Recherche appliquée

Tuées à la fin de chaque procédure parce qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, 1 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la rate par chirurgie, puis viennent jusqu'à dix injections, dix prises de sang et neuf séances d'imagerie sous anesthésie par animal, pour tester un vaccin contre le cancer du foie lié au virus de l'hépatite B. Le porteur écrit que la croissance de la tumeur hépatique "est tolérée par les souris" tout en indiquant qu'elle peut affecter leur capacité à s'alimenter. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'immunogénicité des vecteurs et que la complexité des réponses vaccinales dans un "organisme entier" impose l'animal.

Objectifs

Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement certaines cellules immunitaires capables de tuer des cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur de nouveaux candidats vaccins pourrait être particulièrement efficace pour activer ces cellules immunitaires et contrôler la prolifération tumorale. Dans un premier temps, le but est d'établir des lignées tumorales exprimant des antigènes du virus de l'hépatite B au niveau du foie des souris. En cas de succès, l’objectif sera d'évaluer l’efficacité des candidats vaccins seuls, ou en combinaison avec des molécules anticancéreuses, à éliminer ces tumeurs. Cela permettra d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du foie et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une vaccination thérapeutique basée sur ces nouveaux candidats vaccins. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité antitumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de la preuve du concept préclinique d'utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des candidats vaccins, avec ou sans combinaison avec d’autres molécules anticancéreuses, dans l’immunothérapie du cancer du foie lié à l'infection par le virus de l'hépatite B. L’avantage à long terme du projet actuel sera l'utilisation de ces vaccins d’immuno-oncothérapie dans le contexte d’une co-administration en clinique dans le but d’obtenir un effet additif ou synergique de la réponse immunitaire contre des tumeurs hépatiques.

Procédures

Pour un groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 7x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 7x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 6x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 1 ou 2x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 4x - Injection sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x

Impact sur les animaux

L'injection dans la rate des cellules tumorales nécessite une chirurgie et des complications post-opératoires comme des infections peuvent survenir pendant toute la période de suivi. La croissance de la tumeur au niveau hépatique est tolérée par les souris mais peut, dans certains cas, s’associer à une perte d'activité et affecter leur capacité à s'alimenter. Les animaux sont susceptibles de ressentir une légère douleur au moment des injections de vaccins, d'anticorps ou des prises de sang. Cette douleur sera de courte durée et sans impact significatif sur leur bien-être ou leur état général. Douleur au point de piqure et stress lors des prélèvements de sang sur animaux vigils.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les souris présentant des tumeurs seront euthanasiées pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité vaccinale antitumorale d’un vaccin thérapeutique, injecté seul ou en co-injection avec des molécules anticancéreuses, destiné ultimement à la thérapie de certains cancers du foie. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale, car aucun modèle in vitro ne permet d’évaluer l’immunogénicité des vecteurs d’immunisation. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité des réponses vaccinales et antitumorales au niveau d’un organisme entier. Les mécanismes en jeu sont multifactoriels et ne sont pas encore caractérisés de manière exhaustive. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est déterminé en prenant en compte que le développement d’une tumeur et son interaction avec le système immunitaire comporte une large variabilité entre les individus, comme chez l’homme. En choisissant des animaux d’âge proche, il est possible de réduire au maximum cette variabilité. Toujours pour réduire le plus possible le nombre de souris utilisées tout en s’assurant qu’un nombre suffisant sera inclus de façon à rendre les résultats concluants, le nombre d’animaux et de répétitions par expérience ont été définis en fonction de la nature de l’expérience et validés suite à l’exposé et à la discussion du projet avec un biostatisticien. Sur ses conseils, les groupes seront constitués de 10 animaux du fait de la capacité d’implantation et de la variabilité de la croissance tumorale de manière à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes. Ce nombre pourra être réduit si la variabilité observée lors de la première procédure est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser notre protocole de vaccination et de définir la cinétique de vaccination permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vaccins utilisés dans cette étude ont été préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses spécifiques contre les tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si les tumeurs ne s'implantent pas ou si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes ne seront pas réalisées.

Raffinement

L'injection dans la rate des cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie gazeuse avec une prise en charge de la douleur avant, pendant et après l'injection. L’implantation de tumeurs hépatiques peut induire une gêne modérée qui sera spécifiquement monitorée 2 à 3 fois par semaine au cours des expériences. Selon notre expérience antérieure, l’injection des vecteurs lentiviraux vaccinaux n’induit aucun signe clinique chez les souris. Les animaux seront observés 2 à 3 fois par semaine pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance. Si un point limite est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises. Cela inclut l’ajout de gel hydrique, la réhydratation sous cutanée, le chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose pour éviter l’irritation par les copeaux de bois.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe un modèle de tumeur hépatique qui peut être utilisé chez la souris pour tester notre candidat vaccin. Nos études précédentes montrent que les vecteurs vaccinaux évalués sont immunogènes chez la souris. De plus, de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.

Dix semaines de gavage intragastrique et treize semaines de tests : 80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles doivent appuyer sur un levier pendant soixante minutes par jour pour obtenir une nourriture appétente, sous privation alimentaire, et leur prise de boisson est mesurée trente minutes par jour. Le porteur veut savoir si une bactérie intestinale humaine réduit la motivation pour le gras et le sucre, et si elle limite la prise de poids sous régime hypercalorique, en vue d'un usage comme probiotique contre l'obésité. Une perte de poids supérieure à 20 % associée à un score de souffrance maintenu plus de quarante-huit heures déclenche la mise à mort par dislocation cervicale.

Objectifs

Le but du projet est de caractériser l'effet de la bactérie intestinale commensale humaine Phascolarctobacterium faecium G104 sur le comportement alimentaire chez la souris (objectif 1) ainsi que de déterminer son rôle dans la prévention de la prise de poids en réponse à l'ingestion d'un régime hypercalorique (objectif 2).

Bénéfices attendus

Ce travail fournira des preuves scientifiques des effets de la bactérie intestinale commensale humaine P. faecium G104 sur le comportement alimentaire en explorant son rôle sur la motivation pour les aliments palatables. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il nous permettra de mieux comprendre les avantages métaboliques de cette bactérie et son utilisation potentielle comme probiotique pour prévenir et traiter l'obésité.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : Administration des traitements par sonde intragastrique pendant 10 semaines (80 souris, vigiles) ; Mesures comportementales pendant 13 semaines (80 souris, vigiles). L'adminstration par gavage oral prend moins de 10 sec par animal. Lors des tests comportementaux les animaux peuvent librement se déplacer: on mesure la consommation de nourriture palatable après appui sur un levier pendant 60 minutes par jour. Test de préférence/ aversion gustative on mesure la prise hydrique pendant 30 minutes par jour. Rythmes circadiens du comportement alimentaire sera mesuré pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

L´injection intrapéritonéale et l´administration par gavage oral peuvent être cause de stress pour l’animal dû à la contention/préhension. – Le test comportemental pour évaluer la motivation pour la nourriture palatable nécessitent une déprivation alimentaire légère. L’exposition au régime hyperlipidique entraine une prise de poids et des désordres métaboliques pour les souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour l'étude des effets du traitement au probiotique sur le cerveau (80 animaux)

Remplacement

Notre projet de recherche vise à mieux comprendre comment une bactérie spécifique présente dans l’intestin influence les habitudes alimentaires. Plus précisément, nous voulons savoir si cette bactérie peut moduler la motivation pour des aliments palatables comme les aliments sucrés et gras et si cette bactérie peut réguler la prise de poids lors d’une exposition à une régime obésogène. Notre projet vise à comprendre les mécanismes neurobiologiques par lesquels cette bactérie intestinale module le comportement alimentaire. Pour étudier cette question de manière approfondie, nous devons utiliser des modèles animaux. Nous avons choisi d'étudier des souris de la souche C57BL/6J, car cette souche développe une obésité lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en graisses et en sucres. Il n'existe pas d'alternative à l'étude des effets de cette bactérie sur les comportements et le cerveau. Ce travail fournira des preuves scientifiques des effets de la bactérie intestinale commensale humaine P. faecium G104 sur le comportement alimentaire en explorant son rôle sur la motivation pour les aliments palatables. Ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), et nous permettra de mieux comprendre les avantages métaboliques de cette bactérie et son utilisation potentielle comme probiotique pour prévenir et traiter l'obésité.

Réduction

Les mêmes souris (80 au total) seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la caractérisation des effets. Le nombre d'animaux nécessaires (10 par groupes) est basé sur des expériences précédemment effectuées dans l'équipe permettant de révéler des différences statistiques entre groupes dans ce type de tâches comportementales . Il est nécessaire d'utiliser deux lots d'animaux pour obtenir des tissus frais et des tissus perfusés et fixés, la taille totale de l'échantillon incluant les deux lots est donc de 80 souris (40 x 2).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. - Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille (foournie en annexe) : si un score supérieur à 3 (associé à une perte de poids >20%) persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé.Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Avant la mise à mort, les animaux recevront un traitement analgésique suivi d'un traitement avec un anesthesique.

Choix des espèces

la souris est un bon modèle pour l'étude du comportement alimentaire et la motivation. Le comportement sera étudié à l'âge adulte, qui constitue la population la plus exposée à l'obesité en clinique.

Pour sélectionner des composés contre l'hyperactivité de la vessie, 960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une irritation de la vessie leur est provoquée par de la capsaïcine ou de la prostaglandine, et l'effet des molécules est mesuré par cystométrie, jusqu'à quatre heures avec un cathéter posé dans la vessie sous anesthésie. Certains animaux reçoivent une pompe implantée sous la peau, des prélèvements de sang et des collectes d'urine en cage individuelle de moins de vingt-quatre heures, le protocole étant arrêté en accord avec une entreprise pharmaceutique partenaire. Le porteur présente le recours au rat comme un choix limitant "l'utilisation d'animaux tels que le chien".

Objectifs

L’hyperactivité de la vessie touche environ 15 % de la population, et devient plus fréquente avec l’âge. Elle entraine des envies urgentes et fréquentes d'uriner, des incontinences et des lever nocturnes qui perturbent grandement la vie au quotidien des patients souffrants de cette pathologie. Les causes de ce trouble sont encore mal connues, mais on pense qu’il est lié à un fonctionnement anormal du muscle de la vessie. Les traitements actuels reposent principalement sur des médicaments appelés antimuscariniques dont le but est d'inhiber les contractions involontaires de la vessie en agissant sur certains récepteurs. Cependant, leur efficacité est souvent limitée, et ils provoquent des effets secondaires (sécheresse de la bouche, constipation, troubles de la vision...) qui amènent de nombreuses personnes à arrêter leur traitement. Il est donc important de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Pour cela, des recherches sont menées à l’aide de modèles expérimentaux qui reproduisent les symptômes de l’hyperactivité de la vessie. Ce projet vise à tester de nouveaux composés destinés à traiter l’hyperactivité vésicale. Certains de ces composés testés agissent différemment des traitements actuels, tandis que d'autres utilisent les mêmes mécanismes, mais avec moins d'effets secondaires. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez le rat, dans lequel une irritation temporaire de la vessie est provoquée à l’aide de substances comme la capsaïcine (un composé extrait du piment). Ces tests permettront d’évaluer l’efficacité des traitements avant d’envisager leur utilisation chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de l’hyperactivité vésicale sont souvent mal tolérés, peu efficaces, ou contraignants à utiliser. Beaucoup de patients finissent par les abandonner, faute de résultats satisfaisants. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques, mieux adaptées aux besoins des malades. L’objectif de ce projet est justement de contribuer à la mise au point de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux supportés. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez le rat, qui permet de reproduire certains symptômes du trouble observé chez l’humain. Ce modèle permet de tester rapidement et de manière fiable l’efficacité et l’innocuité de nouvelles molécules. À terme, ce travail pourrait aboutir à des traitements innovants qui améliorerait significativement le quotidien des patients. Il pourrait aussi permettre de mieux comprendre les causes de ce trouble, ce qui ouvrirait la voie à d'autres avancées médicales. Enfin, en réduisant les complications liées à l’hyperactivité de la vessie, comme les infections à répétition ou les problèmes rénaux, ces recherches pourraient également contribuer à diminuer les hospitalisations et les coûts de santé.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront le traitement à tester ou bien un placébo. La durée et la fréquence du traitement dépendront du médicament étudié, mais resteront en général inférieures à six mois. L'administration du traitement sera rapide : elle dure moins d'une minute lorsque l'animal est éveillé, moins de 30 minutes si une anesthésie est nécessaire, et au maximum 45 minutes si le produit doit être injecté dans la vessie sous anesthésie profonde. Dans certains cas, un examen spécifique pourra être réalisé pour évaluer l'effet du traitement sur la vessie. Cet examen, appelé cystométrie, permet de mesurer le fonctionnement de la vessie pendant quelques heures (jamais plus de 4 heures) et nécessite l’installation préalable d’un petit tube dans la vessie. Au cours de l’étude, des prélèvements pourront être faits (sang, urine) afin de procéder à des analyses pour mieux comprendre les effets du traitement. Chaque prise de sang dure moins de 3 minutes, et la collecte d’urine se fait sur moins de 24 heures dans une cage adaptée. Il est important de souligner que tous les animaux ne subiront pas toutes ces procédures. Les interventions seront limitées à ce qui est strictement nécessaire, selon les objectifs du projet, et en accord avec les recommandations établies dans le cadre de notre collaboration avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

Certaines étapes du projet peuvent entraîner un inconfort temporaire pour les animaux, bien que tout soit mis en œuvre pour les limiter. Les effets indésirables possibles incluent : - Un léger stress ou une gêne lors de l’administration du traitement, car nécessitant que l’animal soit maintenu immobile pendant un court instant. - Une douleur ou gêne temporaire liée à l’implantation d’une petite pompe sous la peau, ou bien à l’administration du composé à tester directement dans la vessie. - Un stress léger lié à la collecte d’urine (sur une période inférieure à 24h) ainsi qu'aux prises de sang.

Devenir

Les animaux recevront les traitements à tester, soit en une seule fois, soit de manière répétée sur une période plus longue, selon les besoins de l’étude. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par différents moyens, notamment : - L’analyse de la quantité d’urine produite sur une période de moins de 24 heures, - Un examen permettant d’étudier le fonctionnement de la vessie, - L’analyse d’échantillons de sang, d’urine ou d’organes. À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur garantissant l’absence de douleur. Cette étape sera réalisée par du personnel formé, expérimenté et autorisé à le faire, conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet se justifie par l’absence de méthode alternative permettant d’étudier efficacement l’hyperactivité de la vessie. Cette maldie dépend de nombreux mécanismes complexes (nerveux, hormonaux, métaboliques…) qui interagissent entre eux dans un organisme vivant. Aujourd’hui, aucun modèle en laboratoire ne permet de reproduire cette complexité de manière fiable. L’utilisation de modèles animaux reste donc indispensable pour développer de nouveaux traitements mieux adaptés aux patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été calculé avec soin, afin d’être le plus faible possible tout en garantissant des résultats fiables. Une méthode statistique a été utilisée pour déterminer le nombre minimum nécessaire par groupe. De plus, lorsque cela sera possible, deux traitements seront testés en même temps. Cela permettra de limiter encore le nombre d’animaux en évitant de répéter inutilement certaines expériences, notamment pour les groupes qui ne reçoivent pas de traitement ou qui reçoivent un traitement de référence déjà connu.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long du projet. - Les rats sont hébergés par deux dans une même cage, dès que cela est possible, afin de préserver leur bien-être en favorisant le contact social. - Chaque jour, les soigneurs spécialisés vérifient l’état de santé général de chaque animal, leur comportement et la propreté de leur environnement. - Des critères de surveillance précis ont été définis. Si un animal montre des signes de douleur ou de souffrance, les responsables du projet sont immédiatement alertés, et les soins nécessaires sont apportés sans délai. - Les interventions chirurgicales, comme l’implantation de pompes ou les injections dans la vessie, sont réalisées sous anesthésie générale avec des médicaments contre la douleur. Un traitement antibiotique est également donné pour prévenir les infections. - D’autres procédures, comme la pose de petits cathéters (tubes) pour les examens de la vessie, ainsi que les examens eux-mêmes, sont aussi réalisés sous anesthésie complète, afin que l’animal ne ressente aucune douleur.

Choix des espèces

L’expérimentation animale est nécessaire pour l’étude d’une fonction physiologique complexe telle que l’hyperactivité vésicale. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitant l’utilisation d’animaux tels que le chien. Le choix des protocoles est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chances d’obtenir des résultats satisfaisants. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Concernant l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines d'âge). Ce choix est justifié par la littérature scientifique.

Hôte naturel de la bactérie Lactococcus petauri et poisson le plus élevé en France, la truite arc-en-ciel est retenue pour 308 individus utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons sont plongés quatre, huit ou seize heures dans une eau chargée de bactéries, vingt-huit d'entre eux recevant en plus une injection intramusculaire, avec deux prises de sang sous anesthésie à trois semaines d'intervalle. Le porteur dimensionne les lots à quatorze poissons en tablant sur une mortalité d'environ 50 % liée à l'infection, de façon à conserver au moins sept survivants par condition. Aucun poisson potentiellement infecté ne pouvant être relâché ni réutilisé, tous sont tués en fin de protocole.

Objectifs

Afin de limiter l’usage des antimicrobiens, la vaccination est considérée comme l’une des meilleures options pour contrôler les maladies infectieuses en aquaculture. Cette demande d'autorisation de projet s’inscrit dans le cadre d’une étude plus globale portant sur l'efficacité de protocoles vaccinaux utilisant différentes voies d'administration, telles que la balnéation ou l’injection intrapéritonéale. Le présent projet constitue une extension de la demande d’autorisation de projet précédemment soumise. La DAP initiale avait pour objectif de déterminer la souche bactérienne et la modalité d’infection les plus appropriées pour établir un modèle de challenge infectieux, par balnéation ou par injection intramusculaire, chez la truite arc-en-ciel. Cette nouvelle demande vise à compléter les résultats obtenus lors de cette première expérimentation, en affinant spécifiquement le protocole de challenge infectieux par balnéation. Cette manipulation est nécessaire pour confirmer la reproductibilité du modèle, ajuster certaines conditions expérimentales (notamment la dose infectieuse et la durée d’exposition), et ainsi valider un protocole robuste permettant d’évaluer de manière fiable l'efficacité des stratégies vaccinales testées.

Bénéfices attendus

La lactococcose est une maladie bactérienne dont l'impact augmente actuellement en Bretagne en lien avec le réchauffement des eaux de surface. La maitrise par vaccination est nécessaire pour contrôler cette maladie et réduire l'usage d'antibiotiques. La maitrise du challenge infectieux par Lactococcus petauri est obligatoire et indispensable pour tester des solutions innovantes de contrôle, notamment la vaccination, facilitant leur mise en oeuvre dans les élevages et limitant le stress des animaux.

Procédures

Prises de sang : deux prélèvements seront réalisés sur animaux anesthésiés (temps T0 et Tfinal 3 semaines plus tard). Chaque intervention, incluant l’induction de l’anesthésie, le prélèvement et la récupération, durera environ 15 à 20 minutes. Infection par balnéation : les poissons seront exposés à une suspension bactérienne de L. petauri pendant 4 h, 8 h ou 16 h selon les modalités, dans un volume d’eau restreint mais oxygéné en continu. Infection par injection (lot témoin positif uniquement, 28 poissons au total) : une injection intramusculaire sera réalisée sous anesthésie. La durée totale (induction, injection, réveil) sera d’environ 15 à 20 minutes.

Impact sur les animaux

L'évaluation de l'efficacité vaccinale nécessite d'infecter des truites par L. petauri. Les manifestations cliniques de l'infection expérimentale peuvent entrainer de la douleur chez les poissons. Le protocole sera arrêté dès l'observation de poissons moribonds (mélanisme, nage erratique sur le dos, arrêt d'alimentation) ou de signes caractéristiques de la lactococcose (exophtalmie).

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévue en fin de protocole, pour des raisons sanitaires (impossibilité de relâcher ou réutiliser des poissons potentiellement infectés par L. petauri)

Remplacement

L'évaluation de l'efficacité d'un vaccin nécessite la réalisation d'un challenge infectieux et ne peut se faire que sur animaux vivants. La présente demande est une étape initiale de ce projet sur l'efficacité vaccinale

Réduction

Dans cette nouvelle phase, 11 modalités expérimentales seront testées, correspondant à différentes combinaisons de doses infectieuses et de durées d’exposition. Chaque modalité sera réalisée en duplicat afin de limiter l’effet « bac » et de valider la reproductibilité du protocole. Chaque lot contiendra 14 poissons, ce qui représente un total de 22 lots (11 modalités × 2 répétitions), soit 308 poissons au total (14 × 22 = 308). Ce nombre est déterminé pour permettre une analyse statistique robuste. En considérant un taux de mortalité d’environ 50 % lié au challenge infectieux, 14 poissons par lot permettent de garantir au moins 7 individus survivants par condition. Une analyse immunologique sérique sera réalisée en fin d’expérimentation sur l’ensemble des poissons survivants, afin de vérifier l'infection et de documenter la réponse immune.

Raffinement

Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute la durée du protocole. Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène < 80 %) et ne peuvent pas être rectifiés, l'expérimentation sera arrêtée. Les points limites concernent d'autre part la santé et le comportement des poissons. Les poissons moribonds seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés. La densité sera de 20 kg/m3 environ, ce qui est bien en dessous de ce qui est réalisé en élevage (50-70 kg/m3) et les bacs seront enrichis de tubes permettant aux poissons de se cacher et de fuir.

Choix des espèces

La truite arc en Ciel est un hôte naturel de Lactococcus garvieae/petauri. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France et donc pour laquelle il est important d'améliorer l'efficacité vaccinale. Les truites utilisées pèseront environ 100 à 150g. La lactococcose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage. L'étude sur des poissons de poids de 150 g est un bon compromis entre le poids et le nombre de poissons pouvant entrer dans l'étude. De plus, les protocoles vaccinaux par balnéation seront testés sur des alevins de 4 à 5 g et la durée de l'efficacité vaccinale après quelques mois d'élevage, lorsque les truites atteindront 100 -150 g environ. A ce poids, les truites sont considérées comme immunocompétentes.

Des cellules tumorales leur sont injectées dans le cerveau, puis la tumeur est retirée par chirurgie et remplacée par un gel chargé de médicaments : 1 512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à six injections thérapeutiques et quatre injections d'agents d'imagerie, avec deux prélèvements sanguins par séance. Le porteur décrit une combinaison de radiothérapie, d'immunothérapie et d'ultrasons destinée à traiter les récidives de glioblastome après opération, les retombées pour les patients restant annoncées comme une survie prolongée et une meilleure qualité de vie. Il annonce quatre sessions d'imagerie au maximum et écrit dans le même paragraphe que chaque animal pourra être examiné jusqu'à six fois.

Objectifs

Le glioblastome est la forme la plus fréquente et la plus agressive de tumeur cérébrale primaire. Son taux élevé de récidive, associé à une survie médiane inférieure à un an, souligne la difficulté à traiter efficacement cette pathologie. Bien que la résection chirurgicale demeure la principale approche pour réduire la masse tumorale et soulager les symptômes, elle ne permet jamais une élimination complète de la tumeur. En effet, des cellules tumorales résiduelles, souvent localisées aux marges de la zone réséquée, contribuent inévitablement à la récidive du cancer. De plus, la chirurgie engendre des modifications substantielles de l’environnement tumoral, favorisant la prolifération, la migration et la résistance des cellules tumorales, ce qui rend encore plus complexe la mise en place d’un traitement efficace. C’est dans ce contexte que le projet proposé cherche à développer des stratégies thérapeutiques innovantes pour traiter le glioblastome. L’objectif est de combiner différentes approches : notamment la radiothérapie externe et interne, ainsi que des immunothérapies administrées soit localement sous forme de gel biodégradable, soit par injection. Une dimension supplémentaire de ce projet est l’utilisation d’une technique d’ultrasons thérapeutiques, qui doit favoriser le passage dans le cerveau des médicaments immunothérapeutiques et ainsi renforcer leur efficacité. Deux approches principales seront visées par la radiothérapie: d’une part, en ciblant le côté prolifératif et immunosuppresseur de la tumeur, et d’autre part en ciblant certaines voies métaboliques de la tumeur. Ces thérapies seront testées en combinaison ou non à des immunothérapies ciblées combinées ou non à des ultrasons thérapeutiques. L'efficacité de ces approches sera évaluée grâce à des techniques d’imagerie avancées, qui permettront de suivre de près la réponse biologique des tumeurs et d’ajuster le traitement de manière personnalisée. L’objectif final est de proposer une solution qui combine diagnostic et thérapie, les deux supervisés par l’imagerie, afin d’optimiser l’efficacité des thérapies tout en surmontant les résistances aux traitements traditionnels du glioblastome.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à répondre à des enjeux cliniques cruciaux concernant le glioblastome Bénéfices pour la recherche : • Compréhension accrue des mécanismes tumoraux post-chirurgie : La première phase du projet permettra d’étudier comment la chirurgie influence le microenvironnement tumoral. Ces données permettront de développer des stratégies pour minimiser les récidives tumorales après la chirurgie. • Évaluation préclinique de nouveaux outils thérapeutiques : Grâce à des technologies avancées, telles que l’imagerie TEP, l’imagerie optique et les gels vectorisant les traitements, ce projet validera de nouvelles combinaisons thérapeutiques associant immunothérapie, immunostimulation et radio-immunothérapie interne, offrant ainsi des alternatives aux traitements conventionnels. • Mise au point des traitements personnalisés : Les résultats obtenus contribueront à l’élaboration de thérapies plus ciblées et plus efficaces contre les cellules tumorales résiduelles, réduisant ainsi les récidives post-chirurgicales. • Validation et Optimisation des ultrasons thérapeutiques : L'intégration des ultrasons thérapeutiques avec des traitements ciblés pourrait améliorer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, augmentant ainsi la concentration d’agents thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales et l’efficacité du traitement. Cette approche peut s’adresser à d’autres pathologies du système nerveux central. Bénéfice pour le patient : • Prolongation de la survie des patients . • Améliorer la qualité de vie des patients. L'utilisation de gels biodégradables pour une administration localisée, ainsi que l’optimisation des traitements systémiques, permettra de réduire les effets secondaires liés à l’utilisation de molécules toxiques.

Procédures

Les interventions suivantes auront lieu : • Mise en place du modèle tumoral (45 minutes, 1 injection par animal) : Des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau pour induire la formation de tumeurs. Cette intervention est réalisée sous anesthésie générale. • Injection d’agents d’imagerie (5 minutes par injection, maximum 4 injections par animal au total car 4 sessions d'imagerie, séparées de 2 à 3 jours minimum) : • Injection d’agents thérapeutiques (5 minutes par injection, maximum 6 injections par animal) : Les traitements seront administrés tous les deux à trois jours pendant environ deux semaines, sous forme d'injections systématiques pour tester l’efficacité des thérapies ciblées. • Ablation tumorale (environ 30 minutes) : Une ablation tumorale sera réalisée sous anesthésie pour retirer la tumeur, avec une vérification de l’étendue de la résection tumorale via des techniques d’imagerie. • Application d’un gel biodégradable (15 minutes) : Après la résection tumorale, un gel biodégradable contenant des agents thérapeutiques sera appliqué directement dans la cavité tumorale avant la fermeture chirurgicale. Ce gel permettra une libération localisée et prolongée des traitements, ciblant les cellules tumorales résiduelles. • Sessions d’imagerie (15 à 70 minutes, maximum 4 sessions) : elles servent à surveiller la progression tumorale et évaluer l’efficacité des traitements. Elles sont réalisées sous anesthésie générale. Chaque animal pourra être examiné jusqu’à six fois à des moments différents pour un suivi dynamique des agents thérapeutiques et des marqueurs tumoraux. • Prélèvement sanguin (maximum 5 minutes, 2 fois par session d’imagerie);

Impact sur les animaux

Les procédures prévues dans ce projet peuvent entraîner différentes formes de nuisances pour les animaux, qui seront attentivement surveillées et documentées. Ces effets sont inhérents aux expérimentations et varient en fonction des interventions spécifiques : - Douleur et inconfort liés aux procédures chirurgicales Les résections tumorales et implantations nécessitent des interventions chirurgicales, potentiellement associées à des douleurs post-opératoires modérées. Une réduction temporaire de la mobilité et une inactivité peuvent être observées pendant les 2 à 3 jours suivant la chirurgie. Les douleurs post-opératoires devraient s’estomper dans les 48 à 72 heures suivant la chirurgie. - La croissance tumorale peut impliquer des problèmes neurologiques notamment quand la tumeur atteint un volume ou une prolifération trop importante pouvant induire une inactivité ou une mobilité réduite.Effets secondaires des traitements Les traitements immunostimulateurs peuvent induire une inflammation locale ou systémique, avec des symptômes comme la fièvre, la fatigue ou un stress métabolique (déséquilibre entre les besoins énergétiques et les ressources disponibles). La radio-immunothérapie interne peut provoquer une toxicité systémique légère à modérée, avec une possible perte de poids transitoire (jusqu’à 10 %), une diminution de l’activité et un changement comportemental. - Effets liés aux techniques d’imagerie Les anesthésies répétées pour l’imagerie multimodale peuvent générer un stress physiologique, une inactivité temporaire et un ralentissement de la reprise alimentaire après chaque session. Les ultrasons thérapeutiques, bien que non invasifs, pourraient entraîner des douleurs légères ou un inconfort transitoire au niveau des tissus ciblés. Les effets secondaires des traitements et des imageries seront surveillés et devraient se résorber en 2 à 3 jours, selon la gravité. - Stress général et comportements anormaux Les animaux peuvent présenter du stress comportemental (agitation, repli, diminution de l’interaction sociale) en raison des manipulations répétées et des injections. Une acclimatation rigoureuse aux conditions expérimentales est prévue pour réduire ces effets.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d’extraire les organes et réaliser les différentes analyses ex vivo pour améliorer les compréhensions mécanistiques.

Remplacement

Actuellement, aucune alternative totalement fiable et valide aux modèles animaux n’existe pour reproduire la complexité du microenvironnement tumoral et et de tous les mécanismes pathologiques mis en jeu dans le glioblastome. Les modèles in vitro (lignées cellulaires ou organoïdes) et in silico permettent d’étudier des aspects isolés que nous exploitons afin de sélectionner au mieux les traitements que nous proposons. Mais ils ne peuvent pas reproduire cette complexité propre aux organismes vivants. Pour bien évaluer les rechutes de tumeur après une opération, il faut que le système immunitaire fonctionne normalement. Cela n’est pas possible dans des modèles en laboratoire (in vitro), car ils ne reproduisent pas toute la complexité du corps humain. Par exemple, la façon dont les cellules immunitaires atteignent la tumeur ou réagissent aux traitements (comme l’immunothérapie ou la radiothérapie ciblée) dépend de structures importantes comme la barrière qui protège le cerveau (barrière hématoencéphalique). Les techniques d’imagerie biomédicale que nous employons requièrent un fonctionnement organique préservé pour permettre une analyse fiable de la distribution des traitements et de leur efficacité.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour être le plus petit possible tout en étant suffisamment grand pour garantir une puissance statistique suffisante des données qui seront collectées. Les groupes sont composés de 12 animaux, un effectif défini pour détecter des différences significatives dans les paramètres mesurés (volume tumoral, biomarqueurs d’imagerie, survie). De plus, le choix a été fait de suivre les paramètres mesurés par imagerie longitudinale, qui contrairement à d’autres méthodes permet de faire plusieurs mesures des paramètres au cours du temps sur un seul animal. Un soin particulier est apporté à la sélection des modèles tumoraux de manière à limiter l’étude sur animal aux modèles les plus pertinents. Enfin, les protocoles expérimentaux sont standardisés pour minimiser la variabilité inter-individuelle et limiter le nombre de groupes nécessaires.

Raffinement

Des mesures spécifiques seront mises en place pour garantir le bien-être des animaux tout au long des procédures : - Surveillance accrue : Les animaux seront monitorés régulièrement pour détecter rapidement tout signe de douleur ou de stress. Des grilles de score validées seront utilisées pour évaluer leur état général. - Gestion de la douleur : Des analgésiques adaptés, seront administrés systématiquement en postopératoire, en complément des anesthésiques utilisés pendant les procédures. - Soins postopératoires : Une attention particulière sera portée aux soins après chirurgie, avec hydratation, alimentation enrichie et contrôle des plaies pour éviter toute infection. - Habituation préalable : Les animaux seront habitués aux manipulations et à l’environnement expérimental, réduisant ainsi leur stress lors des procédures. Ces mesures assurent en plus la qualité des données recueillies. Des mesures spécifiques seront mises en place pour garantir le bien-être des animaux tout au long des procédures. Des points limites ont également été définis afin de permettre une prise en charge rapide ou un arrêt anticipé si nécessaire.

Choix des espèces

Les espèces utilisées dans ce projet sont des souris, qui sont largement reconnues pour leur pertinence dans les recherches sur le glioblastome. Sur le plan scientifique, les souris utilisées dans nos recherches permettent de reproduire différentes situations proches de ce qui se passe chez l’humain. Certaines souris ont un système immunitaire affaibli: elles permettent d’implanter des tumeurs humaines et de tester des traitements ciblés sans que leur système immunitaire ne les rejette. D’autres, avec un système immunitaire intact, sont utiles pour étudier la réaction du corps face à une tumeur ou à un traitement. En combinant ces différents modèles, on peut mieux comprendre la maladie et évaluer les thérapies dans des contextes variés. Du point de vue technique, les souris sont particulièrement adaptées aux systèmes d’imagerie utilisés dans ce projet, tels que la tomographie par émission de positrons (TEP), l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et l’imagerie par fluorescence. Leur taille permet d’intégrer des équipements d’imagerie avancés, tout en facilitant des manipulations chirurgicales précises et reproductibles. En outre, ces animaux sont bien caractérisés en termes de biologie et d’éthologie, ce qui garantit une évaluation éthique rigoureuse et une minimisation des nuisances associées aux expérimentations. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris âgées de 6 à 10 semaines au moment de la chirurgie. L’âge choisi permet de travailler avec des animaux à un stade de développement adolescent à adulte, ce qui est en adéquation avec l’âge moyen des sujets humains concernés par la pathologie. Les animaux seront reçus à un âge minimal de 4 semaines et bénéficieront d’une période d’acclimatation d'au moins une semaine après leur livraison. Cela permettra de réduire le stress et d’assurer que les animaux sont dans un état optimal avant les interventions expérimentales.