée : 5 minutes). -Prélèvements de sang, sur animaux anesthésiés, par ponction dans : la veine jugulaire ou veine caudale (fréquence :2 fois, durée : 5 minutes).
Impact sur les animaux
Une douleur sera induite par la procédure de greffe des cellules tumorales, l’analgésie mise en place permettra de l’atténuer très significativement. Une douleur modérée sera ressentie lors de la mise en place du dispositif d’activation par la lumière, l’analgésie mise en place permettra de l’atténuer très significativement. Les gestes techniques suivants induiront un stress léger (et de courte durée, moins de 1 heure) à l’animal, aucune analgésie n’étant donc requise : -Traitements par voie orale, sur animaux vigiles sous contention -Suivi des animaux (poids) Au début de l’étude avant le début des traitements, les animaux seront randomisés et donc mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress pendant 1 à 2 jours. Les traitements et les procédures chirurgicales pourront induire une perte de poids. Le modèle pourra également induire des signes neurologiques. Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress modéré chez l’animal : -Prélèvements de sang, sous anesthésie, par ponction dans la veine jugulaire ou la veine caudale.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de sang, nécessaires pour évaluer la spécificité des composés sur la maladie d’intérêt.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments En effet, les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D peuvent être utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes a été ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la survie des animaux entre les différents groupes de l’étude seront comparées pour évaluer l’efficacité des composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter individuelles. Ce projet sera composé de 6 groupes de 14 animaux dont 10 animaux dédiés à l’évaluation de l’activité antitumorale (critère d’évaluation principale : augmentation de l’espérance de vie des groupes traités par rapport au groupe contrôle) et 4 animaux satellites qui seront prélevés (prélèvement de sang) à 3 temps cinétiques pour le suivi de marqueurs biologiques. Ces animaux satellites seront euthanasiés au dernier temps cinétique. Chaque groupe est composé de 14 rats donc 10 rats seront gardés en survie après le traitement afin d’évaluer l’efficacité des traitements et 4 rats satellites par groupe seront prélevés (prélèvement de sang) au cours de l’étude afin d’acquérir des données pharmacologiques (cinétique des cytokines et de l’infiltrat immunitaire). Le nombre d’animaux engagés dans cette étude a été ajusté au minimum nécessaire afin de garantir une robustesse et la significativité des résultats obtenus.
Raffinement
Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées, par des techniciens formés et qualifiés, selon les modes opératoires validés. L’induction tumorale et les traitements par un dispositif d’activation type laser seront réalisés sous anesthésie et analgésie pour limiter la douleur induite. Les animaux bénéficieront d’un suivi post op (réveil sous tapis chauffant pour éviter l’hypothermie, poursuite de l’analgésie tant que nécessaire). La réorganisation liée à la randomisation induira un stress léger, mais l’enrichissement présent limitera fortement l’impact sur les animaux. Le suivi des poids des animaux induira un stress léger. La fréquence de ce suivi sera quotidienne dès l’apparition des premiers symptômes de développement de la tumeur. Cela permettra de prodiguer des soins adaptés aux animaux dès que nécessaire. Les prélèvements de sang réalisés induiront un stress de l’animal. C’est pourquoi, ils seront réalisés sous anesthésie. Le développement tumoral entrainera une perte de poids. De même, des troubles du comportement, indiquant des troubles neurologiques, constitueront un point limite. Toute autre anomalie décelée sur un animal indiquant une quelconque souffrance de celui-ci sera rapportée à la SBEA et au directeur d’étude, et ce pour que la meilleure décision soit prise dans l’intérêt de l’animal.
Choix des espèces
L’utilisation d’animaux adultes garantit la reproductibilité l’injection des cellules tumorales, c’est-à-dire que cette injection est toujours réalisée au niveau de l’emplacement cérébral souhaité. Cela garantit également que la vitesse de croissance des tumeurs sera similaire d’une expérience à l’autre. L’utilisation d’animaux plus jeunes ne permet pas de garantir que l’injection des cellules est réalisée au niveau de l’emplacement cérébral souhaité, ceci pouvant donc induire des effets neurologiques néfastes.
Développement d’anticorps de type VHH dirigés contre la protéine prion chez le rongeur, à visée diagnostique et/ou thérapeutique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris reçoit six injections d'immunogènes espacées de trois semaines, six prélèvements sanguins, puis trois injections supplémentaires dans les cinq jours précédant sa mise à mort. 100 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des nanocorps dirigés contre la protéine prion. Le porteur décrit ces quinze interventions comme de "légères gênes temporaires" qui ne devraient entraîner "ni douleur importante ni effet durable", quand la gravité déclarée du projet est modérée. Toutes sont tuées dès que la réponse en anticorps est jugée correcte, pour prélever la rate.
Objectifs
Ce projet a pour but de produire un type particulier d’anticorps appelés VHH ou nanocorps. Ces anticorps sont beaucoup plus petits que les anticorps classiques. Leur petite taille est intéressante car elle leur permettrait, en théorie, de franchir plus facilement la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre la possibilité d’imaginer un jour des traitements pour des maladies qui touchent directement le système nerveux. Nous voulons produire ces anticorps contre la protéine prion (PrP). Cette protéine est responsable des maladies à prion, qui touchent l’animal et l’Homme, et qui sont toujours fatales car il n’existe actuellement aucun traitement. Les nanocorps obtenus pourraient servir à mieux comprendre comment ces maladies se développent, à améliorer leur diagnostic et à explorer de nouvelles pistes de traitement. Nous cherchons aussi à produire des nanocorps capables de reconnaître non seulement la forme « normale » de la protéine prion, mais aussi certaines formes anormales associées aux maladies. Cela permettrait d’obtenir des anticorps plus spécifiques et plus utiles que ceux dont nous disposons aujourd’hui. Enfin, la protéine prion est également impliquée dans d’autres maladies, comme certains cancers ou encore la maladie d’Alzheimer et de Parkinson. La production de nanocorps dirigés contre la protéine prion pourrait donc avoir un intérêt bien au-delà des seules maladies à prion, et bénéficier à un domaine plus large de la recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Les anticorps de type VHH, aussi appelés nanocorps, sont des outils innovants qui possèdent plusieurs avantages par rapport aux anticorps classiques. Leur petite taille leur permet de se fixer sur des cibles difficiles d’accès et, en théorie, de franchir la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre des perspectives uniques pour envisager un jour des traitements de maladies qui touchent directement le système nerveux. Ils sont aussi très stables, faciles à produire en laboratoire et peuvent être utilisés sous différentes formes pour la recherche, le diagnostic ou le traitement. Ces nanocorps sont déjà étudiés dans d’autres maladies humaines, par exemple certains cancers, des maladies infectieuses, ou encore des maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Leur potentiel d’application est donc très large. À ce jour, il n’existe aucun nanocorps dirigé contre les maladies à prion. Ce projet vise à combler ce manque en développant une nouvelle génération d’anticorps contre la protéine prion. L’intérêt dépasse les maladies à prion elles-mêmes, car la protéine prion est aussi impliquée dans d’autres pathologies. Les bénéfices de ce projet seront donc multiples : - fournir de nouveaux outils de recherche pour mieux comprendre le rôle de la protéine prion, - permettre un diagnostic plus précoce et plus précis des maladies à prions, - et à plus long terme, ouvrir des pistes thérapeutiques innovantes grâce à la petite taille des nanocorps, qui pourrait leur permettre d’atteindre le cerveau et de cibler spécifiquement les formes anormales de la protéine prion.
Procédures
100 souris sont prévues pour le projet. Pour chaque animal, les gestes techniques seront les suivants : - injection d’analgésique avant injection des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigile. Il faut compter 30 secondes par intervention. - Injections des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigiles. Il faut compter 1 minute maximum par intervention (contention et injection) - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles 1 prélèvement avant la première injection puis toutes les 2 semaines après chaque immunisation, soit 6 prélèvements. Il faut compter 2 minutes par intervention (contention, prélèvement puis massage de la joue) - Cinq jours avant la mise à mort, 3 injections toutes les 24h d’immunogènes sur animaux vigiles. Il faut compter environ 1 minute par intervention (contention et injection).
Impact sur les animaux
Les interventions prévues (injections et prises de sang) peuvent provoquer de légères gênes temporaires chez les souris, mais elles ne devraient pas entraîner de douleur importante ni d'effet durable. Les effets observés peuvent être une petite rougeur ou un léger gonflement à l'endroit de l'injection ou de la prise de sang ; une sensibilité locale passagère ; un léger inconfort dans les heures suivant la manipulation. Il peut arriver que certains animaux soient un peu moins actifs ou mangent un peu moins pendant un jour ou deux, ou qu'ils perdent légèrement du poids. Ces effets disparaissent généralement rapidement, sans conséquence sur leur état général.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la campagne d’immunisation quand les réponses en anticorps seront correctes afin de prélever la rate.
Remplacement
Il existe aujourd’hui des méthodes permettant de produire des anticorps sans utiliser d’animaux, par exemple des techniques de sélection réalisées uniquement en laboratoire., Cependant, ces approches n’aboutissent pas encore à des anticorps de même qualité que ceux produits par le système immunitaire d’un animal. En effet, l’organisme possède un mécanisme naturel qui « améliore » progressivement les anticorps pour qu’ils se fixent très efficacement à leur cible, un processus qui ne peut pas être reproduit artificiellement avec les techniques actuelles. Dans ce projet, les souris sont utilisées pour générer des cellules capables de produire durablement des anticorps. Ces cellules seront ensuite immortalisées en laboratoire et permettront de produire les anticorps sur le long terme, sans avoir à réutiliser de nouveaux animaux pour chaque antigène ou chaque série d’expériences.
Réduction
Le nombre de 5 souris par antigène a été déterminé à partir d’un calcul statistique. L’objectif est de garantir, avec une forte probabilité, que au moins deux souris par lot développent une bonne réponse immunitaire. Cela est nécessaire pour pouvoir utiliser leurs cellules et produire les anticorps sans avoir à recommencer tout le protocole depuis le début. En pratique, il est bien connu qu’une ou deux souris sur cinq peuvent ne pas répondre correctement aux immunisations. Le choix de 5 animaux tient donc compte de cette variabilité naturelle tout en évitant d’utiliser plus de souris que nécessaire. De plus, si la première tentative de production d’anticorps en laboratoire échoue (ce qui est rare), les trois souris restantes du lot servent de filet de sécurité. Cela permet de refaire un essai sans devoir réimmuniser un nouveau groupe d’animaux, ce qui contribue directement à réduire leur nombre sur l’ensemble du projet.
Raffinement
Trente minutes avant l’intervention les animaux recevront une injection d’analgésique. Après les interventions, les animaux seront surveillés et placés sur un tapis chauffant à 37°C pendant 2 heures pour favoriser leur récupération. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Les lignées de souris de laboratoires sont classiquement utilisées pour l’immunisation et la production d’anticorps. Les souris transgéniques exprimant des anticorps de camélidés évitent le recours à ces espèces, protocole beaucoup plus difficile à mettre en œuvre. De jeunes adultes (6 à 8 semaines) seront utilisés au démarrage des immunisations ; ils ont en effet la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires lors des immunisations successives.
PRELEVEMENT DE PRODUITS BIOLOGIQUES D’ORIGINE ANIMALE SUR RONGEURS
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Rats : 575
Fournir aux laboratoires du sang, de la bile, du liquide cérébral, de l'urine et des fèces de rongeurs sains : 3 700 souris et rats vont être utilisés, dont 825 anesthésiés puis prélevés sans jamais être réveillés. Les autres passent jusqu'à seize heures en cage à métabolisme, quatre nuits par semaine pendant deux semaines, à jeun et parfois isolés. Tous sont ensuite tués. Le porteur présente ces animaux comme des "surplus de stock" d'élevage et décrit un service de fourniture interne, les scientifiques demandeurs devant justifier que les matrices in vitro ne permettent pas "d'atteindre les résultats attendus".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de collecter sur des rongeurs (rats et souris) sains sans maladie des produits du corps : sang, liquide cérébral, bile, urine, fécès. Ces fluides servent par la suite à développer ou vérifier l’efficacité de tests de diagnostiques (tests permettant de vérifier l’absence ou la présence d’une maladie par exemple) ou servent dans des études regardant le devenir du médicament et sa toxicité dans le corps. Il n’est parfois pas possible de prélever ces produits sur animal non vivant car sinon la qualité ou la quantité n’est pas conforme aux besoins de la communauté scientifique pour des résultats fiables et pertinents (après la mort, le produit se détériore trop vite ; trop de produit est nécessaire ce qui demanderait de prélever beaucoup d’animaux après leur mort). Les produits sont donc collectés sur des rongeurs vivants si cela n’est pas douloureux (urine et fécès collectés grâce à un système collecteur le permettant dans la cage) ou sur rongeurs endormis et dont la douleur a été contrôlée et qui ne seront pas réveillés.
Bénéfices attendus
Les produits collectés servent dans la santé humaine et vétérinaire. Ils servent par exemple à développer ou vérifier l’efficacité de tests de diagnostiques (tests permettant de vérifier l’absence ou la présence d’une maladie par exemple) ou servent dans des études regardant le devenir du médicament et sa toxicité dans le corps.
Procédures
Prélèvement d’urines et de fécès pendant maximum 16 heures maximum 4 nuits par semaine sur maximum 2 semaines dans des cages permettant la collecte d’urines et fécès (présence de grilles pour collecte) pour les animaux entrant dans la procédure de collecte d’urines et fécès Une à deux injections (d’une durée de 10 secondes maximum par injection) d’analgésiques pour les animaux entrant dans la procédure de collecte de produits biologique sous anesthésie / analgésie générale Anesthésie générale d’une heure maximum pour les animaux entrant dans la procédure de collecte de produits biologique sous anesthésie / analgésie générale Collecte de produits biologiques (d’une heure maximum) sans réveil pour les animaux entrant dans la procédure de collecte de produits biologique sous anesthésie / analgésie générale
Impact sur les animaux
Dans le cadre de prélèvements d’urine ou de fécès, les animaux sont soumis à un hébergement en cage à métabolisme pendant une durée maximale de 16 heures maximum 4 nuits par semaine sur maximum 2 semaines. Hébergement isolé possible dans le cadre de prélèvements d’urine ou de fécès pour une durée maximale de 16 heures Mise à jeûn alimentaire dans le cadre de prélèvements d’urine ou de fécès pour une durée maximale de 16 heures 4 nuits par semaine sur maximum 2 semaines Stress dû à la contention et à l’induction d’une analgésie / anesthésie générale dans le cadre de prélèvements de produits biologiques d’origine animale sur animaux anesthésiés et analgésiés mais non réveillés
Devenir
Dans le but de réduire l’utilisation d’animaux (règles des 3R), les animaux ayant subi uniquement un prélèvement d’urine ou de fécès proviendront de nos surplus de stock puis mis à mort. Dans le cadre des animaux prélevés sous anesthésie / analgésie générale, tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
De nombreuses supports in vitro existent afin de mimer les produits biologiques d’origine animale et ont permis de réduire l’utilisation des animaux pour les études en question. Cependant, dans certains cas, ces matrices ne permettent pas d’atteindre les résultats attendus et une fiabilité forte des résultats (échec du diagnostic recherché par le test diagnostique, pas de possibilité de valider la matrice comme témoin pour des études de pharmacocinétique ou toxicologie). L’objectif du projet est donc de fournir aux scientifiques des produits biologiques d’origine animale de rongeurs (sang, sérum, plasma, organe, fluides) lorsque l’utilisation de matrices in vitro n’est pas possible. Une justification de l’obligation de l’utilisation de ces produits d’origine animale est demandée aux scientifiques avec support de la SBEA.
Réduction
Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont des animaux de surplus de stock. Grâce à l’application de ces procédures au sein de nos zones d’élevage plutôt que chez les scientifiques (pas de remise en stock possible), aucun animal n’est produit volontairement pour l’application de ces procédures, contribuant donc à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet. Sur la base de notre expérience passée dans ce type de prélèvements, des tableaux sont à notre disposition afin de calculer au plus près le nombre d’animaux nécessaires en fonction du poids, du sexe et de la souche de l’animal. Les méthodes de calcul sont régulièrement revues pour utiliser le moins d’animaux possible pour le besoin attendu. La meilleure balance nuisances / nombre d’animaux utilisés sur une durée maximale de 10 jours (temps de conservation de l’urine au réfrigérateur) sera effectuée avec support de la SBEA.
Raffinement
Les produits biologiques d’origine animale peuvent également être collectés sur animaux après la mort, en post mortem. La pertinence de prélèvements de ces fluides sur animal vigile peut donc être demandée en amont au scientifique (en cas volume concordant avec un prélèvement post mortem pour les urines et les fécès et en cas de faisabilité en postmortem pour les prélèvements sous anesthésie/analgésie) avec si besoin support de la SBEA. Lors des collectes sur animal anesthésié, une anesthésie adéquate ainsi qu’une analgésie couvrant la totalité de la procédure sera effectuée. Des points limites spécifiques et suffisamment prédicitfs ont été définis et seront appliqués pour chaque procédure. Les animaux sont manipulés selon de bonnes pratiques de manipulation (main en coupe, tunnel, …). Une récompense alimentaire type graines de tournesol sera proposée lors de la remise en cage d’hébergement des animaux dans le cadre des prélèvements d’urines et de fécès.
Choix des espèces
Les produits biologiques d’origine animale sont utilisés d’une part dans le cadre de réalisation de tests diagnostiques qui ont été créés à partir des espèces souris et rat d’où l’utilisation de ces espèces ; d’autre part dans le cadre d’études de toxicologie dans lesquelles sont inclus principalement les espèces souris et rat. Le prélèvement de sang, d’organe ou de fluide pourra être réalisé sur des rongeurs de la naissance jusqu’au stade âgé, en fonction du besoin du scientifique. En cas de demande de prélèvement sur animaux non sevrés ou gestantes, un accord préalable de la SBEA sera demandé.
Evaluation de l’intéret thérapeutique de molécules chimiques pour traiter l’amyotrophie spinale
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Les souris utilisées naissent avec une amyotrophie spinale, les plus atteintes étant incapables de se déplacer, de s'alimenter ou de respirer normalement et mourant vers dix jours. 2 168 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever muscles, cœur, cerveau et moelle épinière. Elles reçoivent des injections répétées dans la veine, dans le bas du dos ou directement dans le cerveau, jusqu'à une par semaine pendant six mois. Le porteur décrit chez la lignée moins atteinte des nécroses sèches qui gagnent la queue puis les oreilles, et affirme qu'elles n'entravent pas le comportement normal de l'animal.
Objectifs
L’amyotrophie spinale (SMA) est une maladie génétique rare qui touche les muscles et les mouvements. Elle est causée par la mutation d’un gène qui impacte la production d’une protéine importante pour la survie des cellules nerveuses responsables des mouvements. Sans cette protéine, ces cellules nerveuses se détériorent, ce qui entraîne une faiblesse musculaire et des complications graves. Il existe un autre gène dans le génome de la souris qui permet de produire une petite quantité de cette protéine. Plus le nombre de copies de ce second gène est grand, moins la maladie est grave. Pour mieux comprendre la SMA et tester de nouveaux traitements, nous utilisons des modèles de souris génétiquement modifiées. Certaines souris ont peu de copies du second gène, ce qui imite les formes les plus graves de la maladie, tandis que d’autres ont plus de copies de ce gène, représentant des formes moins graves. Ces modèles permettent d’évaluer l’efficacité des traitements et de développer de nouvelles thérapies. Ces traitements pourraient aider à produire la protéine manquante et ainsi améliorer la qualité de vie des patients atteints de la SMA.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques prometteuses pour de futurs essais cliniques destinés au traitement de l’amyotrophie spinale (SMA). Les bénéfices attendus incluent la sélection des molécules candidates ayant le plus grand potentiel thérapeutique ainsi que la détermination de la voie d'administration optimale, avec l'objectif à long terme d'apporter des bénéfices similaires aux patients traités
Procédures
Chaque animal recevra un seul type de procédure (injection intraveineuse, injection au niveau lombaire ou injection cérébrale). Les animaux pourront recevoir des injections chroniques (maximum une injection par semaine pour l'intraveineuse, ou maximum toutes les 2 semaines pour les injections cérébrales), sur une durée maximale de 6 mois. Les injections intraveineuses se feront sous anesthésie générale, avec un délai maximal de 10 minutes entre l'anesthésie et le réveil. Un analgésique local sera administré avant chaque injection. Les injections lombaires et cérébrales se feront également sous anesthésie générale. Compte tenu de la complexité de ces injections, le délai entre l'anesthésie et le réveil est compris entre 30 minutes et 1 heure. Un analgésique global et un analgésique local seront administrés avant chaque injection.
Impact sur les animaux
Les souris SMA type 1 ont une espérance de vie très courte (environ 10 jours). Cela limite les études à long terme sur la maladie ou les traitements. Ces souris présentent des anomalies sévères dès la naissance (faiblesse musculaire extrême, incapacité à se déplacer, à s’alimenter ou à respirer normalement, poids moindre), donc les manipuler n'est pas un acte anodin car elles sont extrêmement fragiles. Le modèle SMA type 3 (forme modérée à légère) présente une progression plus lente. À partir de 3 à 4 semaines de vie environ, ces souris présentent des nécroses sèches au bout de la queue, puis les nécroses évoluent au niveau des oreilles, et beaucoup plus tard (1 an environ) à quelques orteils. Ces nécroses sèches sont attendues chez ces animaux, sans automutilation et n’entravent pas le comportement normal de l’animal (alimentation, déplacements, survie …). Les injections intraveineuses et lombaires peuvent entraîner des douleurs, une légère perte de poids et un risque d’infection au point d’injection. Les injections dans le système nerveux (dans le cerveau avec chirurgie sont des actes nécessitant une chirurgie. Elles peuvent entraîner chez l’animal des douleurs, une perte de poids, des infections, des modifications du comportement (comme une diminution de l’activité, des prostrations, des paralysies en cas de complications).
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés afin d’analyser les différents tissus (muscles squelettiques, cœur, cerveau, foie, rein, cerveau, moelle épinière …).
Remplacement
Dans le cadre de notre engagement envers la règle des 3R, nous procédons systématiquement à une évaluation in vitro de nos molécules actives afin de ne retenir que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques pour les cellules, et ainsi minimiser le recours aux méthodes d'évaluation in vivo. Cependant, pour le développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux est essentielle pour identifier celles qui ont le meilleur potentiel thérapeutique.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire eu utilisant les données préliminaires.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées avec une anesthésie et une analgésie appropriée. Les souris recevront si nécessaire un régime alimentaire additionnel (nourriture gélifiée). Les souris seront inspectées quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. Des mesures précoces pour prévenir toute souffrance ou stress de l’animal seront mises en place grâce à l’utilisation d’une grille scorée pour le suivi des animaux. Ceci permet également d’avoir des points limites précoces permettant de mettre en place des actions avant que les animaux ne souffrent.
Choix des espèces
La souris est l'espèce modèle de référence en recherche biomédicale, notamment pour les pathologies neurodégénératives et les maladies génétiques humaines. Elle présente une grande similitude génétique avec l’humain (environ 95 % de conservation des gènes) et une reproductibilité expérimentale élevée. Par ailleurs, des modèles bien caractérisés de la maladie de l’amyotrophie spinale (SMA) existent chez la souris, permettant une transposition pertinente des résultats précliniques. Le modèle type 1 reproduit une forme grave de la SMA, caractérisée par un déficit de la protéine impliquée, une faiblesse musculaire progressive, une perte rapide de motoneurones. Il permet de tester l’efficacité de traitements précoces et d'étudier les mécanismes pathologiques initiaux de la SMA. Ces souris seront utilisées au stade nouveau-né, car l’injection doit avoir lieu précocement, afin d’étudier les effets du traitement, sur ce modèle présentant une mortalité précoce (souvent avant l'âge de 10 jours sans traitement). Le modèle de SMA type 3 repose sur une mutation génétique similaire mais moins sévère, induisant une forme plus modérée de la maladie, avec une apparition tardive des symptômes et une espérance de vie normale. Il permet d'étudier les effets à long terme des traitements, la récupération fonctionnelle et les conséquences chroniques de la pathologie. Pour toutes ces raisons, ces animaux seront utilisés à partir de l’âge de 3-4 semaines, correspondant au moment d’apparition des symptômes.
Etude des mécanismes pathogènes et des facteurs environnementaux dans un modèle de sclérodermie chez la souris 3/3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
1 214 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 24 injections dans l'abdomen et 40 gavages sur deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent deux instillations dans la gorge sous anesthésie, un prélèvement sanguin, une séance d'imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements. Le porteur indique que le modèle peut provoquer des atteintes cutanées à partir de quatorze semaines, puis une perte de poids et une mobilité réduite, pour étudier une sclérodermie déclenchée par la silice. Toutes sont tuées afin de prélever sang, poumon, rate et peau, une partie l'étant simplement faute de porter le génotype recherché.
Objectifs
La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques. Une partie des animaux seront euthanasiés car sans génotype d'intérêt.
Remplacement
Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.