Recherche appliquée

Rasées à la crème dépilatoire sous anesthésie puis badigeonnées d'un produit irritant trois fois par semaine pendant trois semaines, ou injectées cinq jours sur sept, 1 388 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever des organes. L'objet est de tester des molécules censées relancer la résolution de l'inflammation dans des modèles de dermatite atopique et de sclérodermie, un essai clinique étant évoqué comme suite possible. Le porteur écrit que le rasage et les applications n'engendrent "pas de douleur mais un léger stresse", puis annonce que l'apparition des signes cliniques, elle, provoquera de la douleur chez l'animal.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chronique ont aujourd’hui une incidence en constante augmentation notamment dans les pays industrialisés. Ces maladies peuvent être localisées à un organe comme la rectocolite hémorragique, ou bien toucher tout l’organisme : c’est le cas de la dermatite atopique (DA). La DA est une inflammation qui touche 2 millions de personnes et entraîne de nombreux inconvénients tel que des démangeaisons intenses, des rougeurs et des troubles du sommeil. Cette inflammation est déclenchée par une altération de la barrière cutanée menant à l’activation du système immunitaire. Les traitements actuels utilisés visent à réduire l’inflammation et les démangeaisons par 1) l’application de crème et 2) l'utilisation d'immunomodulateurs ayant pour objectif d'inhiber le système immunitaire. Ces molécules ne sont pas spécifiques et sont associées à de nombreux effets secondaires tel que des brulures, bouffées de chaleur ainsi qu’une immunodépression rendant les patients très fragiles aux infections. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires. De nouvelles cibles ont été identifiés comme jouant un rôle dans la modulation de l'inflammation. Nous aimerions tester différentes molécules capables d’activer une de ces cibles et analyser les effets engendrés par cette activation dans différents modèles animaux de dermatite atopique.

Bénéfices attendus

Les traitements utilisés contre la dermatite atopique font appel à des traitements locaux de type crème corticoïdes limitant les rougeurs ainsi que les démangeaisons. Puis, lorsque les patients ne répondent plus aux corticoïdes ils peuvent être mis sous immunomodulateurs. Ces traitements entrainent néanmoins de nombreux effets secondaires tels que des sensations de brulures ainsi qu’un risque accru de lymphomes ou de cancers cutanées. De plus, il a été démontré que dans 50% des cas une inefficacité ou une tolérance aux traitements est observé chez ces patients. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons développé de nouvelles molécules ciblant le système immunitaire. Ces molécules ont pour avantage de ne pas induire d’inhibition du système immunitaire, rendant le patient totalement apte à répondre à tout type d’attaque extérieure. Chez l’animal nous espérons pouvoir activer la phase de récupération dans ces différents modèles avec notamment une diminution des signes cliniques. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’humain afin de traiter les patients n’ayant plus de possibilité thérapeutique et de leur proposer une nouvelle voie thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs gestes d'administrations. L'administration des traitements se fera à hauteur de 3 fois par semaine sur une durée de 3 semaines. L'administration des agents inducteurs se fera sur animaux anesthésiés 2 à 5 fois par semaines pendant 3 à 4 semaines. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire pourront être effectués sur animaux vigile (1 fois par semaine maximum tout au long du protocole). Pour finir certains animaux seront rasés par utilisation de crème épilatoire après anesthésie de l'animal lors de l'induction du modèle.

Impact sur les animaux

Modèles de sclérodermie : Les animaux subiront des injections quotidienne (5 jours sur 7) d'inducteurs pour un maxium de 3 semaines, ceci engendrera du stress répéter ainsi qu’une légère douleur lors de l’injection. De plus, l’apparition des premières signes cliniques dès la première semaine ainsi qu’une perte de poids contrôlé, engendrera de la douleur chez l’animal. Modèles de dermatite atopique : Les souris seront rasées puis subiront une application cutanée d'inducteur 3 fois par semaine pendant 3 semaines. Ce geste n’engendrera pas de douleur mais un léger stresse chez l’animal. L’apparition des premiers signes cliniques provoquera de la douleur chez l’animal.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d'intérêts pourront être prélevés pour compléter les analyses

Remplacement

Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les 5 études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant validé le plus de critères de la pathologie et le moins de nuisances sur l'animal. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre d'animaux de n=22 animaux/groupe nécessaire.

Raffinement

Les animaux auront une phase d’acclimatation de plusieurs jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de l'analgésique 3 fois par jour puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe, avec des frisottis pour se camoufler ainsi que des dômes ou des tunnels. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton

Choix des espèces

Afin d'étudier le rôle des différentes cibles in vivo dans des modèles expérimentaux d'inflammations induit par des molécules chimiques, nous utiliserons différentes lignées chez la souris décrite pour déclencher ce type d'inflammation. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

Une inflammation du muscle cardiaque leur est provoquée par deux injections sous la peau, à sept jours d'intervalle. 128 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant les trois semaines qui suivent, elles reçoivent un agent d'imagerie par voie intraveineuse puis passent sous anesthésie pour l'acquisition des images, l'objectif étant de tester si ce produit repère mieux l'inflammation cardiaque que l'agent de référence. Le porteur résume le raffinement en deux lignes, annonce des "points limites adaptés au modèle" sans dire lesquels, et ne précise ni la fréquence de la surveillance ni les signes qui déclencheraient une mise à mort anticipée.

Objectifs

Le terme de « cardiomyopathies inflammatoires » regroupe un ensemble de pathologies qui toutes sont caractérisées par une inflammation du muscle cardiaque. Cependant, malgré ce point commun, la prise en charge des patients diffère fortement en fonction de la nature de la maladie. Il est donc essentiel, en pratique clinique, de diagnostiquer la présence d’un site inflammatoire dans le cœur, puis de réaliser un prélèvement (biospie) à ce site pour déterminer la nature de la maladie. En pratique, il reste difficile de localiser le site inflammatoire avec l’ agent d’imagerie de référence, car il peut également se fixer de manière non spécifique dans le cœur sain. L’objectif de ce projet est de résoudre ce problème grâce à un nouvel agent d'imagerie de l'inflammation offrant un meilleur signal. Il fera l’objet d’une évaluation pour cette application en réalisant de l’imagerie sur un modèle de souris d’inflammation du cœur.

Bénéfices attendus

L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué est en cours d’évaluation clinique dans une autre indication. L’objectif ici sont donc de déterminer s’il permet également la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque . S’il est validé pour cette nouvelle application, il pourra être utilisé dans le cadre de la pratique clinique pour diagnostiquer cette inflammation et pour guider les prélèvements. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.

Procédures

Les animaux subiront une unique procédure incluant l’induction de l’inflammation du muscle cardiaque (myocardite) (réalisée via 2 injections en sous-cutané au temps initial et à 7 jours) et son suivie par imagerie. A différents temps (de 0 à 3 semaines suivant l’induction de la myocardite) les animaux recevront une injection intraveineuse d’un agent d’imagerie suivi d’une anesthésie volatile de courte durée (

Impact sur les animaux

Cette procédure a été classée en modérée car l’induction de la maladie peut être une source de stress et de douleurs pour l’animal. Un stress léger lié aux injections peut également survenir.

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.

Remplacement

La réponse inflammatoire lors d’une myocardite ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine et sur cellules. Sa spécificité et sa sensibilité pour lier sa cible ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.

Réduction

Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. Ainsi, dans un premier temps un suivi longitudinal sera réalisé afin de restreindre l’étude aux seuls temps pertinents.

Raffinement

Des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence pour l’étude des de la myocardite. L’agent d’imagerie reconnait la protéine humaine impliquée dans l’inflammation, mais également la protéine de souris. De ce fait l’espèce retenue est la souris. Des souris adultes seront utilisées afin de se rapprocher du contexte clinique.

Greffer dans les bronches des cellules souches humaines corrigées génétiquement conduit ici à utiliser 10 mini-porcs, tous tués à l'issue pour analyses histologiques, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie sous anesthésie pouvant durer deux heures trente, deux séances d'imagerie d'une heure trente et huit prélèvements sanguins sous anesthésie de trente minutes. Le porteur liste les risques attendus, bronchite, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aiguë, pneumothorax, pleurésie et signes de sepsis, puis les juge "extrêmement réduits" grâce aux traitements préventifs. Le bénéfice qu'il avance, fournir les données d'un futur essai clinique sur la dyskinésie ciliaire primitive, dépend entièrement de résultats "favorables" encore à obtenir.

Objectifs

La majorité des maladies pulmonaires d’origine génétique, comme certaines formes de mucoviscidose, n’ont pas encore de traitement curatif. Les tentatives de traitement par inhalation de virus modifiés n’ayant pas donné les résultats espérés, une nouvelle approche combinant thérapie cellulaire et thérapie génique a vu le jour. Nous avons mis au point une méthode simplifiée pour créer des cellules souches à partir du sang du patient, les corriger génétiquement, puis les transformer en cellules capables de régénérer les voies respiratoires. Cette technologie ouvre la voie à des traitements innovants pour les maladies pulmonaires génétiques. Pour valider cette approche, nous l’appliquons actuellement à une maladie rare appelée dyskinésie ciliaire primitive (PCD).

Bénéfices attendus

Les bénéfices concernent le traitement de la dyskinésie ciliaire primitive (PCD). Si les résultats sont favorables, notre travail pourrait permettre à conduire un futur essai clinique, en fournissant des données qui seront nécessaires à la mise en place d'un essai clinique.

Procédures

Les animaux sont soumis à : -Procédures chirurgicales : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux; - Imagerie (2 fois) : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 1h30; - Prélèvements sanguins (8 fois) : sous anesthésie rapide de 30 minutes maximum.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la greffe des cellules, plus précisément au conditionnement excessif (risque de dommage des bronches) ou bien insuffisant, lesquelles pourront induire la mort des cellules greffées. Une mort cellulaire excessive pourrait être la conséquence d'une dissociation unicellulaire des progéniteurs bronchiques humains dérivés des iPSC dans le contexte d'une stase intra bronchique, d'un piégeage du mucus ou, à l'inverse, d'une toux et d'expectorations après administration. Les risques principaux sont également : bronchites, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aigue, pneumothorax, pleurésie, signes de sepsis. Ces risques à priori paraissent extrêmement réduits étant donnés les prémédications prophylactiques périprocédures (antibiothérapies, corticothérapie, anti tussifs). La simple mesure des constantes, et la réalisation d’une tomodensitométrie visant à évaluer ces risques sont ainsi prévues. Entre autres, des complications liées à la chirurgie ou à l'anesthésie ou les effets indésirables du traitement immunosuppression peut être également observées. De plus, une adaptation du protocole en termes de médicament anesthésique, de choix de traitement, etc. sera éventuellement proposée pour la deuxième série d'animaux (8 mini-pigs).

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative de remplacement, car l’objectif de cette étude est d’évaluer la toxicité ainsi que l’efficacité sur un modèle animal avant passage chez l’homme.

Réduction

Au total, 10 animaux seront utilisés (2 et 8). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables, la toxicité et efficacité de xénogreffe de progéniteurs d'épithélium bronchique dérivés d'iPSC en "conditions réelles".

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée après chaque anesthésie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés : anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et/ou morphiniques. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. Des examens d'imagerie (une bronchoscopie et le scanner) et sanguins viendront compléter cette évaluation.Concernant l'immunosuppression, le traitement par ciclosporine sera administré avec l’alimentation, afin de limiter le stress et de ne pas perturber les animaux. De plus, compte tenu de l’immunosuppression, des mesures de biosécurité seront renforcées : un équipement de protection individuelle propre sera utilisé pour réduire le risque infectieux. Enfin, un suivi biologique régulier (formule sanguine complète et biochimie) permettra d’adapter rapidement la posologie en fonction des effets observés, limitant ainsi les effets secondaires.

Choix des espèces

Nous utiliserons des mini-porcs qui ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain et peuvent facilement être immunosupprimés pendant plusieurs semaines grâce à la ciclosporine permettant une xénogreffe. De plus, seul un grand modèle comme le porc peut fournir une situation clinique similaire à celle rencontrée chez l'homme, notamment en ce qui concerne l'accès par fibroscopie lobaire et la grande surface à traiter. Les mini-pigs à l'âge adulte (8 à 10 mois) ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain (5 lobes, accès facile à l'endoscope humain).

4 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour analyse du cœur et des organes, une partie gardée pour entretenir l'élevage. Elles subissent une biopsie de la queue ou de l'oreille, des injections, et pour certaines des échocardiographies sous anesthésie de quinze minutes. Le porteur indique que certains animaux portent un phénotype dommageable provoquant une atteinte cardiaque et une mort spontanée, et prévoit 60 souris par groupe au lieu de 40 pour absorber cette mortalité. Il qualifie le modèle animal d'"incontournable" et de "préalable indispensable" pour valider des traitements de la myocardite, tout en précisant que les produits testés sont des références du commerce dont l'efficacité a déjà été confirmée sur cellules.

Objectifs

Notre projet a pour but de comprendre le rôle de l'inflammation dans la myocardite, pathologie cardiaque aigüe et sévère. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris présentant spontanément une myocardite. Nous étudierons la fonction cardiaque ainsi que la présence de cellules immunitaire dans le coeur afin d’identifier les acteurs clés responsables de l’aggravation de la maladie. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette myocardite, et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques pour cette pathologie qui présente chez l’homme une évolution rapide et souvent grave, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 30 à 50%.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires résultant de l'action des cellules immunitaires au cours d'une myocardite. Le développement d'un traitement de la phase aiguë de la myocardite présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.

Procédures

Les animaux vont subir la une biopsie de queue ou d'oreille. Une partie des animaux va subir une injection d'une durée maximale de 30 seconde. Une partie des animaux va subir une ou plusieurs échocardiographie non-invasive et indolore qui sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, stress lié à l'anesthésie. Potentielle douleur légère et de courte durée lors de l'injection et lors de la biopsie de queue ou d'oreille. Certains animaux présentent un phénotype dommageable associé à une atteinte cardiaque provoquant une mort spontannée.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront utilisés pour contribuer au maintien de l'élevage ou pour constituer les groupes expérimentaux s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux constituant les groupes expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.

Remplacement

L'étude expérimentale sur des animaux est une étape incontournable pour comprendre les mécanismes intervenant dans le développement de la myocardite. En effet, ces phénomènes complexes impliquent plusieurs organes et de nombreux types cellulaires, ce que les modèles in vitro ne peuvent reproduire. Nous cherchons à comprendre dans ce modèle animal, les diverses interactions cellulaires et tissulaires qui se produisent lors d'une myocardite. Ces modèles précliniques de souris sont également un préalable indispensable pour valider les stratégies thérapeutiques avant leur application chez les patients atteints d'une myocardite. Les produits utilisés sont des références disponibles dans le commerce et dont l'efficacité a déjà été confirmée in vitro sur des cellules.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 17 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents au modèle animal, et en distinguant mâles et femelles, nous estimons une taille de groupe à 40 animaux sans phénotype dommageable et 60 pour les animaux présentant le phénotype dommageable, afin d’inclure la mortalité associée au modèle. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par le personnel technique qualifié de l’animalerie ainsi que les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Nous utiliserons des souris âgées de 3 semaines environ au moment de l'identification Cet âge correspond à l'âge à partir duquel il faut sevrer les animaux. Nous utiliserons ensuite les animaux adultes, âgés de 9 à 32 semaines pour les expérimentations. A ces âges, le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité mais n'est pas encore senescent.

Tuées à la fin de chaque procédure parce qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, 1 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la rate par chirurgie, puis viennent jusqu'à dix injections, dix prises de sang et neuf séances d'imagerie sous anesthésie par animal, pour tester un vaccin contre le cancer du foie lié au virus de l'hépatite B. Le porteur écrit que la croissance de la tumeur hépatique "est tolérée par les souris" tout en indiquant qu'elle peut affecter leur capacité à s'alimenter. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'immunogénicité des vecteurs et que la complexité des réponses vaccinales dans un "organisme entier" impose l'animal.

Objectifs

Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement certaines cellules immunitaires capables de tuer des cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur de nouveaux candidats vaccins pourrait être particulièrement efficace pour activer ces cellules immunitaires et contrôler la prolifération tumorale. Dans un premier temps, le but est d'établir des lignées tumorales exprimant des antigènes du virus de l'hépatite B au niveau du foie des souris. En cas de succès, l’objectif sera d'évaluer l’efficacité des candidats vaccins seuls, ou en combinaison avec des molécules anticancéreuses, à éliminer ces tumeurs. Cela permettra d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du foie et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une vaccination thérapeutique basée sur ces nouveaux candidats vaccins. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité antitumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de la preuve du concept préclinique d'utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des candidats vaccins, avec ou sans combinaison avec d’autres molécules anticancéreuses, dans l’immunothérapie du cancer du foie lié à l'infection par le virus de l'hépatite B. L’avantage à long terme du projet actuel sera l'utilisation de ces vaccins d’immuno-oncothérapie dans le contexte d’une co-administration en clinique dans le but d’obtenir un effet additif ou synergique de la réponse immunitaire contre des tumeurs hépatiques.

Procédures

Pour un groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 7x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 7x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 6x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 1 ou 2x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 4x - Injection sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x

Impact sur les animaux

L'injection dans la rate des cellules tumorales nécessite une chirurgie et des complications post-opératoires comme des infections peuvent survenir pendant toute la période de suivi. La croissance de la tumeur au niveau hépatique est tolérée par les souris mais peut, dans certains cas, s’associer à une perte d'activité et affecter leur capacité à s'alimenter. Les animaux sont susceptibles de ressentir une légère douleur au moment des injections de vaccins, d'anticorps ou des prises de sang. Cette douleur sera de courte durée et sans impact significatif sur leur bien-être ou leur état général. Douleur au point de piqure et stress lors des prélèvements de sang sur animaux vigils.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les souris présentant des tumeurs seront euthanasiées pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité vaccinale antitumorale d’un vaccin thérapeutique, injecté seul ou en co-injection avec des molécules anticancéreuses, destiné ultimement à la thérapie de certains cancers du foie. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale, car aucun modèle in vitro ne permet d’évaluer l’immunogénicité des vecteurs d’immunisation. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité des réponses vaccinales et antitumorales au niveau d’un organisme entier. Les mécanismes en jeu sont multifactoriels et ne sont pas encore caractérisés de manière exhaustive. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est déterminé en prenant en compte que le développement d’une tumeur et son interaction avec le système immunitaire comporte une large variabilité entre les individus, comme chez l’homme. En choisissant des animaux d’âge proche, il est possible de réduire au maximum cette variabilité. Toujours pour réduire le plus possible le nombre de souris utilisées tout en s’assurant qu’un nombre suffisant sera inclus de façon à rendre les résultats concluants, le nombre d’animaux et de répétitions par expérience ont été définis en fonction de la nature de l’expérience et validés suite à l’exposé et à la discussion du projet avec un biostatisticien. Sur ses conseils, les groupes seront constitués de 10 animaux du fait de la capacité d’implantation et de la variabilité de la croissance tumorale de manière à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes. Ce nombre pourra être réduit si la variabilité observée lors de la première procédure est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser notre protocole de vaccination et de définir la cinétique de vaccination permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vaccins utilisés dans cette étude ont été préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses spécifiques contre les tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si les tumeurs ne s'implantent pas ou si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes ne seront pas réalisées.

Raffinement

L'injection dans la rate des cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie gazeuse avec une prise en charge de la douleur avant, pendant et après l'injection. L’implantation de tumeurs hépatiques peut induire une gêne modérée qui sera spécifiquement monitorée 2 à 3 fois par semaine au cours des expériences. Selon notre expérience antérieure, l’injection des vecteurs lentiviraux vaccinaux n’induit aucun signe clinique chez les souris. Les animaux seront observés 2 à 3 fois par semaine pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance. Si un point limite est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises. Cela inclut l’ajout de gel hydrique, la réhydratation sous cutanée, le chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose pour éviter l’irritation par les copeaux de bois.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe un modèle de tumeur hépatique qui peut être utilisé chez la souris pour tester notre candidat vaccin. Nos études précédentes montrent que les vecteurs vaccinaux évalués sont immunogènes chez la souris. De plus, de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.

Dix semaines de gavage intragastrique et treize semaines de tests : 80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles doivent appuyer sur un levier pendant soixante minutes par jour pour obtenir une nourriture appétente, sous privation alimentaire, et leur prise de boisson est mesurée trente minutes par jour. Le porteur veut savoir si une bactérie intestinale humaine réduit la motivation pour le gras et le sucre, et si elle limite la prise de poids sous régime hypercalorique, en vue d'un usage comme probiotique contre l'obésité. Une perte de poids supérieure à 20 % associée à un score de souffrance maintenu plus de quarante-huit heures déclenche la mise à mort par dislocation cervicale.

Objectifs

Le but du projet est de caractériser l'effet de la bactérie intestinale commensale humaine Phascolarctobacterium faecium G104 sur le comportement alimentaire chez la souris (objectif 1) ainsi que de déterminer son rôle dans la prévention de la prise de poids en réponse à l'ingestion d'un régime hypercalorique (objectif 2).

Bénéfices attendus

Ce travail fournira des preuves scientifiques des effets de la bactérie intestinale commensale humaine P. faecium G104 sur le comportement alimentaire en explorant son rôle sur la motivation pour les aliments palatables. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il nous permettra de mieux comprendre les avantages métaboliques de cette bactérie et son utilisation potentielle comme probiotique pour prévenir et traiter l'obésité.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : Administration des traitements par sonde intragastrique pendant 10 semaines (80 souris, vigiles) ; Mesures comportementales pendant 13 semaines (80 souris, vigiles). L'adminstration par gavage oral prend moins de 10 sec par animal. Lors des tests comportementaux les animaux peuvent librement se déplacer: on mesure la consommation de nourriture palatable après appui sur un levier pendant 60 minutes par jour. Test de préférence/ aversion gustative on mesure la prise hydrique pendant 30 minutes par jour. Rythmes circadiens du comportement alimentaire sera mesuré pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

L´injection intrapéritonéale et l´administration par gavage oral peuvent être cause de stress pour l’animal dû à la contention/préhension. – Le test comportemental pour évaluer la motivation pour la nourriture palatable nécessitent une déprivation alimentaire légère. L’exposition au régime hyperlipidique entraine une prise de poids et des désordres métaboliques pour les souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour l'étude des effets du traitement au probiotique sur le cerveau (80 animaux)

Remplacement

Notre projet de recherche vise à mieux comprendre comment une bactérie spécifique présente dans l’intestin influence les habitudes alimentaires. Plus précisément, nous voulons savoir si cette bactérie peut moduler la motivation pour des aliments palatables comme les aliments sucrés et gras et si cette bactérie peut réguler la prise de poids lors d’une exposition à une régime obésogène. Notre projet vise à comprendre les mécanismes neurobiologiques par lesquels cette bactérie intestinale module le comportement alimentaire. Pour étudier cette question de manière approfondie, nous devons utiliser des modèles animaux. Nous avons choisi d'étudier des souris de la souche C57BL/6J, car cette souche développe une obésité lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en graisses et en sucres. Il n'existe pas d'alternative à l'étude des effets de cette bactérie sur les comportements et le cerveau. Ce travail fournira des preuves scientifiques des effets de la bactérie intestinale commensale humaine P. faecium G104 sur le comportement alimentaire en explorant son rôle sur la motivation pour les aliments palatables. Ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), et nous permettra de mieux comprendre les avantages métaboliques de cette bactérie et son utilisation potentielle comme probiotique pour prévenir et traiter l'obésité.

Réduction

Les mêmes souris (80 au total) seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la caractérisation des effets. Le nombre d'animaux nécessaires (10 par groupes) est basé sur des expériences précédemment effectuées dans l'équipe permettant de révéler des différences statistiques entre groupes dans ce type de tâches comportementales . Il est nécessaire d'utiliser deux lots d'animaux pour obtenir des tissus frais et des tissus perfusés et fixés, la taille totale de l'échantillon incluant les deux lots est donc de 80 souris (40 x 2).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. - Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille (foournie en annexe) : si un score supérieur à 3 (associé à une perte de poids >20%) persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé.Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Avant la mise à mort, les animaux recevront un traitement analgésique suivi d'un traitement avec un anesthesique.

Choix des espèces

la souris est un bon modèle pour l'étude du comportement alimentaire et la motivation. Le comportement sera étudié à l'âge adulte, qui constitue la population la plus exposée à l'obesité en clinique.

Pour sélectionner des composés contre l'hyperactivité de la vessie, 960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une irritation de la vessie leur est provoquée par de la capsaïcine ou de la prostaglandine, et l'effet des molécules est mesuré par cystométrie, jusqu'à quatre heures avec un cathéter posé dans la vessie sous anesthésie. Certains animaux reçoivent une pompe implantée sous la peau, des prélèvements de sang et des collectes d'urine en cage individuelle de moins de vingt-quatre heures, le protocole étant arrêté en accord avec une entreprise pharmaceutique partenaire. Le porteur présente le recours au rat comme un choix limitant "l'utilisation d'animaux tels que le chien".

Objectifs

L’hyperactivité de la vessie touche environ 15 % de la population, et devient plus fréquente avec l’âge. Elle entraine des envies urgentes et fréquentes d'uriner, des incontinences et des lever nocturnes qui perturbent grandement la vie au quotidien des patients souffrants de cette pathologie. Les causes de ce trouble sont encore mal connues, mais on pense qu’il est lié à un fonctionnement anormal du muscle de la vessie. Les traitements actuels reposent principalement sur des médicaments appelés antimuscariniques dont le but est d'inhiber les contractions involontaires de la vessie en agissant sur certains récepteurs. Cependant, leur efficacité est souvent limitée, et ils provoquent des effets secondaires (sécheresse de la bouche, constipation, troubles de la vision...) qui amènent de nombreuses personnes à arrêter leur traitement. Il est donc important de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Pour cela, des recherches sont menées à l’aide de modèles expérimentaux qui reproduisent les symptômes de l’hyperactivité de la vessie. Ce projet vise à tester de nouveaux composés destinés à traiter l’hyperactivité vésicale. Certains de ces composés testés agissent différemment des traitements actuels, tandis que d'autres utilisent les mêmes mécanismes, mais avec moins d'effets secondaires. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez le rat, dans lequel une irritation temporaire de la vessie est provoquée à l’aide de substances comme la capsaïcine (un composé extrait du piment). Ces tests permettront d’évaluer l’efficacité des traitements avant d’envisager leur utilisation chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de l’hyperactivité vésicale sont souvent mal tolérés, peu efficaces, ou contraignants à utiliser. Beaucoup de patients finissent par les abandonner, faute de résultats satisfaisants. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques, mieux adaptées aux besoins des malades. L’objectif de ce projet est justement de contribuer à la mise au point de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux supportés. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez le rat, qui permet de reproduire certains symptômes du trouble observé chez l’humain. Ce modèle permet de tester rapidement et de manière fiable l’efficacité et l’innocuité de nouvelles molécules. À terme, ce travail pourrait aboutir à des traitements innovants qui améliorerait significativement le quotidien des patients. Il pourrait aussi permettre de mieux comprendre les causes de ce trouble, ce qui ouvrirait la voie à d'autres avancées médicales. Enfin, en réduisant les complications liées à l’hyperactivité de la vessie, comme les infections à répétition ou les problèmes rénaux, ces recherches pourraient également contribuer à diminuer les hospitalisations et les coûts de santé.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront le traitement à tester ou bien un placébo. La durée et la fréquence du traitement dépendront du médicament étudié, mais resteront en général inférieures à six mois. L'administration du traitement sera rapide : elle dure moins d'une minute lorsque l'animal est éveillé, moins de 30 minutes si une anesthésie est nécessaire, et au maximum 45 minutes si le produit doit être injecté dans la vessie sous anesthésie profonde. Dans certains cas, un examen spécifique pourra être réalisé pour évaluer l'effet du traitement sur la vessie. Cet examen, appelé cystométrie, permet de mesurer le fonctionnement de la vessie pendant quelques heures (jamais plus de 4 heures) et nécessite l’installation préalable d’un petit tube dans la vessie. Au cours de l’étude, des prélèvements pourront être faits (sang, urine) afin de procéder à des analyses pour mieux comprendre les effets du traitement. Chaque prise de sang dure moins de 3 minutes, et la collecte d’urine se fait sur moins de 24 heures dans une cage adaptée. Il est important de souligner que tous les animaux ne subiront pas toutes ces procédures. Les interventions seront limitées à ce qui est strictement nécessaire, selon les objectifs du projet, et en accord avec les recommandations établies dans le cadre de notre collaboration avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

Certaines étapes du projet peuvent entraîner un inconfort temporaire pour les animaux, bien que tout soit mis en œuvre pour les limiter. Les effets indésirables possibles incluent : - Un léger stress ou une gêne lors de l’administration du traitement, car nécessitant que l’animal soit maintenu immobile pendant un court instant. - Une douleur ou gêne temporaire liée à l’implantation d’une petite pompe sous la peau, ou bien à l’administration du composé à tester directement dans la vessie. - Un stress léger lié à la collecte d’urine (sur une période inférieure à 24h) ainsi qu'aux prises de sang.

Devenir

Les animaux recevront les traitements à tester, soit en une seule fois, soit de manière répétée sur une période plus longue, selon les besoins de l’étude. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par différents moyens, notamment : - L’analyse de la quantité d’urine produite sur une période de moins de 24 heures, - Un examen permettant d’étudier le fonctionnement de la vessie, - L’analyse d’échantillons de sang, d’urine ou d’organes. À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur garantissant l’absence de douleur. Cette étape sera réalisée par du personnel formé, expérimenté et autorisé à le faire, conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet se justifie par l’absence de méthode alternative permettant d’étudier efficacement l’hyperactivité de la vessie. Cette maldie dépend de nombreux mécanismes complexes (nerveux, hormonaux, métaboliques…) qui interagissent entre eux dans un organisme vivant. Aujourd’hui, aucun modèle en laboratoire ne permet de reproduire cette complexité de manière fiable. L’utilisation de modèles animaux reste donc indispensable pour développer de nouveaux traitements mieux adaptés aux patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été calculé avec soin, afin d’être le plus faible possible tout en garantissant des résultats fiables. Une méthode statistique a été utilisée pour déterminer le nombre minimum nécessaire par groupe. De plus, lorsque cela sera possible, deux traitements seront testés en même temps. Cela permettra de limiter encore le nombre d’animaux en évitant de répéter inutilement certaines expériences, notamment pour les groupes qui ne reçoivent pas de traitement ou qui reçoivent un traitement de référence déjà connu.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long du projet. - Les rats sont hébergés par deux dans une même cage, dès que cela est possible, afin de préserver leur bien-être en favorisant le contact social. - Chaque jour, les soigneurs spécialisés vérifient l’état de santé général de chaque animal, leur comportement et la propreté de leur environnement. - Des critères de surveillance précis ont été définis. Si un animal montre des signes de douleur ou de souffrance, les responsables du projet sont immédiatement alertés, et les soins nécessaires sont apportés sans délai. - Les interventions chirurgicales, comme l’implantation de pompes ou les injections dans la vessie, sont réalisées sous anesthésie générale avec des médicaments contre la douleur. Un traitement antibiotique est également donné pour prévenir les infections. - D’autres procédures, comme la pose de petits cathéters (tubes) pour les examens de la vessie, ainsi que les examens eux-mêmes, sont aussi réalisés sous anesthésie complète, afin que l’animal ne ressente aucune douleur.

Choix des espèces

L’expérimentation animale est nécessaire pour l’étude d’une fonction physiologique complexe telle que l’hyperactivité vésicale. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitant l’utilisation d’animaux tels que le chien. Le choix des protocoles est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chances d’obtenir des résultats satisfaisants. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Concernant l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines d'âge). Ce choix est justifié par la littérature scientifique.