Recherche appliquée

Les souris sont tuées à partir d'une taille de tumeur fixée à l'avance, mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine. 46 souris immunodéficientes NSG vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus et des organes. Elles reçoivent une injection unique de cellules humaines de cancer du sein triple négatif sous anesthésie locale, et la tumeur qui pousse peut provoquer une gêne mécanique et une perte d'appétit. Le projet ajoute deux lignées cellulaires à un projet antérieur mené jusqu'à son terme, pour les tester dans les mêmes conditions et comparer.

Objectifs

Ce projet est la suite d'un projet déjà validé et qui a donné les résultats prévus. Nous avons depuis obtenu deux nouveaux modèles cellulaires (ajout d'un gène déficient) qui nécessitent d’être testés dans les mêmes conditions pour comparaison. Cette demande a donc pour objectif de compléter le projet précédent et renforcer l’analyse biologique associée. Parmi les différents types de cancer du sein, le cancer triple négatif (TNBC) est l’un des plus difficiles à traiter. Contrairement à d'autres formes, il ne répond pas aux traitements ciblés habituels, et la chimiothérapie y est souvent peu efficace. Ce type de cancer est donc particulièrement agressif et a un risque plus élevé de récidive ou de propagation à d’autres organes (métastases). Dans une étude menée par notre équipe, nous avons découvert qu’un certain gène, est quatre fois plus souvent altéré dans les formes avancées et métastatiques de ce cancer que dans les formes précoces. Cela nous a poussés à penser qu’il pourrait jouer un rôle dans la capacité du cancer à se propager. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons créé en laboratoire des cellules cancéreuses issues d’un cancer du sein triple négatif reproduisant cette altération génétique. Nous avons observé que ces cellules devenaient plus agressives : elles bougent plus facilement, s'accrochent moins aux autres cellules (ce qui facilite leur dispersion dans le corps), résistent mieux à certains stress, et sont capables de survivre même dans des conditions difficiles (manque de nutriments). Ces résultats suggèrent que les mutations du gène en question pourraient rendre les cellules cancéreuses plus agressives capables de former des métastases plus facilement. Le projet de départ initial comportait trois lignées cellulaires : une lignée normale et deux clones mutés pour le gène d'intérêt. Ce projet a pour objectif de rajouter deux nouveaux modèles cellulaires qui complémentent le gène déficient des deux clones mutés (pour récupération du gène initialement muté). Les informations apportées par ces deux nouvelles lignées seront très importantes pour valider les résultats obtenus par les trois lignées du projet initial. Les résultats attendus viendront compléter nos travaux in vitro pour suggérer que la détection d’altérations du gène d'intérêt dans des tumeurs triple-négaitf est un marqueur de risque accru de dissémination métastatique et de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet de validation préclinique vise à confirmer l’implication des altérations du gène étudié dans la promotion de la dissémination métastatique des cellules de cancer du sein triple-négatif. Les informations attendues sont essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle visant à déterminer si ce gène pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif, de mauvais pronostic et aux traitements limités.

Procédures

Injection de cellules tumorales : une fois par animal, durée 10 minutes, anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Le développement du modèle de cancer du sein triple négatif métastatique nécessite la réalisation de procédures qui peuvent entraîner des nuisances modérées pour les souris. La greffe des cellules, engendre du stress et une douleur transitoire et légère chez l'animal. Le suivi longitudinal individuel de nos souris (2 fois par semaine puis 5j/semaine si nécessaire) avec la mesure de la taille tumorale peut entraîner un stress lors de l'intervention, mais celui-ci diminue avec le temps par habituation. La tumeur par elle même peut induire une gène mécanique et une perte d'appétit modérées

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leur dissémination à d’autres organes distants. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans la dissémination métastatique dans les cancers du sein de type triple négatif. Il est indispensable pour notre projet de tester nos hypothèses in vivo dans un modèle orthotopique et xénogénique de souris.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance de manière à en utiliser le moins possible tout en conservant une puissance statistique satisfaisante. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Les souris sont laissées une semaine en quarantaine après leur arrivée pour qu'elles s'habituent à leur nouvel environnement. Les souris sont hébergées en locaux confinés dans des portoirs ventilés, avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux seront au nombre maximum de 5 par cage, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Les animaux sont surveillés et font l’objet d’une observation clinique individuelle afin d’évaluer leur état de santé. Cette observation permet de vérifier si l’animal se nourrit et s’hydrate bien mais aussi permet de voir l’aspect général de l’animal, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. Un pied à coulisse est utilisé pour mesurer la taille de la tumeur. Le sacrifice des animaux est effectué à partir d’une taille tumorale limite définie dans la procédure de suivi des animaux. Si une souris semble souffrir, elle reçoit une médication contre la douleur et une surveillance renforcée afin de vérifier sa bonne alimentation et hydratation. Afin de répondre à la directive européenne 2010/63/UE sur les conditions de vie des animaux confinés, de l’enrichissement environnemental a été ajouté dans les cages d’hébergement des animaux avec la mise place de jouets, de cachettes et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant occupés durant leur période de captivité. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant à la détection de points limites (suivi régulier de l’état de santé des animaux et contrôle du poids).

Choix des espèces

Nous implanterons des cellules tumorales humaines. Le modèle de souris immunodéficientes NSG sera utilisé pour éviter un rejet de la greffe des cellules humaines. L'espèce souris est l'espèce de choix en oncologie préclinique. Pour ce projet, le fait qu'il soit possible d'utiliser des animaux immunodéficients bien caractérisés dans cette espèce est crucial. De plus, de précédentes études au laboratoire ont été réalisées sur ce modèle de souris avec la lignée MDA-MB-231. Nous devrions faire des mises au point supplémentaires en utilisant un autre modèle et nous utiliserions plus d’animaux pour cela. Enfin, l’animalerie du site n’héberge que des souris. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures (souris adultes).

Une grille de score décide de l'arrêt de l'expérience ou de la mise à mort quand les points limites sont atteints. 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le sang et différents tissus. Pucées sous anesthésie à leur arrivée, transportées vers un second établissement, elles reçoivent une injection par jour cinq jours sur sept pendant dix semaines, jeûnent douze heures avant un test de tolérance au sucre, courent sur tapis roulant et subissent un prélèvement de sang à la queue suivi de cinq gouttes espacées sur quatre heures. Le régime gras qui leur est imposé doit produire une obésité et un diabète, pour tester des molécules censées limiter la prise de poids chez l'être humain.

Objectifs

En 2020, environ 8,5 millions de personnes en France sont touchées par l’obésité, dont 1 million avec une obésité très sévère. Cela représente 17 % de la population. Ce qui inquiète particulièrement, c’est l’augmentation rapide de l’obésité chez les jeunes adultes (18-24 ans). Si cette tendance continue, on risque de voir apparaitre de plus en plus de maladies graves liées à l’obésité. Nos recherches portent sur une protéine, connue pour avoir plusieurs fonctions selon l’endroit où elle se trouve dans la cellule. Elle influence notamment le métabolisme des graisses et des acides aminés. De plus, nous avons montré sur des cultures de cellules qu’en bloquant l’action de cette protéine, on empêche les cellules de stocker la graisse. Ainsi, nous travaillons avec des petites molécules, dérivées d’un composé connu pour détruire spécifiquement la version de notre protéine active in vitro mais dont les propriétés chimiques ne permettent pas d’envisager d’études cliniques directement chez l’humain. Ainsi, ces nouvelles molécules sont conçues pour être plus efficaces, avec une meilleure solubilité et moins de toxicité. Après leur validation in vitro, et afin d’évaluer l’amélioration de leurs propriétés pharmaco biologiques, ces molécules seront testées dans des modèles murins d’obésité dans le but de limiter la prise de poids et in fine de réduire le risque de complications associées à l’obésité chez l’Homme. En résumé, notre projet vise à explorer une nouvelle piste thérapeutique contre l’obésité, en ciblant un acteur clé du stockage des graisses dans les cellules.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un dégradeur d’une protéine spécifique dans la lutte contre l’obésité et les syndromes métaboliques associés. En inhibant cette protéine chez des animaux obèses ou chez des animaux ayant un régime riche en graisse, nous espérons limiter la prise de poids et montrer son rôle clé dans le stockage et l’utilisation des graisses. L’objectif est d’emmener vers l’utilisation de ces dégradeurs spécifiques comme potentielle thérapie dans la lutte contre l’obésité humaine.

Procédures

A leur arrivée, tous les animaux subiront une implantation de puce (avec une injection d’analgésique et une anesthésie volatile) utile pour leurs identifications et leurs pesées. Toute la durée de la procédure, tous les animaux seront pesés 1 fois par semaine. Cette mesure prend moins de 30 sec et sera réalisée sur animaux vigiles. En fin d’expérimentation ces animaux subiront une incision cutanée afin de leur retirer la puce (avec une injection d’analgésique et une anesthésie volatile) en vue d’analyses métaboliques. Tous les animaux seront traités avec 1 injection par jour (piqure 2 secondes) 5 jours sur 7, pendant 10 semaines. Tous les animaux vigiles auront une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 30 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte de sang espacés sur 4 heures (10 secondes par prélèvement). Une pesée de tous les animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées pour obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent moins de 2 minutes par souris et sont réalisées sur les animaux vigiles à la fin de chaque procédure. Ces animaux seront aussi soumis à des tests de motricité et de force (3 fois 5 minutes et 3 fois 10 secondes / deux sessions pour tous les animaux) ainsi que des tests de course.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois provoquer des hématomes sous la peau. De plus, l’administration de certains traitements par voie orale (à l’aide d’une sonde spécialisée) peut irriter la gorge. Les animaux pourront ressentir un stress léger dû à la manipulation pendant l’administration du traitement, tests non invasifs (analyse de la composition du corps ou des tests de motricité. Un stress un peu plus important est possible lors d’une mise en cage individuelle de moins de 48 heures, nécessaire pour mesurer leur respiration. Pour un test sur la tolérance au sucre, un jeûne de 12 heures peut entraîner une légère perte de poids et l’administration de sucre par la bouche, peut aussi être une source de stress. Pendant un test sur tapis roulant, certains effets indésirables comme de la fatigue ou, très rarement, une blessure à la patte peut survenir. Les animaux sont cependant surveillés pendant cet exercice. Un régime alimentaire riche en gras peut conduire à des troubles similaires à ceux que l’on observe dans des maladies humaines comme l’obésité, le diabète ou une mauvaise réponse à l’insuline. Certains animaux génétiquement modifiés obèses développent ces troubles spontanément dès l’âge de 4 à 5 semaines.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode recommandée pour limiter la souffrance des animaux. Nous prélèverons le sang et différents tissus afin de mener notre étude et analyser les dérégulations métaboliques et l’avancement de l’obésité.

Remplacement

Dans notre laboratoire, nous menons aussi des expériences en utilisant des cellules en culture, plus précisément des cellules qui peuvent devenir des cellules graisseuses. Ces études ont montré que notre protéine d’intérêt joue un rôle important dans la formation et la composition de ces cellules graisseuses. Mais l’obésité est un problème complexe, impliquant plusieurs composantes du corps et l’étudier seulement sur des cellules in vitro ne permet pas de comprendre toutes les interactions qui se produisent entre différents organes et différents types cellulaires. En effet, l’obésité est une maladie métabolique systémique, c’est pourquoi il est nécessaire de faire des expériences sur des animaux, à l’échelle d’un organisme complet. Ces tests sont essentiels si nous voulons, à terme, développer un traitement contre l’obésité. Pour progresser vers des applications chez l’humain, les tests chez l’animal restent donc indispensables.

Réduction

Nos résultats expérimentaux obtenus sur des cellules nous permettent d’anticiper certains résultats et ainsi diminuer le nombre de conditions expérimentales in vivo. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour valider ces approches in vitro et tester l’ensemble de nos molécules pour mettre en évidence le meilleur candidat en vue d’une application chez l’Homme.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Nous ajouterons dans les cages des briques de peuplier pour éviter les problèmes de malocclusion (absence d’usure des dents à croissance continue) à cause de la nourriture enrichie en graisse qui est très friable. De plus, les animaux seront pesés une fois par semaine. Tout animal présentant des difficultés à se nourrir ou à s’abreuver sera assisté par le dépôt dans la cage d’un gel lui évitant d’aller chercher en hauteur nourriture ou boisson. Nous avons défini préalablement une grille de score en fonction de laquelle nous procéderons à l’arrêt des expérimentations ou à l’euthanasie de l’animal en cas d’atteinte des points limites. Pour le transport de courte durée (inférieure à 10 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, hydratation et enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée dans le deuxième établissement les souris seront remises en cage d’hébergement. Pour l'implantation et le retrait de la puce d'identification les animaux recevront préalablement une injection d’analgésique et une anesthésie volatile. Dès qu’ils seront endormis, ils seront mis sur tapis chauffant pour éviter le refroidissement. Les animaux seront préalablement habitués à tous les tests de motricité et de course en étant simplement placés sur l’appareil, d’abord sans mouvement, puis à vitesse réduite. De plus, des points limites ont été établis permettant d’éviter l'épuisement et la blessure.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, disposant d’un génome proche de l’homme. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés pour les études de l’obésité ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. L’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci à l’échelle d’un organisme entier. Nous choisirons des souris jeunes sevrées (c’est-à-dire environ 6-8 semaines de vie). Pour notre projet, il est important d’avoir de jeune souris pour suivre au plus tôt le développement de la pathologie (obésité/diabète). Cela nous permettra aussi d’observer au mieux le temps de l’apparition des syndromes métaboliques associées à l’obésité. Nous suivrons le poids des animaux une fois par semaine dès l’âge de 8 semaines jusqu’à l’âge de 23 semaines pour 624 animaux et 33 semaines pour 576 animaux, âge auquel la différence de poids entre animaux traités ou non traités devrait être observable.

Exposition à un bruit fort pendant une à deux heures, tests auditifs sous anesthésie avec électrodes placées sous la peau, prélèvements de sang répétés jusqu'à six semaines : ces actes sont déclarés dans le premier des deux établissements, le résumé précisant qu'aucune intervention ne sera effectuée dans le second. 4 590 souris sont pourtant déclarées ici aussi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce second résumé reprenant mot pour mot le texte du premier, publié sous le même titre suivi de 2/2. Les 1 530 souris transférées dans ce second établissement y sont mises à mort pour analyser les mêmes tissus de l'oreille interne que les 3 060 autres. Le passage consacré au raffinement reprend lui aussi, mot pour mot, celui qui porte sur la réduction du nombre d'animaux non-humains, si bien que rien n'est dit des conditions faites aux souris.

Objectifs

Le projet se réalise dans deux établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2). La perte auditive présente dès la naissance, touche 26 millions de personnes dans le monde, dont 60 % (environ 15 millions) sont dues à des facteurs génétiques. Cependant, plus de 440 millions de personnes souffrent d’une surdité acquise ou progressive après la naissance, qu’elle soit liée à l’âge, au bruit ou à d’autres facteurs. La perte auditive liée à l'âge (ou presbyacousie) a un impact significatif sur la qualité de vie : 1 adulte sur 3 âgé de plus de 65 ans souffre d'un certain degré de perte auditive. Bien que les mécanismes sous-jacents à ces déficiences auditives restent à élucider, il est de plus en plus reconnu que l'inflammation joue un rôle crucial dans le développement et la progression des troubles auditifs, qu’ils soient d’origine génétique, environnementale (exposition au bruit) ou lié à l’âge. En étudiant des modèles de souris présentant une surdité progressive ou liée au bruit, ciblant des gènes clés liés à l'immunité et ses voies de régulation, nos objectifs sont de : - caractériser les voies moléculaires, découvrir des marqueurs précoces, précis, et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive - Étudier les liens entre l’inflammation, les marqueurs immunitaires et la perte auditive, en conditions normales et après exposition à des bruits. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à des traitements ciblant l’inflammation dans l’oreille interne, réduisant ainsi les dommages auditifs et améliorant la fonction auditive.

Bénéfices attendus

Les données obtenues de ce projet nous permettront de mieux comprendre la relation entre la surdité progressive ou liée au bruit et la dérégulation des voies immunitaires. Nous identifierons également des biomarqueurs précoces, précis et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive. Cela nous permettra de développer des thérapies ciblées pour atténuer les lésions auditives, applicables aux patients. À court terme, nous identifierons des marqueurs biologiques et des mécanismes physiopathologiques. À long terme, ces connaissances permettront de concevoir des traitements innovants pour préserver l'audition, avec des applications potentielles pour les humains et les animaux. Les résultats pourraient également contribuer à la prévention de la surdité induite par le bruit, un problème de santé publique majeur. Ce travail fondamental aura ainsi un impact significatif sur la recherche médicale et les applications cliniques futures.

Procédures

Dans l’EU1/2 : Exposition sonore : Les souris âgées de 3 semaines seront exposées pendant 1 ou 2 heures à un bruit d’un niveau sonore comparable à celui d’une discothèque ou une circulation urbaine dense. Tests auditifs : Des tests auditifs seront effectués dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Prélèvements de sang : Un petit échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes par prélèvement) avant l’exposition sonore, puis à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Aucune intervention ne sera effectuée dans l’EU2/2. Toutes les souris transférées dans l’EU2/2 seront mis à mort afin d’analyser des tissus.

Impact sur les animaux

Dans l’EU1/2 et l’EU2/2, certaines souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort à l’âge de 60 jours. Les autres modèles murins, bien que sourds, ne présentent aucun autre symptôme et conservent un phénotype identique à celui des souris sauvages. Dans l’EU1/2, quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : L’exposition sonore peut potentiellement induire un stress temporaire sur l’animal. Les études scientifiques sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. Aucune dégradation durable de leur état de santé n’est anticipée, et aucun effet indésirable majeur (perte de poids, inactivité prolongée, comportement anormal) n’est attendu. Les tests auditifs nécessitent une contention de courte durée des souris, associée à une anesthésie générale légère pour les immobiliser. Bien que cette procédure puisse provoquer une angoisse passagère lors de la mise sous anesthésie, ses effets sont atténués par la courte durée du test (quelques minutes) et la réversibilité rapide de l'anesthésie. Aucun effet indésirable durable n'est attendu.

Devenir

À l'issue de cette procédure expérimentale, 3060 souris seront mises à mort dans l’EU1/2 pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques. Les autres animaux (soit 1530 souris) seront transférées à un collaborateur dans l’EU2/2 où ils seront mis à mort pour une analyse complémentaire des mêmes tissus.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous utiliserons des souris dans notre projet pour étudier les effets pathologiques de l’inflammation dans les surdités progressives ou liées au bruit, afin d’identifier des marqueurs biologiques, avec des applications potentielles pour les humains.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Raffinement

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’homme, ces modèles vont nous permettre d’explorer la relation entre la dérégulation des voies immunitaires et la surdité progressive ou liée à l'âge, et fournir ainsi de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. Le projet impliquera principalement des souris adultes âgées de 3 semaines, correspondant au stade jeune adulte, afin d'étudier l'effet du bruit sur la réponse immunitaire dans l'oreille interne. Ce stade de développement a été choisi car l'oreille interne est complètement mature à ce stade, la réponse immunitaire est pleinement fonctionnelle, et cela permet d'étudier les effets du bruit sur un système auditif développé. La mise à mort se fera à 22 jours (soit 1 jour après exposition sonore) pour évaluer les effets immédiats, et entre 1 et 2 mois post-exposition pour évaluer les effets à long terme. Ces stades permettent d'étudier les réponses immunitaires aiguës à 22 jours, les changements chroniques entre 1 et 2 mois, et la progression potentielle de la perte auditive.

4 590 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 3 060 tuées dans le premier établissement pour prélever l'oreille interne, les 1 530 autres transférées chez un collaborateur où elles sont tuées pour les mêmes analyses. Dès l'âge de trois semaines, elles sont exposées une à deux heures à un bruit que le porteur compare à celui d'une discothèque, puis anesthésiées pour des tests auditifs avec électrodes sous la peau, répétés jusqu'à six semaines après l'exposition, et prélevées de sang à chaque échéance. Une partie d'entre elles, privées d'une protéine de l'audition, présentent des troubles de l'équilibre dès la deuxième semaine de vie, qui durent jusqu'à leur mise à mort à 60 jours. Le porteur écrit pourtant n'anticiper aucune "dégradation durable de leur état de santé".

Objectifs

Le projet se réalise dans deux établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2). La perte auditive présente dès la naissance, touche 26 millions de personnes dans le monde, dont 60 % (environ 15 millions) sont dues à des facteurs génétiques. Cependant, plus de 440 millions de personnes souffrent d’une surdité acquise ou progressive après la naissance, qu’elle soit liée à l’âge, au bruit ou à d’autres facteurs. La perte auditive liée à l'âge (ou presbyacousie) a un impact significatif sur la qualité de vie : 1 adulte sur 3 âgé de plus de 65 ans souffre d'un certain degré de perte auditive. Bien que les mécanismes sous-jacents à ces déficiences auditives restent à élucider, il est de plus en plus reconnu que l'inflammation joue un rôle crucial dans le développement et la progression des troubles auditifs, qu’ils soient d’origine génétique, environnementale (exposition au bruit) ou lié à l’âge. En étudiant des modèles de souris présentant une surdité progressive ou liée au bruit, ciblant des gènes clés liés à l'immunité et ses voies de régulation, nos objectifs sont de : - caractériser les voies moléculaires, découvrir des marqueurs précoces, précis, et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive - Étudier les liens entre l’inflammation, les marqueurs immunitaires et la perte auditive, en conditions normales et après exposition à des bruits. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à des traitements ciblant l’inflammation dans l’oreille interne, réduisant ainsi les dommages auditifs et améliorant la fonction auditive.

Bénéfices attendus

Les données obtenues de ce projet nous permettront de mieux comprendre la relation entre la surdité progressive ou liée au bruit et la dérégulation des voies immunitaires. Nous identifierons également des biomarqueurs précoces, précis et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive. Cela nous permettra de développer des thérapies ciblées pour atténuer les lésions auditives, applicables aux patients. À court terme, nous identifierons des marqueurs biologiques et des mécanismes physiopathologiques. À long terme, ces connaissances permettront de concevoir des traitements innovants pour préserver l'audition, avec des applications potentielles pour les humains et les animaux. Les résultats pourraient également contribuer à la prévention de la surdité induite par le bruit, un problème de santé publique majeur. Ce travail fondamental aura ainsi un impact significatif sur la recherche médicale et les applications cliniques futures.

Procédures

Dans l’EU1/2 : Exposition sonore : Les souris âgées de 3 semaines seront exposées pendant 1 ou 2 heures à un bruit d’un niveau sonore comparable à celui d’une discothèque ou une circulation urbaine dense. Tests auditifs : Des tests auditifs seront effectués dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Prélèvements de sang : Un petit échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes par prélèvement) avant l’exposition sonore, puis à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Aucune intervention ne sera effectuée dans l’EU2/2. Toutes les souris transférées dans l’EU2/2 seront mis à mort afin d’analyser des tissus.

Impact sur les animaux

Dans l’EU1/2 et l’EU2/2, certaines souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort à l’âge de 60 jours. Les autres modèles murins, bien que sourds, ne présentent aucun autre symptôme et conservent un phénotype identique à celui des souris sauvages. Dans l’EU1/2, quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : L’exposition sonore peut potentiellement induire un stress temporaire sur l’animal. Les études scientifiques sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. Aucune dégradation durable de leur état de santé n’est anticipée, et aucun effet indésirable majeur (perte de poids, inactivité prolongée, comportement anormal) n’est attendu. Les tests auditifs nécessitent une contention de courte durée des souris, associée à une anesthésie générale légère pour les immobiliser. Bien que cette procédure puisse provoquer une angoisse passagère lors de la mise sous anesthésie, ses effets sont atténués par la courte durée du test (quelques minutes) et la réversibilité rapide de l'anesthésie. Aucun effet indésirable durable n'est attendu.

Devenir

À l'issue de cette procédure expérimentale, 3060 souris seront mises à mort dans l’EU1/2 pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques. Les autres animaux (soit 1530 souris) seront transférées à un collaborateur dans l’EU2/2 où ils seront mis à mort pour une analyse complémentaire des mêmes tissus.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous utiliserons des souris dans notre projet pour étudier les effets pathologiques de l’inflammation dans les surdités progressives ou liées au bruit, afin d’identifier des marqueurs biologiques, avec des applications potentielles pour les humains.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Raffinement

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’homme, ces modèles vont nous permettre d’explorer la relation entre la dérégulation des voies immunitaires et la surdité progressive ou liée à l'âge, et fournir ainsi de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. Le projet impliquera principalement des souris adultes âgées de 3 semaines, correspondant au stade jeune adulte, afin d'étudier l'effet du bruit sur la réponse immunitaire dans l'oreille interne. Ce stade de développement a été choisi car l'oreille interne est complètement mature à ce stade, la réponse immunitaire est pleinement fonctionnelle, et cela permet d'étudier les effets du bruit sur un système auditif développé. La mise à mort se fera à 22 jours (soit 1 jour après exposition sonore) pour évaluer les effets immédiats, et entre 1 et 2 mois post-exposition pour évaluer les effets à long terme. Ces stades permettent d'étudier les réponses immunitaires aiguës à 22 jours, les changements chroniques entre 1 et 2 mois, et la progression potentielle de la perte auditive.

Une partie des souris utilisées a le système immunitaire affaibli, ce qui permet d'implanter des cellules tumorales humaines, les autres gardant leurs défenses pour observer la réaction immunitaire à la greffe. 3 868 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, greffées d'un fragment de tumeur ou de cellules cancéreuses sur le flanc, prélevées de sang chaque semaine sous anesthésie et traitées par injection dans le ventre, dans la veine de la queue ou par voie orale. Certaines études imposent en plus des périodes de mise à jeun pour mesurer l'effet des traitements sur le métabolisme. Toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes, le porteur écrivant que cette mise à mort respecte les règles de "bien-être animal".

Objectifs

Les cancers ont besoin de grandes quantités de nutriments pour se développer rapidement. Pour survivre et se multiplier, les cellules cancéreuses modifient leur fonctionnement afin d’absorber davantage de molécules essentielles, comme certains acides aminés (par exemple la sérine) ou des lipides tels que le cholestérol. Ces mécanismes d’adaptation représentent des points de fragilité qui pourraient être exploitées pour freiner la croissance des tumeurs. Nos travaux ont montré que certaines tumeurs, notamment les liposarcomes, mais aussi certains cancers du sein agressifs et certains cancers du rein, dépendent fortement de ces nutriments pour se développer. Nous avons également identifié plusieurs protéines jouant un rôle dans l’entrée de ces nutriments dans les cellules tumorales. L’objectif principal de ce projet est de développer et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à empêcher les cellules cancéreuses d’accéder à ces nutriments essentiels. Pour cela, deux types de traitements innovants seront étudiés : - des petites molécules capables de perturber le fonctionnement interne des cellules tumorales, - des anticorps thérapeutiques capables de reconnaître des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses, notamment celle impliquée dans l’entrée de la sérine ou du cholestérol. Ces traitements seront testés dans différents modèles de cancers chez la souris, notamment des modèles de liposarcome, de cancer du sein agressif et de cancer du rein. L’utilisation de la souris est nécessaire car elle permet d’étudier le développement de la tumeur dans un organisme entier, en tenant compte des interactions entre la tumeur, le système immunitaire et le métabolisme. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la façon dont les tumeurs puisent et utilisent leur source d’énergie pour se développer et d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques ciblées contre ces mécanismes.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes utilisés par certaines tumeurs pour capter et utiliser la nourriture nécessaire à leur croissance. Il permettra notamment d’étudier le rôle de protéines impliquées dans l’absorption de molécules essentielles comme la sérine ou le cholestérol, et de déterminer si leur blocage peut ralentir le développement tumoral. Ce projet contribuera également au développement de nouveaux médicaments innovants, notamment des anticorps thérapeutiques et des petites molécules ciblant spécifiquement ces mécanismes. L’objectif est d’identifier les traitements les plus efficaces et les mieux tolérés afin de préparer de futures études chez l’être humain. À plus long terme, les résultats obtenus pourraient conduire au développement de nouvelles options thérapeutiques pour des cancers rares actuellement difficiles à traiter, tels que les liposarcomes, certains cancers du sein agressifs ou certains cancers du rein, pour lesquels les traitements disponibles restent limités. Enfin, ce projet pourrait contribuer au développement de traitements plus ciblés et mieux adaptés aux caractéristiques biologiques des tumeurs, avec l’espoir d’améliorer l’efficacité des soins tout en limitant les effets indésirables pour les patients.

Procédures

Lors de cette procédure le personnel qualifié sera emmené à réaliser des greffes de cellules (1min par greffe) ou morceaux de tumeurs (4 min par greffe) sur les flancs des souris. Des prélèvements sanguins sous anesthésies (1min par prélèvement) seront réalisés avant la greffe, puis une fois par semaine après la prise de la tumeur jusqu'à la fin de l'expérience. Différents traitements thérapeutiques seront administrés soit par injection dans le ventre (3s par piqure), soit par injection dans la veine (30s contention comprise) de la queue soit par voie orale (10s par manipulation).

Impact sur les animaux

La greffe de cellules tumorales sous la peau peut entraîner des effets locaux modérés, tels qu’une rougeur, un gonflement temporaire, un petit saignement ou un hématome au niveau du site d’injection. Cette procédure peut également provoquer un stress modéré chez les animaux. Les traitements administrés au cours du projet nécessiteront des injections répétées pouvant provoquer des effets locaux comme des irritations, des hématomes ou une gêne au site d’injection. Dans certains cas, des effets plus généraux peuvent apparaître, notamment une fatigue transitoire ou des réactions inflammatoires. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de mauvaise tolérance. En cas d’apparition d’effets indésirables importants, le traitement sera interrompu et l’animal pris en charge selon les critères établis. Les prises de sang répétées peuvent également entraîner un stress modéré. Elles seront réalisées uniquement par du personnel qualifié et le volume prélevé sera limité afin de préserver le bien-être des animaux. Si l’état général d’un animal est jugé insuffisant, le prélèvement ne sera pas effectué. Certaines études nécessiteront une courte période de mise à jeun afin d’évaluer l’effet des traitements sur le métabolisme. Ces périodes seront strictement limitées au minimum nécessaire et les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés en respectant les règles de bien-être animal. Leurs organes seront prélevés afin d’étudier les effets de nos traitements thérapeutiques.

Remplacement

Avant toute expérimentation animale, de nombreux essais ont été réalisés sur des cellules cancéreuses en culture et sur des modèles cellulaires en trois dimensions. Ces expériences ont permis de sélectionner les traitements les plus prometteurs et de limiter le nombre d’expériences réalisées chez l’animal. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, notamment les interactions entre la tumeur, le système immunitaire et le métabolisme. L’utilisation de souris reste donc indispensable pour évaluer l’efficacité et la tolérance des traitements développés dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé à l’aide d’analyses statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le plus possible le nombre de souris nécessaires. Les résultats déjà obtenus sur cellules et lors d’expériences précédentes ont permis de mieux cibler les conditions expérimentales utiles et d’éviter des essais inutiles. Les groupes expérimentaux ont été conçus pour répondre précisément aux objectifs scientifiques du projet tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées de manière à limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les interventions chirurgicales nécessaires aux greffes tumorales seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux seront surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet. Après les greffes et pendant toute la durée des expériences, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’altération de leur état de santé. Le poids des animaux et la taille des tumeurs seront contrôlés régulièrement. Des critères d’arrêt précis seront appliqués afin d’éviter une dégradation excessive de l’état des animaux. Les injections et prélèvements seront réalisés par du personnel formé, avec du matériel adapté et en limitant autant que possible les manipulations stressantes. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies favorisant leur bien-être et leurs comportements naturels.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle particulièrement adapté à ce projet car son fonctionnement biologique, immunitaire et métabolique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. Elle permet d’étudier le développement des tumeurs et la réponse aux traitements dans un organisme entier, en tenant compte des interactions complexes entre les cellules cancéreuses, le système immunitaire et le métabolisme. Certaines souris utilisées dans ce projet présentent un système immunitaire affaibli, ce qui permet l’implantation de cellules tumorales humaines et l’étude de cancers proches de ceux observés chez les patients. D’autres souris possèdent un système immunitaire normal, permettant d’évaluer l’impact des traitements sur les interactions entre la tumeur et les défenses immunitaires. Les expériences seront réalisées sur de jeunes souris adultes, âge auquel leur organisme est stable et adapté à ce type d’étude, tout en limitant les risques liés au vieillissement.