Recherche appliquée

40 mini-porcs sont utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour la seconde moitié d'un projet déclaré sur deux établissements. Après implantation de tumeurs cérébrales humaines, chaque animal enchaîne une chirurgie et une imagerie sous anesthésie de trois heures au plus, quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, puis deux examens TEP sous anesthésie de quatre heures au plus, l'intubation et la pose d'un cathéter dans une veine de l'oreille venant après une injection intramusculaire de 10 mL décrite comme douloureuse. Le cerveau et les tumeurs sont prélevés après la mise à mort pour caractériser l'expression de l'enzyme ciblée. Sur le remplacement, le porteur écarte organoïdes et organ-on-chip au motif qu'ils modélisent incomplètement les interactions étudiées, et affirme que "L'utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats".

Objectifs

Les mutations de l'enzyme d’isocitrate déshydrognéase (IDH) constituent un marqueur majeur chez certaines tumeurs cérébrales de l’adulte. Leur diagnostic repose actuellement sur une biopsie cérébrale invasive lourde. De plus, la distinction entre progression tumorale et inflammation après radiothérapie demeure difficile. Ce projet sera réalisé sur deux établissements et vise à développer et évaluer des radiotraceurs ciblant spécifiquement cette enzyme IDH mutée afin d’améliorer le diagnostic et le suivi non invasif de ces tumeurs cérébrales. L’évaluation sera réalisée chez le porc immunodéficient porteur de greffes de tumeurs cérébrales IDH mutées issues de prélèvement de patients. Cette phase expérimentale sera conduite sur l'établissement n° 1. Les radiotraceurs seront caractérisés in vivo par imagerie nucléaire au sein de l'établissement n° 2.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront la validation d’un nouvel outil en neuro-oncologie pour l’exploration des gliomes car, à l’heure actuelle, aucun examen non-invasif n’est suffisamment spécifique et sensible. L’étude préclinique fournira des informations essentielles pour la poursuite d’un radiotraceur candidat vers un passage à l’Homme. Le radiotraceur pourra ensuite plus largement être proposé pour d’autres études cliniques ou précliniques à l’ensemble de la communauté scientifique s’intéressant à la thématique. A long terme, l’objectif ultime serait d’avoir, pour les patients, un examen d'imagerie médicale non-invasif permettant à la fois le diagnostic, l’évaluation de l’éligibilité au traitement, le suivi d’efficacité et la détection de rechute. Enfin, les données acquises lors de cette étude permettront alors d'obtenir des financements pour une études chez l'Homme.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale et une analyse d’imagerie : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 3h, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. Cette longue procédure permet d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des prises de sang seront effectuées 1-2 fois par semaine sous anesthésie avec une durée environ 2 minutes (total de prélèvements de sang = 4). Dans un second temps, deux examens d'imagerie nucléaire seront réalisés sous anesthésie, dont la durée sera plafonnée à 4h, avec injection de radiotraceur.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la chirurgie et à la période postopératoire. Il s’agit plus précisément de : - stress de l’anesthésie, hypothermie ; - hémorragique puis possible œdème cérébral au niveau du cerveau pendant la chirurgie ; - la douleur modérée en postopératoire ; - risque d’infection au niveau des points de sutures. La principale nuisance attendue sur la partie d’hébergement : développement des signes cliniques de déficits neurologiques focaux. Pour les prélèvements (sang) : stress de l’anesthésie, légère douleur possible. Une surveillance des paramètres comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter les complications inattendues. Lors du premier examen avec réveil de l’animal, le porc sera en anesthésie générale, intubé et aura un cathéter sur une veine de l’oreille. Les nuisances sont le stress lors de la prémédication et l’injection intra-musculaire d’un mélange de médicaments d’anesthésies sans contention de l’animal. La nuisance provient de la piqûre, ainsi que de la douleur générée par l’injection du mélange (volume de 10 mL). La procédure se poursuit par la mise en place d’un cathéter dans une veine périphérique du pavillon de l’oreille après administration de la prémédication sédative. A partir de cette étape, l’animal est maintenu sous anesthésie générale profonde. Un défaut d’anesthésie générale pourrait être source de nuisances et avoir comme effets indésirables : myoclonies, mouvements respiratoires spontanés, lutte contre le respirateur, étirement ou agitation des membres, hypertension.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau et les tumeurs sur lesquels des examens in-vitro histopathologiques seront réalisés afin de caractériser notamment le niveau d’expression IDH dans les tumeurs.

Remplacement

Le projet et la procédure utilisée ont été choisis après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons étudier le devenir des traceurs dans les tissus. Nous avons donc besoin des organes entiers dans leur environnement ainsi que d’une circulation sanguine efficace pour assurer la biodistribution du traceur dans l’organisme. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP-IRM) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants car les interactions physiopathologiques sont incomplètement modélisées par les systèmes in vitro (organoïdes, organ-on-chip). Les équipements d’imagerie (TEP-IRM) sont adaptés au porc. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celles obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’homme.

Réduction

Chaque animal sera utilisé au cours de plusieurs séances d’imagerie. Ce suivi longitudinal permet de suivre des modifications structurales et fonctionnelles sans avoir à mettre à mort les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de s'affranchir de la variabilité structurale d'un animal à un autre. Il n’existe pas de test de puissance disponible pour déterminer le nombre optimal d’animaux, car il s’agit de nouveaux radiotraceurs dont les caractéristiques ne sont pas encore connues. Par contre, l’étude réalisée pourra servir de base pour les tests de puissance de projets futurs utilisant ce même radiotraceur. Les données seront analysées au fur et à mesure et dès que les paramètres attendus seront obtenus, le protocole s’arrêtera. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés par radiotraceur (n=8) est un maximum. Par exemple, si les paramètres attendus sont jugés non atteignables (e.g. pas de pénétration intracérébrale du traceur), la procédure s’arrêtera immédiatement. Les modalités d’imagerie in vivo ont l’avantage de permettre un suivi longitudinal des animaux, diminuant ainsi leur nombre, chaque animal qui entrera en campagne d’expérimentation aura 3 examens d’imagerie (une IRM et deux TEP).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. La surveillance est renforcée durant la période post-opératoire et en cas d’apparition de troubles. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Lors des examens d’imagerie, l’animal sera sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée à ce type procédure, permettant à l'animal de ne ressentir aucune douleur. Le cerveau sera prélevé pour alimenter une collection de données en cas de validation d’un radiotraceur candidat et réaliser des caractérisations in vitro de la tumeur.

Choix des espèces

Le porc est le modèle non-primate le plus proche de l'Homme, à la fois anatomiquement et physiologiquement. En effet, la taille de son cerveau est compatible avec la résolution de la caméra sur laquelle seront réalisés les examens d'imagerie et son organisation neurochimique est proche de celle de l’Homme, ce qui favorise l’aspect translationnel du projet. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car l'injection des tumeurs doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés.

Porteurs de greffes de tumeurs cérébrales issues de prélèvements de patients, 40 mini-porcs immunodéficients sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit une chirurgie cérébrale et une imagerie sous anesthésie plafonnées à trois heures, quatre prises de sang sous anesthésie, puis deux examens d'imagerie nucléaire sous anesthésie plafonnés à quatre heures, avec un risque d'hémorragie et d'œdème cérébral pendant la chirurgie. L'objectif affiché est de valider un radiotraceur permettant de repérer sans biopsie une mutation présente dans certaines tumeurs cérébrales, et le porteur ajoute que les données acquises permettront d'"obtenir des financements" pour une étude chez l'humain. Il justifie le choix de l'espèce par la taille du cerveau, compatible avec la résolution de la caméra, et par une organisation neurochimique proche de celle de l'humain.

Objectifs

Les mutations de l'enzyme d’isocitrate déshydrognéase (IDH) constituent un marqueur majeur chez certaines tumeurs cérébrales de l’adulte. Leur diagnostic repose actuellement sur une biopsie cérébrale invasive lourde. De plus, la distinction entre progression tumorale et inflammation après radiothérapie demeure difficile. Ce projet sera réalisé sur deux établissements et vise à développer et évaluer des radiotraceurs ciblant spécifiquement cette enzyme IDH mutée afin d’améliorer le diagnostic et le suivi non invasif de ces tumeurs cérébrales. L’évaluation sera réalisée chez le porc immunodéficient porteur de greffes de tumeurs cérébrales IDH mutées issues de prélèvement de patients. Cette phase expérimentale sera conduite sur l'établissement n° 1. Les radiotraceurs seront caractérisés in vivo par imagerie nucléaire au sein de l'établissement n° 2.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront la validation d’un nouvel outil en neuro-oncologie pour l’exploration des gliomes car, à l’heure actuelle, aucun examen non-invasif n’est suffisamment spécifique et sensible. L’étude préclinique fournira des informations essentielles pour la poursuite d’un radiotraceur candidat vers un passage à l’Homme. Le radiotraceur pourra ensuite plus largement être proposé pour d’autres études cliniques ou précliniques à l’ensemble de la communauté scientifique s’intéressant à la thématique. A long terme, l’objectif ultime serait d’avoir, pour les patients, un examen d'imagerie médicale non-invasif permettant à la fois le diagnostic, l’évaluation de l’éligibilité au traitement, le suivi d’efficacité et la détection de rechute. Enfin, les données acquises lors de cette étude permettront alors d'obtenir des financements pour une études chez l'Homme.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale et une analyse d’imagerie : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 3h, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. Cette longue procédure permet d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des prises de sang seront effectuées 1-2 fois par semaine sous anesthésie avec une durée environ 2 minutes (total de prélèvements de sang = 4). Dans un second temps, deux examens d'imagerie nucléaire seront réalisés sous anesthésie, dont la durée sera plafonnée à 4h, avec injection de radiotraceur.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la chirurgie et à la période postopératoire. Il s’agit plus précisément de : - stress de l’anesthésie, hypothermie ; - hémorragique puis possible œdème cérébral au niveau du cerveau pendant la chirurgie ; - la douleur modérée en postopératoire ; - risque d’infection au niveau des points de sutures. La principale nuisance attendue sur la partie d’hébergement : développement des signes cliniques de déficits neurologiques focaux. Pour les prélèvements (sang) : stress de l’anesthésie, légère douleur possible. Une surveillance des paramètres comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter les complications inattendues. Lors du premier examen avec réveil de l’animal, le porc sera en anesthésie générale, intubé et aura un cathéter sur une veine de l’oreille. Les nuisances sont le stress lors de la prémédication et l’injection intra-musculaire d’un mélange de médicaments d’anesthésies sans contention de l’animal. La nuisance provient de la piqûre, ainsi que de la douleur générée par l’injection du mélange (volume de 10 mL). La procédure se poursuit par la mise en place d’un cathéter dans une veine périphérique du pavillon de l’oreille après administration de la prémédication sédative. A partir de cette étape, l’animal est maintenu sous anesthésie générale profonde. Un défaut d’anesthésie générale pourrait être source de nuisances et avoir comme effets indésirables : myoclonies, mouvements respiratoires spontanés, lutte contre le respirateur, étirement ou agitation des membres, hypertension.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau et les tumeurs sur lesquels des examens in-vitro histopathologiques seront réalisés afin de caractériser notamment le niveau d’expression IDH dans les tumeurs.

Remplacement

Le projet et la procédure utilisée ont été choisis après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons étudier le devenir des traceurs dans les tissus. Nous avons donc besoin des organes entiers dans leur environnement ainsi que d’une circulation sanguine efficace pour assurer la biodistribution du traceur dans l’organisme. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP-IRM) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants car les interactions physiopathologiques sont incomplètement modélisées par les systèmes in vitro (organoïdes, organ-on-chip). Les équipements d’imagerie (TEP-IRM) sont adaptés au porc. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celles obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’homme.

Réduction

Chaque animal sera utilisé au cours de plusieurs séances d’imagerie. Ce suivi longitudinal permet de suivre des modifications structurales et fonctionnelles sans avoir à mettre à mort les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de s'affranchir de la variabilité structurale d'un animal à un autre. Il n’existe pas de test de puissance disponible pour déterminer le nombre optimal d’animaux, car il s’agit de nouveaux radiotraceurs dont les caractéristiques ne sont pas encore connues. Par contre, l’étude réalisée pourra servir de base pour les tests de puissance de projets futurs utilisant ce même radiotraceur. Les données seront analysées au fur et à mesure et dès que les paramètres attendus seront obtenus, le protocole s’arrêtera. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés par radiotraceur (n=8) est un maximum. Par exemple, si les paramètres attendus sont jugés non atteignables (e.g. pas de pénétration intracérébrale du traceur), la procédure s’arrêtera immédiatement. Les modalités d’imagerie in vivo ont l’avantage de permettre un suivi longitudinal des animaux, diminuant ainsi leur nombre, chaque animal qui entrera en campagne d’expérimentation aura 3 examens d’imagerie (une IRM et deux TEP).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. La surveillance est renforcée durant la période post-opératoire et en cas d’apparition de troubles. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Lors des examens d’imagerie, l’animal sera sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée à ce type procédure, permettant à l'animal de ne ressentir aucune douleur. Le cerveau sera prélevé pour alimenter une collection de données en cas de validation d’un radiotraceur candidat et réaliser des caractérisations in vitro de la tumeur.

Choix des espèces

Le porc est le modèle non-primate le plus proche de l'Homme, à la fois anatomiquement et physiologiquement. En effet, la taille de son cerveau est compatible avec la résolution de la caméra sur laquelle seront réalisés les examens d'imagerie et son organisation neurochimique est proche de celle de l’Homme, ce qui favorise l’aspect translationnel du projet. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car l'injection des tumeurs doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés.

Une chirurgie de 45 minutes implante des cellules tumorales dans le cerveau de souris, suivie de trois mois de traitement, avec jusqu'à trois administrations par jour, douze séances d'imagerie sous anesthésie et six prélèvements sanguins en 24 heures. 7 320 souris, immunocompétentes ou immunodéprimées, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente le suivi par imagerie comme une méthode "non invasive pour l'animal et sans douleur", alors qu'il décrit par ailleurs l'injection du substrat bioluminescent et la contention comme pouvant "générer du stress et de la douleur légère". Toutes sont mises à mort en fin d'étude pour prélever le sang, la tumeur et d'autres organes, échantillons qui pourront servir à des études ultérieures.

Objectifs

Les glioblastomes sont des cancers du cerveau dont l’incidence augmente avec l’âge mais qui sont également décrits chez l’enfant et l’adolescent. Ces tumeurs se forment à partir des cellules gliales, des cellules qui soutiennent et protègent les neurones dans le cerveau. Il existe trois types de gliomes : l'astrocytome, l'épendymome et l'oligodendrogliome. Le glioblastome représente la forme la plus agressive ; il correspond à l'évolution d'un astrocytome vers un stade de malignité avancé. Le pronostic de ces cancers reste difficile, et leur localisation dans le cerveau rend l'accès à la tumeur particulièrement complexe pour les médecins. Le traitement actuel repose sur trois approches, chirurgicale pour retirer la plus grande partie possible de la tumeur, radiothérapie, et pour certaines tumeurs, chimiothérapie. L'opération seule guérit rarement le patient et d'autres traitements sont souvent nécessaires. Ces raisons nous poussent à nous consacrer au développement de solutions thérapeutiques innovantes. Notre projet vise à évaluer de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. Le cerveau est protégé par la barrière hémato-encéphalique (BHE), un mécanisme physiologique qui restreint l'accès de nombreuses substances présentes dans le sang au tissu cérébral dans le but de le préserver. Afin de reproduire fidèlement cette contrainte, nous implantons les cellules tumorales dans le cerveau de souris, par voie chirurgicale. Cette approche permet de recréer la tumeur dans son environnement d'origine et d'en respecter les spécificités biologiques. L'efficacité des traitements à évaluer est mesurée par bioluminescence, une technique d'imagerie de haute précision permettant de détecter des tumeurs invisibles à l'œil nu. Un suivi hebdomadaire et un suivi clinique quotidien est instauré pour suivre l'évolution tumorale durant 3 mois. En parallèle, nous effectuons des analyses sanguines pour identifier des biomarqueurs et réalisons des prélèvements d'organes en fin d'étude afin de confirmer que les molécules modulent effectivement leurs cibles thérapeutiques. Nous testons ces médicaments en monothérapie ou en association avec les chimiothérapies, en optimisant les dosages et la fréquence d'administration. Notre objectif ultime est d'obtenir une régression tumorale partielle ou totale en développant de nouveaux médicaments efficaces, tout en améliorant significativement la qualité de vie des patients atteints de glioblastome.

Bénéfices attendus

Dans le processus de développement d’un nouveau candidat médicament, ce type d’étude intervient après les phases de présélection in vitro sur des lignées cellulaires et de modélisation informatique in silico. Des études sont préalablement réalisées pour caractériser la croissance tumorale et définir les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, sélection de la souche de souris, etc.) dans un autre projet que celui-ci. Ces étapes permettent également de déterminer les fenêtres thérapeutiques optimales pour chacune des lignées tumorales constituant nos modèles de pharmacologie. Dans le cadre de ce projet des greffes de tumeurs humaines ou murines sont réalisées chez des souris immunodéprimées afin d’évaluer l’impact du système immunitaire sur nos candidats médicaments sans risque de rejet de greffe mais également immunocompétentes ce qui pourra nous permettre d’évaluer des candidats médicaments sur des tumeurs humaines. L’objectif à court terme est de pouvoir tester et sélectionner les meilleurs candidats médicaments dans un contexte de passage de la barrière hématoencéphalique. Les bénéfices attendus sont : -A court terme évaluer chez la souris l’efficacité de ces candidats médicaments seuls ou en combinaison pour à moyen terme justifier les choix de dose et de candidats chez l’homme -Etablir une relation entre la quantité de candidat médicaments détecté dans le sang ou la tumeur et l’efficacité observée et ainsi mieux comprendre et exploiter les données générées -Investiguer la persistance d’efficacité du traitement après observation d’une régression tumorale. A plus long terme l’objectif est de mettre à disposition des patients une nouvelle option thérapeutique et d’améliorer leur survie après diagnostic et leur qualité de vie.

Procédures

- Chirurgie : cette chirurgie durera 45 minutes maximum par animal et sera réalisée une seule fois avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, anesthésie, protocole analgésique pré et post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Prélèvements de sang : Faible volume, tout au long de l’étude pour une durée maximale de 3 mois pendant environ 20 secondes/souris. Réalisable plusieurs fois sur un même individu (jusqu’à 6 prélèvements maximum/24h). En fonction de l’intérêt, le prélèvement de sang ou la cinétique peuvent être réitérés à 2 semaines d’intervalle, en respectant les recommandations de la structure chargée du bien-être animal (SBEA). - Imagerie sous anesthésie : Une fois par semaine, 12 fois maximum au cours de l’étude. - Administration d’un composé ou d’une association de composés au maximum 3 administrations par jour (environ 30 secondes par administration, Exceptionnellement 4 administrations/jour avec dans ce cas un suivi par la structure de bien-être animal), durée de traitement de 3 mois maximum. - Prélèvement terminal de sang réalisé sous anesthésie générale profonde en fin d’étude (une seule fois, environ 30 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut survenir lors : − de la phase chirurgicale sous anesthésie nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 45 minutes) et la phase post-opératoire : Stress et douleur modérée durant les 24 premières heures -de la phase de pousse de la tumeur (évaluée durant 90 jours maximum). Stress et douleur légère. L’évolution de la tumeur pourrait potentiellement avoir des effets neurologiques (Stéréotypie , trouble locomoteur) liés à la pousse de la tumeur et la structure cérébrale ciblée, ce qui pourrait engendrer une douleur et un stress légers. - de l’évaluation hebdomadaire par imagerie réalisée après induction d’une anesthésie gazeuse et injection du substrat bioluminescent d’une durée de 20 min à chaque mesure (Stress léger). -des injections nécessaires à l’administration de substrat bioluminescent pour chaque mesure par imagerie et d’anesthésiques et d’analgésiques lors des soins pré- péri-, post-opératoire, et également lors de la mise à mort : chaque contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent générer du stress et de la douleur légère − de l’administration répétée de candidats médicaments testés. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress et douleur modérée − des prélèvements de sang sur animal vigile. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et une douleur modérée − des signes cliniques observables associés à des effets des composés testés / candidats médicaments étudiés pendant une durée maximale de 3 mois (troubles du comportement, altération de l’état général) qui peuvent générer du stress et une douleur modérée

Devenir

A la fin de chaque étude, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes d’intérêt pour analyse selon la question scientifique posée. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacité et d’engagement de cible.

Remplacement

Ce projet a pour but l’évaluation de l’activité anti-tumorale de composés sur des tumeurs implantées par voie intracérébrale chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente. L’implantation des cellules dans le cerveau permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau présentant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. En amont de l’évaluation de l'activité vivo, une sélection in vitro sur culture de cellule sera réalisée, qui a pour objectif de vérifier le passage de la BHE. Les produits capables de passer la barrière seront sélectionnés selon leur devenir dans l’organisme pour être testés in vivo sur des modèles greffés dans le cerveau, site d’origine de la tumeur afin de vérifier leur activité sur les cellules tumorales et la cible. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les paramètres pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux et notamment la relation entre le devenir du médicament dans l’organisme et son action biologique.

Réduction

Avant d’être évalués chez l’humain, ces candidats médicaments font l'objet d'une évaluation initiale in vitro en laboratoire, avant d'être testés sur des modèles murins (souris) porteurs de tumeurs. Ces phases de pré sélection in vitro vont permettre d’identifier au préalable les molécules inhibant la cible de manière spécifique et ayant une efficacité antitumorale in vitro importante afin de ne tester in vivo que les composés prometteurs qui ont les bonnes propriétés. • L’évaluation de la capacité du composé à passer la BHE est également un critère évalué afin de restreindre les composés investigués chez l’animal au strict composé remplissant les critères de passage de la BHE. La tolerabilité de ces composés sera également un critère pris en compte afin de réduire au maximum les composés évalués et donc le nombre d’animaux. • Les conditions et cinétique de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminées au préalable dans un projet dédié et permettent de définir les conditions optimales de greffe, la fenêtre de traitement et le nombre d’animaux nécessaires dans chaque groupe après une modélisation statistique rigoureuse. • En fin d’étude, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui seront utilisés pour des études complémentaires (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Des prélèvements de fluides, organes et structures du cerveau seront réalisés également. Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • De plus, afin d’inclure dans les études toutes les souris greffées, nous utiliserons l’imagerie par bioluminescence pour randomiser les animaux, au fur et à mesure du développement de la tumeur, sur la base d’une croissance tumorale similaire permettant ainsi de maximiser le taux d'inclusion. • Le design expérimental sera revu avec le biostatisticien/pharmacocinéticien afin d’identifier notamment le nombre de souris dans chaque groupe et étude selon la lignée cancéreuse étudiée. L’objectif est d’obtenir des conclusions fiables en utilisant le nombre d’animaux le plus faible possible.

Raffinement

La procédure de greffe dans le cerveau est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. • Les souris seront replacées en hébergement groupé après la chirurgie après leur réveil. • Mise en place d’un gel alimentaire nutritif préventif systématiquement 3 à 5 jours avant la chirurgie pour habituation des animaux à cet aliment pour une meilleure prise en post chirurgie et tout au long de l’étude. • L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude via l’utilisation d’une grille de scoring par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe d’altération de l’état général de l’animal, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la structure de bien-être des animaux et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement pourra permettre de suivre, au cours de l'étude, d’éventuelles altérations de l’activité cumulée des souris dans une cage. Avec ce système l’analyse des résultats fournira une meilleure documentation des modèles et du bien-être des animaux mais également des réponses aux médicaments. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans avoir à euthanasier les animaux à chaque temps de mesure.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe dans le site initial de développement du cancer, donc ici dans le cerveau chez la souris, est couramment utilisée dans les études précliniques visant à étudier les cancers du cerveau. La souris constitue en effet un modèle de choix grâce à l’accessibilité pour l’implantation des tumeurs et la maturité précoce du cerveau murin. Les animaux utilisés seront des souris immunocompétentes ou immunodéprimées pour permettre la prise de greffe de cellules humaines d’intérêt. Le phénotype dommageable lié à l’absence génétique de système immunitaire de ces dernières est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie du fait de l’atteinte d’un poids corporel suffisant pour la récupération post opératoire et de la maturité cérébrale adaptée.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, condition qui permet la prise de greffe des tumeurs et les expose à un risque infectieux accru que le porteur dit surveiller. 256 souris âgées de six semaines reçoivent une injection de cellules tumorales de carcinome de Merkel sous anesthésie gazeuse, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Suivent deux injections de la thérapie cellulaire testée à une semaine d'écart, des mesures de tumeur au pied à coulisse et des pesées deux à trois fois par semaine, deux prélèvements sanguins et deux examens IRM, sur 45 jours au plus. Toutes sont mises à mort à l'issue, le porteur indiquant que le maintien en vie est impossible du fait de la tumeur induite et que les tumeurs et les organes lymphoïdes doivent être prélevés.

Objectifs

Le carcinome de Merkel est un cancer cutané rare et agressif. Son incidence est en augmentation. Les facteurs de risque de survenue sont : l'âge, la peau claire, le sexe masculin et les antécédents d'immunodépression. 50% des patients ne répondent pas aux traitements les plus récents. Nous avons développé in vitro un traitement par thérapie cellulaire destiné à soigner ce cancer. Nous avons besoin d’étudier l’effet de ces traitements dans un modèle de tumeur chez la souris. Pour cela, nous allons induire chez la souris des tumeurs de carcinome de Merkel, puis injecter aux souris la thérapie cellulaire, en la comparant au traitement de référence actuel. Cette étape est indispensable pour vérifier l'efficacité et la sécurité du traitement avant toute utilisation chez l'être humain.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de déterminer si cette nouvelle thérapie cellulaire pourrait constituer une option thérapeutique pour les patients atteints de carcinome de Merkel. Les résultats obtenus chez l'animal sont nécessaires pour constituer le dossier réglementaire permettant de demander l'autorisation de réaliser un premier essai clinique chez l'homme.

Procédures

Chaque souris recevra au jour 0 une injection de cellules tumorales, sous anesthésie gazeuse. La procédure dure environ 30 secondes. Si la phase de validation est concluante, les animaux de la phase thérapeutique recevront deux injections d’une minute environ, à une semaine d’écart, sous anesthésie gazeuse, vers J14. Les animaux feront également l’objet de mesures régulières : suivi tumoral au pied à coulisse (deux à trois fois par semaine) et pesées (deux à trois fois par semaine), sans anesthésie. Des prélèvements sanguins seront réalisés à J14 et J30 sous anesthésie gazeuse, pour analyses biologiques. Ils dureront environ 20 secondes. Enfin, deux examens IRM seront effectués à J14 et J30 sous anesthésie, pour une durée de 20 à 40 minutes. L’ensemble des procédures s’étend sur une période maximale de 45 jours, avec une surveillance clinique régulière.

Impact sur les animaux

Les nuisances anticipées dans le cadre de ce protocole comprennent un stress lié aux manipulations répétées (mesures tumorales, pesées, injections), ainsi qu’une douleur légère et transitoire associée aux injections sous-cutanées et intraveineuses. La croissance tumorale progressive peut entraîner une tension cutanée locale. Compte tenu du statut immunodéprimé des souris, un risque infectieux accru est également pris en considération et fera l’objet d’une surveillance attentive.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés. Le maintien en vie n’est pas possible en raison de la tumeur induite ; de plus, les tumeurs et les organes lymphoïdes seront prélevés pour réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Conformément au principe de remplacement, les thérapies cellulaires développées dans ce projet font l’objet d’une évaluation préalable in vitro, incluant des tests de cytotoxicité, d’activation et de phénotypage des sous-populations lymphocytaires. Toutefois, l’évaluation in vivo demeure indispensable pour appréhender des paramètres biologiques qui ne peuvent être reproduits en culture cellulaire, notamment la vascularisation tumorale, l’infiltration immune au sein du microenvironnement tumoral et la cinétique tumorale systémique. À ce jour, aucun modèle alternatif in vitro ou in silico ne permet de restituer l’ensemble de ces interactions complexes, justifiant le recours à un modèle murin pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le principe de réduction est appliqué à travers une stratégie expérimentale structurée visant à limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Le projet repose sur un design séquentiel de type go/no-go : la phase thérapeutique n’est engagée qu’après validation préalable de la prise tumorale, ce qui évite l’utilisation d’animaux supplémentaires en cas d’échec initial du modèle. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’un calcul statistique préalable intégrant l’effet attendu, la variabilité estimée et la puissance souhaitée, afin de ne pas exposer plus d’animaux que nécessaire. Par ailleurs, la randomisation des animaux est réalisée après homogénéisation des volumes tumoraux, ce qui permet de réduire la variabilité intergroupe et d’optimiser la puissance statistique. Enfin, la définition d’un endpoint principal unique limite les comparaisons multiples et contribue à rationaliser l’effectif expérimental.

Raffinement

Le principe de raffinement est intégré à l’ensemble du protocole afin de réduire au maximum la contrainte et la souffrance potentielle des animaux. Les injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Un tapis chauffant et du gel oculaire sont utilisés pour améliorer le confort de l'animal. Une grille de score clinique standardisée est appliquée tout au long de l’étude, avec une surveillance renforcée et une euthanasie anticipée dès qu’un critère d’endpoint humanitaire est atteint. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé et expérimenté afin de limiter la durée et la répétition des gestes techniques. Les conditions d’hébergement participent également au raffinement. Les souris sont maintenues environnement contrôlé et stable. Un enrichissement du milieu est mis en place afin de favoriser l’expression de comportements naturels et de réduire le stress : ajout de matériaux de nidification (papier, coton compressé), abris ou tunnels, ainsi que structures favorisant l’exploration. Les animaux sont hébergés en groupe lorsque leur état clinique le permet, afin de préserver les interactions sociales. En cas d’altération de l’état général ou de nécessité vétérinaire, un isolement temporaire peut être instauré. L’ensemble de ces mesures vise à améliorer les conditions de vie des animaux et à minimiser l’impact des procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les modèles immunodéficients permettant la prise de greffe tumorale sont disponibles chez la souris. Les animaux utilisés dans ce projet sont des souris adultes jeunes, âgées de six semaines au moment de leur inclusion dans l’étude. Ce stade de développement correspond à la fin de la période juvénile et au début de l’âge adulte, lorsque la croissance somatique est stabilisée et que les paramètres physiologiques sont matures. Le choix de ce stade présente plusieurs avantages scientifiques et éthiques. D’une part, il garantit une meilleure homogénéité des animaux en termes de poids, de développement immunologique et de capacité de cicatrisation, ce qui contribue à réduire la variabilité expérimentale. D’autre part, l’utilisation d’animaux jeunes adultes permet d’éviter les contraintes associées aux stades néonataux ou sénescents, qui sont plus vulnérables aux stress expérimentaux et aux déséquilibres physiologiques.

Tous tués à l'issue pour que leurs yeux soient prélevés et analysés, 9 ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une injection de vecteur lentiviral sous la rétine, sur un œil ou sur les deux, puis quatre à seize séances d'anesthésie de une à quatre heures, espacées de une à deux semaines. Le porteur indique que l'injection devrait provoquer un léger traumatisme de l'œil et peut entraîner une hémorragie localisée, et que des effets plus graves, décollement rétinien ou endophtalmie, peuvent être attendus, avec douleur, photophobie, hausse de la pression intraoculaire et baisse de l'acuité visuelle. Il écrit s'entraîner à l'injection sur des ouistitis mis à mort dans d'autres projets, et affirme qu'aucun dispositif in vitro ne reproduit la fovéa et la macula, structures absentes chez les rongeurs.

Objectifs

Les dystrophies rétiniennes génétiques sont des maladies des yeux qui font perdre la vue précocement et ont un impact socio-économique important. La thérapie génique est la solution la plus prometteuse pour soigner ces maladies. Elle consiste à remplacer un gène défectueux par un nouveau gène. Pour cela, on utilise un « vecteur » qui transporte le nouveau gène jusqu'aux cellules de la rétine. L'objectif de cette étude est de tester un nouveau type de vecteur pour améliorer l’efficacité de la thérapie génique de la rétine. Actuellement, il n'y a qu'une thérapie génique pour une maladie des yeux concernant un gène unique (nommé « RPE65 »). Mais il n’est pas possible d’utiliser cette thérapie pour toutes les maladies des yeux d'origine génétique, car les méthodes actuelles ne peuvent pas manipuler des gènes de trop grande taille. La technologie utilisée ici permet de transférer des gènes de toute taille, et serait donc applicable à toutes les maladies rétiniennes. Le gène qui sera utilisé dans cette expérience est de grande taille et ses mutations sont responsables de la plus fréquente maladie génétique de la rétine : la maladie de Stargardt. Des essais cliniques sont en cours concernant cette maladie, cependant les vecteurs utilisés sont inefficaces. Notre projet vise donc à utiliser une nouvelle technologie pour augmenter significativement l’efficacité de la thérapie. Des tests sur la souris avec ce vecteur ont montré une augmentation d’efficacité de ~5 % à ~90 % dans les photorécepteurs, comparé aux thérapies géniques préexistantes. Nous voulons maintenant vérifier si le système fonctionne de la même manière chez les primates non-humain. Nous allons d'abord regarder le taux d’intégration du gène dans les cellules de la rétine, puis nous vérifierons si le fonctionnement de la rétine est modifié après l’intervention.

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus sur les primates non humains sont aussi concluants que ceux observés sur les souris, cela pourrait représenter une avancée majeure pour l’utilisation de ce vecteur chez l’homme, notamment pour les mutations du gène testé dans cette étude, mais aussi pour d’autres gènes responsables des maladies rétiniennes génétiques. Les vecteurs classiquement utilisés, appelés adenoassociated virus (AAV) sont couramment utilisés pour cibler la rétine en raison de leur affinité naturelle pour l'œil. Toutefois, un inconvénient majeur des AAV réside dans leur capacité de charge limitée (taille du matériel génétique), ce qui restreint leur application aux gènes de petite taille. Cette contrainte empêche le développement de traitements pour les nombreuses maladies rétiniennes génétiques causées par des gènes volumineux. Les vecteurs lentiviraux (lentivirus, LV), en raison de leur capacité de charge nettement plus grande, représentent une solution prometteuse. Un autre avantage des lentivirus réside dans la faible réaction inflammatoire qu’ils induisent. Ainsi, ils constituent une option prometteuse pour les thérapies géniques rétiniennes, surmontant les limitations des AAV et offrant de nouvelles perspectives pour traiter de nombreuses maladies rétiniennes génétiques.

Procédures

1 intervention pour des injections sous-rétiniennes de 1 à 4 heures, 4 à 16 sessions d'anesthésie de 1 à 4 heures: il s'agira donc d'anesthésies répétées à 1-2 semaines d'intervalles.

Impact sur les animaux

Le gène lié à cette étude code pour une protéine qui intervient dans le transport de dérivés de la vitamine A au travers la rétine. Une surexpression temporaire de cette protéine chez un animal sain ne causera donc aucun phénotype dommageable mais cette protéine non native pourrait créer une réponse immunitaire inflammatoire. L'injection sous-rétinienne sera effectuée par un chirurgien ophtalmologue. Elle devrait provoquer un léger traumatisme localisé de l'œil, potentiellement une hémorragie localisée. Des effets indésirables plus graves, tels qu’un décollement rétinien ou une endophtalmie, peuvent être attendus, entraînant douleur, photophobie, rougeur, augmentation de la pression intraoculaire et une baisse de l'acuité visuelle. Réponse inflammatoire au vecteur viral : ils sont connus pour déclencher une réponse immune innée et adaptative. Une inflammation locale peut être attendue, généralement transitoire entre ~24-72 heures après la dose. Les signes cliniques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, une fermeture persistante des yeux, une difficulté avec les mouvements oculaires et une augmentation de la pression intraoculaire. Réponse inflammatoire au transgène : L'expression du gène d'intérêt est attendue environ 2 à 3 semaines après l'administration. Cette expression pourrait entraîner une réponse immunitaire anti-transgène. Notre vecteur codera pour le gène natif du tamarin. La production de la protéine transgénique pourrait entraîner une inflammation locale. Les signes cliniques typiques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, la fermeture des yeux, des difficultés avec les mouvements oculaires (de façon similaire à la réponse immunitaire au vecteur viral). Enfin il nous faut mentionner le stress lié à la préhension et aux anesthésies répétées que subiront les animaux.

Devenir

Pour la seule procédure, tous les animaux seront euthanasiés à la fin car les yeux doivent être extraits pour l'analyse physiopathologique.

Remplacement

Les aspects de la technologie qui ne nécessitent pas de modèles de primates non-humains (PNH) in vivo ont été développés à l'aide de méthodes in vitro (organoïdes rétiniens humains) et testés par administration chez la souris. Cependant, il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de simuler l'impact de l'efficacité de la transduction sur l'architecture de l'œil, les mécanismes d'élimination de cette voie d'administration, et la réponse immune innée et adaptative au vecteur. En particulier, la technologie vise à traiter des maladies rétiniennes affectant la fovéa et la macula, des structures oculaires qui ne peuvent pas être modélisées avec précision chez d'autres espèces (sans fovéa, ex : les rongeurs). C'est pourquoi les vecteurs doivent encore être évalués pour leur efficacité et leur sécurité dans des modèles animaux de grande taille avant d'être testés chez des patients humains.

Réduction

Des données préliminaires obtenues sur des organoïdes rétiniens et dans des modèles murins permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir la preuve du concept chez le ouistiti. Les doses utilisées par animal seront étalées de façon à permettre une analyse intermédiaire du tropisme du vecteur. Si la transduction du vecteur s'avère moins variable que prévu, cela pourrait permettre de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre les objectifs de cette étude. Toutefois, ces injections n'ayant jamais été testées chez les primates non humains, un risque de perte animale et/ou de problèmes liés à l'injection est à prévoir. Pour quantifier les conséquences de l’administration du composé sur le bien-être animal, nous commencerons par injecter un œil à la plus faible dose du protocole à un premier animal. Trois doses seront ensuite testées sur les deux yeux de groupes de deux animaux (n = 6). Nous estimons les risques de sortir du protocole à 20 %, ce qui correspond à 7 animaux, soit 8,4 animaux au total, arrondi à la hausse pour tenir compte de la marge d'erreur. Pour limiter encore ce nombre, nous nous entraînerons à l’injection sur des animaux mis à mort dans le cadre d'autres projets. L’approche statistique consistera à comparer, sur des tranches histologiques, le nombre de photorécepteurs présentant le transgène, en comparant « œil sain vs œil injecté » sur le premier animal, puis à comparer ce nombre en fonction des deux constructions virales chez les animaux injectés bilatéralement, et ceci en fonction des trois doses utilisées sur des groupes de deux animaux. Dans ce contexte, une simple analyse de variance permettra d’évaluer la significativité de l’augmentation de la transduction. À noter que si les premières doses s’avèrent efficaces pour prouver l’amélioration de la transduction (> 80 %), les animaux des doses supérieures ne seront pas utilisés.

Raffinement

Les doses du vecteur ont été adaptées à partir de doses bien tolérées chez d'autres modèles mammifères (souris et rats) et ne dépasseront pas celles bien tolérées lors des essais cliniques chez l’homme. Des méthodes de dosage cliniques modifiées seront utilisées pour l'administration du vecteur. Pour l’administration, la vitrectomie sera évitée afin de minimiser le risque de traumatisme rétinien. Des médicaments pour réduire la réponse immunitaire et soulager la douleur seront donnés avant, pendant et après la chirurgie afin de minimiser les risques d'inflammation et de douleur. L'administration sous-rétinienne, réalisée par un chirurgien ophtalmologue, minimise considérablement la bio-distribution du vecteur et limite la probabilité de déclencher une forte réponse immunitaire. Cette réponse ne devrait pas causer de douleur ou de détresse et se résorbera en quelques jour. La protéine générée par le transgène administré ne sera pas secrétée par les cellules rétiniennes et restera liée à la membrane interne des cellules. Ces caractéristiques devraient minimiser le risque de réponse anti-transgène. Le dosage des animaux individuels sera étalé pour surveiller les événements indésirables liés au vecteur ou au transgène, permettant ainsi des modifications des protocoles, des procédures ou des doses si besoin et si ces changements ne modifient pas les objectifs scientifiques de l'étude. En particulier, avant de l’appliquer à tous les animaux, un premier animal sera injecté sur un seul œil pour vérifier par une observation (photophobie, œil fermé, position prostré) et/ou auscultation (œil rouge et inflammé) quotidienne que le protocole ne génère pas d’impact sur le bien-être de l’animal. En cas contraire, qui reste peu probable compte tenu des mesures déjà prises, nous ajusterons la dose pour les prochains et continueront ainsi animal par animal jusqu’à trouver la bonne dose. Cette approche minimisera la douleur ou les dommages potentiels. Tous les tests ophtalmologiques et de santé seront réalisés sous anesthésie afin d'éviter le stress que cela provoquerait si l'on les réalisait à l'état éveillé. Les procédures de surveillance réalisées sous anesthésie seront exécutées de manière séquentielle pour minimiser le nombre total d'inductions requises. Les animaux seront logés par paires dans des volières adaptées enrichies de divers éléments (hamacs, tunnels, nids suspendus, perchoirs, etc.).

Choix des espèces

L'objectif principal de l'étude est d'examiner l'efficacité de transduction d'un nouveau système vectoriel destiné à des applications cliniques en thérapie génique. L'efficacité prédite de la transduction déterminera la probabilité que

7 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour que leurs organes soient collectés. Chacune peut subir jusqu'à quarante-sept prélèvements d'urine, vingt-trois prélèvements sanguins et six injections, avec un suivi allant jusqu'à douze mois. Le projet teste des transporteurs naturels censés délivrer un traitement à une population précise de cellules rénales, sur deux lignées de souris génétiquement modifiées. De ces dizaines de manipulations répétées, le porteur ne retient qu'une "douleur légère de courte durée" et un "stress léger de courte durée", et écrit que la souris en fait un "modèle de choix".

Objectifs

La maladie rénale chronique est une maladie où les reins, dont le rôle est de filtrer le sang, s’abîment lentement et silencieusement, entrainant une insuffisance rénale grave et obligeant les patients à suivre des traitements lourds et coûteux (dialyse, greffe de rein). En l’absence de traitement curatif, il est important de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour empêcher/ralentir l’évolution vers l’insuffisance rénale. Des défauts dans différentes populations de cellules rénales sont à l’origine de ces maladies. Ce projet vise à tester de nouveaux transporteurs naturels capables de délivrer un traitement directement à une population spécifique de cellules rénales défaillantes, afin de restaurer leur fonctionnement et ralentir, voire d’empêcher, la progression de la maladie. Ces transporteurs seront d’abord validés sur des cellules rénales en laboratoire, puis testés sur deux modèles de souris génétiquement modifiées pour reproduire la maladie rénale humaine. Ces souris recevront une injection de transporteurs ou du placebo à différents stades de leur vie pour évaluer l’efficacité d’un traitement préventif, précoce et tardif. L’objectif est de découvrir de nouveaux transporteurs capables d’aider à protéger, voire réparer, la population de cellules rénales malades et d’empêcher la progression vers l’insuffisance rénale grave, évitant aux patients d’avoir recours à une greffe de rein.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est d’identifier des transporteurs ayant une plus grande spécificité pour les cellules défaillantes ciblées permettant de prévenir/retarder l’évolution de la maladie dans deux modèles de souris. Les résultats obtenus valideront l’utilisation de ces transporteurs comme nouvelle approche thérapeutique pour certaines maladies rénales chroniques, permettant sur le long terme d’éviter la greffe rénale aux patients et d’espérer étendre cette approche thérapeutique à d’autres maladies rénales chroniques impliquant d’autres populations de cellules rénales.

Procédures

Prélèvement de tissu caudal (animal vigile, 1 fois, 10 secondes), prélèvements d’urines (animal vigile, 47 fois au maximum, 30 secondes), prélèvements sanguins (animal vigile ou sous anesthésie générale, 23 fois au maximum, 30 secondes), injections (animal vigile ou sous anesthésie générale, 6 fois au maximum,

Impact sur les animaux

Pour le prélèvement de tissu caudal: douleur légère et localisée de courte durée. Pour la contention : stress léger de courte durée lié à la contention manuelle ou au tube de contention. Pour les injections: douleur légère de courte durée liée à la piqûre. Pour les prélèvements sanguins: douleur légère de courte durée liée à la piqûre. Pour le prélèvement d’urines: stress léger et de courte durée lié à la préhension.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et les organes seront collectés en post-mortem pour les analyses biologiques et moléculaires.

Remplacement

Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des souris. Le rein des mammifères et son fonctionnement en conditions normales et pathologiques (maladie rénale) sont bien caractérisés chez la souris avec de nombreux modèles génétiques, et de nombreuses études ont été publiées utilisant une approche similaire avec des transporteurs naturels sur des modèles murins, ce qui en fait un modèle de choix. Ce projet s’intéresse particulièrement à une population de cellules pour laquelle il n’existe à ce jour aucun équivalent in vitro (cultures de cellules rénales). Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire adéquat, il n’est pas possible de remplacer les modèles de souris utilisés dans ce projet par des modèles cellulaires rénaux in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour les lots expérimentaux a été ajusté en prenant en compte l’expérience acquise au laboratoire sur différents modèles de souris similaires et en intégrant les données de la littérature utilisant ces transporteurs. Ce nombre correspond au nombre minimal nécessaire pour chaque expérience, qui permet à la fois d'être assuré de la reproductibilité des phénomènes observés et d’avoir la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale des modèles employés et des protocoles . Les réponses aux traitements seront étudiés à la fois sur les mâles et les femelles et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués. L’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être animal tout au long de l’étude permet de surveiller l’état général de l’animal. Ainsi, les souris seront surveillées plusieurs fois par semaine lors des pesées par les personnes en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans un environnement enrichi adapté afin de diminuer leur stress.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés pour cette espèce animale. Enfin, la souris développe des maladies rénales très semblables à celles observées chez l’homme. Pour le premier modèle (défaut rénal à la naissance), l’injection des transporteurs et du placebo sera effectuée dans les premiers jours de vie du souriceau (traitement à un stade précoce de la maladie) et les souris seront suivies jusqu’à l’âge adulte (6 mois), temps déjà étudié dans d’autres maladies rénales chroniques. Pour le second modèle (maladie rénale induite), l’induction de la maladie et l’injection des transporteurs et du placebo seront réalisées à l’âge adulte (entre 4 et 10 semaines) (traitement à des stades précoces et modérés de la maladie) et les souris suivies jusqu’à 12 mois.

Injectées une fois avec des cellules humaines de cancer du sein, sous la peau, dans la veine de la queue ou directement dans le cœur par voie percutanée, 640 souris immunodéficientes entrent dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la tumeur ou la métastase détectable, elles reçoivent jusqu'à trente-trois injections ou soixante gavages, quotidiens ou hebdomadaires selon le traitement, pendant soixante jours au maximum. Le porteur indique que les injections intracardiaques disséminent les cellules tumorales dans tout le corps et peuvent produire des métastases osseuses et cérébrales, avec douleurs et troubles neurologiques. Toutes sont mises à mort pour études sur organes post-mortem.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif constitue une forme particulièrement agressive de cancer mammaire. L’absence d’expression des récepteurs hormonaux et de la protéine HER2 limite les options thérapeutiques ciblées, rendant l’identification de nouveaux biomarqueurs et de cibles thérapeutiques cruciale pour la prise en charge des patientes. Des travaux préliminaires menés au laboratoire ont permis d’identifier deux biomarqueurs d’intérêt, dont l’expression est corrélée à la progression tumorale et au phénotype agressif de ce cancer. Nos approches in vitro ont révélé des cibles thérapeutiques potentielles liées à ces protéines, suggérant leur implication dans des voies critiques de survie et de prolifération. L’objectif principal de ce projet est de valider in vivo le rôle fonctionnel de ces biomarqueurs ainsi que l’efficacité des cibles thérapeutiques associées. Le passage au modèle animal est indispensable pour étudier ces mécanismes au sein d’un microenvironnement tumoral complexe (interactions stroma, vascularisation), ce que les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire. Plus spécifiquement, se projet vise à caractériser l’impact de la modulation des biomarqueurs d'intérêt sur la croissance tumorale et la dissémination métastatique, évaluer l’efficacité des stratégies thérapeutiques ciblant ces voies, seules ou en combinaison avec la chimiothérapie de référence, et à déterminer la valeur prédictive de ces biomarqueurs vis-à-vis de la réponse thérapeutique dans un contexte physiologique global.

Bénéfices attendus

Le cancer du sein triple négatif est le sous-type le plus agressif et le plus démuni en thérapies ciblées. La validation de l'efficacité préclinique de molécules d'intérêt (seules ou en combinaison avec le Taxol) offrira un rationnel solide pour de futurs essais cliniques. De plus, en corrélant la réponse aux traitements avec le niveau d'expression des biomarqueurs étudiés, ce projet permettra d'en évaluer la valeur prédictive. Ce projet vise ainsi à établir des preuves de concept solides en faveur de l’utilisation de ces biomarqueurs non seulement comme cibles thérapeutiques innovantes, mais aussi comme outils de stratification des patientes. Cela s'inscrit dans la perspective concrète de développer de nouvelles approches personnalisées, maximisant l'efficacité des traitements tout en limitant les toxicités inutiles pour les patientes atteintes de cancer du sein triple-négatif.

Procédures

Les souris recevront une injection unique de cellules de cancer du sein humain. Selon le but de l'étude, cette injection sera réalisée sous la peau (pour former une tumeur locale, n=1, durée 1 minute, anesthésie locale), dans une veine de la queue (n=1, durée 1 minute, anesthésie locale), ou directement dans le cœur par voie percutanée (pour étudier la dissémination des métastases, n=1, durée 1 minute, anesthésie générale). Dès que la tumeur ou la métastase sont détectables (la métastase est détectable par imagerie), les animaux recevront des traitements (chimiothérapie classique ou nouvelles molécules) administrés soit par injection (n=7 à 33, durée 1 minute, anesthésie locale), soit par voie orale (gavage, n=60 au maximum, durée 1 minute, animaux vigiles) quotidiennement ou une fois par semaine selon le traitement. L'évolution de la maladie sera évaluée deux fois par semaine en mesurant la taille des tumeurs (pied à coulisse) et des métastases (Imagerie intravitale). Durée des procédures : maximum 60 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à plusieurs procédures susceptibles d’engendrer des nuisances d’intensité variable. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie locale au niveau du flanc peut induire une douleur légère et transitoire au point d’injection. Le développement tumoral progressif est susceptible d’entraîner une gêne locomotrice, un inconfort, voire perte d'appétit modérés. Les injections intraveineuses par la veine caudale peuvent provoquer un stress lié à la contention, ainsi qu’une douleur légère et transitoire. Ces injections peuvent conduire au développement de métastases, notamment pulmonaires, susceptibles d’induire à terme une détresse respiratoire modérée. Les injections intracardiaques, réalisées sous anesthésie générale, comportent un risque de risque douleur ou d'inconfort au réveil. Elles induisent une dissémination systémique des cellules tumorales pouvant conduire à des atteintes métastatiques multiples (notamment osseuses et cérébrales), pouvant provoquer des douleurs, des troubles neurologiques et une altération de l’état général modérés. L’administration des traitements par voie intrapéritonéale et par gavage oral peut provoquer une douleur transitoire et induire un stress lié à la contention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour études sur organes post-mortem.

Remplacement

Dans cette étude, les hypothèses de travail seront au préalable validées par des expériences in vitro. Un modèle de culture en 3 dimensions (sphéroïdes) en présence de matrice extracellulaire a été spécifiquement mis au point au laboratoire. Ce modèle permet de mimer l'architecture tumorale et de se rapprocher des conditions in vivo. Ce modèle se substituera aux modèles animaux pour valider le choix des composés thérapeutiques et de leur combinaison et pour réaliser l'analyse moléculaire de la réponse au traitement. Néanmoins, les expériences in vitro ne tiennent pas compte de l'environnement complexe de la tumeur intégrée dans un organisme entier (interactions systémiques, vascularisation, métabolisme global), ce qui peut modifier significativement l'efficacité et la biodistribution du traitement. Seules les expériences in vivo permettent de valider les résultats obtenus in vitro, constituant ainsi une étape préclinique indispensable pour un éventuel transfert futur vers la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum requis pour garantir une significativité statistique et une robustesse scientifique des résultats. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé a priori sur la base de nos résultats préliminaires in vitro et de la littérature sur ces modèles précliniques. L’analyse des résultats sera réalisée à l'aide de tests statistiques appropriés pour maximiser l'exploitation des données générées. Outre l'approche statistique, la mesure de la croissance tumorale et le suivi des métastases par imagerie intravitale permettent d'obtenir des données cinétiques répétées sur le même animal. Ce suivi longitudinal permet de réduite le nombre total de souris nécessaires pour ce projet.

Raffinement

Afin de limiter au maximum les contraintes, la douleur et le stress subis par les animaux, plusieurs mesures de raffinement seront systématiquement appliquées à toutes les étapes du projet. Les procédures potentiellement douloureuses ou nécessitant une immobilité stricte (injection intracardiaque, imagerie par bioluminescence) seront réalisées sous anesthésie générale . Pour les injections répétées, une anesthésie locale sera appliquée et les sites d'injection seront alternés. Pour le gavage, des canules souples de taille adaptée seront utilisées pour éviter toute lésion œsophagienne. Les volumes administrés respecteront strictement les recommandations de bonne pratique. L'utilisation de l'imagerie intravitale constitue un raffinement majeur car elle permet un suivi interne longitudinal et non invasif de la progression métastatique. Une surveillance clinique quotidienne pour l'état général et bi-hebdomadaire pour les pesées et les mesures tumorales sera mise en place. Une euthanasie anticipée sera immédiatement pratiquée si un animal atteint l'un des points limites préalablement définis.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris, qui constitue le modèle préclinique de référence pour l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques en oncologie. L'utilisation de modèles de souris immunodéficientes garantit en outre la prise et la viabilité de la xénogreffe cellulaire sans risque de rejet et permet le suivi longitudinal de la croissance tumorale et du développement métastatique. L'âge des animaux au début des expérimentations a été spécifiquement adapté aux contraintes biologiques et techniques de chaque modèle d'étude, afin d'optimiser la réussite des procédures et de limiter le nombre d'animaux nécessaires. Pour les modèles de croissance tumorale (injections sous-cutanées), des souris âgées de 5 à 6 semaines seront utilisées. L'utilisation d'animaux jeunes à ce stade de développement physiologique et immunitaire permet d'optimiser le taux de prise de greffe tissulaire et de favoriser une cinétique de croissance tumorale homogène et reproductible. Pour les modèles de formation de métastases, des souris légèrement plus âgées, de 7 à 8 semaines, seront privilégiées. Ce choix repose sur des impératifs anatomiques et techniques, un développement corporel plus avancé étant indispensable pour faciliter la réalisation des injections intracardiaques ou intraveineuses. Cela permet d'augmenter significativement le taux de succès du geste chirurgical, de réduire le temps d'intervention sous anesthésie, et par conséquent, de minimiser les risques de complications et de mortalité per-procédure pour l'animal.