Recherche appliquée

Nés avec un déficit de poids d'environ 20 %, stériles chez les mâles, les souris modèles du syndrome de Barth ne représentent que 10 % des portées au lieu des 25 % attendus. 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur tapis roulant et sur roue en rotation, subissent des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, une IRM d'une heure trente, une échocardiographie, et un gavage quotidien pendant trois mois si le traitement dans l'eau de boisson ne suffit pas. Le porteur indique qu'une fausse route lors du gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et prévoit des transferts en voiture entre trois établissements. Toutes sont tuées pour prélever leur sang et leurs organes.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.

Les souris qui atteignent un point limite de la grille de score sont mises à mort avant la fin. 2 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 d'entre elles réutilisées ensuite. Elles reçoivent un candidat médicament puis subissent des prélèvements sanguins répétés, veine caudale, saphène ou sinus rétro-orbital, avant un prélèvement terminal de grand volume qui peut provoquer un arrêt cardiaque. Le projet mesure le devenir sanguin de composés anticancéreux, afin de caler les doses des futurs essais chez l'humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole sont "reformées" vers l'entraînement aux gestes techniques, puis mises à mort.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de caractériser les paramètres pharmacocinétiques (PK), c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme et son temps de demi-vie dans la circulation sanguine. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Afin de maximiser la robustesse des données tout en respectant les principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement), une stratégie d’échantillonnage ainsi que des groupes satellites (groupes supplémentaires pouvant être ajoutés pour divers prélèvements) optimisés seront mis en œuvre. Celle-ci permettra d’obtenir l’ensemble des points de la courbe pour un suivi PK à partir d’un nombre réduit d’animaux, tout en assurant la qualité scientifique des résultats.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance ainsi qu'à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : #Lors de l’injection par intraveineuse ou par d’autres voies d’administration (par exemple : intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, per os…) des candidats médicaments (t-0). # Lors de chacun des prélèvements sanguins. Pour tous les types de prélèvements envisagés (e.g. veine caudale, saphène, submandibulaire, Sinus rétro orbital (SRO)…), l'anesthésie générale n'est pas nécessaire, mais une contention efficace est requise, excepté pour les prélèvements SRO. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale, ou surdosage d’anesthésique (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) éventuelles anesthésies (fixe ou gazeuse s'il y a lieu pour prélèvement terminal). # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection des candidats médicaments et (2) de chacun des prélèvements sanguins aux différent temps (par exemple, 10 minutes, J1, J7, J14, J21 et /ou J28 post traitement). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à cette dose. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. Ici, des volumes toujours inférieurs à 7,5% du volume sanguin circulant sur une semaine glissante ou 10% sur deux semaines glissantes pourront ainsi être prélevé en toute sécurité pour l‘animal. En fonction des besoins de l’étude, un prélèvement terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, pourra être effectué.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure. Un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie pourra être réalisée. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation) avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet pouvant être cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le projet a été conçu dans une logique de réduction rigoureuse du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R. Cette réduction repose sur une approche expérimentale optimisée, combinant une planification statistique préalable, une connaissance approfondie des composés testés, et une stratégie d’échantillonnage raisonnée. Avant toute mise en œuvre, chaque candidat médicament fera l’objet d’une caractérisation approfondie (données générées in vitro, propriétés physico-chimiques), permettant de définir avec précision les points de cinétique les plus informatifs. Cette sélection ciblée des temps de prélèvement permet de réduire le nombre de points nécessaires à la modélisation pharmacocinétique, tout en conservant la robustesse des paramètres estimés. Le nombre d’animaux a été choisi en fonction des statistiques adaptées au petit nombre ainsi que de nos connaissances sur la classe thérapeutique de ces candidats médicaments, garantissant une significativité suffisante tout en évitant la surutilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur les mêmes individus à plusieurs temps, grâce à l’utilisation de volumes adaptés (micro-échantillonnage ou volumes standards dans la limite des 7,5 % hebdomadaires, ou 10% sur deux semaines glissantes), ce qui permet d’éviter la constitution de groupes satellites pour chaque point de temps. L’ensemble de ces mesures vise à maximiser l’information obtenue par animal, tout en respectant les contraintes éthiques et réglementaires liées à l’expérimentation animale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Les souris dépourvues de système immunitaire ne seront pas infectées du fait du statut sanitaire préservé de l'animalerie et des manipulations et hébergement en conditions aseptiques. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période minimale de 5 jours dans le but de limiter leur stress. Afin de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement ainsi qu’à chaque prélèvement. Les animaux seront également pesés avant chaque manipulation ainsi qu’au minimum deux fois par semaine en suivi régulier. Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Pour le prélèvement à l’œil une anesthésie gazeuse ainsi qu’une crème anesthésique locale permettra de diminuer la douleur liée au prélèvement. En fonction des besoins, une exsanguination terminale pourra être effectuée (en fin d’expérience ou en cas d’atteinte de point limite), par ponction intracardiaque ou incision sous-claviculaire de l’artère subclavière ou prélèvement à l'oeil, sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. A la fin du prélèvement, la mort sera assurée par dislocation cervicale ou surdosage d’anesthésique afin de conserver les organes intacts en cas de besoin. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation ainsi qu’en cas d’atteinte des points limites. Les analyses statistiques seront appliquées sur l’ensemble de la courbe et non uniquement sur chaque temps indépendamment, augmentant ainsi considérablement la robustesse de ces statistiques. Les souris non entrées en protocole seront utilisées pour l’entraînement à des gestes (DAP_FormationHabilitation) permettant la formation du personnel. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (abacs permettant une allométrie comparative de ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Nous utiliserons préférentiellement la souche CD-1, plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Cependant d’autres souches de souris (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) pourront être utilisées en fonction des modèles utilisés lors des études d’efficacité anticancéreuse, ainsi qu’en fonction de la structure et du profil des candidats médicament qui seront testés. Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après un minimum de 5 jours d’acclimatation dans l’EU). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Les souris CD1 seront préférentiellement utilisées. A titre d’exemple le poids de ces animaux sera compris entre 30 g et 37 g au moment de l’inclusion. Cette échelle de poids permet un prélèvement sanguin compris entre 157 µL et 222 µL par semaine (soit un maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pouvant être prélevé en toute sécurité par semaine glissante). Si d’autres souches (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) sont utilisées, le volume de sang prélevé sera toujours déterminé selon les recommandations internationales.

436 souris transgéniques humanisées vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à douze prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis une à quatre injections d'un anticorps couplé à une chimiothérapie, censé tuer les lymphocytes régulateurs installés dans la tumeur. Le porteur prévoit une gêne modérée, douleur et perte d'appétit, en fin de procédure pour les souris chez qui le traitement n'aura pas fonctionné, et retient un taux de prise de greffe de 80 % pour dimensionner l'effectif. Toutes sont tuées à l'issue, porteuses de tumeurs, pour des analyses sur tissus, tandis que les bénéfices annoncés restent au conditionnel, un traitement qui "pourrait" être plus efficace, moins toxique et "changer la vie de nombreux malades".

Objectifs

Une immunothérapie est actuellement approuvée pour le traitement de nombreux cancers localisés et métastatiques. Certaines cellules jouent un rôle clé dans la prévention des maladies auto-immunes et inflammatoires. Cependant, leur accumulation au sein des tumeurs inhibe l'immunité anti-tumorale, exerçant ainsi un effet délétère sur le traitement des cancers. L'objectif de notre projet est de démontrer qu'un ciblage thérapeutique ciblant et tuant spécifiquement ces cellules intratumorales permettrait de développer des réponses immunitaires anti-tumorales plus spécifiques contre le cancer et moins toxiques pour les tissus sains. Pour cibler ces cellules, nous avons développé une construction comprenant un anticorps (ciblant une protéine spécifiquement exprimé par les cellules immunitaires activées) relié à une molécule de chimiothérapie. Ce médicament pénétrera dans la cellule cible, libérera la chimiothérapie à l'intérieur de celle-ci et induira sa mort. Nous avons développé un tel médicament dans le but de cibler et d'éliminer spécifiquement les cellules d'intérêt. L'objectif de ce projet est de démontrer l'efficacité de notre médicament injecté par voie intraveineuse pour réduire la tumeur, d'identifier la combinaison optimale d'anticorps et de molécule de chimiothérapie, de déterminer la dose minimale efficace, et d'étudier les toxicités associées dans un modèle murin transgénique humanisé. Nous procéderons également à une comparaison de notre médicament avec le traitement actuellement utilisé en clinique

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité d’un nouveau médicament contre le cancer. En conjuguant un médicament d'immunothérapie à une chimiothérapie, une amélioration du traitement est attendue tout en limitant les effets secondaires. Ce nouveau traitement pourrait être plus efficace et moins toxique que les traitements conventionnels actuels. Par conséquent, les bénéfices attendus sont importants car ce nouveau traitement pourrait avoir un impact significatif sur la vie de nombreux patients. En effet, étant donné que ce nouveau médicament agit sur des cellules immunitaires potentiellement présentes dans tous les types de cancer, il pourrait être utilisé dans de nombreuses indications et changer la vie de nombreux malades.

Procédures

Injection de cellules tumorales, 1 par souris, durée 30 secondes, sous anesthésie locale. Traitement sous anesthésie locale et de 4 à 1 injections/souris en fonction des procédures et des groupes. L'injection dure moins d'1 min. Prélèvements de sang sous anesthésie locale, nombre maximal de 12, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Les injections de cellules tumorales et les traitements entraîneront un stress physique et transitoire (préhension) et une douleur et une contrainte légère et transitoire lors de l’injection du produit. Les injections se feront sous anesthésie locale ou générale en fonction du type d'injection. Les tumeurs peuvent entraîner une gène légère pour les souris recevant des traitements et une gêne modérée (douleur modérée, perte d'appétit potentielle) en fin de procédure si le traitement est inefficace. Une toxicité modérée du traitement pourrait être observée (fatigue accrue, douleurs).

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux sont euthanasiés car ils seront tous porteurs de tumeurs et les organes seront utilisés pour faire des analyses sur tissus post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires ou de modélisation mathématique substitutifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité notamment dans le cadre d’injection de traitement ciblant des populations cellulaires immunitaires du microenvironnement tumoral. L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Les modèles animaux décrits vont permettre d'étudier une nouvelle stratégie de traitement ciblant des populations immunitaires immunosuppressives. Des analyses in vitro ont déjà eu lieu sur un modèle cellulaire. Egalement, le choix du composé a été basé en partie sur les résultats de nos études in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, d'après les données bibliographiques et nos connaissances sur ces types cellulaires, le taux de prise de ces lignées est estimé à 80%. Cette valeur pourra être affinée lors des premières étapes du projet, pour diminuer le nombre d'animaux utilisés. Compte tenu de la prise de greffe, des critères objectifs d'efficacité de traitement ont été définis. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés.

Raffinement

Les souris sont greffées sous anesthésie générale. Les administrations intratumorales seront réalisées sous anesthésie générale et les injections intraveineuses sous anesthésie locale. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleur sont détectés, un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie. Leur système immunitaire a été très largement caractérisé. L'utilisation d'une souche transgénique pour la protéine d'intérêt permettra de tester notre candidat médicament (composé de l’anticorps humain) sur lequel nous avons déjà fait des études in vitro et de réutiliser ces données dans le cadre d’études in vivo. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit 6-8 semaines, correspondant à un développement optimal du système immunitaire.

Maintenir en vie un parasite pour pouvoir le cultiver au laboratoire : 150 souris reçoivent une injection intrapéritonéale d'Echinococcus multilocularis, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le geste dure cinq à dix secondes et constitue l'unique intervention, la masse parasitaire se développant ensuite dans leur abdomen pendant deux à trois mois. Le porteur indique que l'échinococcose alvéolaire ne donne de symptômes qu'à un stade très avancé et prévoit une seule visite par semaine, avec une grille de score et une surveillance resserrée au-delà d'un certain seuil. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour récupérer le matériel parasitaire, qui sert à réinfecter un nouveau lot de souris et à relancer les cultures in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de maintenir en vie le parasite Echinococcus multilocularis chez des animaux, afin de pouvoir le multiplier en culture in vitro et tester de nouveaux traitements sur ces cultures.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet de pouvoir tester des nouveaux traitements contre ce parasite sur des cultures in vitro. Ceci permettra d’éliminer les traitements candidats se montrant inefficaces, et de sélectionner ceux se montrant efficaces pour une étude plus approfondie. Le projet permet également de maintenir en vie le parasite, sans quoi il serait perdu.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection de 100 μL de parasite dans le péritoine (durée 5-10 sec).

Impact sur les animaux

L’échinococcose alvéolaire ne génère des symptômes qu’à un stade très avancé de la maladie. Les nuisances générées dépendent de la taille du parasite et de sa localisation. Dans ce projet, le parasite est dans le péritoine, ce qui limite l’impact sur les autres organes. Toutefois, nous réaliserons une visite hebdomadaire avec des observations selon une feuille de score adaptée. Cette feuille permet un suivi individuel des souris une fois par semaine puis avec une fréquence plus importante dès lors qu’un certain score est atteint En cas d’atteinte d’un point limite, l’animal sera mis à mort et la charge parasitaire sera prélevée comme prévu

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort par dislocation cervicale 2 à 3 mois (en fonction de l’évolution de la masse parasitaire et des points limites atteints) après l’infection péritonéale afin de récupérer le matériel parasitaire pour ré-infecter un nouveau lot de souris et démarrer des cultures in vitro.

Remplacement

Un système de culture in vitro du parasite a été développé et permet sa culture à grande échelle. Cependant, cette méthode de culture ne peut pas se maintenir dans un temps infini, justifiant que le matériel parasitaire doit être acquis régulièrement auprès d’animaux infectés, telles que les souris, afin de permettre une amplification du parasite in vitro. Les petits rongeurs sont des hôtes naturels du parasite E. multilocularis. L'utilisation de souris, et leur infection péritonéale est une méthode standard pour le maintien du parasite E. multilocularis et la génération ultérieure de cultures in vitro. Le matériel parasitaire ainsi produit nous permettra de tester et de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette pathologie souvent mortelle.

Réduction

Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire mais suffisant pour réaliser nos cultures in vitro pour tester de nouvelles thérapeutiques. Pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre de 150 souris sera utilisé.

Raffinement

Un suivi régulier de l’état des animaux sera mis en oeuvre, a minima de façon hebdomadaire lors des pesées ou plus régulièrement si nécessaire selon une grille de score adaptée. Nous réaliserons une visite hebdomadaire avec des observations selon une feuille de score. La feuille sera remplie individuellement pour chaque souris au moins chaque semaine une fois que la croissance parasitaire ou une anomalie dans le comportement ou le bien-être de l'animal est observée. En cas d’atteinte sévère l'animal sera euthanasié. A partir d’un certain score sur la grille, la fréquence de contrôle des animaux sera augmentée.

Choix des espèces

es petits rongeurs sont des hôtes naturels du parasite Echinococcus multilocularis. L’utilisation de souris et leur infection péritonéale est une méthode standard pour le maintien du parasite E. multilocularis et la génération ultérieure de cultures in vitro. Adulte, âgées de 6 à 8 semaines, d’environ 20g

129 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome sous la peau du flanc, puis dix injections de prodrogue étalées sur cinq semaines, ou la chimiothérapie de référence cinq jours de suite tous les 28 jours, avant une séance d'imagerie sous anesthésie de moins d'une heure et la mise à mort. Une partie d'entre elles est immunodéprimée, ce qui les expose à un risque d'infection, et les molécules administrées peuvent provoquer une perte de poids et une gêne à la locomotion quand la tumeur devient encombrante. Le porteur annonce une prodrogue active uniquement dans la tumeur, donc "sans effets secondaires" sur les tissus sains, affirme qu'aucun modèle alternatif n'existe, et dit tirer de ses essais antérieurs des arguments en faveur d'une "efficacité redoutable".

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer une nouvelle thérapie plus efficace que la chimiothérapie de référence. Pour cela notre stratégie en deux temps repose sur l’utilisation de nouvelles molécules, délivrant de manière ciblée un agent chimiothérapeutique au sein même des glioblastomes. Cette prodrogue activable transporte une molécule de chimiothérapie sous sa forme inactive, et n’est activée uniquement au sein de la tumeur, présentant donc une efficacité maximale, sans effets secondaires, sur les tissus sains où elle reste sous sa forme inactive. Nous validerons cette approche chez l’animal immunocompétent, permettant d’évaluer sa réponse immunitaire contre le cancer, et chez l’animal immunodéprimé pour évaluer la réponse sur une tumeur humaine. Notre approche s’inscrit dans un contexte de médecine de précision. Une fois validée chez le petit animal, cette stratégie pourrait être appliquée chez l’homme très rapidement.

Bénéfices attendus

L'administration contrôlée d'agents anticancéreux améliorera l'efficacité des systèmes moléculaires proposés sur le glioblastome, et augmentera ainsi les bénéfices en termes de survie et de qualité de vie des patients. Si cette approche se révèle efficace sur ces modèles de glioblastomes, elle pourrait être mise à profit pour beaucoup d’autres types de tumeurs. Cette stratégie de prise en charge pourrait potentiellement devenir universelle, quel que soit le type de tumeurs.

Procédures

Les animaux recevront une unique injection de cellules tumorales sous la peau (durée 2 minutes). Pour tous les groupes traités en deux temps par la prodrogue, le traitement sera administré 1 fois tous les 7 jours pour 5x2 injections au total (durée de l’acte

Impact sur les animaux

Pour ce protocole, l’implantation tumorale sur le flanc des souris entrainera un léger stress à l’implantation, et sera réalisé sous anesthésie volatile. Chez ces animaux, il est possible qu’ils ressentent une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement que la tumeur peut engendrer. Les animaux immunodéprimés présenteront un risque faible d’infection. Les protocoles d’imagerie entraineront un stress bref et modéré lié à l’injection des agents d’imagerie à des animaux vigiles. Les administrations de molécules thérapeutiques entraineront un stress bref et modéré lié à l’injection des molécules à des animaux vigiles. Ces molécules thérapeutiques (chimiothérapie de référence et prodrogue d’intérêt) pourraient provoquer une légère perte de poids dans les jours suivants les administrations.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées en particulier sur les tumeurs afin de valider l’efficacité de la thérapie au niveau cellulaire.

Remplacement

Aucun modèle alternatif n’est disponible actuellement pour s’affranchir de ce type d’étude. Seuls les tests in vivo pourront nous permettre de valider la supériorité en termes d’efficacité de la prodrogue pour la thérapie du glioblastome. Cependant, les études préliminaires réalisées in vitro et in vivo avec d’autres constructions moléculaires ont permis d’avoir des arguments en faveur d’une efficacité redoutable sur les tumeurs.

Réduction

Nous limiterons notre étude au strict minimum requis dans le nombre de souris et les différents modèles murins à utiliser afin de sélectionner et de caractériser cette prodrogue pour la prise en charge du glioblastome. Dans ce projet, ce nombre est fixé à 129 animaux.

Raffinement

L’existence de points limites, basés sur un scoring clinique, comportemental et adaptés à ces modèles tumoraux, seront utilisés afin de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie, d’une durée inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si les tumeurs atteignent un volume impactant le bien-être animal. En ce qui concerne le phénotype dommageable des animaux immunodéprimés, ces animaux seront hébergés en environnement stérile (boite, litière, boisson et nourriture) et la manipulation des animaux se fera sous hotte. Nous utiliserons des lignées de cellules tumorales murines qui seront implantées chez des animaux ayant un phénotype non-dommageable lorsque possible.

Choix des espèces

Les études précédentes utilisant notre chimiothérapie activable ont toutes été effectuées chez la souris. Les modèles sélectionnés sont les seuls à pouvoir permettre une expression de l'enzyme d'intérêt au niveau tumoral et ainsi déclencher l’activation de notre molécule. Ces modèles sont très pertinents vis-à-vis de la pathologie clinique puisque ce sont des modèles qui présentent des caractéristiques similaires aux tumeurs humaines. Les protocoles concerneront uniquement des souris qui seront âgées entre 5 et 6 semaines au moment de leur arrivée dans le laboratoire, pour permettre une implantation et un développement tumoral optimal.

Des écouvillons oculaires, buccaux, nasaux, rectaux ou vaginaux, parfois quotidiens, des administrations intranasales, orales, intra-oculaires ou intrapéritonéales sous anesthésie générale, des injections sous-cutanées sur animaux éveillés et des prises de sang régulières : 260 chats de moins d'un an vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le calicivirus, le virus de la panleucopénie, l'herpèsvirus félin, Chlamydia felis ou le virus leucémogène, et peuvent développer ulcères buccaux, conjonctivite, kératite, dyspnée, diarrhées, vomissements, déshydratation et douleurs abdominales. Le projet sert à mettre au point des vaccins vétérinaires, 192 chats étant tués pour des prélèvements terminaux, 40 réutilisés et 28 adoptés sous réserve d'un feu vert sanitaire. Le porteur chiffre les effectifs par souche pour trois virus, s'en tient à une fourchette de deux à huit chats par groupe pour les autres pathogènes, et ne précise ni le nombre d'interventions par animal ni la fréquence exacte des écouvillonnages.

Objectifs

Le projet vise à développer de nouveaux vaccins pour les chats, notamment dirigé contre le calicivirus félin (FCV), le virus de la panleucopénie (FPV), le virus de l'herpes félin (FHV), la Chlamydia felis, et le virus leucémogène félin (FeLV). Les objectifs principaux sont la sélection de souches récentes à inclure dans un nouveau vaccin plus efficace, la mise au point de modèles félins d'infection par les différents pathogènes à partir de souches récentes collectées sur le terrain, la vérification de sûreté/innocuité des vaccins mis au point, ainsi que la vérification de leur efficacité.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mettre au point de nouveaux vaccins à destination des chats, afin d'offrir une meilleure protection contre des maladies courantes et potentiellement graves, telles que le coryza, le typhus, l'herpèse virose et la chlamydiose, la leucose féline.

Procédures

Les animaux recevront des administrations intranasales, orales, intra-oculaires ou intrapéritonéales (sous anesthésie générale) ainsi que les injections sous-cutanée (sur les animaux vigiles) et dans le respect des ligne directrices sur les volumes reçus. Cela représente environ 15 minutes/animal Des prises de sang seront effectuées régulièrement, en respectant les volumes maximaux, non préjudiciables aux animaux (quelques millilitres/semaine). Afin de ne pas stresser les animaux, elles pourront être effectuées sous sédation. (env. 2 minute par prise de sang) Des écouvillons seront également effectués, parfois quotidiennement, au niveau oculaire, buccal, nasal, rectal ou vaginal, pour mesurer la présence des virus ou bactéries. Le matériel utilisé est des très petite taille, de façon à être compatible avec la taille des animaux, et à ne pas générer de douleur (env. 2 minutes par jour)

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la mise en place d’un modèle infectieux, le projet nécessite l’administration de virus ou de bactéries aux chats. Ils pourraient ainsi développer des symptômes spécifiques aux maladies ciblées : - Pour le calicivirus félin : symptômes du coryza, incluant abattement, perte de poids, hyperthermie, jetage nasal et/ou oculaire, éternuements, toux, ulcères buccaux et/ou nasaux, conjonctivite, dyspnée. - Pour le virus de la panleucopénie féline : symptômes du typhus félin, tels que abattement, perte de poids, hyperthermie, perte d'appétit, diarrhées, vomissements, déshydratation, douleurs abdominales. Les symptômes, s’ils apparaissent, devraient être modérés et transitoires, avec une expression maximale sur quelques jours (3 à 5 jours), bien que des manifestations légères puissent persister jusqu’à 1 à 2 semaines. - Pour le virus de l’herpès félin (rhinotrachéite infectieuse) : encombrement des voies respiratoires, écoulement nasal, conjonctivite, kératite, et écoulements oculaires. Dans le cas d’une vaccination avec un virus atténué, le projet implique l’administration de virus atténués aux chats, pouvant entraîner des symptômes légers et transitoires : -Pour le virus de la leucose féline (FeLV, vaccin à virus atténué) : les effets attendus devraient être limités et temporaires, comprenant une légère fièvre, un discret abattement et une diminution passagère de l’appétit. Les animaux seront également soumis à des contentions brèves (quelques minutes au plus) et à des anesthésies légères pour la réalisation des différents actes techniques. Un conditionnement positif sera mis en place afin de réduire la contrainte et le stress, garantissant ainsi leur bien-être tout au long de l’étude.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux de sang et/ou d'organes ou pourront être réutilisés si ces prélèvements ne sont pas nécessaires. Quelques animaux pourront être réutilisés, sous réserve de leur état de santé, ou adoptés, à condition d'avoir retrouvé un état de santé compatible, de ne présenter aucun risque de contagion pour l'humain ou d'autres animaux et sous réserve de la validation de l'adoption par les autorités sanitaires.

Remplacement

La production d'immunserum felin contre différentes souches virales de FCV necessite un organisme complet avec un système immunitaire fonctionnel et un système sanguin, qui ne peuvent être reproduits artificiellement. Il s'agit d'anticorps polyclonaux ne pouvant être produits à partir de banques de phages / culture cellulaire. La mise au point de modèles d'infection par différents virus félins, l'évaluation ultérieure de vaccins innovants, ainsi que l'évaluation de sureté et d'immunogénicité de souches bactériennes ou virales necessitent également un organisme complet avec un système immunitaire fonctionnel, un système sanguin et la présence des organes cibles des pathogènes, qui ne peuvent être reproduits artificiellement du fait de la complexité des mécanismes / intéractions.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est réduit au strict minimum nécessaire, et ajusté selon les exigences de la pharmacopée européenne: deux chats / souche de FCV justifié par la quantité d'antisérums nécessaires pour réaliser l'essai de neutralisation croisée contre un panel de 25-50 isolats de terrain du FCV (tests in vitro) et quatre chats / souche de FCV, pour les essais d'epreuve virulente pour lesquelles la pharmacopée correspondante indique 10 chats par groupe, cependant considérant que cela est suffisant pour une étude d’efficacité visant à évaluer la protection contre la calicivirose féline causée par une souche du FCV pré-selectionnée. Quatre chats / souche de FPV: la pharmacopée correspondante indique 5 chats par groupe témoin infecté non vacciné pour les essai d'épreuve virulente, cependant considérant qu'il s'agit d'études de mise au point il a été décidé d'utiliser un nombre inférieur jugé suffisant pour l'obtention de données cliniques. Cinq chats / groupe de FHV: la pharmacopée correspondante indique 10 chats par groupe pour les essai d'épreuve virulente, cependant considérant que cela est suffisant pour une étude d’efficacité visant à évaluer la protection contre la rhinotrachéite féline causée par une souche du FHV pré-selectionnée. Pour les autres pathogènes, le nombre sera également réduit au minimum nécessaire à l'obtention de données pertinentes, tout en respectant les exigences réglementaires, soit 2 à 8 chats par groupe expérimental.

Raffinement

Les animaux seront retirés de l'étude s'ils doivent suivre un traitement concomitant qui compromet leur aptitude à participer à l'étude, ou si leur état de santé se détériore au point de compromettre leur bien-être. Afin d'éviter de compromettre le bien-être des animaux pendant l'essai, les chats seront évalués quotidiennement par du personnel qualifié et, si le bien-être des animaux est compromis, des mesures correctives seront appliquées. Des tableaux de signes cliniques seront utilisés afin de déterminer un score journalier d'état clinique. Dans le cas où l'animal présenterait de la douleur, de la souffrance ou de la détresse, selon la ponctuation obtenue dans l'évaluation des signes cliniques, un vétérinaire examinera l'animal afin de déterminer l'origine de la douleur, de la souffrance ou de la détresse et des actions correctives seront appliquées (traitement si possible, ou sortie d'étude) Les animaux seront hébergés en groupe d'individus compatibles, dans de grandes salles d'hébergement, avec un enrichissement adapté à l'espèce et à leur âge, et avec des intéractions positives quotidiennes avec le personnel en charge des soins. Un programme d'entrainement basé sur le renforcement positif sera mis en place afin de limiter le stress engendré par les manipulations nécessaires à l'étude, et de diminuer autant que possible le recours aux sédations.

Choix des espèces

Le chat est l'espèce cible des vaccins mis au points et des virus utilisés. Les animaux seront de jeunes chats âgés de moins d'un an, correspondant à la population la plus sévèrement touchée par les virus étudiés.

Les souris mâles utilisées portent une mutation qui les fait naître avec 20 à 30 % de poids en moins, les rend stériles et fait chuter leur proportion dans les portées à 10 % au lieu des 25 % attendus. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et organes. Elles sont gavées une fois par jour pendant trois mois au maximum, prélevées par ponction rétro-orbitaire, mises à courir sur tapis et à tenir sur une roue en rotation, passées en IRM pendant une heure trente et en échocardiographie, avec des transferts routiers entre trois établissements. Le porteur indique qu'une fausse route lors du gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et qu'une perte de poids de 20 % ou l'absence d'amélioration après 48 heures y conduit également.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.