Recherche appliquée

216 souris privées de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec un volume de tumeur autorisé jusqu'à 1 500 mm3. Cent quarante-quatre d'entre elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas sous la peau, cent huit une injection intraveineuse de nanoparticules, trente-six une injection directe dans la tumeur. Le porteur écrit pouvoir "imaginer" une perte de poids et de motricité chez les animaux dont la tumeur grossit. Aucun traitement n'est évalué à ce stade : les 216 souris sont utilisées pour choisir la souche, la dose et la voie d'administration de l'essai thérapeutique à venir, dont l'effectif n'est pas indiqué.

Objectifs

Le cancer du pancréas est la 12e forme de cancer la plus fréquente, mais l’une des plus meurtrières, avec un taux de survie très faible. En France, environ 15 000 nouveaux cas par an (légèrement plus d'hommes que de femmes) sont diagnostiqués avec une incidence en augmentation depuis plusieurs décennies, en partie à cause du vieillissement de la population et de facteurs de risque (tabac, obésité, diabète, alcool...). La survie du cancer du pancréas reste malheureusement l’une des plus faibles parmi tous les cancers, en raison de son diagnostic souvent tardif et de sa progression rapide. En France la survie nette à 5 ans (tous stades confondus) est Hommes : environ 9 % et Femmes : environ 10 %. L’objectif de ce projet est de faire une étude préliminaire (étude pilote) qui lèvera des verrous techniques (variabilité des modèles, voies optimales d’injection des nanoparticules) et scientifiques pour les choix du projet global à venir par la suite. Il s’agit d’une première partie d’étude préclinique pour le développement de nanoparticules thérapeutiques seules ou chargées dans des cellules qui seraient utilisées comme vecteurs. Ces nouvelles nanoparticules seront utilisées dans le traitement du cancer du pancréas. Plus précisément, les nanoparticules seront utilisées en présence de champs magnétiques et ce afin de valider une approche thérapeutique par hyperthermie magnétique. Ceci sera détaillé lors du dépôt de la seconde DAP dans laquelle le protocole thérapeutique sera détaillé. Le projet se découpe en 2 procédures expérimentales : La première procédure expérimentale vise à caractériser le développement tumoral de deux modèles in vivo chez des animaux immunodéficients. La deuxième procédure expérimentale vise à démontrer la tolérance et la bioaccumulation des nanoparticules dans les tissus en comparant deux voies d’administration.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet global sont de pouvoir valider une nouvelle nanoparticule pour le traitement du cancer du pancréas. Cette première partie, courte et considérée pilote nous aidera dans le choix de souche de souris d'intérêt, le type de cellules vecteurs plus pertinentes, la dose de nanoparticules et la voie d'administration d'intérêt. Cela permettra donc de réduire le nombre de groupes expérimentaux par la suite pour l’étude thérapeutique.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - chirurgie : injection de cellules sous-cutanée de cellules tumorales : 144 souris concernées = 5 min /souris - injection intraveineuse : 72 souris saines + 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris - injection intra-tumorale : 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris

Impact sur les animaux

D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Afin d’éviter cela, nous avons prévu un volume maximum de tumeur à atteindre de 1500mm3. L’inoculation de tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs, juste après l’inoculation. Pour la deuxième procédure, l’injection des particules véhiculées dans les différents types cellulaires est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Dans le groupe avec une tumeur, les douleurs dues à l’inoculation de la tumeur en sous-cutanée peuvent apparaître juste après l’inoculation.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer de pancréas afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui-même est une étude pilote pour établir le bon choix de souche de souris, de modèle tumoral et de voie d’administration de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers du pancréas. Une suite est prévue une fois ces informations traitées.

Réduction

Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur ainsi que la voie d’administration et les doses optimales à utiliser pour l’utilisation des nanoparticules dans les cellules vectrices. De plus, des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la littérature complétées par des simulations à l’aide d’outils en ligne régulièrement utilisés en recherche.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de trois individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite trois fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Il s'agit d'animaux OGM, au système immunitaire affaibli. Ils sont donc hébérgés en animalerie spécifique, en environnement controlé afin d'éviter tout risque d'infection et donc éviter un phénotype dommageable.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales qui peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris au système immunitaire déficient « SCID » qui sont considérées les plus pertinentes dans l’étude de tumeurs pancréatiques. Nous utiliserons des mâles et des femelles, tenant compte que la prévalence du cancer du pancréas touche aussi bien les hommes que les femmes. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.

4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises pendant six à douze mois à des régimes enrichis en gras et en sucre destinés à provoquer une stéatose puis un cancer du foie, avec une injection intraveineuse sous anesthésie, huit à douze échographies hépatiques, trois prélèvements de sang et un transport entre deux établissements. Le porteur attend une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité et leur comportement, ainsi qu'une altération de l'état général liée au développement des tumeurs. Les retombées annoncées, de nouveaux outils de diagnostic et de nouvelles pistes thérapeutiques, sont renvoyées à un "futur proche", tandis que le recours à la souris est déclaré "indispensable" au motif qu'aucune lignée cellulaire ne restituerait les interactions du foie avec les autres organes.

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire. (MODIFICATION) L'ajout des prélèvements sanguins nécessite une modification du projet sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnostic et pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris) (MODIFICATION: et trois prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux au cours du projet (3 fois, 1 minutes, animal vigile)]. Une autre partie des animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). (MODIFICATION :Un prélèvement sanguin de plus grand volume sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié en fin de projet (1 fois, 2 minutes)). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. (MODIFICATION : De la douleur légère de courte durée peut être ressentie au point de prélèvement pour les prélèvements sanguins. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée). Enfin, le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4608).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4608 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

Vingt-huit des 32 macaques à longue queue seront tués pour prélever leurs yeux et vérifier l'intégration de la thérapie génique, les quatre autres restant en vie. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une période pouvant atteindre six mois. Chaque animal subit jusqu'à sept batteries d'examens oculaires de cinquante minutes, une injection dans chaque œil, huit prélèvements de sang et sept ponctions d'humeur vitrée sous anesthésie générale, chaque anesthésie étant précédée d'un jeûne de seize heures, avec des contentions répétées pendant les sept jours suivant l'injection. Le porteur justifie le recours au primate par l'absence de fovéa chez les rongeurs, les chiens et les porcs, cette zone centrale de la rétine n'existant que chez les simiens, l'être humain compris.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à développer une nouvelle approche pour traiter certaines maladies des yeux qui provoquent une perte de vision, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré. Ces maladies sont causées par une croissance anormale des vaisseaux sanguins dans la rétine, pouvant entraîner des saignements, des cicatrices et une perte de vision irréversible. Actuellement, les traitements existants, comme les injections répétées dans l’œil, permettent de ralentir la progression de la maladie, mais ils sont contraignants et ne suffisent pas toujours à stopper la dégradation de la vision. Notre recherche propose une nouvelle solution : une thérapie génique qui permettrait aux cellules de l’œil de produire elles-mêmes un traitement capable de bloquer cette croissance anormale des vaisseaux. En utilisant un vecteur viral spécifique (AAV), nous espérons cibler précisément certaines cellules de la rétine afin de prolonger l’effet du traitement et réduire le besoin d’injections répétées. Ce projet pourrait améliorer la qualité de vie des patients en leur offrant une solution plus efficace et durable, tout en réduisant les contraintes liées aux traitements actuels. Ces travaux permettront aussi d’en apprendre davantage sur ces maladies et d’optimiser les futures thérapies géniques pour la vision.

Bénéfices attendus

A terme, le bénéfice de ce projet fera progresser les connaissances scientifiques concernant l'étude et l'identification de nouveaux outils de thérapie géniques ciblant le traitement de maladies touchant le système visuel et plus spécifiquement la dégénérescence maculaire liée à l'âge. À long terme, les découvertes apportées par ce projet serviront au développement de thérapies géniques efficaces permettant de guérir des maladies de la vision.

Procédures

Les interventions prévues seront les suivantes : (1) Jusqu’à 7 batteries d’examens oculaires (environ 50 minutes par animal), comprenant une tomographie en cohérence optique, un examen du fond d’œil, un examen à la lampe à fente et une angiographie. Ces examens seront réalisés le mois précédant les interventions, le jour des interventions, puis à raison d’une séance mensuelle (maximum 6 mois). (2) Injections intraoculaires (une injection unique par œil, d’une durée d’environ 5 minutes). (3) Jusqu’à 8 prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale (durée d’environ 5 minutes chacun), espacés de 15 jours à 1 mois. (4) Jusqu’à 7 prélèvements d’humeur vitrée sous anesthésie (environ 5 minutes chacun), réalisés le jour des injections puis à raison d’un prélèvement mensuel. (5) Chirurgie terminale sous anesthésie profonde, destinée au prélèvement des yeux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont le jeûne de moins de 16h nécessaire la veille des anesthésies, un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture de l’animal, les contentions répétées (pendant 7 jours post injection), potentiellement une légère perte de poids consécutive aux injections et le maintien en infirmerie les jours suivant les injections. Une légère douleur liée à la réalisation des gestes techniques (Injection intravitréenne des AAVs sous anesthésie générale) et des peut être observée également. Les injections et induction de la croissance des vaisseaux, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer un très léger inconfort au niveau de la zone d’injection.

Devenir

A l’issue de la procédure, 28 des 32 animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses de tissus oculaires afin de vérifier la bonne intégration de la thérapie génique. Les 4 animaux non inclus dans l'étude seront gardés en vie.

Remplacement

Les maladies rétiniennes de type dégénérescence maculaire liée à l'âge ou rétinopathies affecte les cellules de la rétine et plus particulièrement la fovéa. Les outils de thérapie génique ciblant ces cellules, l'utilisation de modèle animaux tels que les rongeurs n'est pas possible car ils ne possèdent pas de fovéa. De plus, l'efficacité des vecteurs viraux qui seront utilisés ont été testés et validé au préalable in vitro sur des explants rétiniens humain. La technique proposée dans ce projet aura pour objectif la validation d'une preuve de concept visant à être évaluée à plus long terme dans des études cliniques chez l'Homme. Ce passage à la clinique nécéssite donc cette phase sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet a été réduit à son maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Trente deux macaques seront ainsi utilisés sur 5 ans. Ce nombre d'animaux à été déterminé sur la base d'études similaire réalisées chez le PNH.

Raffinement

Pour chaque procédure réalisée, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale complétée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires. Les méthodes expérimentales ont été pensées et choisies pour éviter toute souffrance des animaux et des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance en cas d’effets indésirables. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans des animaleries respectant les standards prévus par la réglementation et dans un environnement adapté et enrichi (enrichissements structurels, jouets, litière pour fourrager, socialisation).

Choix des espèces

Les maladies de la vision humaine pour lesquelles le bénéfice du développement de thérapie génique est le plus porteur concerne les maladies altérants les photorécepteurs de la fovea, partie centrale de la rétine. Cette région de l’oeil contient les cônes nécessaires à la vision des couleurs et n’est pas présente chez le rongeur, les chiens ou les porcs invalidant par conséquent leur utilisation pour ce type d'étude. Le primate non-humain a ainsi été choisi car la fovéa n’est présente que chez les simiens (homme inclus). Le modèle PNH choisi et accessible est le macaque cynomolgus. Cette espèce est l’une des espèces de PNH la plus utilisée en recherche pour ce type d’étude. En effet, le macaque cynomolgus présente une structure anatomique de la rétine similaire à celle de l'Homme avec la présence de la fovéa. Ce projet sera réalisé avec des animaux adultes âgés à minima de plus de 3 ans de manière à ce que les structures oculaires soient développées.

Les souris utilisées portent une altération génétique censée reproduire la myopathie de Duchenne, mais le porteur précise que le modèle n'en présente qu'une forme légère, avec une espérance de vie intacte et une locomotion spontanée normale, quand les patients meurent vers 25 ans. 106 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 53 administrations du composé testé, seize pesées, quatre mesures de composition corporelle, trois prélèvements de sang et deux mesures de force musculaire sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les muscles des pattes, le cœur et le diaphragme, au bénéfice d'un client dont le porteur espère qu'il portera la molécule jusqu'au marché.

Objectifs

La myopathie de Duchenne est une maladie d'origine génétique induisant une dégénérescence progressive de l’ensemble des muscles de l’organisme. Elle est liée à une anomalie génétique, responsable de la production d’une protéine impliquée dans le soutien de la fibre musculaire. Chez les patients atteints de cette maladie, qui sont à 99,5% des hommes, les fibres qui constituent les muscles squelettiques et cardiaque se détériorent à chaque contraction et finissent par se détruire. Des cellules souches musculaires tentent de régénérer le tissu musculaire lésé, mais ce processus est vite débordé et la dégénérescence finit par l’emporter. Les patients atteints de la maladie de Duchenne présentent ainsi une espérance de vie très réduite, de l'ordre de 25 ans, du fait notamment de complications cardiaques et respiratoires. La recherche est ainsi très active concernant cette maladie et plusieurs pistes visant à mise au point d’un traitement curatif sont actuellement à l’étude. Néanmoins, à aujourd'hui, il n'existe aucun traitement curatif sur le marché. En revanche, les patients sont le plus souvent traités à l'aide d'anti-inflammatoires afin de réduire l'inflammation musculaire et alléger quelque peu les symptômes de la maladie. Le présent projet vise à étudier les effets d'un composé X en développement sur les symptômes musculaires liés à la myopathie de Duchenne en association ou non avec ces anti-inflammatoires. Le modèle employé est un modèle de mutation génétique spontanée qui présente des symptômes proches de la maladie de Duchenne chez l'humain, bien que les symptômes soient moins prononcés. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur les capacités musculaires du modèle de maladie de Duchenne, dans le cadre d'une administration seule ou en co-traitement avec des anti-inflammatoires.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter les conséquences musculaires de la maladie de Duchenne chez l'humain. Alors que plusieurs molécules ont été testées ces vingt dernières années, il n'existe toujours aucun médicament curatif de la maladie de Duchenne. Il s'agit donc d'une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la maladie de Duchenne.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (16 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (4 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Administration de traitements (53 administrations; durée : 1 minute); 4) Mesures in vivo de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes), 5) Prélèvements sanguins (3 prélèvements, durée du prélèvement : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle, les prélèvements sanguins et les administrations des traitements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les injections pour réaliser les traitements seront source de douleurs légères et transitoires. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, les animaux pourront subir des troubles digestifs mineurs du fait des traitements chronique par les anti-inflammatoires.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les muscles des pattes, le coeur et le diaphragme pour des analyses fonctionnelles (mesures de force musculaire) et histologiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de tester, suite à une première série d'études menées sur cultures cellulaires, le composé sur organisme entier afin de vérifier que les effets observés dans ces premières étapes se traduisent effectivement en un bénéfice dans le cadre de la pathologie. Par ailleurs, l'étude sur animal reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre de 12 animaux par groupes utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés en tenant compte de l'hétérogénéité du modèle mdx. Le groupe contrôle du modèle, constitué de souris sauvages, a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu que la maladie de Duchenne touche à 99,5% des garçons, l'étude sera limitée au seul genre mâle.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2/3 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les procédures de mesure de la force des muscles de la patte arrière seront réalisée chez la souris anesthésié. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée. Il est a noter qu'une étude préalable de toxicité a été réalisée afin de déterminer la dose de composé X employée dans le présent projet : aucun effet toxique n’a été observé, même à des doses 10 fois supérieures à la dose qui sera ici employée. Enfin, pendant la seconde semaine d'habituation les animaux seront habitués par 2 fois (pendant 2 minutes) aux tubes de contention nécessaire à la mesure de composition corporelle et aux prélèvements sanguins.

Choix des espèces

La modèle génétiquement altéré que nous emploieront est classiquement utilisé pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la dystrophie de Duchenne et pour tester des candidats médicaments au stade préclinique visant à traiter cette pathologie. Le modèle récapitule de nombreux symptômes de la pathologie de Duchenne, bien qu'il n'exhibe qu'une forme relativement légère de la maladie comparativement à l'humain (espérance de vie non réduite et locomotion spontannée non affectée par la mutation). Ces souris présentent une diminution de leur force musculaire comparativement aux souris sauvages dès 5 semaines d'âge. Elles présentent également une hypertrophie musculaire, mais cette dernière ne compense pas la perte de force. Cette hypertrophie persiste jusqu'à la fin de vie des animaux (leur durée de vie n'est pas affectée par la mutation) mais reste néanmoins légère et n'entraine aucune perturbation de l'activité locomotrice spontanée des souris mutantes comparativement aux souris sauvages. Les souris seront reçues à 5 semaines d'âge. Cet âge a été déterminé en fonction de la cinétique des défaut musculaires observés chez ce modèle. En effet, à partir de 12 semaines, le modèle commence à présenter une hypertrophie musculaire progressive. Bien que la force musculaire des souris génétiquement altérées reste inférieure à celle des souris sauvages à tout âge, et compte tenu de la durée du traitement, nous souhaitons que les souris ne présentent pas une hypertrophie musculaire trop marquée en fin d'étude.

Une fausse route pendant le gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et une perte de 20 % du poids déclenche la même issue. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Elles sont gavées une fois par jour pendant trois mois au maximum, subissent des prélèvements de sang derrière l'œil, des courses sur tapis roulant, un maintien en équilibre sur une roue en rotation, une heure trente d'IRM et vingt minutes d'échocardiographie. Le porteur affirme que le test chez la souris est un "requis obligatoire" avant le passage à l'homme, pour cinq composés déjà commercialisés dans d'autres indications.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.

24 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur moelle osseuse. Le nombre vient d'un calcul que le porteur détaille : environ trente mégacaryocytes observables par souris, cent nécessaires par condition, six conditions, donc quatre souris chacune. Elles reçoivent une chimiothérapie qui fait chuter leurs plaquettes, puis une injection de Romiplostim et un prélèvement de sang sous anesthésie. Le porteur décrit la thrombopénie induite comme sans impact sur le bien-être des animaux non-humains en l'absence de saignement, tandis que le bénéfice clinique annoncé, faire progresser la prise en charge des patients sous chimiothérapie, reste renvoyé à plus tard.

Objectifs

Chaque année, en France, environ 370 000 personnes atteintes de cancer reçoivent un traitement de chimiothérapie. Ce traitement provoque fréquemment une forte baisse de la numération plaquettaire, appelée thrombopénie, exposant les patients à des saignements. Ces thrombopénies peuvent avoir des conséquences très graves, notamment des retards dans le traitement du cancer. Les plaquettes sont produites dans la moelle osseuse par les mégacaryocytes. Ce processus est sous l’influence d’une hormone, la thrombopoïétine (TPO). Un médicament prometteur, le Romiplostim, qui imite l'action de la TPO, pourrait aider à traiter la thrombopénie induite par la chimiothérapie. Cependant, la moelle osseuse des patients n’étant pas facilement accessible, on ne connait pas encore son impact réel sur les mégacaryocytes dans la moelle osseuse. L’objectif de cette étude est une analyse quantitative et qualitative de l’état fonctionnel des mégacaryocytes (MK) de la moelle après traitement au Romiplostim, notamment en évaluant l'impact du Romiplostim sur la morphologie des MKs ex vivo à J+8. Pour se faire il sera utilisé 1) un modèle préclinique murin déjà validé par le laboratoire, 2) des souris génétiquement modifiées, sans phénotype dommageable, possédant des mégacaryocytes fluorescents et 3) une approche d'imagerie de pointe, permettant d’imager en temps réel le comportement des mégacaryocytes dans leur environnement natif.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de la PodoPZ des mégacaryocytes. La PodoPZ est une structure présente sur tout le pourtour du mégacaryocyte qui joue un rôle majeur dans la production et la libération des plaquettes dans le sang. Sur le plan clinique, l’impact du Romiplostim en tant qu’analogue de la thrombopoïétine permettra de faire avancer les traitements de restauration de la numération plaquettaire chez les patients sous chimiothérapie. Une thrombopénie est un réel frein au traitement des cancers puisque la seule prise en charge actuelle est de décaler le traitement de chimiothérapie, nuisant ainsi à l’efficacité du traitement anti cancéreux.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 injections et un prélèvement. Une injection sur animal vigile avec une durée de moins d’une minute et une sur animal anesthésié avec une durée de 2-3 minutes. Le prélèvement sanguin s’effectue sur animal anesthésié et dure moins d’une minute. La durée totale de l’anesthésie est d’environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux sont: - Le stress lié à la préhension et contention de l’animal (léger)- La douleur liée aux injections et prélèvements (léger) - La thrombopénie induite par le traitement (léger) - La baisse, éventuelle, du système immunitaire (léger). Concernant le Romiplostim, il n’est pas attendu d’effets indésirables ; au contraire ce dernier devrait améliorer les effets liés au traitement, notamment pour la thrombopénie. La durée de la procédure n’excédant pas 8 jours, il n’est pas attendu d’altération de l’aspect et du comportement des animaux (état corporel, pelage, mobilité, respiration, etc).

Devenir

Les analyses par imagerie auront lieues sur les moelles osseuses des souris, ex vivo. Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre la capacité des mégacaryocyrtes à franchir une barrière vasculaire dans des conditions où le microenvironnement est fortement perturbé par une chimiothérapie. En effet, le franchissement de la barrière vasculaire met en œuvre, simultanément, des interactions entre les mégacaryocytes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Des expériences préliminaires réalisées in vitro sur des mégacaryocytes, indiquent que ces cellules ne franchissent pas naturellement une membrane poreuse. Afin de répondre à nos questions, nous devons travailler sur le fonctionnement du système hématopoïétique (création des cellules sanguines) dans sa globalité ; en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. C’est pourquoi, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’un organisme vivant, en l’occurrence des rongeurs, par une autre méthode.

Réduction

Nous savons par expérience qu'il nous est possible d'observer en moyenne 30 mégacaryocytes par souris en imagerie. Afin d’effectuer des tests statistiques cohérents, nous devons obtenir environ 100 mégacaryocytes par condition. Il nous faut donc 4 souris par condition, qui sont au nombre de 6, ce qui fait un total de 24 souris.

Raffinement

Les animaux étant habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. Pour les injections, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, selon la procédure en vigueur et un anesthésique local ainsi qu’un onguent ophtalmique seront utilisés. Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress lié à la contention. En ce qui concerne la thrombopénie induite par le traitement, en l’absence de saignement, cette dernière est non impactante pour le bien-être animal. Toutefois, nous anticipons tout risque potentiel de saignement, notamment en cas de bagarre, par un enrichissement supplémentaire (tunnel) et un suivi, rigoureux, des animaux sera effectué deux fois par jour. Cela permettra de détecter au plus tôt tout comportement agressif au sein d’une cage. Pour ce qui est du risque lié à la baisse du système immunitaire induite par le traitement, celui-ci est minime ; toutefois les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé qui permettra d’éviter le développement d’une infection. De plus, des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués le cas échéant.

Choix des espèces

Pour ce qui est du choix de l'espèce, la souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir des mégacaryocytes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptées à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à une seule injection), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmacologiques, qui dans notre cas est le Romiplostim. En ce qui concerne le stade de développement des souris : les souris adultes (8–18 semaines, 25–30 g) constituent le modèle le plus adapté car leur système hématopoïétique est pleinement mature, stable et comparable à celui de l’adulte humain, ce qui permet une interprétation pertinente des résultats.

Un gavage oro-gastrique quotidien pendant quatre semaines et jusqu'à quatre prises de sang sous-mandibulaires attendent chaque souris de ce projet. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer l'effet de produits alimentaires d'origine végétale sur l'expression des gènes et le microbiote intestinal. Le porteur reconnaît que la répétition du gavage peut provoquer des irritations ou des lésions de l'œsophage, et annonce que les prises de sang seront évitées si des tests préalables sur cellules ne montrent aucune modification des hormones de satiété. 576 souris sont tuées à l'issue pour prélever foie, iléon et cæcum, les 144 restantes sont "relâchées de l'étude" et réutilisées dans un autre protocole.

Objectifs

L’objectif du projet est de tester l’effet de différents produits et denrées alimentaires issus de différentes plantes sur l’expression génique (approche nutrigénomique) et sur le microbiote intestinal (effet prébiotique) chez un modèle murin.

Bénéfices attendus

Un bénéfice majeur du projet sera la mise en évidence des modification dand l'expression de gènes impliqués dans des voies métaboliques clés (prolifération cellulaire, immunité, métabolisme), ce qui permettra d'estimer la valeur fonctionnelle du produit alimentaire testé. Un autre bénéfice très important sera la mise en évidence des changements dans la composition du microbiote intestinal, ce qui nous permettra d'évaluer l'effet prébiotique de l'aliment. Nous attendons aussi une confirmation des résultats obtenus in vitro sur les changements dans les dosage des hormones suite à l'ingestion des différents produits, ce qui s'associera aux effets métaboliques observés par les analyses sur l'expression des gènes.

Procédures

Chaque animal fera l’objet d’un gavage oro-gastrique quotidien, d’une durée inférieure à 5 minutes. Les prélèvements sanguins seront effectués chez des animaux vigiles, au niveau sous-mandibulaire et sous anesthésie locale, pour une durée inférieure à 5 minutes par individu. Le nombre total de prélèvements par animal ne dépassera pas quatre.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire aux prélèvements sanguins (moins de 5 minutes par session) ou aux gavages (également inférieurs à 5 minutes) engendre un certain inconfort et du stress chez les animaux, mais elle est indispensable pour recueillir des réponses individuelles. Bien que le gavage oro-gastrique ne soit pas douloureux en soi, sa répétition peut causer des irritations ou des lésions œsophagiennes, notamment lorsque le protocole impose une administration quotidienne pendant une période de quatre semaines.

Devenir

A la fin de la procédure, un total de 576 animaux seront euthanasiés afin de récupérer le fois, iléon et caecum. Les 144 animaux restants seront relâchés de l’étude et réutilisés dans un autre protocole.

Remplacement

Les prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux uniquement après que des expériences préalables aient été faites in vitro. Nous allons réaliser d’abord les expériences sur des cellules entéroendocrines avec des digestats des différents produits issus des differents produis alimentaires testés obtenus par digestion in vitro. Si aucune modification n’est constatée in vitro, nous allons conclure que le produit ne change pas le taux des hormones de satiété et nous n’allons pas réaliser les prélèvements de sang, évitant ainsi une procédure invasive. Si nous constatons une modification du niveau des hormones suite au contact avec les digestats de différents produits alimentaires testés, nous allons réaliser des prises de sang chez les souris pour doser ces hormones dans le plasma et si les résultats obtenus par les méthodes in vitro montrent une corrélation significative avec les dosages Luminex, nous allons remplacer complètement les dosages dans le serum par les dosages issus de la digestion in vitro, pour toutes nos futures analyses de ce type.

Réduction

Des études in vitro au laboratoire seront préalablement réalisées afin de sélectionner les produits alimentaires susceptibles d’induire un effet fonctionnel, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction se traduira aussi dans l’utilisation d’un nombre réduit à 6 animaux par groupe. Les analyses statistiques exigent un minimum de 5 individus et nous rajoutons seulement un individu de plus par groupe pour éviter des pertes imprévisibles durant l'expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et manipulés dans le calme, à distance des autres groupes, dans une salle indépendante (y compris pour les euthanasies). Si des prélèvements sanguins s’avèrent nécessaires, ils seront réalisés par ponction sous-mandibulaire, sous anesthésie locale à la lidocaïne, et espacés dans le temps (J0, J15, J30, J36). Un enrichissement de l’environnement est systématiquement assuré dans notre animalerie (maisons et carrés de cellulose dans toutes les cages). Pour évaluer l’effet du gavage et des prélèvements sanguins, une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place. Si une souris présente des signes de souffrance, elle sera euthanasiée afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix du fait de son utilisation majoritaire comme modèle d'étude dans la communauté scientifique: cela permet ainsi de comparer ses résultats avec ceux d'autres laboratoires, et échanger avec eux, idées et modèles, à un niveau international. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé dans la littérature pour les expérimentations sur transcriptomiques et les modifications du microbiote intestinal puisqu’elles présentent un génome très bien connu et annoté, un métabolisme proche de l’homme et un microbiote présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. Le modèle animal souris présente l’avantage d’un gavage relativement facile, et des résultats extrapolable chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes de 6 à 9 semaines puisque ces stades de développement sont fréquemment utilisés dans la littérature sur le sujet.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, chacun passant trois fois par la même séquence de dix minutes de test moteur, une heure de second test et un prélèvement sanguin sous anesthésie. Entre la première séquence et les suivantes, une chirurgie du cerveau de quarante-cinq minutes leur induit la maladie de Parkinson, selon deux modèles distincts. Le porteur indique que les animaux mimant la phase avancée peuvent avoir des difficultés à se déplacer et à se nourrir, avec une perte de poids. Les bénéfices annoncés, des marqueurs de diagnostic précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques, restent une perspective, quand la chirurgie et ses douleurs post-opératoires sont, elles, programmées.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre les modifications précoces qui accompagnent la progression de la maladie de Parkinson dans deux modèles animaux complémentaires, chacun mimant des caractéristiques pathologiques et des stades différents de la maladie. MODIFICATION: l'augmentation de la durée du projet sans ajout d’animaux nécessite une nouvelle autorisation

Bénéfices attendus

Outre une meilleure connaissance des modifications comportementales et du métabolisme (ensemble des transformations chimiques et biologiques qui s'accomplissent dans l'organisme) qui accompagnent la progression de la maladie de Parkinson, cette étude permettra l’identification de composés biologiques qui serviront de marqueurs de la pathologie et favoriseront le diagnostic précoce de la maladie pour une prise en charge optimale des patients, mais également l’identification de composés biologiques qui pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux tests moteurs (l’un de 10 minutes le premier jour, l’autre d’une heure le deuxième jour) et un prélèvement sanguin (le 3ème jour, sous anesthésie générale, durée de 5 minutes) avant induction de la maladie par chirurgie du cerveau (durée de la chirurgie : 45 minutes). Puis les animaux seront à nouveau soumis à ces mêmes tests moteurs et prélèvement à deux temps différents à distance de la chirurgie (une et quatre semaines pour un modèle et trois et dix semaines après pour l’autre modèle).

Impact sur les animaux

Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.

Raffinement

Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ils sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront un à trois mois.