Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude de l’effet de l’inflammation sur l’expression du gène Fkrp
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Des injections intramusculaires quatre jours de suite sous anesthésie, des injections intrapéritonéales deux à cinq fois par semaine sur animaux éveillés, des prélèvements sanguins deux fois par semaine : 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles et leurs organes. Les molécules injectées sont pro-inflammatoires. Le porteur décrit la réaction locale ou générale qu'elles provoquent comme transitoire, résolue en moins de 76 heures, et situe l'objet du projet dans la compréhension du lien entre inflammation et aggravation d'une myopathie des ceintures, les retombées pour les patients tenant à des "perspectives d'amélioration". Il retient la souris adulte parce que son muscle est assez volumineux pour recevoir la quantité de produit voulue, et affirme avoir "besoin" d'un modèle animal parce que les cultures cellulaires n'intègrent pas les interactions avec le système immunitaire.
Objectifs
Les dystrophies des ceintures sont des maladies génétiques qui affectent principalement les muscles proches du tronc, comme ceux des épaules et des hanches. Ces maladies entraînent une dégradation des muscles, ce qui cause une perte de mobilité des bras et des jambes. Parmi les différentes formes existantes, notre laboratoire étudie particulièrement la LGMD-R9 (Limb Girdle Muscular Dystrophy R9 en anglais ou Myopathie des Ceintures de type R9 en français), causée par des mutations dans le gène responsable de la production de la protéine FKRP. Une des options pour traiter cette maladie est la thérapie génique. Cela consiste à utiliser des virus modifiés pour introduire une version saine du gène FKRP (Fukutin Related Protein) dans les cellules malades. Cependant, même si cette méthode a montré des résultats prometteurs, elle pose encore des défis importants. Par exemple, les doses nécessaires pour traiter les muscles sont très élevées, ce qui peut provoquer des réactions immunitaires et des inflammations. Le but de notre projet est de comprendre comment l'inflammation est liée à l'aggravation des symptômes de cette maladie. En comprenant mieux ce lien, nous espérons développer de nouvelles méthodes de traitement pour cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permet d’approfondir nos connaissances fondamentales sur l’expression du gène FKRP. Les approches thérapeutiques destinées aux patients atteints de LGMD-R9 pourraient directement bénéficier des résultats générés par cette étude. Ces résultats pourraient contribuer aux perspectives d’amélioration des traitements de thérapie génique dans le cadre de cette maladie.
Procédures
Des injections sont réalisées par voie intramusculaire au maximum 1 fois par jour pendant 4 jours, ou en une seule fois sur la durée de l’étude, sous anesthésie gazeuse de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. D’autres injections seront faites par voie intra-péritonéale (durée d’injection : moins de 1 minute), sur animaux vigiles. Dans ce cas les molécules seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Des prélèvements de sang seront faits au maximum deux fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont classées légères à modérées. Certaines sont liées à la nature des différents actes réalisés : douleur de l’injection pour administration de molécules en intramusculaire ou intra-péritonéale (classe légère). Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie (classe légère). Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. D’autres nuisances sont liées à la nature des molécules injectées. Il s’agit de molécules pro-inflammatoires induisant une réaction inflammatoire systémique ou locale (classe modérée). Il s’agit de réactions transitoires qui sont résolues en moins de 76h.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des muscles et des organes.
Remplacement
Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doit prendre en compte des paramètres tels que les interactions avec le système immunitaire. Pour poursuivre l’étude et en tirer des conclusions potentiellement applicables à l’espèce humaine, nous avons donc besoin d’utiliser un modèle animal.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôles pour les différentes conditions évaluées. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Un test statistique a été utilisé pour pouvoir tirer des conclusions à partir des expériences.
Raffinement
Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Les souris étant des animaux sociaux, elles sont hébergées par groupes. Une phase d’adaptation de 7 jours est mise en place avant l’entrée en protocole. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi et sont observés quotidiennement. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Nous utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir une température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte. A ce stade les animaux présentent une taille de muscle suffisamment importante pour injecter une quantité suffisante de molécules. Chez une souris plus jeune nous ne pourrions pas injecter une quantité suffisante pour mesurer l’efficacité du traitement administré.
Ciblage des Glioblastomes par transfert adoptif de lymphocytes T Vγ9Vδ2 exprimant OAcGD2-CAR
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Deux passages d'IRM par semaine sous anesthésie générale, pendant jusqu'à quatre-vingts jours, attendent chacune des 404 souris du projet. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tuées pour récupérer leur cerveau. Après l'implantation d'un glioblastome humain dans le cerveau, 192 reçoivent une irradiation cérébrale de 15 Gy en une séance et 288 une injection intracrânienne de lymphocytes T modifiés, le porteur attendant une perte de poids, de motricité et de sensibilité. Les souris NSG sont choisies pour leur absence d'immunité, qui permet la greffe de cellules humaines et évite les réactions contre le traitement, et le porteur ajoute que le laboratoire partenaire maîtrise déjà ce modèle.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne dont l’hétérogénéité et l’agressivité limitent l’efficacité du traitement. Parmis les nouveaux enjeux thérapeutiques, l’immunothérapie constitue une piste intéressante. A ce jour, la meilleure approche d’immunothérapie réside dans le transfert cellulaire adoptif, basé sur l’administration d’effecteurs cellulaires immunitaires spécifiques aux antigènes tumoraux afin de stimuler et promouvoir la prolifération, l’expansion et le maintien des fonctions effectrices immunitaires anti-tumorales. L’utilisation de cette technique avec des cellules T modifiées par des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) représente une piste thérapeutique pertinente contre les GBM. Ce projet a ainsi pour but d’évaluer l’efficacité préclinique d’un transfert adoptif de lymphocytes T Vγ9Vδ2-CAR (LTgd) expriment un CAR dirigé contre la forme acétylée du disialoganglioside GD2 (CAR-OAcGD2), cible prometteuse pour la thérapie par cellules CAR T contre les GBM. Le protocole d’injection du traitement par CAR-LT (ou solution saline) correspond à une injection intracrânienne intratumorale à un débit de 0.6µL/min. Cette procédure d’administration fait suite à une précédente saisine.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles pour les tumeurs cérébrales (GBM).
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - chirurgie : implantation de tumeurs cérébrales sous anesthésie générale, 20 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 404 animaux sont concernés. - imagerie IRM : pour suivie de la croissance tumorale : sous anesthésie générale, 10 minutes par animal maximum, réalisée deux fois par semaine jusqu’à 80 jours. 404 animaux sont concernés. - radiothérapie : irradiation cérébrale (15 Gy en une fraction) sous anesthésie générale, 15 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 192 animaux sont concernés. - injection intracrânienne du traitement sous anesthésie générale, 30 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 288 animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
L’établissement du modèle de tumeur cérébrale est permis grâce à une procédure chirurgicale sévère qui peut induire des douleurs. Les animaux recevront une prise en charge analgésique pré- et post-opératoire et seront surveillés jusqu'à leur réveil, puis replacés dans leur cage et remis à l'animalerie. Les animaux seront surveillés quotidiennement. D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à observer une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les aniamux ayant développé un GBM, suite à l'injection (procédure sévère). Les séquences d’imagerie par IRM (procédure légère) n’induisent pas de douleur, de perte de poids ou de perturbation du comportement, mais elles peuvent induire un autre point limite qui est défini pendant l’acquisition IRM : c’est la diminution de la fréquence respiratoire en deçà de 30 respirations par minutes. S’il est atteint et que la diminution du pourcentage d’isoflurane ne suffit pas à augmenter la fréquence respiratoire, la procédure sera arrêtée. A chaque sortie des animaux de la zone EOPS, lors des séquences d'imagerie par IRM, un risque d'infection ou de contamination par les autres animaux n'ayant pas de phénotype dommageable existe. D'après l'expérience du laboratoire, la radiothérapie cérébrale (procédure légère) induit une perte de poids transitoire chez les animaux.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort dans le but de récupérer le cerveau pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les tumeurs de type GBM sont connues pour être multi-compartimentales, hétérogènes et caractérisées par une immunosuppression forte. Au-delà du compartiment tumoral, d’autres composantes jouent un rôle essentiel dans la réponse au traitement, telles que la vascularisation, l’hypoxie et l’immunité. Leurs interactions réciproques avec les cellules tumorales influencent la réponse au traitement et la survie des patients. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de GBM afin de déterminer le comportement des cellules de ces lignées de GBM. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation de méthodes d’imagerie non-invasives se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chaque temps. Chaque animal constitue dans ce cas son prorpre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Pour pouvoir obtenir des analyses statistiques robustes, ces simulations ont été faites à l’aide d'un l’outil statistique en ligne et selon des données préliminaires acquises dans l’unité, pour lesquelles la survie du modèle murin de glioblastome du 1er groupe (tumeur) est de 28 jours et celle du 2ème groupe (tumeur + radiothérapie) est de 10 jours. Les paramètre saisis sur BiostaTGV sont les suivants : valeur de variabilité = 14 (écart type commun σ), risque de première espèce α = 0.05, puissance 1-β = 0.8, avec un test de nature bilatéral. Un nombre de 12 animaux par sous-groupe de traitement est donc nécessaire afin d'obtenir une différence significative avec une valeur statistique de 5 % pour un effet de 80 % du traitement. Ce nombre d’animaux est considéré comme maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude. Nous justifions également le nombre d’animaux par sous-groupe d’après l’expérience du laboratoire et la DAP issue du laboratoire collaborateur au projet.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de quatre individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéfécieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, craft). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. La mesure du poids sera faite trois fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les différences procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés ainsi que par le choix de points limites cohérents. A chaque sortie des aniamux de la zone EOPS, une désinfection au phagospray est réalisée sur chaque matériel utilisé avant chaque expérimentation et pour chaque procédure.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris immunodéprimées NSG. Notre traitement étant constitué de CAR-T, l’absence d’immunité de ces souris évitera les réactions croisées et dirigées contre les CAR-T. Ce modèle permettra donc la croissance de cellules tumorales humaines et la survie des cellules immunitaires humaines, permettant ainsi d’étudier l’effet du traitement sur un modèle de tumeur cérébrale reposant sur l’implantation de cellules de glioblastome d’origine humaine et reflétant l’hétérogénéité moléculaire des GBM observée en clinique. Le choix de la souris NSG est idéal car ce modèle étant déjà maîtrisé dans le laboratoire partenaire, il permettra d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. Nous utiliserons des souris mâles et femelles, en lien avec les recommandations actuelles pour mieux représenter la réalité clinique car, si le sexe ratio du GBM est de 1.6 (en faveur des hommes), il touche aussi bien des femmes que des hommes. L’ensemble des animaux utiliés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, le cerveau est mature et cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. Il sera possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps plus longs.
Etude des déficits immunologiques dans un modèle de souris mutantes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
36 souris vont être utilisées pour une seule prise de sang d'une minute chacune, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées ensuite pour prélever leur moelle osseuse. Elles portent une mutation qui reproduit le syndrome de Hermansky-Pudlak, donc un déficit immunitaire et un défaut des plaquettes qui expose à un saignement prolongé au moment même du prélèvement. Le geste se fait sur animal éveillé, le porteur prévoyant de comprimer le point de ponction avec un hémostatique. Il indique que le déficit immunitaire ne s'exprime pas ou peu grâce aux barrières sanitaires de l'élevage, ce qui fait dépendre la gravité déclarée du maintien de ces conditions d'hébergement.
Objectifs
Les maladies rares d’origine génétique peuvent nous en apprendre beaucoup sur le fonctionnement du corps humain. En les étudiant, les chercheurs découvrent des informations précieuses sur les gènes, les protéines et les mécanismes essentiels de la vie. Ces découvertes peuvent aussi aider à mieux comprendre des maladies plus courantes. Dans notre recherche, nous nous intéressons à une maladie appelée syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP). C’est une maladie rare qui touche plusieurs organes et se manifeste notamment par une forme d’albinisme (peau et yeux très clairs) et une tendance aux saignements. Chez certains patients atteints de cette maladie, nous avons découvert des anomalies dans un gène. Ces anomalies pourraient expliquer certaines difficultés de défense contre les infections (déficit immunitaire) ainsi que des troubles du sang, en particulier un manque de plaquettes – des cellules qui aident à arrêter les saignements – et des problèmes dans leur fonctionnement. Le but de notre projet est d'étudier les effets de cette anomalie génétique, en utilisant un modèle de souris spécialement conçu pour porter cette mutation. Nous allons nous concentrer sur l’étude du sang, et plus particulièrement sur les plaquettes. Pour cela, nous réaliserons des prises de sang sur des souris saines et sur des souris porteuses de la mutation, afin d’analyser les différences et mieux comprendre les conséquences de cette modification génétique.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet est l'étude de système immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare, le syndrome de Hermansky-Pudlak. Nous souhaitons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène cible et son effet sur la thrombopénie (réduction de nombre de plaquettes) ainsi que les dysfonctionnements de ces plaquettes.
Procédures
Dans le cadre de cette procédure, un prélèvements de sang sera réalisé sur chaque animal à 6 semaines d'âges. Ce geste dure environ une minute.
Impact sur les animaux
Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction plaquettaire et de la thrombopénie, un risque de saignement prolongé au moment de la prise de sang pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes. Le prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile pouvant induire un stress. Nos souris ont un phénotype dommageable (déficit immunitaire) et sont sensibles aux infections liées aux pathogènes. Cependant, grâce à nos conditions d’élevage avec des barrières sanitaires spécifiques, l'expression du phénotype est limitée voire inexistante.
Devenir
En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder a la collecte d'organe, de la moelle ossuse, afin de l'analyser.
Remplacement
Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et peut être étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information. De plus, le système immunitaire est complexe et impliques plusieurs organes. Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification d’une protéine sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie immunitaire. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (régulation et production des cellules immunitaires). Seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (fonctionnement du système immunitaire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en gardant s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Vu l'expérience que nous avons sur l'étude précédente, 18 animaux mutants et 18 animaux contrôles sont nécessaires pour obtenir des résultats robustes dans l’analyse des populations cellulaires par cytométrie.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, la posture, la présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat (présence de matériel pour la construction du nid et un tube). Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique déterminé par le service vétérinaire pourra être administré. Des points limites sont mis en place, si un des points limites est atteint la mise à mort de l'animal pourra être envisagée afin d'éviter toute souffrance. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local afin d’atteindre l’hémostase. Le phénotype étant dommageable (déficit immunologique), les animaux seront hébergés dans un environnement adapté à leur immunodéficience : ils seront traités en premier en début de journée pour être dans les conditions les plus propres, et pour éviter les contaminations et seront hébergées en cages sur portoir ventilé pour éviter toute infection par un pathogène. Ces conditions permettent d'éviter l’apparition du phénotype dommageable en lien avec l’immunodéficience.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons du modèle porteur de modifications génétiques sur le gène d'intérêt. Le modèle de souris est notamment très utilisé pour étudier les fonctions immunitaires, où un large panel d’outils d’analyse est disponible. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. En particulier, les systèmes immunitaires chez l’humain et chez la souris ont de nombreuses similitudes (réponse innée et adaptative, même protéines exprimées…). Le prélèvement sera réalisé sur les animaux à 6 semaines car c'est un âge compatible avec un prélèvement sanguin suffisant pour effectuer les analyses. A ce stade, le système immunitaire est mature.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles thérapeutiques dans un modèle d’allogreffe chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
85 souris sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, pour fournir la peau greffée aux autres. 400 receveuses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées pour prélever leurs tissus. Chaque greffe de peau pleine épaisseur dure une vingtaine de minutes, suivie de trente jours au plus de traitements immunosuppresseurs testés, de clichés sous anesthésie légère tous les deux jours et d'une imagerie de fluorescence par semaine. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires, des infections possibles du greffon et des pertes de poids liées aux molécules testées, et conclut que le rôle des souris reste "crucial et irremplaçable".
Objectifs
Le rejet de greffe reste un obstacle central en transplantation, nécessitant des traitements immunosuppresseurs souvent lourds et aux effets secondaires significatifs. Ce projet a pour objectif d’utiliser un modèle murin de greffe de peau pleine épaisseur afin d’évaluer des approches innovantes pour inhiber efficacement le rejet et prolonger la survie des greffes. L’un des objectifs principaux est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules et formulations qui ciblent spécifiquement les voies métaboliques critiques des lymphocytes T activés. Ces cellules immunitaires, responsables du rejet, reprogramment leur métabolisme en faveur de la glycolyse, de la phosphorylation oxydative et du métabolisme de la glutamine pour répondre à leurs besoins énergétiques. Ce projet vise à tester des inhibiteurs de ces voies, individuellement ou en combinaison, afin de déterminer leur capacité à moduler la réponse immunitaire et à prolonger la survie des greffes. Une attention particulière sera portée à l’optimisation des conditions d’administration des molécules étudiées. Le projet explorera différentes stratégies de dosage et de fréquence d’administration afin de maximiser l’efficacité tout en minimisant les effets secondaires. Ces efforts visent à établir des protocoles thérapeutiques mieux tolérés par les sujets, garantissant un équilibre entre immunosuppression et tolérance immunitaire. Enfin, ce projet ambitionne d’explorer les interactions potentielles entre les inhibiteurs métaboliques et d’autres approches immunomodulatrices, telles que les traitements par co-stimulation ou la déplétion cellulaire. L’objectif est de développer des combinaisons thérapeutiques capables de générer une immunosuppression robuste et synergique, tout en minimisant les risques de rejet aigu et en favorisant une tolérance durable. À travers cette démarche, ce projet contribuera à l’élaboration de stratégies novatrices et transposables en clinique, offrant des perspectives prometteuses pour améliorer les résultats des greffes et la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche ambitionne de transformer la gestion du rejet de greffe en se concentrant sur la découverte de nouvelles approches thérapeutiques. En évaluant des molécules innovantes et en testant des formulations ciblant les voies métaboliques clés des lymphocytes T activés, il vise à élargir le répertoire des traitements disponibles en transplantation. Un des principaux bénéfices attendus est l’identification de nouvelles molécules capables d’inhiber sélectivement les mécanismes immunitaires responsables du rejet, tout en limitant les effets secondaires courants associés aux traitements immunosuppresseurs conventionnels. Ces découvertes permettront de mieux comprendre les interactions complexes entre métabolisme cellulaire et réponses immunitaires, ouvrant ainsi la voie à des interventions plus spécifiques et efficaces. Ce projet se distingue également par son approche novatrice de combinaison thérapeutique. En explorant les synergies potentielles entre deux molécules ou plus, il sera possible de maximiser l’effet immunosuppresseur tout en réduisant les doses nécessaires, diminuant ainsi la toxicité et les risques pour les patients. Cette démarche pourrait générer des stratégies thérapeutiques robustes et durables, adaptées à des contextes cliniques variés. Enfin, l’optimisation des doses et des schémas d’administration constituera un bénéfice clé. Grâce à une évaluation rigoureuse des relations dose-réponse, ce projet permettra d’identifier les protocoles les plus sûrs et les plus efficaces, minimisant les complications et maximisant les chances de succès des greffes. En résumé, ce projet s’inscrit dans une dynamique d’innovation centrée sur la découverte et l’optimisation de traitements de nouvelle génération, offrant des perspectives prometteuses pour améliorer la gestion du rejet de greffe et la qualité de vie des patients transplantés.
Procédures
Les animaux donneurs seront prélevés selon une procédure chirurgicale sans réveil durant approximativement 20 minutes, puis seront mis à mort. Les animaux receveurs recevront les gerffes de peaux des donneurs lors d'une procédure chirurgicale durant approximativement 20 minutes, puis seront suivis pendant une période pouvant aller jusqu'à 30jours. Les animaux seront surveillés journalièrement la 1ère semaine, puis tous les 2 jours pour évaluer leur état et réaliser un scoring de prise de greffe. les animaux seront traités avec des traitements de référence et des traitements tests pour comparer l'efficacité de nouvelles thérapeutiques. L'évaluation de la prise de greffe se fera aussi par imagerie non invasive (prise de clichés sous anesthésie légère tous les 2 jours et imagerie de fluoresence une fois par semaine).
Impact sur les animaux
Ce projet, bien que conçu pour minimiser l'impact sur les animaux, peut entraîner certaines nuisances ou effets indésirables inhérents à la mise en œuvre d’un modèle de transplantation cutanée et aux traitements testés. L’intervention chirurgicale nécessaire pour réaliser les greffes de peau constitue une source potentielle de douleur et d’inconfort postopératoires. Cependant, ces effets seront atténués grâce à une prise en charge rigoureuse, incluant l’utilisation d’anesthésiques pendant l’opération et d’analgésiques (par exemple, la buprénorphine) pour soulager la douleur après l’intervention. Des complications locales, telles que des infections au site de greffe ou un retard de cicatrisation, peuvent survenir. Ces risques seront contrôlés par des mesures prophylactiques, comme l’administration d’antibiotiques, et une surveillance attentive des animaux pour détecter rapidement toute anomalie. Les traitements administrés dans le cadre de l’étude (inhibiteurs métaboliques ou molécules immunosuppressives) pourraient entraîner des effets secondaires dose-dépendants, tels qu’une perte de poids, une fatigue ou des altérations métaboliques. Ces manifestations seront étroitement surveillées grâce à un suivi clinique quotidien des animaux, incluant l’évaluation de leur comportement, de leur alimentation et de leur état général. Des ajustements de dose seront effectués si nécessaire pour limiter ces effets.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux donneurs seront mis à mort. A l'issue de chaque procédure, les animaux receveurs seront mis à mort afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo.
Remplacement
La recherche menée dans ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour inhiber le rejet de greffe, en s’appuyant sur un modèle murin de transplantation cutanée. Bien que le recours aux animaux soit limité aux cas où aucune alternative équivalente n’existe, leur utilisation demeure essentielle pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Les modèles in vitro et les simulations informatiques constituent des alternatives précieuses et seront exploitées dans les phases préliminaires. Les cultures cellulaires, par exemple, permettront d’évaluer les interactions moléculaires et les effets directs des traitements sur les lymphocytes T. De même, des outils de modélisation informatique seront utilisés pour prédire les propriétés pharmacocinétiques et les interactions potentielles entre les molécules. Ces méthodes contribueront à réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant en amont les composés inefficaces ou toxiques. Cependant, ces approches ne peuvent pas reproduire les processus biologiques complexes d’un organisme vivant, tels que les interactions immunologiques, la vascularisation des greffes ou les effets systémiques des traitements. Le rejet de greffe implique des mécanismes dynamiques qui ne peuvent être modélisés de manière fiable qu’en étudiant un système immunitaire fonctionnel dans son intégralité. Les souris, grâce à leur génétique bien caractérisée et leur similitude immunologique avec les humains, constituent le modèle le plus adapté pour explorer ces phénomènes de manière rigoureuse et reproductible. En outre, le modèle murin de greffe de peau permet une observation directe et précise des effets des molécules testées, notamment par l’évaluation visuelle et histologique des greffes. Ce niveau de précision est indispensable pour garantir la robustesse et la transposabilité des résultats à un contexte clinique. Enfin, l’utilisation des animaux sera strictement encadrée par des protocoles respectant les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Tous les efforts seront faits pour réduire leur nombre au strict minimum nécessaire et pour limiter leur inconfort par des soins appropriés et des critères d’arrêt clairs. Ainsi, bien que des alternatives soient intégrées au projet pour limiter l’utilisation des animaux, leur rôle reste crucial et irremplaçable pour répondre aux questions scientifiques complexes liées au rejet de greffe et au développement de traitements innovants.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d’analyses statistiques rigoureuses. Les tests utilisés incluent des méthodes telles que l’analyse de puissance statistique, permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux avec une probabilité donnée (généralement 80 %) et un seuil de signification de 5 %. Ces calculs tiennent compte de la variabilité attendue des réponses, basée sur des études antérieures dans le domaine de la transplantation.
Raffinement
Raffinement des conditions d’hébergement et de manipulation : Les souris sont maintenues dans des conditions optimales, adaptées à leur statut sanitaire : Utilisation de cages spécifiques avec filtration d’air pour réduire le risque d’infections. Température (20-24 °C) et humidité (40-60 %) contrôlées, essentielles pour éviter les perturbations cutanées. Enrichissement environnemental adapté (matériaux stériles comme tunnels ou abris) pour éviter tout traumatisme mécanique sur les greffes. Minimisation de la douleur et de la détresse : Anesthésie générale des animaux lors des chirurgies et analgésie préventive et postopératoire : Administration d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et antibiothérapie. Techniques chirurgicales optimisées : Utilisation d’instruments microchirurgicaux pour minimiser les traumatismes tissulaires et surveillance stricte de l’asepsie pour prévenir les infections postopératoires. Monitoring du bien-être : Mise en place d’une grille d’évaluation régulière incluant des paramètres comportementaux, physiologiques (perte de poids, température corporelle), et spécifiques (aspect de la greffe). Suivi longitudinal par imagerie non invasive : Utilisation de technologies telles que la fluorescence ou la tomographie optique cohérente (OCT). Ces outils permettent de suivre en temps réel l’état des greffes sans euthanasier les animaux à différents temps.
Choix des espèces
Le modèle murin a été retenu pour ce projet en raison de ses nombreux avantages scientifiques et pratiques. Les souris possèdent un système immunitaire bien caractérisé et similaire à celui des humains, permettant une extrapolation pertinente des mécanismes immunologiques étudiés. La disponibilité de lignées inbred et transgéniques facilite l’exploration des réponses immunitaires spécifiques et des mécanismes d’action des molécules testées. La transplantation cutanée chez la souris est un modèle robuste, largement documenté et reproductible, idéal pour évaluer le rejet de greffe. La petite taille des souris et leur gestion pratique réduisent les coûts et permettent des études efficaces avec un nombre minimal d’animaux. Malgré l’utilisation d’alternatives in vitro pour réduire leur nombre, les souris restent indispensables pour étudier les réponses immunitaires systémiques et les interactions complexes in vivo, essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris adultes, âgées de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement est privilégié car il correspond à la maturité immunologique, nécessaire pour étudier les mécanismes de rejet de greffe et les réponses aux traitements immunosuppresseurs. Les souris adultes présentent des systèmes immunitaire, métabolique et vasculaire pleinement fonctionnels, ce qui garantit la fiabilité des résultats et leur transposabilité aux humains. De plus, à cet âge, les animaux sont suffisamment robustes pour supporter les procédures chirurgicales tout en minimisant les risques de complications liés à l’immaturité ou à la sénescence. L’utilisation de souris au même stade de développement permet également de réduire la variabilité des résultats, en limitant les différences physiologiques liées à l’âge.
Étude de la résistance à la colonisation dans un modèle d’infection poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
La mort par infection est retenue comme point limite, le porteur indiquant que les signes de souffrance sont mal connus et peu observables au stade larvaire. 42 282 poissons zèbres vont être utilisés, dont 38 700 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Les larves sont plongées trois ou vingt-quatre heures dans une eau contenant une bactérie pathogène, chacune seule dans deux millilitres d'eau au fond d'un puits, la mort survenant en vingt-quatre à quarante-huit heures quand la flore ne protège pas. Le porteur écrit que la douleur et le stress liés à l'infection ne sont pas quantifiables à ce stade, tout en concluant qu'ils restent de courte durée puisque la mort arrive vite.
Objectifs
La flore microbienne joue de nombreux rôles en santé humaine et contribue notamment à la protection contre l’infection, plus communément appelé l’effet probiotique. Cependant, ces effets bien que décrits restent peu caractérisés du fait de la diversité et complexité de la flore intestinale chez les mammifères et des limites pratiques intrinsèques aux modèles in vivo correspondants (coûts d’hébergement, manipulation...). Dans ce contexte, la larve du poisson zèbre constitue un modèle de choix puisque la flore y est moins complexe, l’observation microscopique non invasive plus aisée, tout en arborant un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables aux mammifères, en faisant ainsi un modèle pertinent pour étudier les interactions hôte-pathogène. L’objectif de ce projet est ici de caractériser les mécanismes moléculaires responsables de la protection conférée par la flore contre un pathogène en utilisant un modèle de colonisation par immersion chez la larve de poisson-zèbre. Pour cela, trois aspects seront étudiés : (i) la réponse de l’hôte face au pathogène ainsi que l’influence d’un microbiote, protecteur ou non, sur celle-ci (ii) le pathogène et ses potentiels facteurs de virulence, et (iii) l’établissement et la dynamique de la flore commensale, les interactions entre les différents membres, la composition minimale permettant la protection et les facteurs moléculaires impliqués.
Bénéfices attendus
La flore joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote-pathogène sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles. Dans ce contexte, notre projet vise à caractériser les facteurs de protection développés par le microbiote et l’influence de l’hôte, et permettra ainsi de mettre en lumière des bactéries probiotiques capables de protéger les poissons-zèbre contre une infection par des pathogènes invasifs. L’étude du rôle protecteur de ces potentiels probiotiques contre des pathogènes de poissons pourrait être ensuite envisagée chez des poissons économiquement importants en aquaculture tels que la truite. Enfin, l’identification de mécanismes moléculaires responsables de l’effet protecteur aboutira, de manière plus générale, à une meilleure compréhension du rôle du microbiote dans la santé de l’hôte.
Procédures
Les larves de poisson-zèbre vigiles seront exposées une fois à un pathogène par balnéation pendant 3 ou 24 heures selon la procédure. Cela pourra entrainer le développement d’une infection, notamment en l’absence d’une flore protectrice. L’infection est probablement associée avec un certain niveau de douleur et/ou stress non quantifiables à ce stade de développement de la larve, qui peut aboutir à la mort de l’animal en 24 à 48 heures.
Impact sur les animaux
Nos expériences consistant à évaluer soit la protection conférée par la flore contre le pathogène soit la capacité des pathogènes sélectionnés à infecter et tuer les larves, la mort des poissons sera alors majoritairement considérée comme point limite. Des signes de souffrance en amont ne sont en fait que très peu listés et /ou adaptés au stade larvaire et à notre procédure d’élevage. Leur niveau d’appétit ou leur taille exacte ne peuvent pas être mesurés dans notre système et à ce stade de développement, et l’absence de réponse au stimulus souvent synonyme de souffrance n’est pas observée de manière systématique avant la mort de l’animal. Le développement de l’infection doit engendrer une douleur et/ou un stress à l’animal que l’on ne peut quantifier mais qui reste de courte durée puisque la mort intervient alors très rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car : (i) une majorité aura été en contact avec le pathogène et ils ne peuvent ainsi pas être réutilisés, ni replacés, ni adoptés. (ii) cela permettra les différentes analyses prévues (à différents temps ou en fin d’expérience)
Remplacement
Le rôle de la flore dans la protection contre l’infection et les interactions de celle-ci avec l’hôte ne peut être étudié que dans un contexte in vivo. Le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé et nous utiliserons ici des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’être minimum tout en permettant l’application des approches statistiques choisies et est basé essentiellement sur des données de la littérature. L’analyse statistique pour la comparaison de la survie des larves dans de multiples conditions expérimentales au cours du temps s’appuiera sur l’utilisation d’un modèle de survie. Des ajustemenst seront réalisés afin de prendre en compte la multiplicité des tests.
Raffinement
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence et comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la protection conférée par la flore contre un pathogène. L’ensemble des procédures consiste ainsi en l’infection des poissons-zèbres en ajoutant l’agent pathogène dans l’eau des larves de poissons et le suivi de la survie en fonction notamment de la composition de la flore reconstituée au préalable. Des mutants du pathogène utilisé seront également testés afin de mettre en lumière les facteurs de virulence impliqués dans le développement de l’infection. Les symptômes chez la larve étant peu connus et non systématiques, la mort de l’animal par l’infection ne peut majoritairement pas être évitée sans interférer avec nos résultats. Certains signes cliniques propres à la pathologie du pathogène donné seront néanmoins recherchés quotidiennement et aboutiront à la mise à mort du poisson par surdose d’anesthésique. Une observation quotidienne des poissons sera ainsi réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de quinze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau.
Choix des espèces
La flore intestinale joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-pathogène ainsi que l’identification du rôle du microbiote sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles, et cela ne peut se faire sans le recours à l’expérimentation animale. Le Danio zébré est un modèle in vivo bien caractérisé (notamment du fait de son utilisation en biologie du développement), avec un génome connu et de nombreuses lignées transgéniques déjà disponibles. De plus, nos procédures impliquent de n’exposer aux bactéries pathogènes invasives que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude. Outre l’obtention de pontes, qui nécessite des poissons-zèbres adultes, mâles et femelles, mais non inclus dans ce projet car simplement géniteurs, nos procédures impliquent de n’exposer aux bactéries pathogènes que des poissons au stade larvaire de développement. L’utilisation de poissons au stade larvaire de développement se justifie au niveau scientifique et éthique puisque ces derniers possèdent déjà un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables à ceux des mammifères.
Etudier l’efficacité d’un traitement combiné avec des cellules immunitaires modifiés dans le glioblastome après la résection chirurgicale
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 170 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Des cellules tumorales leur sont injectées dans le cerveau, une partie subit trois semaines plus tard l'ouverture du crâne pour retirer la tumeur, reçoit dans la cavité des cellules immunitaires modifiées ou un implant, et donne deux prises de sang par semaine. Le porteur annonce une perte de poids pouvant dépasser 20 %, une tête inclinée et une perte progressive d'équilibre, et écrit que le retrait de la tumeur ne provoque pas de douleur puisque le cerveau n'a pas de terminaisons nerveuses. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier une chirurgie associée à une immunothérapie, ce qui selon lui "justifie l'utilisation du modèle animal", le projet étant mené avec un groupe pharmaceutique.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive chez l'adulte. Malgré un traitement lourd associant chirurgie (résection pour réduire la taille de la tumeur), chimiothérapie et radiothérapie, la survie moyenne des patients est inférieure à 15 mois, en raison de la survenue quasi systématique de récidives. Le principal facteur explicatif de ces récidives est la repousse de cellules très invasives qui se sont propagées à partir de la masse tumorale et qui ne sont donc pas éliminées par la résection chirurgicale. Sur la base de ces données, il est urgent d'élaborer de nouvelles stratégies de traitement. Si l'immunothérapie (utilisation des cellules immunitaires contre le cancer) s'est révélée prometteuse dans de nombreux types de cancer, notamment le mélanome, le cancer de la prostate, le cancer du poumon non à petites cellules et le carcinome rénal, elle n'a pas pu concurrencer les autres traitements dans le cas du GBM, en raison du niveau anti-inflammatoire élevé de la tumeur. Il est donc essentiel de comprendre comment nous pouvons stimuler le système immunitaire pour surmonter cet échec et améliorer son efficacité. Sur la base de ces données et en collaboration avec un groupe pharmaceutique, qui dispose déjà de données préliminaires sur la pertinence de l'utilisation de cellules immunitaires contre le cancer, nous voulons étudier l'utilisation de cellules immunitaires pour augmenter la stimulation de la réponse immunitaire anti-tumorale Dans l'ensemble, cette étude vise à explorer l'utilisation de cellules immunitaires modifiées pour cibler les cellules tumorales après la résection par chirurgie, dans le but d'améliorer la survie et de contrôler la croissance de la tumeur. En injectant ces cellules immunitaires modifiées dans la cavité chirurgicale, nous espérons améliorer leur efficacité à tuer les cellules tumorales et à stimuler l’ensemble du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est la tumeur cérébrale agressive la plus fréquente chez l'adulte et l'un des cancers les plus mortels. Malgré des traitements intensifs tels que la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, la récidive est presque inévitable (90 %). Avec ce projet, notre objectif principal est d'acquérir des connaissances importantes qui peuvent être appliquées dans des contextes cliniques pour le traitement du GBM. Les options thérapeutiques pour ces tumeurs solides ont été relativement jusqu'à présent peu efficace .
Procédures
Dans cette étude, les animaux subiront plusieurs interventions afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement basé sur des cellules immunitaires modifiées contre le glioblastome. Tout d’abord, une première intervention consistera en l’injection de cellules tumorales directement dans le cerveau des animaux sous anesthésie générale. Cette procédure, réalisée une seule fois par animal, durera environ 10 à 15 minutes. Trois semaines après l’injection des cellules tumorales, certains animaux subiront une résection chirurgicale de la tumeur, toujours sous anesthésie générale. Cette intervention, qui vise à mimer la prise en charge clinique du glioblastome chez l’humain, durera environ 30 à 45 minutes. Dans le cadre du traitement expérimental, des cellules immunitaires modifiées seront injectées soit directement dans la tumeur, soit dans la cavité laissée par la résection. Cette injection, réalisée une seule fois sous anesthésie brève, durera environ 5 minutes. Chez certains animaux, un implant biodégradable sera placé dans la cavité tumorale au moment de la résection. Cet implant permettra une libération contrôlée des cellules immunitaires et/ou de médicaments anti-inflammatoires pour améliorer l’efficacité du traitement. Parallèlement, des prélèvements sanguins seront effectués deux fois par semaine afin de mesurer l’évolution de la tumeur. Chaque prélèvement, réalisé en quelques secondes sur une veine de la queue, permettra de limiter le stress des animaux. Enfin les animaux seront opérés sous anesthésie générale profonde juste avant leur mise à mort pour remplacer le sang par une solution de fixation (durée de l’anesthésie : 15 min). Les animaux ne reprendront pas conscience après cette anesthésie.
Impact sur les animaux
Pendant l'injection des cellules tumorales :Suite à l’injection des cellules tumorales, les animaux peuvent présenter une douleur localisée au site d’injection apparaissant immédiatement après la procédure et pouvant persister jusqu’à 24 heures ; cette douleur sera contrôlée par l’administration d’analgésiques. Des troubles transitoires de l’équilibre et une légère diminution de l’activité motrice peuvent également être observés durant les premières 24 heures. Avec le développement de la tumeur cérébrale, attendu dans les 1 à 2 semaines suivant l’inoculation, une perte progressive de l’équilibre, une réduction de la mobilité, une inclinaison anormale de la tête et un amaigrissement peuvent apparaître. Ces signes tendent à s’aggraver avec la croissance tumorale et seront surveillés quotidiennement afin d’identifier le moment approprié pour appliquer les critères d’arrêt. Pendant la résection : l'os du crâne étant mal innervé, la craniotomie provoque une douleur modérée. Alors que l'incision de la peau provoque une douleur modérée, la résection de la tumeur elle-même ne provoque pas de douleur puisque le cerveau n'a pas de terminaisons nerveuses. À la suite de cette opération, l'animal peut présenter une réduction de ses mouvements et de sa mobilité, ainsi qu'une perte de coordination dans les heures qui suivent l'intervention. Une perte de poids peut également être observée dans les jours qui suivent l'opération. Injection de monocytes modifiés: À la suite de l’injection de ces cellules immunes modifées, une perte progressive de poids supérieure à 20 % et un pelage hirsute, notamment au niveau du museau, peuvent être observés. D’autres signes incluent une réduction de la mobilité et une posture anormale (par exemple tête inclinée), comme rapporté dans des modèles similaires dans la littérature. Ces signes traduisent une dégradation de l’état général et entraîneront l’euthanasie conformément aux critères d’arrêt afin d’éviter toute souffrance. Nous prévoyons un stress et une douleur minimes lors des injections intracrâniennes, La douleur associée aux prélèvements sanguins répétés sera équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille et pourront provoquer un stress chez la souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Les résultats préliminaires obtenus en laboratoire et les données de la littérature nous amènent à penser que les changements de comportement des cellules tumorales après une intervention chirurgicale sont intimement dépendants de leur environnement. Cependant, le microenvironnement tumoral (toutes les cellules non tumorales autour de la masse tumorale) est un système complexe avec un nombre extrêmement élevé de paramètres, dont la plupart sont inconnus : il est actuellement impossible de recréer complètement cet environnement ex vivo. C'est pourquoi des études animales sont nécessaires. Notre hypothèse est que l'administration d'une thérapie par CAR-monocytes (cellules immunitaires modifiées) en utilisant la cavité chirurgicale renforcera la capacité du système immunitaire à combattre la tumeur et fournira une meilleure réponse au traitement standard par radiothérapie et chimiothérapie. Cette approche ne peut pas être étudiée de manière fiable par des modèles in vitro, car aucun ne permet de reproduire l'interaction complexe entre la cavité chirurgicale, le microenvironnement tumoral et la thérapie immunitaire. Cela justifie l’utilisation du modèle animal.. En outre, nos collaborateurs ont déjà utilisé des monocytes modifiés in vitro en co-culture 2D, testé avec des cellules GBM ce qui a permis de sélectionner les meilleurs candidats et de prouver leur efficacité contre les cellules tumorales. De plus, nous souhaitons évaluer l'effet d'une résection chirurgicale combinée à une immunothérapie utilisant des monocytes modifiés. A notre connaissance, aucun modèle in vitro ne permet d'étudier cette procédure sans utiliser d'animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons procédé à une analyse documentaire approfondie. En outre, notre expérience passée nous permet de limiter le nombre d'animaux. Plus précisément : 1. Nous avons identifié le nombre de cellules à injecter pour obtenir une tumeur de taille correcte. Nous n’aurons donc pas besoin de reproduire ces expériences 2. Nous avons appris à réséquer la tumeur, cette technique étant déjà pratiquée et maîtrisée dans notre laboratoire depuis plusieurs années. 3. Pour les traitements par CAR-Monocytes (cellules immunitaires modifiées), nous avons réalisé de nombreuses expériences in vitro avec l'aide de nos collaborateurs, ce qui nous a permis de déterminer les doses et le moment du traitement, réduisant ainsi de manière significative le nombre d'animaux utilisés. 4. Le suivi régulier de la progression de la tumeur par la mesure d'un marqueur sanguin nous permet de savoir quand réséquer la tumeur, réduisant ainsi également le nombre d'animaux utilisés. 5. Les analyses nécessitent une faible quantité de matériel, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires. 6. Pour ce projet, le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. Le nombre de souris par groupe est donc réduit au strict minimum, en fonction du type d’expérience tout en garantissant que les résultats soient statistiquement solides.
Raffinement
Conformément aux recommandations internationales, notamment dans le domaine de l'oncologie, les animaux sont suivis individuellement plusieurs fois par semaine (2 à 3 fois) afin de s'assurer de leur bien-être. Celui-ci sera évalué à l'aide d'une grille de cotation. Les interventions invasives sont réalisées sous anesthésie générale et les animaux reçoivent systématiquement des traitements analgésiques appropriés pendant et après les opérations. Les interventions chirurgicales sont réalisées dans des conditions de stérilité maximale par un personnel spécialement formé. Les animaux bénéficient d'une prise en charge standardisée de la douleur et sont régulièrement suivis après l'opération. Après injection du traitement, les animaux seront suivis 2 à 3 fois par semaine pendant les deux premières semaines, puis une surveillance quotidienne sera mise en place dès le développement de la tumeur. Cette surveillance quotidienne sera assurée y compris les week-ends et les jours fériés. L’objectif est de détecter précocement toute perte de poids ou signe de souffrance. En cas de perte de poids détectée, une surveillance rapprochée avec pesées quotidiennes et soins complémentaires (hydratation, compléments alimentaires) sera assurée. Après injections du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement (jours ouvrés donc 5j/semaine) afin d’évaluer la perte de poils, et pesés plusieurs fois par semaine. Si une perte de poids est détectée, l’animal sera alors surveillé de manière plus rapprochée avec une pesée quotidienne et des soins complémentaires effectués (hydratation, compléments alimentaires). Nous travaillons avec un personnel expérimenté dans l’observation et la gestion des souris, capable de reconnaître rapidement les signes de douleur ou de détresse. Le suivi est effectué de manière objective en s'appuyant sur la grille d'évaluation spécifique au projet. Si nécessaire, des soins supplémentaires, tels que des analgésiques ou réhydratation, compléments alimentaires seront apportés. Si aucun soulagement n’est possible, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous mènerons nos expériences en utilisant des souris, espèce de choix pour les études de cancérogenèse et les expériences menées en thérapeutique du cancer. Elles ont depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que leur physiologie est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes, qui permettent l'implantation de cellules humaines sans rejet et offrent un modèle pertinent pour évaluer la croissance tumorale et les effets des traitements anticancéreux in vivo. Adultes de 7-8 semaines, un âge qui permet une bonne prise tumorale. De plus, les animaux à cet âge supportent mieux l’anesthésie et la chirurgie
Nouvelles thérapies ciblant les voies de la résolution de l’inflammation dans des modèles de dermatite chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rasées à la crème dépilatoire sous anesthésie puis badigeonnées d'un produit irritant trois fois par semaine pendant trois semaines, ou injectées cinq jours sur sept, 1 388 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever des organes. L'objet est de tester des molécules censées relancer la résolution de l'inflammation dans des modèles de dermatite atopique et de sclérodermie, un essai clinique étant évoqué comme suite possible. Le porteur écrit que le rasage et les applications n'engendrent "pas de douleur mais un léger stresse", puis annonce que l'apparition des signes cliniques, elle, provoquera de la douleur chez l'animal.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chronique ont aujourd’hui une incidence en constante augmentation notamment dans les pays industrialisés. Ces maladies peuvent être localisées à un organe comme la rectocolite hémorragique, ou bien toucher tout l’organisme : c’est le cas de la dermatite atopique (DA). La DA est une inflammation qui touche 2 millions de personnes et entraîne de nombreux inconvénients tel que des démangeaisons intenses, des rougeurs et des troubles du sommeil. Cette inflammation est déclenchée par une altération de la barrière cutanée menant à l’activation du système immunitaire. Les traitements actuels utilisés visent à réduire l’inflammation et les démangeaisons par 1) l’application de crème et 2) l'utilisation d'immunomodulateurs ayant pour objectif d'inhiber le système immunitaire. Ces molécules ne sont pas spécifiques et sont associées à de nombreux effets secondaires tel que des brulures, bouffées de chaleur ainsi qu’une immunodépression rendant les patients très fragiles aux infections. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires. De nouvelles cibles ont été identifiés comme jouant un rôle dans la modulation de l'inflammation. Nous aimerions tester différentes molécules capables d’activer une de ces cibles et analyser les effets engendrés par cette activation dans différents modèles animaux de dermatite atopique.
Bénéfices attendus
Les traitements utilisés contre la dermatite atopique font appel à des traitements locaux de type crème corticoïdes limitant les rougeurs ainsi que les démangeaisons. Puis, lorsque les patients ne répondent plus aux corticoïdes ils peuvent être mis sous immunomodulateurs. Ces traitements entrainent néanmoins de nombreux effets secondaires tels que des sensations de brulures ainsi qu’un risque accru de lymphomes ou de cancers cutanées. De plus, il a été démontré que dans 50% des cas une inefficacité ou une tolérance aux traitements est observé chez ces patients. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons développé de nouvelles molécules ciblant le système immunitaire. Ces molécules ont pour avantage de ne pas induire d’inhibition du système immunitaire, rendant le patient totalement apte à répondre à tout type d’attaque extérieure. Chez l’animal nous espérons pouvoir activer la phase de récupération dans ces différents modèles avec notamment une diminution des signes cliniques. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’humain afin de traiter les patients n’ayant plus de possibilité thérapeutique et de leur proposer une nouvelle voie thérapeutique.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs gestes d'administrations. L'administration des traitements se fera à hauteur de 3 fois par semaine sur une durée de 3 semaines. L'administration des agents inducteurs se fera sur animaux anesthésiés 2 à 5 fois par semaines pendant 3 à 4 semaines. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire pourront être effectués sur animaux vigile (1 fois par semaine maximum tout au long du protocole). Pour finir certains animaux seront rasés par utilisation de crème épilatoire après anesthésie de l'animal lors de l'induction du modèle.
Impact sur les animaux
Modèles de sclérodermie : Les animaux subiront des injections quotidienne (5 jours sur 7) d'inducteurs pour un maxium de 3 semaines, ceci engendrera du stress répéter ainsi qu’une légère douleur lors de l’injection. De plus, l’apparition des premières signes cliniques dès la première semaine ainsi qu’une perte de poids contrôlé, engendrera de la douleur chez l’animal. Modèles de dermatite atopique : Les souris seront rasées puis subiront une application cutanée d'inducteur 3 fois par semaine pendant 3 semaines. Ce geste n’engendrera pas de douleur mais un léger stresse chez l’animal. L’apparition des premiers signes cliniques provoquera de la douleur chez l’animal.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d'intérêts pourront être prélevés pour compléter les analyses
Remplacement
Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les 5 études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant validé le plus de critères de la pathologie et le moins de nuisances sur l'animal. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre d'animaux de n=22 animaux/groupe nécessaire.
Raffinement
Les animaux auront une phase d’acclimatation de plusieurs jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de l'analgésique 3 fois par jour puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe, avec des frisottis pour se camoufler ainsi que des dômes ou des tunnels. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton
Choix des espèces
Afin d'étudier le rôle des différentes cibles in vivo dans des modèles expérimentaux d'inflammations induit par des molécules chimiques, nous utiliserons différentes lignées chez la souris décrite pour déclencher ce type d'inflammation. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.
Etude de l’effet anti-inflammatoire d’un traitement par des microbulles d’oxygène
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées en fin d'étude pour récupérer dans des conditions stériles le liquide accumulé dans leur ventre, 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit deux à quatre injections destinées à déclencher une inflammation du péritoine, puis une gêne abdominale que le porteur qualifie de transitoire. L'objet réel est de tester des microbulles d'oxygène censées calmer les cellules immunitaires du sang, les retombées annoncées pour les malades chroniques étant renvoyées à des traitements futurs. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit cette complexité et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
Les maladies chroniques inflammatoires représentent aujourd’hui une des plus grandes menaces pour la santé humaine selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS). Environ 5 % de la population mondiale en est atteinte. Ces maladies provoquent des poussées inflammatoires qui nuisent fortement à la qualité de vie et peuvent mettre en danger la santé à moyen et long terme. Malgré de nombreux traitements disponibles, ces poussées restent difficiles à contrôler et les médicaments actuels ont souvent des effets secondaires importants. Une piste prometteuse réside dans la régulation du métabolisme des cellules immunitaires, en particulier des monocytes, des cellules du sang qui jouent un rôle clé dans l’inflammation. Quand elles manquent d’oxygène, comme c’est souvent le cas dans le sang, ces cellules adoptent un comportement pro-inflammatoire. Leur fournir de l’oxygène pourrait donc permettre de limiter leur activité inflammatoire. Mais distribuer de l’oxygène aux bonnes cellules est complexe. Les méthodes actuelles sont peu efficaces, peu ciblées ou présentent des risques. Notre projet propose une solution innovante : utiliser de petites bulles d’oxygène compatibles avec l’organisme. Ces bulles, conçues pour rester dans le sang et être reconnues par les monocytes, pourraient leur fournir de l’oxygène de manière ciblée. En les absorbant, les monocytes réduiraient ainsi leur capacité à entretenir l’inflammation.
Bénéfices attendus
1_ Réduction ciblée de l'inflammation : Diminuer les poussées inflammatoires en agissant directement sur les cellules en partie responsables (les monocytes). 2_Moins d'effets secondaires : Limiter les effets indésirables grâce à une approche localisée. 3_Nouvelle stratégie thérapeutique : Ouvrir la voie à des traitements innovants pour les maladies inflammatoires chroniques résistantes aux thérapies actuelles.
Procédures
les souris vont être soumises aux interventions suivantes : injections (1 minute 2 à 4 fois).
Impact sur les animaux
un stress léger pourra survenir lors de la prise en main des animaux pour les injections. Une douleur légère et passagère pourra survenir sur la zone d’injection et une gêne abdominale transitoire due à l'irritation.
Devenir
La mise à mort des animaux en fin d’étude est indispensable afin de récupérer le liquide dans le ventre dans des conditions stériles et optimales, permettant une analyse précise de la réponse cellulaire inflammatoire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier in vivo l’impact d’une modulation métabolique ciblée des monocytes au cours d’une inflammation systémique. Ce type de réponse immunitaire est complexe, impliquant des interactions dynamiques entre cellules circulantes, tissus, médiateurs inflammatoires et des facteurs généraux comme l’oxygène ou les nutriments. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire fidèlement cette complexité dans un organisme vivant. Des modèles cellulaires sont utilisés en parallèle pour affiner nos hypothèses, mais le recours à l’animal est indispensable pour valider l’efficacité, la spécificité et la tolérance d’une délivrance ciblée d’oxygène via microbulles dans un contexte physiologique pertinent.
Réduction
Le protocole est conçu pour utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire à la significativité statistique. Des pré-tests in vitro ont permis d’optimiser les formulations, doses et modalités de délivrance avant toute expérimentation animale. Des groupes témoins strictement limités sont prévus pour permettre une comparaison pertinente (thioglycollate seul, traitement sans microbulles, etc.). Des réplicats biologiques et des analyses croisées (biomarqueurs, cytométrie, histologie) sont mutualisés pour maximiser les données obtenues par animal. De plus, si dans la première phase du projet nous avons 100% d'inflamation homogène, nous n'utiliserons que 10 souris par groupe dans la seconde phase.
Raffinement
Tout a été mis en œuvre pour minimiser la douleur, le stress et les effets secondaires induits par les manipulations : L’injection de notre produit est une méthode standardisée et maîtrisée. Les animaux sont manipulés par un personnel formé et expérimenté. Le volume et la concentration du produit injecté ont été choisis pour provoquer une inflammation modérée, sans provoquer de souffrance prolongée. Une grille de suivi clinique est mise en place, avec des points limites définis. Une surveillance rapprochée est assurée. Les microbulles sont conçues pour être biocompatibles et non toxiques.
Choix des espèces
La souche de souris choisi est une souche de référence dans les études immunologiques et inflammatoires : son profil immunitaire est bien caractérisé. Cette souche est largement utilisée dans les modèles de péritonite, avec une cinétique bien connue de recrutement des cellules immunitaires, notamment des monocytes/macrophages, qui sont la cible principale de notre stratégie. À 7 semaines, les souris sont jeunes adultes : leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour étudier une réponse inflammatoire reproductible et physiologiquement représentative. De plus, la plupart des études publiées sur le modèle d’inflammation dans le ventre utilisent des souris de 6 à 10 semaines, ce qui garantit la comparabilité de nos résultats avec les données existantes.
Imagerie non invasive de l’inflammation lors d’une myocardite chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Une inflammation du muscle cardiaque leur est provoquée par deux injections sous la peau, à sept jours d'intervalle. 128 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant les trois semaines qui suivent, elles reçoivent un agent d'imagerie par voie intraveineuse puis passent sous anesthésie pour l'acquisition des images, l'objectif étant de tester si ce produit repère mieux l'inflammation cardiaque que l'agent de référence. Le porteur résume le raffinement en deux lignes, annonce des "points limites adaptés au modèle" sans dire lesquels, et ne précise ni la fréquence de la surveillance ni les signes qui déclencheraient une mise à mort anticipée.
Objectifs
Le terme de « cardiomyopathies inflammatoires » regroupe un ensemble de pathologies qui toutes sont caractérisées par une inflammation du muscle cardiaque. Cependant, malgré ce point commun, la prise en charge des patients diffère fortement en fonction de la nature de la maladie. Il est donc essentiel, en pratique clinique, de diagnostiquer la présence d’un site inflammatoire dans le cœur, puis de réaliser un prélèvement (biospie) à ce site pour déterminer la nature de la maladie. En pratique, il reste difficile de localiser le site inflammatoire avec l’ agent d’imagerie de référence, car il peut également se fixer de manière non spécifique dans le cœur sain. L’objectif de ce projet est de résoudre ce problème grâce à un nouvel agent d'imagerie de l'inflammation offrant un meilleur signal. Il fera l’objet d’une évaluation pour cette application en réalisant de l’imagerie sur un modèle de souris d’inflammation du cœur.
Bénéfices attendus
L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué est en cours d’évaluation clinique dans une autre indication. L’objectif ici sont donc de déterminer s’il permet également la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque . S’il est validé pour cette nouvelle application, il pourra être utilisé dans le cadre de la pratique clinique pour diagnostiquer cette inflammation et pour guider les prélèvements. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.
Procédures
Les animaux subiront une unique procédure incluant l’induction de l’inflammation du muscle cardiaque (myocardite) (réalisée via 2 injections en sous-cutané au temps initial et à 7 jours) et son suivie par imagerie. A différents temps (de 0 à 3 semaines suivant l’induction de la myocardite) les animaux recevront une injection intraveineuse d’un agent d’imagerie suivi d’une anesthésie volatile de courte durée (
Impact sur les animaux
Cette procédure a été classée en modérée car l’induction de la maladie peut être une source de stress et de douleurs pour l’animal. Un stress léger lié aux injections peut également survenir.
Devenir
A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.
Remplacement
La réponse inflammatoire lors d’une myocardite ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine et sur cellules. Sa spécificité et sa sensibilité pour lier sa cible ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.
Réduction
Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. Ainsi, dans un premier temps un suivi longitudinal sera réalisé afin de restreindre l’étude aux seuls temps pertinents.
Raffinement
Des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour l’étude des de la myocardite. L’agent d’imagerie reconnait la protéine humaine impliquée dans l’inflammation, mais également la protéine de souris. De ce fait l’espèce retenue est la souris. Des souris adultes seront utilisées afin de se rapprocher du contexte clinique.
Étude de remplacement cellulaire pour restaurer la fonction multiciliaire des voies respiratoires chez le minipig, dans le cadre de la recherche sur la dyskinésie ciliaire primaire.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Greffer dans les bronches des cellules souches humaines corrigées génétiquement conduit ici à utiliser 10 mini-porcs, tous tués à l'issue pour analyses histologiques, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie sous anesthésie pouvant durer deux heures trente, deux séances d'imagerie d'une heure trente et huit prélèvements sanguins sous anesthésie de trente minutes. Le porteur liste les risques attendus, bronchite, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aiguë, pneumothorax, pleurésie et signes de sepsis, puis les juge "extrêmement réduits" grâce aux traitements préventifs. Le bénéfice qu'il avance, fournir les données d'un futur essai clinique sur la dyskinésie ciliaire primitive, dépend entièrement de résultats "favorables" encore à obtenir.
Objectifs
La majorité des maladies pulmonaires d’origine génétique, comme certaines formes de mucoviscidose, n’ont pas encore de traitement curatif. Les tentatives de traitement par inhalation de virus modifiés n’ayant pas donné les résultats espérés, une nouvelle approche combinant thérapie cellulaire et thérapie génique a vu le jour. Nous avons mis au point une méthode simplifiée pour créer des cellules souches à partir du sang du patient, les corriger génétiquement, puis les transformer en cellules capables de régénérer les voies respiratoires. Cette technologie ouvre la voie à des traitements innovants pour les maladies pulmonaires génétiques. Pour valider cette approche, nous l’appliquons actuellement à une maladie rare appelée dyskinésie ciliaire primitive (PCD).
Bénéfices attendus
Les bénéfices concernent le traitement de la dyskinésie ciliaire primitive (PCD). Si les résultats sont favorables, notre travail pourrait permettre à conduire un futur essai clinique, en fournissant des données qui seront nécessaires à la mise en place d'un essai clinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à : -Procédures chirurgicales : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux; - Imagerie (2 fois) : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 1h30; - Prélèvements sanguins (8 fois) : sous anesthésie rapide de 30 minutes maximum.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la greffe des cellules, plus précisément au conditionnement excessif (risque de dommage des bronches) ou bien insuffisant, lesquelles pourront induire la mort des cellules greffées. Une mort cellulaire excessive pourrait être la conséquence d'une dissociation unicellulaire des progéniteurs bronchiques humains dérivés des iPSC dans le contexte d'une stase intra bronchique, d'un piégeage du mucus ou, à l'inverse, d'une toux et d'expectorations après administration. Les risques principaux sont également : bronchites, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aigue, pneumothorax, pleurésie, signes de sepsis. Ces risques à priori paraissent extrêmement réduits étant donnés les prémédications prophylactiques périprocédures (antibiothérapies, corticothérapie, anti tussifs). La simple mesure des constantes, et la réalisation d’une tomodensitométrie visant à évaluer ces risques sont ainsi prévues. Entre autres, des complications liées à la chirurgie ou à l'anesthésie ou les effets indésirables du traitement immunosuppression peut être également observées. De plus, une adaptation du protocole en termes de médicament anesthésique, de choix de traitement, etc. sera éventuellement proposée pour la deuxième série d'animaux (8 mini-pigs).
Devenir
A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative de remplacement, car l’objectif de cette étude est d’évaluer la toxicité ainsi que l’efficacité sur un modèle animal avant passage chez l’homme.
Réduction
Au total, 10 animaux seront utilisés (2 et 8). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables, la toxicité et efficacité de xénogreffe de progéniteurs d'épithélium bronchique dérivés d'iPSC en "conditions réelles".
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée après chaque anesthésie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés : anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et/ou morphiniques. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. Des examens d'imagerie (une bronchoscopie et le scanner) et sanguins viendront compléter cette évaluation.Concernant l'immunosuppression, le traitement par ciclosporine sera administré avec l’alimentation, afin de limiter le stress et de ne pas perturber les animaux. De plus, compte tenu de l’immunosuppression, des mesures de biosécurité seront renforcées : un équipement de protection individuelle propre sera utilisé pour réduire le risque infectieux. Enfin, un suivi biologique régulier (formule sanguine complète et biochimie) permettra d’adapter rapidement la posologie en fonction des effets observés, limitant ainsi les effets secondaires.
Choix des espèces
Nous utiliserons des mini-porcs qui ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain et peuvent facilement être immunosupprimés pendant plusieurs semaines grâce à la ciclosporine permettant une xénogreffe. De plus, seul un grand modèle comme le porc peut fournir une situation clinique similaire à celle rencontrée chez l'homme, notamment en ce qui concerne l'accès par fibroscopie lobaire et la grande surface à traiter. Les mini-pigs à l'âge adulte (8 à 10 mois) ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain (5 lobes, accès facile à l'endoscope humain).
Rôle de l’inflammation dans un modèle de maladie cardiovasculaire chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
4 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour analyse du cœur et des organes, une partie gardée pour entretenir l'élevage. Elles subissent une biopsie de la queue ou de l'oreille, des injections, et pour certaines des échocardiographies sous anesthésie de quinze minutes. Le porteur indique que certains animaux portent un phénotype dommageable provoquant une atteinte cardiaque et une mort spontanée, et prévoit 60 souris par groupe au lieu de 40 pour absorber cette mortalité. Il qualifie le modèle animal d'"incontournable" et de "préalable indispensable" pour valider des traitements de la myocardite, tout en précisant que les produits testés sont des références du commerce dont l'efficacité a déjà été confirmée sur cellules.
Objectifs
Notre projet a pour but de comprendre le rôle de l'inflammation dans la myocardite, pathologie cardiaque aigüe et sévère. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris présentant spontanément une myocardite. Nous étudierons la fonction cardiaque ainsi que la présence de cellules immunitaire dans le coeur afin d’identifier les acteurs clés responsables de l’aggravation de la maladie. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette myocardite, et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques pour cette pathologie qui présente chez l’homme une évolution rapide et souvent grave, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 30 à 50%.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires résultant de l'action des cellules immunitaires au cours d'une myocardite. Le développement d'un traitement de la phase aiguë de la myocardite présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.
Procédures
Les animaux vont subir la une biopsie de queue ou d'oreille. Une partie des animaux va subir une injection d'une durée maximale de 30 seconde. Une partie des animaux va subir une ou plusieurs échocardiographie non-invasive et indolore qui sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, stress lié à l'anesthésie. Potentielle douleur légère et de courte durée lors de l'injection et lors de la biopsie de queue ou d'oreille. Certains animaux présentent un phénotype dommageable associé à une atteinte cardiaque provoquant une mort spontannée.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage seront utilisés pour contribuer au maintien de l'élevage ou pour constituer les groupes expérimentaux s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux constituant les groupes expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.
Remplacement
L'étude expérimentale sur des animaux est une étape incontournable pour comprendre les mécanismes intervenant dans le développement de la myocardite. En effet, ces phénomènes complexes impliquent plusieurs organes et de nombreux types cellulaires, ce que les modèles in vitro ne peuvent reproduire. Nous cherchons à comprendre dans ce modèle animal, les diverses interactions cellulaires et tissulaires qui se produisent lors d'une myocardite. Ces modèles précliniques de souris sont également un préalable indispensable pour valider les stratégies thérapeutiques avant leur application chez les patients atteints d'une myocardite. Les produits utilisés sont des références disponibles dans le commerce et dont l'efficacité a déjà été confirmée in vitro sur des cellules.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 17 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents au modèle animal, et en distinguant mâles et femelles, nous estimons une taille de groupe à 40 animaux sans phénotype dommageable et 60 pour les animaux présentant le phénotype dommageable, afin d’inclure la mortalité associée au modèle. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par le personnel technique qualifié de l’animalerie ainsi que les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Nous utiliserons des souris âgées de 3 semaines environ au moment de l'identification Cet âge correspond à l'âge à partir duquel il faut sevrer les animaux. Nous utiliserons ensuite les animaux adultes, âgés de 9 à 32 semaines pour les expérimentations. A ces âges, le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité mais n'est pas encore senescent.
Prélèvement de tissus de souris transgéniques pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
L'extrémité de la queue, moins de trois millimètres, est coupée aux ciseaux sur des souriceaux âgés de cinq à dix jours, maintenus une trentaine de secondes. 37 750 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le geste sert à repérer celles qui portent la mutation cardiovasculaire recherchée, lesquelles partiront en reproduction ou vers d'autres protocoles, les autres étant tuées ou utilisées comme contrôles. Le porteur affirme que la douleur est moindre avant ossification "car le système nerveux n'est pas totalement développé", sans mentionner d'anesthésie ni indiquer combien de souriceaux seront tués faute de porter la bonne mutation.
Objectifs
Les modèles murins utilisés sont essentiels pour comprendre les mécanismes impliqués mais aussi pour évaluer le développement de pathologies cardiovasculaires. L'objectif est de définir une méthode de prélèvement pour le service d'élevage. L’objectif de ce projet est l'élevage de plusieurs modèles de souris présentant des modifications génétiques permettant de reproduire des pathologies humaines. Cet élevage implique d'identifier les animaux et d'identifier ceux qui expriment les mutations génétiques d'intérêt. Cette étape est essentielle pour identifier les animaux qui seront ensuite utilisés à des fins expérimentales dans d’autres projets de recherche.
Bénéfices attendus
L'objectif est de définir une méthode de prélèvement pour le service d'élevage. Les animaux seront ensuite utilisés dans divers protocoles autorisés qui s'inscrivent dans le domaine de la recherche cardiovasculaire.
Procédures
Afin d’identifier et de caractériser les souris exprimant les gènes modifiés. Celle-ci nécessitera le maintien de l’animal pendant une trentaine de seconde. Au moment d’être replacé dans sa cage d’hébergement, l’extrémité de la queue (moins de 3 mm) sera coupée à l’aide de ciseaux fins, parfaitement aiguisé et préalablement désinfectés. Ce fragment de tissu permettra d'obtenir l'ADN de la souris et ainsi s'assurer de la présence de la mutation génétique d'intérêt. Cette manipulation très rapide ne dure pas plus de quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 3mm) peut conduire à une légère perte de sang ainsi que du stress et une douleur limitée.
Devenir
Les animaux comportant la mutation d’intérêt seront utilisés pour de la reproduction, le prélèvement de tissus postmortem ou seront utilisés dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées. Les animaux ne comportant pas la mutation d’intérêt seront euthanasiés ou utilisés comme contrôles dans les projets de destinations ou en prélèvement post mortem. Les souris présentant des signes de souffrances seront euthanasiées. Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales, conformément au protocole autorisé.
Remplacement
Les pathologies cardiovasculaires sont complexes et font intervenir de nombreux compartiments du corps humain (vaisseaux, sang) mais aussi des paramètres mécaniques (pression, vitesse). Les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bien sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. De plus, les modèles murins nous permettent de travailler sur des modèles génétiquement modifiés et ainsi de pouvoir moduler et cibler des gènes particuliers.
Réduction
Nous adapterons l'élevage au besoin des équipes de recherche. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris génétiquement modifiées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. De plus nous réalisons les prélèvements de manière raisonnée. S'il s'agit d'une lignée établie, le prélèvement est réalisé uniquement sur la première portée afin de contrôler qu'il n'y ai pas de dérive génétique.
Raffinement
La manipulation se fera systématiquement sous une hotte afin d'éviter leur contamination par des agents pathogènes. Le prélèvement est réalisé entre 5 et 10 jours afin de limiter la douleur. En effet le système nerveux n'étant pas totalement développer la douleur est moindre que sur un animal adulte. Les instruments utilisés sont désinfectés avant chaque utilisation et leur aiguisage est contrôlé avant utilisation. Après le prélèvement une compression du bout de la queue est effectuée afin de favoriser l'arrêt du saignement. Les souris seront surveillés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance liés à une éventuelle infection en tenant compte de leur apparence et de leur comportement. Des contrôles sanitaires (3 à 4 fois par an) permettront de s'assurer du maintien de la barrière et de l'absence d'agents pathogènes dans leur pièce d'hébergement. Nous avons comme enrichissement dans les cages, des battons de coton, du kraft, des igloos, des tunnels et des bâtonnets de bois. En cas de signes cliniques pouvant entrainer un mal-être comme une modification du comportement, d’apparence, de poids, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
De nombreux modèles murins ont déjà été décrits, développés et validés pour les pathologies cardiovasculaires. Le modèle murin permet d'invalider des gènes particuliers donc d'étudier les mécanismes physiopathologiques sous jacent à ces gènes. Le bout de queue est sectionné avant ossification entre 5 et 10 jour, stade auquel la perception de la douleur est moindre. Les animaux utilisés pour les projets de recherche ultérieurs sont adultes (7-10 semaines), pour obtenir des résultats sur des animaux matures au regard de l'immunité et de la formation des organes, et pertinents vis-à-vis de pathologies qui affectent majoritairement des individus adultes.