Recherche appliquée

60 souris rendues obèses par onze semaines d'un régime dont 60 % des calories viennent des graisses vont recevoir soixante-quatorze injections quotidiennes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent quinze pesées, deux mesures de composition corporelle et une session de soixante-douze heures en cage individuelle pour mesurer leurs dépenses énergétiques, isolement que le porteur reconnaît comme une nuisance pour une espèce sociale. Toutes sont tuées pour des prélèvements d'organes. Le projet teste le candidat médicament d'un client à un stade précoce de développement, et le porteur rappelle que plusieurs molécules anti-obésité autorisées ces vingt dernières années ont été retirées du marché pour effets secondaires graves.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus d'1 milliard de personnes en 2022, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un véritable fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (15 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Injection quotidienne de traitements ou du composé de référence ou véhicule (74 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Mesure de dépenses énergétiques (1 session de mesures de 72h)

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les injections de traitement ou véhicule seront source de douleurs légères de courte durée et de stress. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude pour prélèvements d'organes nécessaires à des dosages biochimiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris soumis à une alimentation enrichie en graisses. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par un test statistique adapté.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte âgés de 17 semaines (souris obèses) et de 18 semaines (souris non obèses). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de préconditionnement de 11 semaines de régime enrichi en graisse réalisée chez notre fournisseur.

Nées avec une mutation qui réduit leur poids dès le sevrage, des souris modèles d'une maladie mitochondriale deviennent apathiques entre un mois et un mois et demi, et certaines perdent brutalement du poids puis s'isolent entre quatre et sept mois. Une échographie cardiaque sous anesthésie générale, un test sur tapis roulant et cylindre rotatif, une IRM cérébrale de trente à soixante minutes, deux administrations orales par jour pendant deux mois et trois prélèvements de sang à la veine submandibulaire jalonnent le protocole appliqué à 2 720 animaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range en sévérité modérée les seules nuisances liées aux gestes expérimentaux et décrit à part la dégradation due à la mutation, tout animal isolé dans sa cage ou ayant perdu plus de 20 % de son poids étant mis à mort. Les reproducteurs sont gardés pendant leur phase reproductive, de deux à six mois, puis tués comme tous les autres.

Objectifs

Les mitochondries jouent le rôle essentiel de centrale énergétique dans nos cellules. Les maladies mitochondriales regroupent de nombreuses pathologies héréditaires qui résultent d'un dysfonctionnement du métabolisme énergétique mitochondrial. Ces pathologies ont été associées à de nombreux symptômes incluant désordres du mouvement, cécité, surdité, épilepsie, accidents vasculaires, atteintes cardiaques ou encore neurodégénérescence. Les maladies mitochondriales peuvent débuter à tout âge, de la naissance, dans l'enfance et chez l’adulte jeune. A ce jour il n’existe pas de traitement curatif pour ces maladies. De ce fait, la recherche dans ce domaine des thérapies pour ces maladies mitochondriales est capitale. Nous avons identifié des médicaments candidats pouvant améliorer le fonctionnement des mitochondries. Certaines de ces molécules prometteuses ont été ensuite testées sur des cellules de peau de patients de maladies mitochondriales. Afin de tester les effets bénéfiques de ces médicaments sur un modèle in vivo, nous avons généré des souris présentant une mutation retrouvée chez des patients humains. Notre objectif principal pour ce projet est donc de caractériser en profondeur la pathologie de ces souris et valider l'efficacité des médicaments candidats identifiés, qui pourront ensuite être testés chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet est justifié d'un point de vue scientifique, car il propose d'étudier les effets de médicaments candidats dans les maladies mitochondriales, maladies qui ne bénéficient pas actuellement de traitements curatifs. Le développement d’une médecine mitochondriale est fortement compromis par l’absence de thérapies efficaces avec un nombre limité d'essais cliniques à ce jour. Raison pour laquelle la recherche sur les pathologies mitochondriales humaines s’oriente aujourd'hui résolument vers la thérapeutique. La présence de mutations pathogènes mitochondriales est responsable de maladies mitochondriales sévères et souvent fatales. Ainsi, déterminer l’impact de plusieurs médicaments pourrait permettre de restaurer le fonctionnement mitochondrial, apparaissant comme un objectif important, qui pourrait déboucher sur des essais cliniques pour les patients souffrant de maladies mitochondriales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (30 minutes, 1 fois); Test de la fonction motrice sur tapis roulant et cylindre rotatif (durée variable en fonction des performances des animaux); Imagerie par Résonance Magnétique du cerveau (sous anesthésie, durée 30 à 60 minutes, 1 fois); Administration par voie orale par pipette du médicament supplémenté d’une solution appétante ayant pour but que les souris viennent spontanément prendre le médicament (gavage si nécessaire à l'aide d'une sonde adaptée dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par la technique d’administration orale par pipette ou si la solution appétante ne faciliterait pas le processus) (2 fois par jour pendant 2 mois) et un prélèvement sanguin au niveau de la veine faciale submandibulaire (5 minutes maximum) à 1.5 mois, 2.5 mois et 3.5 mois (1 fois à chaque temps).

Impact sur les animaux

Les souris des deux modèles, présentant une mutation que nous allons utiliser, sont de nouveaux modèles murins pour lesquels nous décrivons un phénotype pour la première fois. Les effets indésirables de cette mutation sur le modèle se traduit par un poids plus faible dès le sevrage et un comportement apathique qui apparaît entre 1 et 1,5 mois pour le modèle KI/KO et entre 2,5 et 4 mois pour le modèle KI/KI. Nous avons observé qu'entre l'âge de 4 mois et 7 mois, certains animaux présentent une perte de poids brutale et un isolement dans la cage. Les jeunes souris peuvent également parfois présenter une dépilation transitoire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale submandibulaire sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquences sur le bien être de l'animal. Dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par administration par voie orale par pipette, le gavage remplacera cette technique. Celle-ci, si utilisée régulièrement, pourrait entraîner un stress chez l'animal, lié au geste de contention et du geste de gavage, et une irritation de l’œsophage lié à la répétition de l'administration.

Devenir

Les reproducteurs seront utilisés pendant leur phase reproductive (2 à 6 mois) puis mis à mort. Pour toutes les autres expériences prévues, tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires humains tels que les fibroblastes de peau pour répondre à certaines questions scientifiques. Cependant ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans les maladies mitochondriales, puisqu'elles ne tiennent pas compte l’ensemble des interactions biologiques existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour la suite du programme de recherche et pouvoir valider et passer aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Aucune expérience inutile ne sera menée. Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, nos expériences solides des méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental par sexe pour la métabolomique. Pour la biologie moléculaire et l'histologie, des groupes de 8 animaux/génotype sont prévus, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux sans compromettre l'obtention de résultats statistiquement valides.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure de Bien-Etre Animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent, et seront pris en charge selon la grille de points limites suivante: Perte de poids 20% = 3 points Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points Isolement: 3 points. A partir de 1 point, un signalement sur la cage avec le numéro de l’animal concerné sera apposé, de telle sorte à ce qu’il y ait une attention particulière lors du contrôle quotidien pour déceler rapidement toute évolution négative, 2 points, surveillance bi-quotidienne de l'animal concerné, 3 points, l’animal est mis à mort en point limite. Pour les procédures de traitements des animaux, nous utiliserons au maximum, à la place du gavage, la technique dite MDA (micropipette-drug administration) qui consiste à donner oralement par pipette le médicament supplémentée d’une solution appétant pour habituer les souris à venir boire spontanément d’elle-même le médicament. En utilisant cette technique, nous évitons le stress et les irritations possibles par le gavage au niveau œsophage.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le présent projet, la souris que nous utilisons est un modèle de maladie mitochondriale unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des médicaments candidats sur les fonctions mitochondriales dans les tissus habituellement affectés dans ces pathologies, que sont le cerveau, les muscles squelettiques et les coeur. Les animaux utilisés pour la mise en place de l'élevage le seront dans leur phase reproductive (2 mois à 6 mois). Pour la caractérisation de la maladie, les animaux seront utilisés entre les âges de 2 mois et 12 mois. De plus, nous traiterons les souris avec des médicaments candidats de l'âge de 1.5 mois à 4 mois dans la phase d'expérimentation de traitements potentiels.

Une nécrose, une ulcération de la tumeur ou une paralysie liée aux métastases comptent parmi les effets que le porteur juge possibles, et déclenchent la mise à mort. 400 souris, immunodéprimées ou immunocompétentes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la mamelle, subissent l'exérèse chirurgicale de la tumeur en vingt minutes, jusqu'à quatre prélèvements de sang sous anesthésie et des micro-prélèvements pouvant aller à deux par jour. Le projet sert à caler les conditions de greffe et les fenêtres de traitement pour de futures études de composés, sans qu'aucun traitement y soit encore évalué, à raison de dix souris par groupe et jusqu'à dix études en un an.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. Les études menées dans le cadre de ce projet seront réalisées chez la souris. Les lignées murines utilisées pourront être immunodéprimée ou immunocompétente. L’objectif de ce projet préliminaire, situé en amont des études d’efficacité anti-tumorale de composés thérapeutiques, consiste à déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur en intra-mammaire (dose cellulaire, souche de souris, utilisation de matrice de membrane basale, etc.), leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études.

Bénéfices attendus

Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur intra-mammaire et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de composés thérapeutiques pour une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.

Procédures

• Sur animal vigile : Administration post-opératoire d’analgésique (2 à 3 fois, 15 s) ; Micro-prélèvement de sang (maximum 2 fois/jour, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) ; Greffe de cellules tumorales (1 injection, 15 s) ; Exérèse chirurgicale de la tumeur (1 fois, 20 min) ; Prélèvement de sang (maximum 4 fois, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal (1 fois, 5 min).

Impact sur les animaux

Douleur légère ou modérée en post chirurgie mammaire. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur, paralysie (dans le cas de métastases).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours ou en fin d’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort.

Remplacement

Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 10 études sera mené sur 1 an. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse associée à un anti-inflammatoires non stéroïdiens et un analgésique opioïde. Les conditions d’asepsie en expérimentation animale seront respectées et la température des animaux régulée. Un traitement analgésique adapté sera dispensé jusqu’à 3 jours après l’intervention et une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée pour s’assurer de la bonne tenue des sutures et de la bonne récupération des animaux. Au-delà de ces jours d’observation post opératoire et dans le cas d’absence de complications, ce suivi sera réalisé, au minimum deux fois/semaine. L’apparence/comportement de l’animal, l’aspect et le volume de la tumeur et la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou la mise à mort de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum deux fois/semaine. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée dans la cage pour faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum deux fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral. Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (jusqu’à 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.

2 120 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune pouvant recevoir le traitement jusqu'à sept fois par semaine et passer deux séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de cellules cancéreuses humaines sous la peau ou dans la prostate, des mesures répétées de la tumeur au pied à coulisse, un prélèvement de sang par semaine à la veine mandibulaire, puis une chirurgie de retrait de la tumeur. Toutes sont tuées pour que les tumeurs et les organes voisins soient prélevés. Le porteur indique que ses molécules ont déjà montré leur efficacité et leur spécificité sur des cellules, et renvoie au conditionnel la stratégie thérapeutique qui serait un jour proposée aux patients, alors que les greffes et les gestes répétés sont, eux, programmés.

Objectifs

Le traitement du cancer par chimiothérapie cible avant tout les cellules à renouvellement rapide dont les cellules cancéreuses mais pas que. Cette absence de sélectivité engendre des effets secondaires importants avec une une toxicité adjacente pour les tissus sains. Les autres traitements tels que les rayons peuvent également toucher les tissus sains autour de la tumeur et l'immunothérapie est un traitement lourd avec des effets secondaires qui altère l'état général car il y a nécessité de stimuler le système immunitaire. Au sein de notre laboratoire, nous avons développé des molécules thérapeutiques anti-cancéreuses dont l’efficacité et la spécificité ont été démontrées. L’innocuité du traitement chez la souris a été vérifié. Nous planifions d’utiliser des modèles tumoraux tels que 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d’oncologie pré-clinique) 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopiques (c’est-à-dire l’organe duquel les cellules tumorales sont issues) comme la prostate. Ces modèles permettront d'évaluer l’efficacité de molécules présentant des propriétés anticancéreuses. 

Bénéfices attendus

Ces molécules thérapeutiques ont déjà montré leur efficacité et leur spécificité sur des cellules Pour valider ces résultats, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans un environnement en 3 dimensions complexe et multicellulaire, idéalement dans leur organe d’origine. C’est pour cela que nous allons réaliser des greffes de cellules cancéreuses humaines qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d’origine. En validant ces résultats chez la souris, nous pourrons à terme proposer une stratégie thérapeutique anti-cancéreuse aux patients qui ciblera spécifiquement la tumeur et aboliera la formation de métastases.

Procédures

Les animaux sont anesthésiés pour les procédures suivantes : - une implantation de cellules tumorales sous-cutanée (

Impact sur les animaux

La répététion des gestes techniques peuvent creer des nuisances chez les animaux . Pour limiter ces effets nous regroupons au maximum ces gestes pendant les séances d'imagerie où les animaux sont sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à l’injection des cellule tumorales sous cutanée avec une aiguille de très faible diamètre. Cette injection dure très peu de temps et n’aura lieu qu’une fois et sur des animaux endormis évitant leur douleur et stress. Par la suite, les gestes techniques : acquisition d’image , mesure du volume de la tumeur avec un pied à coulisse , retrait de la tumeur, prélevement d’un petit volume de sang à la joue auront également lieu sur animaux endormi pour éviter du stress supplémentaire. Une injection de d'une molécule permettant de visualiser la bioluminescence sera réalisée par voie intra péritonéale avec une aiguille de très faible diamètre d’un petit volume adapté qui nécessite quelques secondes de contention indolore. Des nuisances plus importantes peuvent être attendues dans la procédure de la greffe prostatique telles que des difficultés pour les animaux à se redresser completement sur les pattes arrières ou une gène liée à la chirurgie les heures suivantes. Pour limiter et éviter toute douleur et stress liée à la chirugie ou le retrait de la tumeur, les animaux seront sous anti douleur et l’accès à l’eau et la nourriture sera facilitée les heures suivant l'opération. Les animaux peuvent se défaire un point de suture ou la plaie peut ne pas bien cicatriser auquel cas l’expérimentateur refera immédiatement le point et desinfectera la plaie sous anesthésie. Par la suite, le développement de la tumeur peut générer une gène ainsi qu'une baisse de l'état général qui sera au maximum anticipé par l'expérimentateur. L’évolution de la taille de la tumeur sera donc surveillée 2 fois par semaine, sur animaux endormis, par le système d’imagerie in vivo (IVIS) non invasif qui detecte la luminescence de la tumeur.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs seront prélevés juste après l'euthanasie.

Remplacement

Les molécules thérapeutiques ont été caractérisées in vitro avec la même lignée cellulaire utilisée chez la souris. Cependant le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi cellulaire d’une tumeur avec son micro environnement multicellulaire complet. Les études réalisées in cellulo ne permettent pas de conserver et reconstituer le microenvironnement exhaustif des tumeurs et reproduire sa constitution globale, son évolution spatio-temporelle tels qu’ils ont lieu in vivo dans un organisme entier. En effet nous ne pouvons pas in vitro (ni dans les organoïdes, ni dans une flasque de culture) reconstituer tout le micro environnement sécrétoire, le stroma, le système immunitaire et l’endothélium autour des celles tumorales en 3 dimensions qui reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux en expérimentation, nous avons réalisé une étude approfondie de la littérature actuelle concernant les modèles de greffe qu’on utilise pour ne pas reproduire des résultats d’expérience déjà réalisés. Grâce au système d’imagerie in vivo, il est possible de suivre longitudinalement et de manière non invasive les tumeurs bioluminescentes qui se développent au sein des animaux sans nécessiter d’euthanasie. Nous construisons également nos manips pour extraire un maximum d’informations par animal pour éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Un projet pilote est également inclus pour calibrer le protocole et réduire le nombre des animaux nécessaire pour qualifier l’efficacité de la nouvelle molécule.

Raffinement

Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations de la directive 2010/63 EU. Du papier absorbant, du sizzle (lanières de papier kraft), des tunnels seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. Les animaux étant immunodéficients, le statut sanitaire sera strictement contrôlé, l’expérimentateur portera systématiques les EPI adaptés et les animaux seront manipulés sous un poste à sécurité microbiologique. Notre équipe à une expérience solide (>20 ans) dans l’expérimentation animale avec une formation continue des expérimentateurs pour être en cohérence avec les pratiques éthiques les plus récentes et approprié à nos modèles. Cela permet un suivi, une évaluation et une anticipationau plus juste de la souffrance animale. Les expérimentations ont été réfléchie de sorte que la majorité des gestes techniques qui peuvent générer du stress soient réalisées sur animaux endormis. La préhension se fera de cette façon : l’animal sera dirigé doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de le poser sur une grille et d’effectuer la contention de l’animal. Les personnes qui réaliseront la chirurgie possède le diplôme de chirurgie et microchirurgie. Les chirurgies se feront en début de semaine afin de garantir le meilleur suivi des animaux les jours suivant l’opération. Les animaux sont posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie et nous recouvrirons leurs yeux par du gel oculaire afin d’éviter le dessèchement. Les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée par l’expérimentateur. De l’analgésique sera administré aux souris avant et après l’opération pour éviter toute douleur. En complément du tapis chauffant, les animaux seront délicatement déposés entre deux chaufferettes préalablement réglées à 37°C. Les animaux sont remis dans leur cage sur du coton afin d’améliorer leur confort. Des granulés alimentaires déposés dans la cage afin d’éviter le redressement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques. Des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont un excellent modèle d’étude selon plusieurs critères : -La littérature scientifique définit le modèle murin comme pertinent pour étudier le développement tumoral en particulier pour une greffe avec cette lignée cellulaire. -La souche utilisée est immunodeficiente pour limiter le rejet de la greffe. -Leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet . En effet nous nous intéressons à la pathologie du cancer de la prostate chez l’adulte humain. Les souris utilisées dans nos expériences devront avoir atteint un âge considéré comme adulte (après la maturité sexuelle à 6 semaines).

Comprendre comment des zones profondes du cerveau commandent le mouvement et la décision : six macaques rhésus sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur cinq ans. Chacun subit jusqu'à six chirurgies de six heures pour poser des implants crâniens, jusqu'à dix séances d'IRM de quatre heures sous anesthésie, et des sessions quotidiennes allant jusqu'à cinq heures pendant lesquelles de fines électrodes sont insérées dans son cerveau. Le porteur maintient les animaux sous contrôle alimentaire pour "maximiser" leur motivation, et décrit cet accès restreint à la nourriture comme un "levier motivationnel". Deux macaques seront tués pour analyse du cerveau, les quatre autres passant à un projet suivant ou, si leur état le permet, placés en sanctuaire.

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre comment certaines zones profondes de notre cerveau nous permettent de contrôler nos mouvements et de prendre des décisions. Pour comprendre leur rôle exact, nous réaliserons des enregistrements et des stimulations au niveau du cerveau chez le singe macaque, dont le cerveau est très proche du nôtre. L’objectif sera de corréler ces enregistrements et stimulations avec le comportement de l'animal afin de comprendre le lien de cause à effet entre l'activité des neurones des zones étudiées et les actions. Mieux comprendre le fonctionnement normal de ces circuits est une étape essentielle avant de pouvoir comprendre ce qui ne va pas dans certaines maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera surtout des connaissances nouvelles et fondamentales sur le fonctionnement normal de notre cerveau. À court terme il pourrait permettre d’avoir une image beaucoup plus précise du rôle exact joué par une zone spécifique du cerveau dans le contrôle de nos actions et décisions. Il pourrait ainsi être possible de dire comment ces zones spécifiques contribuent à préparer, choisir, démarrer ou exécuter un mouvement. Obtenir ces informations détaillées chez le singe est très important car son cerveau ressemble beaucoup au nôtre et pourrait donc fournir des données cruciales pour l’identification des dysfonctionnements observés dans certaines pathologiques neurologiques. En effet, à plus long terme ce projet contribuera à obtenir une meilleure compréhension de la manière dont ces circuits fonctionnent normalement, ceci constituera la première étape indispensable pour ensuite comprendre pourquoi ils dysfonctionnent dans certaines maladies du cerveau qui affectent les mouvements ou les décisions (comme la maladie de Parkinson, les troubles obsessionnels compulsifs, les addictions...). Ces connaissances fondamentales pourraient, un jour, aider à développer de nouvelles pistes pour des traitements ou à améliorer les thérapies existantes comme la stimulation cérébrale profonde.

Procédures

Les singes seront d'abord entraînés à réaliser des exercices d’interactions avec l’écran. Ces apprentissages peuvent prendre plusieurs mois et seront réalisés à raison de 1 à 5h par session, 5 sessions par semaine sur toute la durée du projet. L’animal est en contrôle alimentaire pendant la durée de ces sessions pour maximiser sa motivation et le nombre d’essai réalisé Une fois entrainés les animaux auront 2 chirurgies sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour mettre en place deux implants sur leur tête (6 heures maximum) avec 3 semaines de récupération minimum entre chaque chirurgie. Ces interventions pourront être renouvelées en cas de perte des implants et avec l’accord du vétérinaire (6 chirurgies au total maximum). Avant et après les chirurgies, ils auront une imagerie par résonance magnétique sous anesthésie générale, ces imageries seront répétées après les premiers enregistrements neurophysiologiques et chaque année pour vérifier l’intégrité des tissus et implants (4heures maximum par imagerie, 10 imageries maximum). Après la première chirurgie, pendant plusieurs mois, lors de sessions quotidiennes de quelques heures (5 jours par semaine maximum, 5h maximum par session), de fines électrodes seront insérées temporairement au niveau du cerveau pour mesurer l'activité des neurones pendant que l'animal vigile réalise les exercices. L’animal sera aussi sous contrôle alimentaire pour augmenter sa motivation. Son dispositif d’enregistrement sera nettoyé avant et après chaque séance (animal vigile, acte indolore, 15 minutes environ). Une dernière intervention sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera faite pour injecter un composé au niveau du cerveau nous permettant de modifier génétiquement certaines cellules nerveuses spécifiques (durée 6h maximum). Après cette chirurgie et un temps d'attente entre un et deux mois, des sessions similaires à l’enregistrement de l’activité des neurones auront lieu, mais cette fois une fibre optique sera insérée pour envoyer de la lumière dans le cerveau et activer ou inhiber les cellules nerveuses modifiées. Une partie des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser des prélèvements et analyses post-mortem d’intérêt. Les autres animaux seront gardés en vie pour une utilisation continue ou pour être replacés dans un centre d’accueil.

Impact sur les animaux

L'entraînement aux tâches comportementales et le maintien de la tête au cours de ces tâches génèrera un stress et un inconfort pour l’animal pendant une durée propre à chaque animal (généralement inférieur à une semaine). L'accès contrôlé à la nourriture pourra créer une légère faim, un risque de perte ou de prise de poids et un stress pour l’animal. Les opérations chirurgicales comportent un risque de douleurs et d’inconfort post-opératoire. Les implants crâniens génèreront un inconfort, seront associés à un risque d’infection et un risque de perte suite à un rejet du matériel. L'injection dans le cerveau peut causer une petite inflammation locale. Les anesthésies générales nécessaires pour les chirurgies et les imageries génèreront un stress pour l’animal à l’induction et seront associées à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiorespiratoires. La stimulation par la fibre optique peut causer un échauffement local extrêmement léger et modifier temporairement le comportement de l'animal (c'est le but de l'étude), ces effets sont temporaires et limités à la durée de la stimulation, mais pourraient éventuellement être associés à un stress ou léger inconfort pour l’animal.

Devenir

Sur les 6 macaques, 2 seront euthanasiés à la fin du projet pour pouvoir analyser précisément leur cerveau afin de répondre à nos objectifs scientifiques. Pour les 4 autres animaux, soit nous les mettrons en utilisation continue dans un futur projet, soit nous chercherons activement à les replacer dans des structures d'accueil spécialisées (sanctuaires ou centres agréés) pour leur retraite, à condition que leur état de santé et leur comportement le permettent (après évaluation vétérinaire). Notre objectif étant de ne pas euthanasier les animaux quand ce n'est pas indispensable pour les vérifications scientifiques finales.

Remplacement

Pour comprendre comment des circuits précis du cerveau contrôlent nos actions et décisions, et pour tester si l'activité de ces circuits est bien la cause des comportements observés, il faut étudier le cerveau en fonctionnement dans un organisme entier. Les méthodes alternatives (cellules en culture, ordinateurs) ne peuvent pas reproduire cette complexité. L'enregistrement direct de l'activité des neurones (électrophysiologie) et leur manipulation ciblée (optogénétique) pendant que l'animal réalise une tâche nécessitent un animal vivant. Le singe est choisi car son cerveau est le plus similaire à celui de l'homme parmi les animaux de laboratoire, rendant les résultats plus pertinents. Les techniques d'imagerie chez l'homme ne sont pas assez précises pour répondre à nos questions. L'utilisation de singes est donc indispensable ici.

Réduction

Nous utiliserons un maximum de 6 singes sur 5 ans. Ce nombre est le minimum nécessaire pour étudier les deux zones cérébrales d’intérêt avec 3 animaux pour chaque zone, ce qui permet des analyses statistiques fiables. Chaque animal participera à toutes les étapes, ce qui maximise les informations obtenues par animal et réduit le nombre total nécessaire. Seuls 2 animaux sur 6 seront euthanasiés pour des analyses post-mortem nécessaires pour répondre à nos objectifs scientifiques, les 4 autres étant destinés à l’utilisation continue ou au replacement. Nous partagerons les tissus des animaux euthanasiés afin de participer à réduire de manière plus globale le nombre de macaques utilisés à des fins scientifique. Si nous obtenons des résultats clairs plus tôt, nous arrêterons le projet avec moins d'animaux.

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation de 2 semaines avant d’entrer en procédure. Ils auront ensuite un entrainement progressif adapté au rythme de chaque animal et réalisé par renforcement positif. Ainsi, l’animal recevra une récompense (nourriture) à chaque comportement attendu durant l’entrainement, pour renforcer la fréquence de ce comportement. Un écran tactile sera fourni en cage pour débuter l’entrainement de manière volontaire avant qu’ils ne soient amenés dans le box de travail. Afin d’obtenir un levier motivationnel pour les tâches plus complexes nous mettrons en place un contrôle de la distribution des aliments, nous suivrons de manière rigoureuse et quotidienne l’équivalent énergétique fourni à l’animal pour nous assurer de couvrir ses besoins journaliers. L’animal sera également pesé chaque jour d’entrainement pour suivre sa courbe de poids et détecter toute variation liée au contrôle. Une diversification de l’apport alimentaire sera mise en place pour fournir des aliments pauvres en calories permettant d’augmenter le temps de disponibilité de nourriture sans influer significativement sur l’apport énergétique fourni à l’animal. Les chirurgies seront optimisées (neuro-navigation, équipe experte et matériel de qualité) et réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée et un suivi post-opératoire de plusieurs jours. Un suivi quotidien rigoureux (comportement et état général) sera assuré tout au long du projet par du personnel qualifié et le vétérinaire. En cas d’anomalie observée un avis vétérinaire sera demandé pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites précis et précoces sont définis et seront appliqués pour éviter toute souffrance. En amont de l'implantation du matériel sur le crâne de l’animal, nous réaliserons une IRM pour localiser précisément les sites d’implantation et d’injection, nous permettant d’optimiser l’implantation et les enregistrements ou stimulations qui seront ensuite réalisés. Les enregistrements de l’activité du cerveau et les stimulations lumineuses seront réalisés via l’implant mis en place et ne nécessiteront donc pas de chirurgie supplémentaire pour l’animal et pourront être réalisés en état vigile (actes non douloureux) grâce à l’entrainement des animaux. Pour la stimulation lumineuse nous utiliserons des paramètres rigoureusement contrôlés pour minimiser l'échauffement tissulaire et surveillerons attentivement les effets comportementaux induits.

Choix des espèces

Nous utilisons des singes macaques rhésus (ou éventuellement cynomolgus en l’absence de rhésus disponible) car leur cerveau, notamment les zones cérébrales qui contrôlent les mouvements et les décisions, est très similaire à celui de l'homme. Cette ressemblance est cruciale pour que nos découvertes sur le fonctionnement de ces circuits soient utiles pour comprendre le cerveau humain. Ces singes peuvent apprendre les tâches complexes nécessaires et les techniques d'enregistrement et de stimulation cérébrales nécessaires dans ce projet sont bien maîtrisées chez eux. Nous utilisons des animaux adultes (3 à 16 ans). À cet âge, ils apprennent bien les tâches, s'adaptent bien à la vie en groupe (important pour leur bien-être), et cela permet d'étudier leur cerveau avant les effets du vieillissement. Cela facilite aussi leur replacement éventuel en fin de projet.