Recherche appliquée

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages ou des injections sous-cutanées, intrapéritonéales ou intramusculaires jusqu'à sept jours par semaine pendant quatre semaines, et un prélèvement sanguin sous anesthésie tous les quinze jours. Le porteur annonce des tests moteurs et comportementaux susceptibles de provoquer un stress léger à modéré et une fatigue passagère, sans préciser lesquels. L'objet réel du projet reste l'évaluation préclinique de quinze produits en cinq ans pour l'industrie agroalimentaire ou pharmaceutique, un passage chez la souris que le porteur qualifie d'"indispensable" pour mesurer les effets sur "l'ensemble de l'organisme".

Objectifs

Les muscles squelettiques assurent de nombreuses fonctions au sein de l’organisme. Aussi, leurs altérations peuvent avoir des répercussions sur la fonction motrice et la qualité de vie des patients. L’industrie du secteur agroalimentaire ou pharmacologique s’oriente vers le développement de produits qui visent à diminuer les états de fatigue ou de faiblesse musculaire. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer au niveau pré-clinique l’efficacité de nouveaux produits, alimentaire ou pharmacologique, pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, nous envisageons de tester 15 produits en 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à évaluer les effets d’approches thérapeutiques innovantes sur la fonction musculaire chez la souris, dans un objectif de transfert vers des populations humaines souffrant de troubles musculaires, notamment les patients atteints de pathologies neuromusculaires et les personnes âgées présentant une perte de la fonction musculaire. L'utilisation du modèle murin permettra également de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dégradation de la fonction musculaire. Les connaissances acquises contribueront à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à l'élaboration de stratégies innovantes pour préserver ou restaurer la masse et la fonction musculaire. À terme, les résultats obtenus pourront ainsi déboucher sur le développement de traitements efficaces, améliorant significativement la qualité de vie des patients concernés.

Procédures

(1) Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse - Fréquence maximale : 1 prélèvement tous les 15 jours ; durée : 5 min maximum (pous tous les animaux) (2) Gavage - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par gavage) (3) Injection sous-cutanée - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection sous-cutanée) (4) Injection intrapéritonéale - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection intrapéritonéale) (5) Iinjection intramusculaire sous anesthésie gazeuse : fréquence maximale : 5/7j sur une semaine, 1/7j sur 4 semaines ;- durée : 10 min maximum (pour les animaux traités par injection intramusculaire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus aux modalités d’administration retenues ou aux prélèvements de sang réalisés au cours du protocole. Les nuisances attendues sur les animaux sont : (1) inflammation transitoire au niveau du site d’injection (2) fausse-route ou blessure du tractus digestif dans le cas d’administration par gavage (3) traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang (4) risque infectieux liés à la réalisation de gestes invasifs. Les tests moteurs et comportementaux peuvent induire un stress léger à modéré du fait de la manipulation des animaux et leur isolement temporaire, ainsi qu'un fatigue passagère du fait de la répétition des mesures.

Devenir

A la fin de la durée du traitement, les animaux seront euthanasiés. Plusieurs muscles squelettiques seront ensuite rapidement prélevés pour étudier leur fonctionnalité.

Remplacement

Dans le cadre d’évaluation préclinique d’une nouvelle approche thérapeutique, le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est limité autant que possible, tout en garantissant des résultats fiables. En raison de la variabilité attendue des réponses aux traitements testés, 15 souris par groupe ont été prévues. Ce nombre permet de détecter des différences significatives entre groupes tout en respectant le bien-être animal et en limitant le nombre d'animaux. Il est basé sur nos expériences passées, où des différences de 20 à 30 % entre groupes ont pu être observées avec ce type d’effectif. Plusieurs mesures sont mises en place pour limiter encore le nombre d’animaux : (1) Utilisation de produits déjà connus comme sûrs (2) Choix réfléchi des groupes de comparaison (3) Suivi répété des mêmes paramètres chez chaque animal (4) Réalisation de tests multiples sur les mêmes animaux, sans nuire à leur bien-être (5) Combinaison de tests in vivo et in vitro sur les mêmes animaux (6) Réutilisation des données de groupes témoins dans des expériences similaires (7) Mutualisation des données issues de groupes recevant un produit de référence.

Raffinement

Les nuisances ou effets indésirables attendus étants principalement dus aux modalités d’administration des produits à tester, des méthodes moins stressantes et moins invasives seront utilisées, tout en tenant compte des contraintes liées au composé à tester (solubilité, stabilité, dose/volume…), les objectifs de l’étude et la pharmacocinétique souhaitée : Liste des actions pour réduire la douleur et le stress des animaux liées au traitement : - Conditionnement positif des animaux à la manipulation/méthode d’administration - Utilisation préférentielle des voies orales volontaires (eau de boisson/alimentation) - Remplacement du gavage par la technique d'administration guidée par micropipette dès que possible - Remplacement des injections intrapéritonéales par des injections sous-cutanés, sans contention. Les méthodes utilisées pour étudier la fonction musculaire des animaux sont validées et non invasives, des périodes d’acclimatation et d’habituation sont systématiquement effectuées. Lors de la réalisation des tests, un renforcement positif par récompense est mis en place pour limiter le stress des animaux. Liste des actions pour réduire la douleur et souffrance des animaux liées aux tests d’exploration de la fonction musculaire - Choix de tests non invasifs pour analyse in vivo de la fonction musculaire, - Prélèvement de sang effectué sous anesthésie générale, - Observation quotidienne des animaux : définition de points d’arrêts anticipés pour identification des souris souffrantes (aspect et comportement général, poids…), exclusion du protocole et euthanasie des animaux ayant atteints ces points d’arrêt. Liste des actions pour réduire l’angoisse des animaux tout au long du protocole - condition d’hébergement selon réglementation, - réalisation des tests fonctionnels et prélèvements dans une salle d’expérimentation différente de la salle d’hébergement, - familiarisation des animaux avec dispositifs expérimentaux avant les essais, - renforcement positif : récompense de l’animale suite à la réalisation des essais, - un expérimentateur et un soigneur dédiés.

Choix des espèces

Le modèle animal est le seul permettant une évaluation de la fonction motrice dans sa globalité. Au stade préclinique, ce modèle permet également de voir non seulement les effets d’un composé sur le système ou une fonction d’intérêt mais également les effets sur l’ensemble de l’organisme. La souris est également un bon modèle pour ce type d’étude incluant de nombreux tests in vivo d’exploration fonctionnelle du fait de sa docilité et de son aptitude à effectuer les différents exercices. Aussi, sa longévité en fait un modèle de choix pour l’analyse des conséquences du vieillissement, modèle validé par des études antérieures. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté en fonction de la nature du projet : Souris de 5-6 semaines pour les souris adultes Souris âgées de de 18 à 24 mois d’âge, pour le modèle d’altération lié à l’âge avec une fonte importante de la masse musculaire (degrés d’atteinte en fonction de l’âge retenu).

Tuées en fin d'étude ou dès qu'elles atteignent les points limites, et pour 928 d'entre elles réutilisées ailleurs, 4 644 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Celles qui n'entrent pas dans le protocole sont reversées à l'entraînement du personnel aux gestes techniques, puis mises à mort. Une tumeur est greffée à chaque animal vigile, mesurée deux fois par semaine puis tous les jours à l'approche des points limites, avec jusqu'à trois injections de composés et deux prélèvements sanguins dont le dernier est terminal. Le porteur signale que les nids et les rouleaux de carton sont retirés des cages pour éviter que les tumeurs ne s'ouvrent, et conclut qu'aucune alternative ne peut remplacer la souris pour ce criblage de candidats médicaments.

Objectifs

Ce projet dans son ensemble consiste à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine. Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représente ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet s’effectuera en 3 temps : # une étude de tumorogénicité permettra de mettre au point différents modèles tumoraux d’intérêt (tumeur/ souris) et d’effectuer un premier tri parmi ceux-ci. # Une étude Pilote d’efficacité antitumorale permettra de tester un/des médicament/s contrôle/s de référence sur les meilleurs modèles précédemment validés. #Une étude d’efficacité permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les meilleurs modèles sélectionnés précédemment.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble consiste à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine. Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représente ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité (combinées avec les données de tolérance), permettent de choisir les candidat médicaments ayant la meilleure fenêtre thérapeutique chez les patients (c'est à dire la meilleure efficacité pour le moins d'effets indésirables). Ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. Une partie du projet permettra ainsi de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux alors que l’autre partie permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés précédemment.

Procédures

# Greffe tumorale sur souris vigile (2-3 minutes_1 fois), # Prise de mesure des tumeurs sur souris vigiles minimum deux fois par semaine et quotidiennement en cas d’approche des points limites (2-3 minutes), # Injection des composés sur souris vigile (2-3 minutes_maximum 3 fois) # Un prélèvement sanguin intermédiaire sur souris vigile (2-3 minutes_1 fois), # Un prélèvement de sang terminal sur souris sous anesthésie et analgésie générale sans réveil (2-5 minutes_ 1 fois).

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions, (4) mesures tumorales et (5) anesthésie fixe ou gazeuse. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (a) de la greffe tumorale sur animal vigile, (b) de l’injection des composés sur souris vigiles et (c) de prélèvements sanguins intermédiaires. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue. En fonction des besoins de l’étude, un prélèvement terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, pourra être effectué.

Devenir

Pour chacune des trois procédures : Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. De même, les souris non entrées en protocole seront utilisées pour l’entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation#50826) avant d’être mises à mort. La Structure Bien Etre Animal (SBEA), assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in- vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en termes de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant majoritairement cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle Souris.

Réduction

Les études de tumorogénicité et de preuve de concept permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés dans l’étude d’efficacité. Selon les modèles, une implantation ectopique dans le tissu adipeux mammaire latéral plutôt que sous-cutanée peut permettre de réduire le nombre d’animaux nécessaires grâce à une croissance des tumeurs plus homogène, mieux vascularisée et de limiter les nécroses tumorales. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des études de tumorogénicité et de preuve de concept seront utilisés pour l’étude d’efficacité avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs, le fait de tester dans les 2 premières études une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés. Des tests statistiques adaptés à un petit nombre d’animaux permettront de suivre au cours du temps le volume tumorale, le poids corporel et la survie des souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, tunnels, bâtons à ronger). Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscrit afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de celluloses et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’environ une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive, avec des points limites définis et qui seront appliqués, permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure seront effectuées au moins deux fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel, du volume tumoral et de la qualité de la tumeur. Cette surveillance sera renforcée à l’approche des points limites. Selon les modèles, une implantation ectopique dans le tissu adipeux mammaire latéral plutôt que sous-cutanée peut permettre de réduire le nombre d’animaux nécessaires grâce à une croissance des tumeurs plus homogène, mieux vascularisée et de limiter les nécroses tumorales. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Ainsi les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).

Choix des espèces

# S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Pour les modèles de tumeurs humaines, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. Dans le cas des tumeurs de souris, l’utilisation de la souche consanguine dont sont issues les cellules cancéreuses est indispensable. # La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacologie seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. # Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines de développement et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’établissement utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non-immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte.

Cinquante-cinq minutes d'opération pour implanter une sonde de mesure sur la carotide gauche, avec un risque d'hémorragie et de détresse respiratoire, 130 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite pendant 28 jours un régime qui leur provoque une maladie rénale, des injections répétées dans la veine de la queue, deux mesures de filtration rénale de deux heures et des tests d'exploration, d'apprentissage et de mémoire dont aucun n'est nommé. Le porteur annonce des nuisances réduites au maximum, et compose dans le même texte des lots de dix animaux parce qu'il en attend jusqu'à 20 % de morts en cours de route. Toutes finissent exsanguinées sous anesthésie, organes et sang prélevés.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique touche près de 700 millions d'adultes dans le monde, avec des taux plus élevés dans les pays les plus développés. Les complications liées aux maladies rénales chroniques incluent notamment l’hypertension artérielle, qui est la cause principale des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Les patients atteints de maladie rénale chronique souffrent également de nombreuses complications neurologiques, notamment d'anxiété, de dépression, d'anomalies motrices, de troubles du sommeil et de troubles cognitifs. Le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique est un mécanisme clé dans le développement des troubles cognitifs au cours de la maladie rénale chronique. Notre projet vise à évaluer l’influence de l’hypertension sur les troubles cognitifs dans un modèle animal de maladie rénale chronique. Nous utiliserons notamment une approche pharmacologique afin d’évaluer l’impact de la modulation de la pression sanguine sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et la fonction cognitive.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le lien les atteintes cérébrales et l’hypertension au cours des maladies rénales chroniques, et de développer des stratégies de prévention de ces atteintes cérébrales via des approches pharmacologiques. La possibilité d’améliorer la prise en charge et le pronostic neurologique des patients atteints de maladie rénale chronique présente un bénéfice en santé humaine. Les troubles cognitifs pouvant être associés aux maladies rénales chroniques entraînent des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie pour placer un implant afin de pouvoir mesurer leurs constantes cardio-vasculaires (55 min). Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique induisant le modèle de maladie rénale (28j). Les animaux seront soumis à l’administration de substances pharmacologiques (schéma d'administration dépendant des molécules). Les animaux seront soumis à deux reprises à une injection sous courte anesthésie de molécules fluorescentes, puis mesure pendant 2 heures de la décroissance de la fluorescence avec une caméra miniature afin de mesurer la filtration glomérulaire. Les animaux seront soumis à des imageries qui seront espacées d’au moins 24h pour une durée maximale de 30min. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux de l’exploration, de l'apprentissage et de la mémoire afin d'évaluer les troubles cognitifs (moins d'une heure pour l'ensemble des tests). Enfin un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer un stress de la manipulation, un risque de déshydratation et de détresse respiratoire lié à l’anesthésie, de la douleur et un risque d’hémorragie . L’induction d’une maladie rénale par un régime spécifique provoque une altération de l’état général et un stress de l’animal qui peut se manifester par une perte de poids. L’imagerie et l’injection de molécules fluorescentes nécessiteront une anesthésie halogénée et pourront engendrer un stress, ainsi qu’une hypothermie. Les tests comportementaux pourront induire un stress par des manipulations quotidiennes. L’administration de substances pharmacologiques pourra engendrer un stress. Plusieurs injections intraveineuses dans les veines caudales seront réalisées pouvant entrainer une douleur et un stress chez l'animal. L'exsanguination, pratiquée sous anesthésie et analgésie, provoquera la mort des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure. Les organes et le sang seront prélevés pour réaliser des analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

La pose d’implants au niveau de la carotide gauche chez la souris ne peut se faire que sur animaux vivants. C’est une méthode validée et utilisée chez la souris. Il n’y a pas d’alternative non animale. En partant de nos résultats observés chez la souris montrant une altération de la barrière hématoencéphalique en contexte de modélisation de maladie rénale chronique, nous étudions une communication entre des organes : le rein et le cerveau, qu'il est impossible de modéliser in vitro et il n’existe actuellement pas de modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d'une substance sur la survenue de troubles cognitifs à la suite d’une insuffisance rénale. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles après une maladie rénale chronique, nous réalisons des évaluations neurocomportementales des animaux, qui n'est pas modélisable in vitro.

Réduction

Comme évalué dans des expériences précédentes notamment concernant l’implantation des sondes télémétriques, des lots de 8 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats. Nous utiliserons des tests statistiques spécifiques pour comparer deux lots entre eux ou pour comparer plusieurs (>2) lots. La mortalité est estimée

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement dans toutes les cages. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge peri-opératoire de la douleur avant, pendant et après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne, par du personnel qualifié et formé, de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole. Toute atteinte de points limites amènera à la mise en place d'actions décrites dans cette annexe. Les critères d’arrêt sont la prostration, la présence de plaies ne cicatrisant pas, ou une perte de poids trop importante.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle souris car ce modèle est largement décrit dans la littérature concernant l’implantation de sondes télémétriques et la modélisation d’insuffisance rénale. Ces espèces permettent également le recours à des techniques validées d’évaluation neurocomportementales, d’imagerie cérébrale et d’immunohistochimie cérébrale, permettant de répondre à nos hypothèses. Un stade de développement adulte est souhaité car cohérent avec le développement de cette pathologie chez l'être humain.

Un prélèvement sanguin terminal qui peut provoquer un arrêt cardiaque, pratiqué sous anesthésie sans réveil, c'est la fin prévue pour la plupart des 3 870 souris de ce projet, utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. 774 d'entre elles sont réutilisées ailleurs, celles qui n'entrent pas dans le protocole étant reversées à l'entraînement du personnel aux gestes techniques. Greffées de tumeurs, injectées dans la veine de la queue, elles subissent des prélèvements répétés destinés à mesurer combien de temps un candidat médicament anticancéreux reste dans le sang et à quelle dose il devient toxique. Le porteur revendique là une "avancée majeure dans le respect des 3R", ces souris humanisées remplaçant selon lui les primates non humains habituellement utilisés pour ce type de composés.

Objectifs

Ce projet consiste à mettre au point des modèles d'étude de toxicocinétiques non réglementairement pour des candidats médicaments de thérapies anticancéreuses ciblées par des antiticorps. Ces modèles de souris permettront ainsi de remplcer d'autres éspèces plus grandes (commes les primates non humains généralement utilisé pour les études de toxicocinétiques de ce type de composés), tout en étant plus pertinents que ces derniers. # Les études de toxicocinétiques sont les études précliniques les plus importantes pour pouvoir accéder à une première étude clinique sur l’homme pour de nouveaux candidats médicaments. Elles consistent à interpréter en parallèle les effets toxiques et l’exposition sanguine de candidats médicaments et ainsi à définir les paramètres de dose, de distribution et d’élimination qui peuvent être utilisés dans l’évaluation des risques pour l’homme. # Ce projet ce divise en trois parties distinctes: (1) Une mise au point et preuve de concept du modèle constituée d’une étude de toxicocinétique sur un médicament de référence connu, testé à une dose forte, en comparaison direct sur les différents modèles testés. Cette étape permettra de comparer les données sur l'ensemble des modèles avec leurs contrôles. (2) Des études de toxicocinétique de candidat médicament en injection unique à trois doses (faible, moyenne et haute) sur les modèles retenus lors de la preuve de concept. Cette étude sera répétable pour 3 candidats médicaments. (3) Des études de toxicocinétique de candidat médicament en injections répétées et à trois doses (faible, moyenne et haute), sur les modèles retenus lors de la preuve de concept. # L'ensemble de ces études réalisées précocement sur des modèles simples et pertinents permettront d’éviter des essais réglementaires lourds si des toxicités majeures sont identifiées précocement. Elles sont cruciales pour les médicaments comme les anticancéreux.

Bénéfices attendus

​Il s'agit ici d'un protocole de mise au point et d'utilisation de modèles de substitution à l’utilisation de primates non humains pour les études de toxicocinétiques dédiées aux composés anticancéreux dérivés d'anticorps. Les études toxicocinétiques de composés thérapeutiques sont essentielles pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine (temps de demi-vie, biodisponibilité, clairance, exposition plasmatique…), et à relier ce comportement à des effets toxiques pour établir des relations dose-effet pour prédire la toxicité chez l’humain de définir des marges de sécurité et déterminer un choix de dose dans les premiers essais cliniques chez l’homme. La mise au point de nouveaux modèles à la fois plus éthique, plus fiables et plus pertinents pour préparer au mieux une phase clinique chez l’homme est une priorité mondiale, récemment annoncées par les autorités de controle des médicaments. Les modèles murins testés ici permettront, non seulement de substituer l’utilisation de primates non humains pour les études de toxicocinétiques dédiées à ce type de composés, mais également de leur être supérieur en matière de pertinence (modèles porteurs de tumeur) et de calcul des doses cliniques (modèle humanisé pour le récepteur aux anticorps), constituant ainsi une avancée majeure dans le respect des 3R dédiés aux thérapies anticancéreuses dérivées d’anticorps.

Procédures

Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions, (4) mesures tumorales et (5) anesthésies fixes ou gazeuses. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors: (a) de la greffe tumorale, (b) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue des candidats médicament, et (c) de chacun des prélèvements sanguins. # Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. # Un prélèvement de sang terminal, sera pratiqué sous anesthésie et analgésie générale sans réveil pouvant durer plusieurs minutes.

Impact sur les animaux

​​# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions, (4) mesures tumorales et (5) anesthésies fixes ou gazeuses. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors: (a) de la greffe tumorale, (b) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue des candidats médicament, et (c) de chacun des prélèvements sanguins. # Les souris ayant des tumeurs atteignant les points limites seront mises à mort. # S’agissant d’une expérience de tolérance, les candidats médicaments peuvent induire des évènements indésirables en cas de surdosage (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, neutropénie, diarrhées, perte de poils…). Ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes). Il est à noter que ces études ne sont pas conditionnées à une atteinte de la dose maximale tolérée chez l'animal, la dose maximale de cette étude étant plafonnée à une dose considérée comme la mieux tolérée en clinique pour cette classe thérapeutique. # Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. # Un prélèvement de sang terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiqué sous anesthésie et analgésie générale sans réveil pouvant durer plusieurs minutes.

Devenir

# La majorité des animaux entrés en experience, seront euthanasiés après un prélèvement sanguin terminal (sous anesthésie/analgésie générale, profonde et sans réveil), pour permettre une étude toxicocinétique du composé dans le sang, une numération, formulation sanguine, une chimie du sang, une étude de biomarqueurs plasmatiques et des prélèvements d'organes. # Les animaux non entrés en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à celui désiré, tumeur inadéquate...), seront reformées pour entraînement aux gestes techniques permettant la formation du personnel ou pouront etre réutilisés dans d'autres experiences sur décision vétérinaire.

Remplacement

Les analyses hors organisme vivant de ces candidats médicaments ont déjà été effectuées avec succès avant de passer à une étude toxicocinétique. A cette étape, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. Ainsi, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle vivant. En revanche, ce projet consiste à mettre au point un modèle de substitution de l’espèce utilisée (essentiellement primate non humain pour ces types de composés), par une espèce rongeur humanisée ou non, et/ou porteuse de tumeur, afin d’être le plus transposable et pertinent possible par rapport aux futures études clinique sur l’humain . Les études toxicocinétiques de composés thérapeutiques sont essentielles pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine et à relier ce comportement à des effets toxiques pour établir des relations dose-effet pour prédire la toxicité chez l’humain, de définir des marges de sécurité et de déterminer un choix de dose dans les premiers essais cliniques chez l’homme. La mise au point de nouveaux modèles à la fois plus éthique, plus fiables et plus pertinents pour préparer au mieux une phase clinique chez l’homme est une priorité mondiale. Les modèles murins testés ici permettront, non seulement de substituer l’utilisation de primates non humains pour les études de toxicocinétiques dédiées à ce type de composés, mais également de leur être supérieur en matière de pertinence et de calcul des doses cliniques, constituant ainsi une avancée majeure dans le respect des 3R dédiés aux thérapies anticancéreuses dérivées d’anticorps.

Réduction

# Une première étude de mise au point et de preuve de concept permettra (1) de valider le nombre d'animaux nécessaire par modèle et (2) de déterminer quels sont les modèles les plus adéquats pour les études suivantes. # Le nombre d’animaux par groupe est en accord avec la guideline de l’agence européenne du médicament, et nos connaissances sur cette classe thérapeutique : - Pour l’étude de tolérance, 4 à 5 animaux par groupe et par sexe sont considérés comme le nombre minimum à la fois nécessaires et suffisants. - Pour l’étude de toxicocinétique, les prélèvements par micro-échantillonnage seront privilégiés. Ce procédé permettra d’avoir autant que possible l’ensemble des valeurs provenant d’un même animal, augmentant ainsi l’homogénéité et la fiabilité des résultats permettant la réduction du nombre d’animaux. # Des méthodes statistiques adaptées aux petits nombres seront utilisées augmentant ainsi considérablement la significativité et la pertinence de ces statistiques, permettant la réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux (jusqu’à 5 par cage et jamais isolés) dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté et un enrichissement de l’environnement. Les souris seront acclimatées pendant une période minimale de 5 jours. Les souris dépourvues de système immunitaire ne seront pas infectées du fait du fait du statut sanitaire préservé de l'animalerie et des manipulations et hébergement en conditions asceptiques. Selon les modèles, une greffe tumorale dans le tissu mammaire sera préférée car plus homogène et moins sujette aux nécrose. Chaque nouvel essai de dose sera séparé du précédent de 1 à 2 semaines, ce qui permettra de ne pas passer à la dose supérieure si une dose toxique est trouvée précocement. Les animaux seront suivis quotidiennement ainsi qu’à chaque geste expérimental. Les animaux seront pesés et leurs tumeurs mesurées (si nécessaire) minimum 2 fois par semaine. Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, incluant une surveillance physiologique et comportementale, permettra d'éviter la souffrance des animaux. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux le week-end et les jours fériés. Les prélèvements sanguins seront effectués préférentiellement par micro-échantillonnage sans jamais dépasser les doses recommandées. # Un prélèvement de sang terminal sera pratiqué sous anesthésie et analgésie générale sans réveil.

Choix des espèces

Les études de toxicocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. ​​Les animaux seront des souris femelles et/ou mâles en fonction des besoins de l’étude. Ils seront livrés à partir de 7 à 8 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une toxicocinétique physiologiquement pertinente.