Recherche appliquée

Un lupus provoqué par une injection unique dans le péritoine, une arthrite par deux injections intradermiques, une colite chimique : 540 souris sont soumises à ces modèles inflammatoires puis à des séances d'imagerie de trente minutes, cathéter posé sous anesthésie profonde, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue. Le porteur veut valider un agent de contraste couplé à un anticorps pour visualiser sans biopsie les agrégats immunitaires qui se forment dans les tissus enflammés. Il décrit pourtant, pour la colite, une diarrhée, des saignements et une souffrance de durée possiblement prolongée sur plusieurs jours, et fixe la mise à mort à plus de 20 % de perte de poids ou à un score de grimace supérieur à 1,5.

Objectifs

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats immunitaires de quelques centaines de micromètres qui se développent dans les tissus sous l'effet d'une inflammation chronique. En temps normal, ces TLS possèdent probablement de nombreux avantages en permettant de générer une réponse immunitaire locale. Néanmoins, dans des situations d'inflammation chronique ces structures entretiennent la pathologie présentée. Il a ainsi pu être démontré chez l'homme que la présence de TLS était associé à un mauvais contrôle de la pathologie au cours de rhumatismes inflammatoires, de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ou de pathologies auto-immunes. Afin de visualiser l'inflammation en imagerie, il est possible d'utiliser des agents de contraste magnétiques pouvant être détectés par des techniques d'IRM ou d'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite qui repose sur la détection du signal émis uniquement par les microparticules d'oxyde de fer, et qui permet la réalisation d'une étude corps entier, contrairement à l'IRM) et sélectivement dirigées contre un marqueur inflammatoire spécifique de la structure d'intérêt. Les TLS sont entourées de cellules vasculaires très spécialisées, qui expriment un motif appelé PNAd. Ce motif est reconnu par un anticorps spécifique, qu'il est alors possible de coupler à l'agent de contraste afin de permettre la visualisation des TLS par une approche d'imagerie. Un nouvel agent de contraste biocompatible a récemment pu être développé, ouvrant ainsi la voie à une translation à l'homme. Nous souhaitons donc valider cette approche d'imagerie moléculaire des TLS en utilisant ce nouvel agent de contraste couplé à un anticorps dirigé spécifiquement contre PNAd dans différents modèles précliniques de pathologies inflammatoires ou auto-immunes. Ceci permettrait de valider la possibilité d'une imagerie moléculaire de l'inflammation chez l'homme, par l'utilisation de ce nouvel agent de contraste.

Bénéfices attendus

La présence de TLS au sein des sites inflammatoire a pu être démontrée comme associée à un mauvais pronostic, y compris sous traitement immunomodulateur. L'évolution de la présence et du nombre de TLS a également pu être associée à la réponse thérapeutique. Actuellement, l'identification des TLS au sein d'un organe d'intérêt repose sur l'analyse microscopique du tissu après réalisation d'une biopsie. Cette technique présente de nombreuses limites. Il s'agit en effet d'un examen invasif, avec un risque de complication (hémorragie du site de ponction, perforation...) non négligeable, ce d'autant plus si l'on souhaite évaluer l'évolution des TLS au cours du temps et donc répéter les examens. De plus, l'analyse d'une biopsie n'apporte qu'une information parcellaire et ne permet pas une analyse complète de l'organe d'intérêt. Outre l'absence de vision d'ensemble, le risque de faux négatif est donc important. Enfin, la réalisation d'une biopsie est un examen destructeur, qui empêche donc le suivi d'une structure donnée au cours du temps. Pour toutes ces limites, il apparaît aujourd'hui nécessaire de développer une technique non invasive permettant l'étude, le suivi et la caractérisation des TLS. Le développement et la validation de notre agent de contraste utilisable en IRM dans différents modèles de pathologies inflammatoires permettrait ainsi d'ouvrir la voie de l'imagerie non invasive de l'inflammation en pratique clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront suivis aux interventions suivantes : induction d'un modèle de lupus par injection intra-péritonéale unique (30 secondes) ou induction d'un modèle d'arthrite par deux injections intradermiques sous anesthésie profonde (5 minutes chaque) ; pesées quotidiennes (durée inférieure à 5 minutes) ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie avec injection de l'agent de contraste (environ 30 minutes) ; injection d'un traitement par voie intra-péritonéale (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les modèles de colite utilisés sont susceptibles d'occasionner des effets indésirables chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience dans l'utilisation de ce modèle et des données de la littérature, nous savons que le modèle de colite est susceptible de produire une diarrhée et des des saignements. Il est susceptible d'entraîner une perte de poids chez les animaux, un inconfort physique et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours). Le modèle de lupus est susceptible d'entraîner une ascite, puis l'apparition de douleurs articulaires. L'effet le plus sévère de ce modèle rapporté dans la littérature est la survenue d'un saignement pulmonaire. Néanmoins, les souris utilisées ici, ne présentant pas ce type d'évènement. Le modèle de polyarthrite est susceptible de produire des douleurs et gonflements articulaires. La réalisation de l'imagerie, accompagnée de la pose d'un cathéter veineux peut se traduire par une douleur au point d'injection, une inflammation, une infection du site, une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant PNAd sur des cultures de cellules endothéliales. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier l'affinité de l'agent de contraste pour sa cible moléculaire à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites ci-après sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles de colite, ainsi que selon les données de la littérature et la sensibilité/spécificité des méthodes utilisées. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu (notamment pour les modèles de colite), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps. Pour le modèle de colite, un calcul du nombre de sujets nécessaire a pu être réalisé à partir des données antérieures de l'équipe (8 sujets par groupe, inflaté à 12 pour tenir compte de pertes potentielles ; 16 sujets pour la modulation par un traitement) pour une puissance de 80% et un risque de première espèce de 5%. Concernant les autres modèles, l'utilisation d'une telle modalité d'imagerie n'y a jamais été réalisée. Nous considérons donc qu'il s'agit d'une étude pilote, et qu'il n'est pas possible de réaliser un calcul du nombre de sujets nécessaires.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel ou igloo, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge (points limites cités plus loin). La douleur sera évaluée par utilisation de la par l'utilisation de la mouse grimace scale. Les animaux seront pesés quotidiennement (points limites cités plus loin). Les animaux des groupes colites ou présentant des arthrites bénéficieront d'une coupelle de croquettes humidifiées pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture ad libitum. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 20% ; le score moyen de la mouse grimace scale est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant la pose du cathéter, l'injection des particules ou la perfusion intracardiaque, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une déshydratation seront réhydratés. Les animaux présentant des signes de douleur ou d'inconfort (mouse grimace scale > 0.5, isolement, horripilation, respiration rapide) recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale, une anesthésie locale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude des TLS en conditions inflammatoires. Il faut également noter que la cible de notre traceur (PNAd) est un motif conservé entres espèces, autorisant une translation rapide des résultats obtenus de la souris à l'homme. Dans les modèles de colite, les souris utilisées seront des souris mâles âgées de 8 semaines, stade optimal pour l'induction du modèle. Le modèle de lupus utilisera des souris femelles de souche BALB/c ou C57BL6/J âgées de 8 semaines. En effet, les souris mâles ne présentent pas de phénotype lupique. Le modèle d'arthrite fera appel à des souris DBA/1 de 8 semaines, selon les données de la littérature. Le modèle de vieillissement fera appel à des souris Swiss âgées de 68 semaines, et de 8 semaines pour les contrôles.

36 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, huit d'entre eux étant tués pour le prélèvement d'organes et vingt-huit réutilisés dans d'autres procédures du projet ou d'autres études. Chacun subit jusqu'à huit prises de sang dans une même journée, vingt-cinq au total sur douze semaines, trois prélèvements de ganglions de trente minutes, et pour certains un prélèvement de moelle osseuse. Les anesthésies s'enchaînent sur vingt-quatre heures, dont une de deux heures et, pour une seconde procédure, une de huit heures, que le porteur reconnaît inconfortables. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace un système immunitaire complet, ce qui rend selon lui l'usage d'animaux non-humains "indispensable".

Objectifs

Les immunothérapies sont des traitements qui agissent sur le système immunitaire du patient pour lutter contre la pathologie. Dans le cadre du cancer, les immunothérapies ont pour objectifs de réactiver le système immunitaire affaibli par la tumeur. Dans le cadre des maladies auto-immunes ou maladie inflammatoire chronique, les immunothérapies ont pour but d’inhiber ou de réguler le système immunitaire. Malgré des avancées et plusieurs immunothérapies efficaces, les patients non-répondeurs/en rechutes sont nombreux. Il est donc essentiel de continuer de chercher d’autres combinaisons de thérapie pour améliorer les soins actuels dans le cancer ou maladies inflammatoires chroniques ou aigues.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration, valider l’intérêt thérapeutique et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. La biodistribution de la molécule thérapeutique d’intérêt dans les tissus permettra de renforcer ces données.

Procédures

Les animaux seront soumis à des anesthésies pour effectuer une injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt, à plusieurs prélèvements : - sanguins (au maximum 8 dans une même et seule journée, 25 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 12 semaines maximum) durée 15 min -de ganglions (3, avant et pendant le traitement,) durée 30 min. Des animaux pourront avoir un prélèvement de moelle osseuse (durée 30 min). Des anesthésies prolongées seront effectuées (maximum 2 heures pour une procédure et 8h pour une seconde) lors de l’injection intraveineuse et le prélèvement de ganglions.

Impact sur les animaux

Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h, et notamment une anesthésie prolongée de 2h, lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Une légère douleur peut être induite par le prélèvement de moelle osseuse, qui sera traitée par antalgique.

Devenir

Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de 28 des animaux dans ce projet après accord du vétérinaire et du SBEA pour une nouvelle procédure. Effectivement, un même animal pourra être réutilisé dans une autre procédure de cette même étude, mais également dans un protocole d'une autre étude. Les 8 animaux (ré-)utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule seront mis à mort pour permettre le prélèvement de différents organes, ces animaux auront pû précédemment étre utilisés dans une procédure expérimentale légère ou modérée.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires, sur des lignées cellulaires, sur des cellules et biopsies humaine (ex vivo) ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Des analyses computationnelles de banques de données humaines et animales ont également permis de confirmer la cohérence des traitements étudiés. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.

Réduction

Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum,. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, un nombre minimal d’animaux est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude Pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule. Dès que cela est possible, les animaux seront réutilisés entre les différentes procédures expérimentales de la même molécule ou d’une autre molécule, cela permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé dans ce projet. Lors de l’étude, les animaux seront leur propre contrôle. Si une dose testée répond à toutes les attentes, les autres doses ne seront pas étudiées. Une étude bibliographique approfondie de l’art antérieur sera effectuée pour espère trouver cette dose. Si une molécule n’a pas un profil satisfaisant pour passer en essai clinique chez l’homme, l’étude complémentaire au niveau tissulaire ne sera pas effectuée.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées chez le macaque sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique Les animaux sont hébergés avant et après protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes dont le système immunitaire est alors mature.

Infestés par des coccidies à six jours d'âge, 252 des 288 poulets de ce projet subissent ensuite vingt-quatre pesées individuelles, vingt-deux écouvillonnages cloacaux et une à deux prises de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués en fin d'expérimentation pour que leur tube digestif soit prélevé et les lésions comptées. L'objectif est de comparer une race décrite comme résistante et une lignée commerciale, afin d'estimer ce que la sélection génétique pourrait apporter contre une maladie dont le porteur souligne d'abord le "fort impact économique". Il annonce des "signes subcliniques transitoires" sur vingt-quatre à quarante-huit heures, sans mortalité ni signe clinique sévère, sans préciser ce que ce terme recouvre.

Objectifs

L’amélioration de la résistance des élevages aux maladies infectieuses est nécessaire pour promouvoir le bien-être des animaux, de même que pour contribuer à la réduction de l’utilisation d’antimicrobiens. Parmi les maladies fréquemment rencontrées en élevage, la coccidiose du poulet est particulièrement intéressante en raison de son fort impact économique. L’objectif de ce projet est d’explorer et de comparer la sensibilité, l’infectiosité, la durée d’infection, la tolérance et la croissance compensatrice chez deux races de poulets suite à une infection. L’une des races étant décrite comme résistante à la coccidiose et l’autre étant une lignée commerciale. Nous regarderons et analyserons les différences entre animaux et entre génétiques, de même que les mécanismes de transmission de la maladie.

Bénéfices attendus

La coccidiose est une des maladies les plus fréquentes chez les volailles. Pourtant, à ce jour, aucune donnée n’est disponible concernant la variabilité inter-individuelle au sein des poulets de chair concernant la sensibilité, l’infectiosité, la durée d’infection, la tolérance et la capacité de croissance compensatoire après une infestation. Notre projet est donc une première étape pour estimer le potentiel de la sélection génétique sur ces caractères. A plus long terme, ce projet permettra l’utilisation des courbes de poids individuelles pour retracer la dynamique d’une épidémie au sein d’une large population, étape nécessaire pour estimer des paramètres génétiques pour des caractères dits « sociaux » tels que la sensibilité et l’infectiosité. Il permettra également d’orienter la sélection génétique sur des caractères favorisant la santé animale face à une maladie infectieuse en prenant en compte les mécanismes de transmission d'un animal à un autre.

Procédures

Sur les 48 parquets de 6 poulets chacun, 42 poulets seront soumis à une infestation coccidienne expérimentale unique. L’inoculation se fera, sur animaux vigiles, à 6 jours d’âge et chaque inoculation durera moins de 20 secondes. Les 288 poulets du projet auront 24 pesées individuelles et 22 prélèvements par écouvillon cloacal. Les pesées sans prélèvement (au nombre de 2) seront faites sur animaux vigiles et la durée sera inférieure à 10 secondes par animal. Les pesées avec prélèvement (au nombre de 22) seront faites sur animaux vigiles et la durée sera de 30 secondes maximum. Les 288 poulets du projet auront une prise de sang à 5 jours et, parmi eux, 240 poulets en auront une seconde à 35 jours. Chaque prélèvement se fera sur animal vigile et durera moins de 15 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets négatifs sur les animaux sont liés à l’infestation coccidienne, aux prises de sang et aux prélèvements par écouvillons cloacaux. Infestation : présence de signes subcliniques transitoires, sur 24h (48h maximum), au moment du pic d’excrétion des coccidies, soit environ 4 à 7 jours d’après l’infestation. La contention lors des inoculations peut également engendrer un stress léger et passager pour l'animal. Prises de sang : douleur légère et transitoire (inférieure à 15 secondes) générée par la pénétration de l’aiguille et stress léger et passager lors de la contention. Prélèvements cloacaux : stress léger et passager lors de la contention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à des fins de prélèvements du tube digestif pour la recherche et le dénombrement de lésions liées à la coccidiose.

Remplacement

Avant la mise en place de ce projet, nous avons développé un modèle in silico de simulation d’une épidémie de coccidiose en élevage. Ce modèle se base cependant sur de fortes hypothèses et ne prend pas en compte la variabilité inter individuelle. A ce jour, il n’existe pas de méthodes pour étudier les réponses physiologiques individuelles des individus face aux parasites (ici les coccidies) auxquels ils sont exposés. En effet, le développement d’une coccidiose et la réaction à la maladie (sensibilité, tolérance…) varient fortement d’un animal à l’autre. Enfin, l’analyse des contenus digestifs en fin de procédure, nécessite obligatoirement le recours à des animaux.

Réduction

Dans notre projet, les 288 poulets sont répartis en trois modalités dont 36 poulets dans la modalité témoin (6 répétitions de 6 animaux). Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum nécessaire, pour d’une part maintenir des relations sociales (6 animaux par répétitions) et d’autre part pour trouver des différences significatives sur la base de l’indice de consommation (6 répétitions). Dans les 2 autres modalités infestés par la coccidiose, les 21 répétitions par modalité sont nécessaires pour détecter des différences significatives de sensibilité et d’infectiosité entre les deux lignées génétiques. Aussi, avec 252 animaux au total dans ces deux modalités (126 par lignée génétique), nous aurons le nombre d’animaux nécessaires pour réaliser des statistiques fiables et trouver des différences significatives pour évaluer les caractères « individuels » comme la durée d’infection ou les caractères liés au poids (tolérance et rapidité de la croissance compensatrice)

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des parquets (petits enclos où se trouvent les poulets), au sol sur des copeaux et en groupe (6 par parquet) afin de créer des relations sociales. Des ficelles et des pierres à piquer seront installées dans chaque parquet en tant que matériel d’enrichissement. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d’alimentation et de soins, selon des normes mieux-disantes que celles prévues par la règlementation. Dans ce projet, nous avons porté une vigilance particulière aux conséquences de l’infestation que nous avons choisi : il n’entrainera ni mortalité, ni signes cliniques sévères. Seuls des réductions de consommation alimentaire et des ralentissements de croissance sont attendus. Toutes les contentions seront réalisées dans le calme par des personnes expérimentées. Afin de limiter le nombre de contentions, les prélèvements cloacaux se feront juste après la pesée. Le matériel de pesée sera adapté à la taille et à la morphologie des animaux. Lors des prélèvements de sang nous utiliserons une garde d’aiguille pour sécuriser le prélèvement. Une grille d’évaluation du bienêtre des animaux, basée sur leur comportement et leur état de santé, est complétée quotidiennement par le personnel animalier afin de détecter toute altération de leur état de bien-être. Pour chaque paramètre d’atteinte au bien-être, nous avons défini plusieurs niveaux d’action.

Choix des espèces

S'agissant d'un objectif finalisé sur la santé des volailles, le choix du poulet (gallus gallus) a été fait car il s’agit l'espèce majeure sur le terrain et un modèle reconnu par la filière. Les poussins arriveront dans notre élevage à 1 jour d’âge mais l‘infestation coccidienne n’aura lieu qu’à 6 jours d’âge. Cela permettra d’avoir des premières excrétions d’oocystes entre 10 et 20 jours, âge auquel les infestations aux coccidies apparaissent en élevage. Nous étudierons ensuite les animaux infestés sur toute la durée d’élevage, c’est-à-dire jusqu’à 35 jours.

Privées de nourriture pendant 72 heures au maximum, une ou plusieurs fois, huit vaches Prim'Holstein taries subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec quatre prises de sang à la queue par phase. Le but est de calibrer l'intensité de restriction qui déclenche un déficit énergétique, pour bâtir un modèle servant ensuite à tester des additifs alimentaires censés limiter la baisse de production laitière. Le porteur ramène l'impact à un "stress et/ou une fatigue temporaire", tout en prévoyant de distribuer de la paille aux vaches qui émettent des vocalises inhabituelles et ininterrompues, et d'écarter de l'expérience celles qui perdent plus de 5 % de leur poids. Les huit vaches restent en vie à l'issue et pourront être réutilisées dans un autre projet.

Objectifs

Après la mise-bas, les besoins énergétiques de la vache laitière sont multipliés par 2 ou 3 afin de couvrir les besoins liés au démarrage de la lactation. Lorsqu’ils ne sont pas suffisamment couverts par l’alimentation, l’animal se retrouve en déficit énergétique. Afin de pallier ce manque, une mobilisation des réserves corporelles est entraînée, ce qui conduit finalement à la synthèse de composés sanguins spécifiques. Ces composés sanguins vont venir s’accumuler dans le foie et le sang. Chez la vache laitière, ils peuvent entraîner une diminution de la production de lait. Un déficit énergétique et une mobilisation des réserves corporelles peuvent être induits par le biais d'une restriction alimentaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’intensité de la restriction alimentaire nécessaire pour atteindre un déficit énergétique et une libération des composés sanguins spécifiques à ce dernier chez la vache. Ce projet servira à la mise en place d’un modèle pour évaluer des solutions nutritionnelles limitant le déficit énergétique post-partum.

Bénéfices attendus

A terme, cette étude permettra de déterminer la restriction alimentaire nécessaire à l’apparition d’un déficit énergétique identifiable à l’aide de marqueurs sanguins. Cela permettra de mieux comprendre les systèmes de régulation mis en place par l’animal afin de compenser le déficit énergétique. Sur le long terme, ce projet servira à mettre en place un modèle de déficit énergétique chez la vache laitière pour évaluer la pertinence de traitements/additifs à ajouter dans la ration afin de limiter la diminution de la production laitière.

Procédures

Un total de 8 vaches seront soumises à une ou plusieurs restrictions alimentaires sur 72h maximum. Afin de suivre l’évolution des biomarqueurs, une prise de sang aura lieu tous les matins, avant la prise alimentaire, sur chaque vache pendant les 72 heures, ainsi qu’une prise de sang avant le démarrage du déficit (soit 4 prises de sang par vache et par phase). Chaque prise de sang aura une durée inférieure à 3 minutes.

Impact sur les animaux

La durée de la restriction alimentaire sera de 72 heures maximum. Les prélèvements sanguins peuvent induire un stress lors de la manipulation des animaux ainsi qu’une douleur transitoire au moment de l’introduction de l’aiguille. Un hématome et/ou une inflammation locale peut apparaitre à la suite du prélèvement. La restriction alimentaire peut induire un stress et/ou une fatigue temporaire pour l’animal.

Devenir

Les vaches seront gardées en vie à l’issue de ce projet et resteront au sein de l’établissement utilisateur. Elles pourront être réutilisées dans le cadre d’un autre projet.

Remplacement

Les effets du déficit énergétique sur le métabolisme étant complexes et touchant plusieurs fonctions métaboliques, son évaluation à l’aide de méthode in vitro reste difficile. L’intérêt de ce projet porte également sur les biomarqueurs sanguins en lien avec le déficit énergétique, ce qui n’est pas mesurable autrement que directement sur l’animal. De plus, la réponse physiologique à une restriction alimentaire est propre à chaque animal et ne permet pas d’exclure l’utilisation d’animaux pour ce projet. Il est donc nécessaire de tester le protocole sur l’ensemble des animaux pour s’assurer qu’au moins 75% des vaches (soit 6 animaux sur 8) montrent une réponse physiologique au déficit énergétique.

Réduction

Un total de 8 vaches sera présent pour la réalisation de la procédure afin de s’assurer qu’au moins 75% des vaches (soit 6 animaux sur 8) présentent la réponse physiologique souhaitée (augmentation des composés sanguins recherchés pour ce projet) avec une des restrictions testées.

Raffinement

Pendant la procédure expérimentale, les vaches seront logées en stabulation sur sciure. La stabulation leur permet de se déplacer librement en dehors des repas et d’être au contact de leurs congénères. Le nombre de tentatives de prise de sang à la queue sera limité à 3 par vache afin de limiter le stress et la douleur occasionnée par la ponction à cet endroit. En cas de vocalises inhabituelles et ininterrompues, les vaches recevront de la paille. Si une vache dépasse le niveau maximal d'un composé sanguin spécifique, elle recevra immédiatement un apport d'énergie rapide, matin et soir pendant 6 jours. En cas de refus supérieur à la moitié du repas distribué sur deux repas consécutifs, l'animal sera sorti de l'expérimentation. Une perte supérieure à 5% de son poids entrainera l'exclusion de l'animal de l'expérimentation.

Choix des espèces

Les animaux choisis sont des vaches adultes Prim’Holstein taries pour correspondre au modèle scientifique de référence et pour correspondre à l’espèce cible (vaches laitières). Les phénomènes physiologiques et biomarqueurs sanguins que nous souhaitons étudier sont spécifiques de l’espèce bovine, ce qui implique qu’il n’est pas possible de remplacer cette espèce par une autre. Les animaux sont des vaches adultes taries (âgées de 7,5 à 14,5 ans). Ces vaches sont nourries avec une ration identique pendant plus de 21 jours, elles possèdent donc une flore microbienne ruminale stable (contrairement à celle d’animaux en croissance), optimisant ainsi la fiabilité des résultats.

Jusqu'à trente-deux injections dans le péritoine en quatre semaines, plus une tumeur colorectale greffée et, pour une partie d'entre elles, une pompe à médicament implantée sous la peau : 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur s'attend à une gêne de la locomotion liée au volume de la tumeur, à une possible nécrose de la masse tumorale, et à une immunosuppression exposant les souris à un risque infectieux accru. L'objectif est de tester un peptide anticancéreux breveté associé à des chimiothérapies courantes, dans une étape que le porteur qualifie de prérequis "indispensable" avant la clinique. Les procédures sont conduites en priorité sur des femelles, pour rester cohérentes avec des travaux antérieurs menés eux aussi uniquement sur des femelles.

Objectifs

Le cancer est la première cause de mortalité prématurée en France et le nombre de cas de cancer diagnostiqués est en constante augmentation depuis 30 ans, du fait du vieillissement de la population. En 2023, le cancer colorectal (CRC) est le deuxième cancer le plus fréquent chez l’homme et la femme et la survie à 5 ans des patients atteints de CRC est de 69% (INCa). Au sein du microenvironnement tumoral (humain et murin), la cible du candidat médicament est une protéine de la matrice extracellulaire qui est exprimée, voire fortement surexprimée dans les cancers tels que les colorectaux et ovariens. Ainsi, cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le CRC. Dans le cadre du CRC, les dépistages préventifs permettent une prise en charge précoce dans le développement de la maladie, cependant, il existe encore un besoin d’identifier de nouveaux agents thérapeutiques permettant de prolonger la survie des patients et d'outrepasser les résistances. Dans l’optique du développement de telles molécules, les modèles expérimentaux chez la souris permettent d’étudier la biologie de la tumeur en réponse à de nouveaux traitements. Le candidat médicament étudié dans cette procédure est un peptide anticancéreux ayant fait l’objet d’un brevet et qui permet de lever l’interaction entre une protéine de la matrice extracellulaire et l’un de ses ligands, une protéine membranaire présente à la surface de nombreux types cellulaires. Par la levée de cette interaction protéique, le peptide induit une diminution de la croissance tumorale liée à une augmentation de l’infiltrat immunitaire ainsi qu’une diminution de l’angiogenèse, et ceci dans différents types de modèles cancéreux. Ce candidat médicament a déjà fait état de fortes propriétés anti-tumorales en laboratoire et en développement préclinique réglementaire en vue de son utilisation en thérapie humaine. L’objectif de ce projet est d’évaluer le bénéfice de l’utilisation de ce traitement en combinaison avec deux autres types de thérapies couramment utilisées en clinique : la chimiothérapie et l’immunothérapie. Les capacités anti-tumorales du candidat médicament seront évaluées dans un modèle de CRC, décrit pour exprimer la protéine ciblée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus consécutifs à la levée de l’interaction entre la protéine cible et son ligand par le peptide anticancéreux sont une diminution de la croissance tumorale liée à une augmentation de l’infiltrat immunitaire ainsi qu’une diminution de l’angiogenèse. C'est dans l'objectif de répondre à ces deux questions que le modèle CT26 de CRC a été choisi pour cette étude. En effet, celui-ci est décrit dans la littérature pour favoriser l'étude de l'infiltrat immunitaire dans des modèles syngéniques de souris immunocompétentes. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de consolider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée au peptide anticancéreux dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo (tumeur vascularisée et système immuno-compétent). Cette étape, permettant de compléter l’étude du mode d’action du peptide anticancéreux en combinaison avec d’autres thérapies couramment utilisées en clinique, constitue un prérequis indispensable à la compréhension de ses mécanismes d’action dans l’anticipation de son utilisation en clinique afin d’améliorer la prise en charge et le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 types d’interventions : - Injection des cellules tumorales de cancer colorectal sous anesthésie gazeuse, toutes les souris sont concernées, une fois au début des 3 procédures expérimentales, temps de manipulation estimé à moins de 15min -Injection en intraveineuse dans la veine de la queue en condition vigile, 15 à 75 souris concernées, pour un maximum de 12 fois durant la période de traitement, temps de manipulation estimé à moins de 5min - Injection intrapéritonéale, 105 à 195 souris concernées, pour un maximum de 10 fois pendant la période de traitement de la procédure 1, un maximum de 28 fois sur 4 semaines pour la procédure 2 et un maximum de 32 fois sur 4 semaines pour la procédure 3, temps de manipulation estimé à moins de 5min - Prélèvement sanguin dans une veine de la patte arrière en condition vigile, toutes les souris sont concernées, une fois à la fin de la période de traitement, pour un temps de manipulation estimé à moins de deux minutes. - Chirurgie sous anesthésie gazeuse pour la pose des pompes de diffusion du médicament en sous la peau, 30 à 120 souris concernées, une fois en début de la période de traitement pour un temps de manipulation estimé à moins de 15 min.

Impact sur les animaux

Des nuisances ou effets indésirables pourraients provenir de différentes sources dans ces procédures. L’ensemble des gestes réalisés sur les souris necessitant des contentions et manipulations répétées, un stress ponctuel ou chronique pourrait être constaté. La modèle de croissance tumorale pourrait induire une cachexie : d’après la biblio, la cachexie apparaît principalement au stade métastatique du développement tumoral environ 5 à 6 semaines suivant l’inoculation des cellules tumorales. Il est donc peu probable que la cachexie apparaisse après les 4 semaines estimées de procédure néanmoins le risque que quelques animaux en présentent n’est pas totalement exclu. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral en raison de la localisation de la tumeur pourrait aussi être attendue. Une inflammation ainsi qu’une nécrose pourraient être constatées sur la masse tumorale. Le recours à des traitements standard anticancéreux) pourraient induire des effets secondaires comme une perte de poids, une deshydratation, de la fatigue, ainsi que de l’immunosuppression, exposant les souris à un risque infectieux plus élevé. De plus, ces traitements étant administrés de manière répétées et en conditions vigiles, les souris pourraient être exposées à un stress ponctuel (quelques minutes) ou chronique (plusieurs jours, stéréotypie) ainsi qu’une douleur ponctuelle (quelques secondes) ou chronique, les injections en intrapéritonéale ou en intraveineuse pouvant être sources d’inflammation ou d’hématomes. Une mauvaise cicatrisation ou une infection à la suite de la procédure chirurgicale pour la pause de pompes osmotiques pourrait survenir. En effet, malgré les précautions de traitements et la surveillance accrues des animaux, une douleur, un infection ou un hématome de plusieurs jours pourraient être constatés sur le site chirurgical. Lors des différents recours à l’anesthésie gazeuse, les souris pourraient présenter des signes de grand ralentissement du rythme respiratoire ainsi que des signes d’hypothermie. Enfin, le prélèvement sanguin dans la veine saphène en condition vigile pourrait êre une source de stress et de douleur ponctuels ou d’hématome si les conditions d’hémostase après le prélèvement ne sont pas respectées.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de limiter la douleur et/ou l’inconfort liés au développement des tumeurs.

Remplacement

La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de consolider les résultats obtenus in silico, in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée au peptide anticancéreux dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo (tumeur vascularisée et système immuno-compétent). En effet, une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. Ainsi, nous devons recourir au modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du peptide anticancéreux en combinaison avec d’autres thérapies.

Réduction

Les souris mâles et femelles pourront être considérées dans les procédures de ce projet afin de pouvoir identifier, si necessaire, une réponse différentielle liée à la synthèse hormonale. Car au cours d’une de nos études préliminaires, aucun effet hormonal n’a été observé sur la croissance tumorale dans des souris males et femelles non traitées et porteuses de tumeurs. Cependant, nos précédentes études d’efficacité du peptide anti- cancéreux ayant été réalisées exclusivement chez la femelle, afin de maintenir une cohérance, les procédures seront prioritairement réalisées chez la femelle. Si une efficacité d’une des bi-therapies ou de la tri-thérapie est démontrée, une étude exploratoire sur des mâles sera programmée afin de pouvoir identifier une éventuelle réponse différentielle liée à la synthèse hormonale. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées. Pour l’ensemble des procédures, le nombre de souris par groupe est déterminé statistiquement. Lors de la réalisation de ces procédures, des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux, à savoir, une randomisation afin de répartir les animaux dans les différents groupes de traitements.

Raffinement

Une observation quotidienne sera réalisée afin de garantir le bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou stress. Une anesthésie à l’isoflurane aura lieu lors de l’injection des cellules tumorales, de la pose chirurgicale des pompes, du suivi de la croissance tumorale, et au préalable de l’euthanasie. Un anti-douleur sera délivré à l’anesthésie pré-opératoire puis 24h après le geste afin de prendre en charge les douleurs opératoires et post-opératoires. Un anti-inflammatoire non stéroïdien sera délivré à l’anesthesie pré-opératoire puis 24h après le geste pour prévenir de l’inflammation provoquée par la chirurgie. Pour chaque manipulation sous anesthésie de plus de 5min les souris seront placées sur un tapis chauffant pour le maintien de la température, un gel oculaire leur sera administré et le reveil se fera sous lampe chauffante pour prévenir l'hypothermie. L’ensemble des procédures seront réalisées dans un environnement calme et par un personnel formé à la manipulation et la contention de l’espèce souris, aux injections, à la pose chirurgicale de pompes, aux prélèvements sanguins et à l’euthanasie par dislocation cervicale. Dans le cadre des injections répétées, une alternance des sites d’injection sera réalisée pour limiter la douleur et le stress de l’animal. Dans le cadre du prélèvement sanguin, une hémostase d’au moins 3sec sera réalisée pour limiter la douleur et le risque d’hématome. Afin de limiter le stress de la manipulation et la contention lors du suivi de la croissance tumorale qui sera réalisée tous les 2-3j à partir de l'injection des cellules, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane. Une attention sera portée à l'observation des points limites fixés tout au long du projet pour éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l'animal sera euthanasié. Un soin sera apporté aux conditions d'hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement, vie en groupe, surveillance quotidienne).

Choix des espèces

-Souris génétiquement identique de la lignée de carcinome colorectal. Travaux antérieurs justifiant de la pertinence de ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de la combinaison d’agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. -Homologie de la protéine cible -Travaux précédents réalisés sur le peptide thérapeutique dans cette espèce Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront receptionnées à l’animalerie à l’age de 6 à 7 semaines et utilisées seulement après une période d’acclimatation d’au moins 7 jours. L’injection des celllules tumorales sera réalisée sur des animaux agés de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte chez cette espèce (entre 2 et 6 mois).

Pour savoir dans quels organes s'accumule un candidat médicament contre le diabète de type 2, quatre macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois reçoivent le produit par injection lente dans une veine de la jambe, isolée de la circulation générale par un garrot, sous anesthésie et pendant une heure environ. Ils subissent ensuite seize prises de sang sur dix-sept semaines et quatre biopsies sur chaque quadriceps, avec des œdèmes, des hématomes et une boiterie aiguë parmi les effets attendus, puis sont mis à mort cent treize jours après l'injection pour que leurs organes soient prélevés. Le quatrième, dit "pilote", sert uniquement à roder la technique d'injection et reste en vie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de comprendre comment un nouveau candidat médicament contre le diabète de type 2 agit dans le corps : comment il circule, combien de temps il reste actif, quels effets il produit et dans quels organes il s’accumule. Le candidat médicament testé bloque sélectivement avec certains gènes impliqués dans la résistance à l’insuline, mécanisme central du diabète de type 2. Contrairement aux traitements qui contrôlent principalement la glycémie, ce candidat médicament vise donc à corriger la cause physiopathologique sous-jacente de la maladie. L’hypothèse est qu’une administration unique de ce médicament permettra d’induire une amélioration durable de la sensibilité à l’insuline des patients et, par conséquent, un meilleur contrôle métabolique. Cette étude préliminaire sur primate est nécessaire pour déterminer les caractérisitiques principales du produit une fois administré dans un organisme entier, avant de futurs études précliniques et cliniques. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de ce candidat médicament. L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, les dosages utilisés dans ce projet sont efficaces mais a priori non toxiques (d’après des études toxicologiques préliminaires).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont à terme la validation et la mise sur le marché d’un traitement innovant pour le diabète de type 2, qui pourrait être administré en une seule injection et offrir des effets durables. Ce médicament pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients en réduisant les contraintes liées aux traitements chroniques.

Procédures

Après plus un mois d’acclimatation et d’habituation, 3 animaux recevront une seule fois le candidat médicament par injection intra-veineuse sur membre isolé (injection lente du produit dans une veine sur une jambe coupée de la circulation sanguine générale à l’aide d’un garrot). L’intervention durera environ une heure et sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun de moins de 16h). Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration du candidat médicament sur animal vigile afin d'étudier sa concentration dans le sang au cours du temps et de mesurer certains paramètres physiologiques des animaux (16 prélèvements sanguins seront réalisés sur une période de 17 semaines). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. 4 biopsies de muscles seront réalisées sur chaque quadriceps (à minimum un mois d’intervalle). L’intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun) durera environ 30 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée sera réalisée chaque semaine. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x le jour de l’administration, et 1x/jour 3 jours après administration. Le projet prendra fin 113 jours après administration de du candidat médicament et les 3 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes. Un 4eme animal sera utilisé uniquement pour la mise au point technique et au raffinement de la procédure d’administration de du candidat médicament (l’animal ne subira aucun prélèvement ou autre manipulation au cours du projet). Cet individu recevra une injection de solution physiologique inerte et ne sera pas exposé au du candidat médicament. L’animal bénéficiera d’une période d’acclimatation et d’un suivi clinique rapproché au même titre que les 3 animaux du projet principal. Il sera gardé en vie à l’issue du projet.

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux. L’administration du candidat médicament (sous anesthésie et analgésie) peut provoquer une douleur légère, un œdème aigue (durant environ 24h maximum), des hématomes et une boiterie aigue (se résorbant en quelques heures). Les biopsies de muscles sous anesthésie et analgésie pourront provoquer des douleurs légères ainsi que des réactions locales au niveau du site de ponction ou une infection post-opératoire. L'anesthésie des animaux dans le cadre de ces interventions (biopsies et administration) pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

Les 3 animaux qui recevront une injection du candidat médicament seront mis à mort afin de récolter leurs organes pour déterminer dans quels tissus le produit s’accumule. Seul l’animal « pilote » n’ayant pas reçu le candidat médicament sera gardé en vie.

Remplacement

Les études pharmacocinétique, pharmacodynamie et de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer combien de temps un médicament reste actif, son efficacité et sa localisation dans les tissus. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, les paramètres étudiés dans ce projet dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 4 animaux seront utilisés, 3 pour le projet principal qui subiront l’ensemble des manipulations et 1 animal « pilote » utilisé uniquement pour la mise au point technique du modèle d’administration du médicament. Concernant les 3 premiers animaux : Chaque animal recevra une dose différente du candidat thérapeutique (faible, intermédiaire, élevée). Cette approche permet de tester l’ensemble des doses potentiellement efficaces chez l'Homme, sans multiplier les groupes. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, elle ne nécessite pas d’utiliser de grands groupes d’animaux pour réaliser des tests statistiques. En amont de l’utilisation de ces 3 animaux, un 4eme animal sera utilisé uniquement pour la mise au point technique de la procédure d’administration du médicament. L’ajout de cet animal « pilote » permet de sécuriser et d’optimiser la procédure avant l’administration du candidat thérapeutique, évitant ainsi toute perte ou souffrance inutile. En fonction des résultats obtenus à partir de cet animal, l’administration du médicament pourra donc être adaptée pour raffiner la procédure.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant un mois avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les biopsies et l’administration du candidat médicament seront réalisées sous anesthésie et analgésie et un traitement analgésique post-opératoire sera mis en place. L’animal « pilote » bénéficiera d’un programme d’enrichissement, d’une période d’acclimatation et d’un suivi clinique rapproché au même titre que les 3 animaux du projet principal. En fonction des résultats obtenus à partir de cet animal, l’administration du candidat médicament pourra être optimisée afin de raffiner la procédure. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les primates sont utilisés comme modèle de recherche avant de tester certains traitements chez l’Homme. Leur système immunitaire réagit de façon très semblable au nôtre, ce qui permet de prévoir d’éventuelles défenses du corps contre le traitement. Leur grande proximité génétique et physiologique avec l’Homme les rend aussi très utiles pour étudier combien de temps le traitement reste actif, comment il agit et dans quels organes il se diffuse. Ainsi, son emploi est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. À ce stade de développement, les animaux présentent un système immunitaire pleinement fonctionnel, comparable à celui d’un patient adulte, ce qui est indispensable pour évaluer la réponse du corps vis-à-vis du candidat médicament testé. Leur organisme a atteint la maturité physiologique et métabolique, mais ne subit pas encore de variations néfastes liées au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes permet de réduire les facteurs associés à des pathologies liées à l’âge qui pourraient interférer dans l’analyse des résultats et la qualité des échantillons prélevés. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

8 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit trois administrations d'anticorps sur une chaise de contention, quarante minutes par séance, subit vingt-trois prélèvements sanguins pour 74 ml au total, quatre biopsies de peau sous anesthésie, et cinq isolements de moins de six heures sans eau ni nourriture pour récolter son urine. Le porteur s'attend à des lésions cutanées, à de la fièvre et à d'éventuelles déhiscences de plaie. Il présente cette étape comme "indispensable", son objet immédiat restant de choisir laquelle des quatre formulations passera en étude de toxicité réglementaire, et affirme qu'aucune méthode alternative n'apporterait le même niveau d'information qu'un "organisme vivant entier".

Objectifs

Ce projet va permettre d’évaluer les effets et le devenir de quatre formulations composées d’anticorps administrées à la même dose de manière répétée (x3) chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) dans le cadre du développement d’un traitement anti-cancéreux chez l’homme. L’étude permettra de sélectionner la formulation la plus pertinente pour une future étude de toxicité réglementaire. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de sélection du candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’une nouvelle modalité d'anticorps multifonctionnels capable de créer une monothérapie anticancéreuse ciblée et puissante. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de sélectionner le meilleur candidat mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Tous les animaux du projet auront les mêmes procédures. Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à trois reprises un candidat médicament. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Les animaux auront également 23 prélèvements de 1 à 9,3ml, pour une volume total prélevé de 74 ml sur 5 semaines. Les animaux seront vigiles. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris) Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie comprise) Cinq récoltes d’urine (environ 2 ml) seront également réalisées. Pour cela, les animaux seront isolés dans les compartiments de la volière afin de réaliser une collecte d’urine individuelle. Les urines seront récoltées de manière non invasive L’isolement durera moins de 6 heures. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible cutanée, des lésions au niveau de la peau pourront être observées. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Une réaction systémique de type fièvre peut éventuellement apparaître les jours suivant les administrations. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieur à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). La récolte d'urine sera réalisée directement dans le module d'isolement présent dans les volières d'hébergement L'animal sera physiquement isolé de ses congénères pendant une durée inferieur à 6h, ce qui peut induire un stress léger. Pendant cet isolement l’animal n’aura pas accès à l’eau et à l’alimentation ce qui pourra engendrer un stress et un inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité des candidats médicaments.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de toxicité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la biodisponibilité des candidats médicaments et permettent d’affiner la connaissance de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 8 primates répartis en 4 lots de 2. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain a été retenu dans le cadre de ce projet. De plus, une analyse de la conservation phylogénétique de la cible de l’anticorps testé a montré une divergence de séquence et une conservation incomplète des profils d'expression chez la souris et le rat alors que les séquences de cette cible chez les primates se sont révélées identiques à 95–100 % à la séquence humaine. Ces résultats démontrent rigoureusement que les espèces de primates constituent des modèles fiables pour tester la pharmacocinétique (PK) et la toxicité de cet anticorps. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau pendant l’étude et des prélèvements d’organes seront réalisés en fin d’étude dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.