Recherche appliquée

Endormies de force au pentobarbital, après avoir reçu par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen, dans une veine ou dans le nez les substances à tester, 1656 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à cent vingt et une administrations, une privation de nourriture et un isolement de moins de seize heures. Le porteur indique que le pentobarbital leur fait perdre le réflexe de redressement, abaisse leur tonus musculaire, ralentit leur respiration et fait chuter leur température, et que les injections répétées dans l'abdomen laissent de petits hématomes. Neuf cent soixante-deux souris seront tuées pour des prélèvements d'organes, et six cent quatre-vingt-quatorze gardées en vie pour être réutilisées dans un autre projet, à condition qu'il soit classé en sévérité légère à modérée.

Objectifs

Ce projet est un projet g?n?rique qui vient poursuivre un projet arrivant ? son terme. Il vise ? ?valuer les effets de nouveaux candidats m?dicaments pour le traitement des troubles du sommeil d?origine centrale, tels que l?insomnie (difficult? d?endormissement, et/ou ? maintenir le sommeil) et l?hyper-somnolence ou l?hypersomnie, notamment la narcolepsie. Les traitements actuels des troubles du sommeil pr?sentent soit une efficacit? insuffisante, soit des effets secondaires n?fastes, notamment accoutumance ou addiction. Ce mod?le sera utilis? pour tester l?efficacit? de produits de diff?rents donneurs d?ordre pr?sentant potentiellement moins d?effets secondaires, notamment de produits naturels extraits de plantes. Les donn?es g?n?r?es contribueront ? la caract?risation pharmacodynamique pr?coce des candidats m?dicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera ? la caract?risation pharmacologique pr?coce de nouveaux candidats m?dicaments en permettant l'identification d'?ventuelles propri?t?s s?datives, hypnotiques ou ?veillantes. Le test du sommeil induit pharmacologiquement constitue un outil reconnu pour d?tecter les interactions pharmacodynamiques susceptibles d'influencer l'?tat de vigilance et les fonctions neurocomportementales. Les donn?es obtenues permettront d'am?liorer la s?lection des candidats les plus prometteurs avant leur engagement dans des ?tudes pr?cliniques plus complexes et plus consommatrices en animaux. L'identification pr?coce de compos?s pr?sentant un profil pharmacologique inadapt? ou des effets centraux ind?sirables contribuera ? r?duire les risques d'?chec lors des phases ult?rieures du d?veloppement. ? plus long terme, les connaissances g?n?r?es pourront participer au d?veloppement de nouvelles approches th?rapeutiques dans diverses aires th?rapeutiques n?cessitant une action sur le syst?me nerveux central ou pour lesquelles l'absence d'effets s?datifs constitue un enjeu de s?curit?. Ainsi, les b?n?fices attendus du projet concernent ? la fois l'am?lioration des connaissances scientifiques relatives aux effets neuropharmacologiques des mol?cules ?tudi?es et l'optimisation du d?veloppement de futurs m?dicaments susceptibles d'apporter un b?n?fice aux patients.

Procédures

Les animaux seront soumis ? une ou plusieurs administrations de substances d'essai (orale, intrap?riton?ale, intraveineuse, sous-cutan?e ou intranasale) ainsi qu'? une administration de pentobarbital destin?e ? induire un ?tat de sommeil transitoire (moins d?une minute, au maximum 121). Les fr?quences d'administration d?pendront des caract?ristiques pharmacologiques des candidats m?dicaments. Une privation de nourriture et un isolement des animaux de moins de 16h seront effectu?s lors de ce projet. Un pr?l?vement sanguin sur animal anesth?si? sera r?alis? en fin d??tude d?une dur?e inf?rieure ? 2 min avec un volume maximal de 1 ml.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis ? une ou plusieurs administrations de substances d'essai ainsi qu'? une administration de pentobarbital destin?e ? induire un ?tat de sommeil transitoire. Les principales nuisances associ?es ? la proc?dure sont li?es ? la contention n?cessaire aux administrations et aux observations cliniques r?alis?es pendant l'?tude. Ces manipulations sont de courte dur?e et susceptibles d'engendrer un stress l?ger et transitoire. L?administration de traitement par injections intrap?riton?ales r?p?t?es pourra provoquer de petits h?matomes au niveau du site de la piq?re. Les administrations per os r?p?t?es peuvent exceptionnellement induire un inconfort lors de l'introduction de la sonde ainsi qu'une irritation de l'?sophage ou du pharynx. Les instillations intranasales r?p?t?es peuvent exceptionnellement induire une g?ne respiratoire transitoire ainsi qu'une irritation des muqueuses nasales. L'administration du pentobarbital induira une diminution de l'activit? locomotrice suivie d'une perte temporaire du r?flexe de redressement . Pendant cette p?riode, les animaux pourront pr?senter une diminution du tonus musculaire, une r?duction de la r?activit? aux stimuli ext?rieurs ainsi qu'un ralentissement mod?r? de la fr?quence respiratoire. Une baisse transitoire de la temp?rature corporelle peut ?galement ?tre observ?e chez certains animaux du fait des propri?t?s pharmacologiques du pentobarbital.

Devenir

En fin d??tude, pour des analyses s?rologiques, histologiques, mol?culaires et immunohistochimiques, certains animaux pourront ?tre soumis ? diff?rents types de pr?l?vements (organes) post mortem, ils seront donc mis ? mort en fin d'?tude. Dans le cas o? le projet ne n?cessite pas de pr?l?vement d'organe post mortem, les animaux pourront ?tre gard?s en vie pour ?tre r?utilis?s dans un projet de s?v?rit? l?g?re ? mod?r?e et sur avis v?t?rinaire. L?ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l??tude comportementale sera mis ? mort.

Remplacement

L??tude du comportement animal est une ?tape essentielle dans le d?veloppement des m?dicaments actifs sur le syst?me nerveux. L?effet de mol?cules sur le comportement est la cons?quence de leur action au niveau de l?ensemble de l?organisme et en particulier sur le syst?me nerveux. La mise en ?vidence de ces effets est r?alis?e sur un organisme vivant entier. Pour ?tre valide, un mod?le alternatif devrait prendre en compte l?ensemble des ph?nom?nes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l?animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l?ensemble de ces ph?nom?nes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilis?s pour les ?tudes comportementales ne peuvent donc pas ?tre remplac?s par des m?thodes alternatives. Le recours ? l?animal de laboratoire s?av?re donc n?cessaire et incontournable pour ?tudier l?efficacit? de nouveaux candidats m?dicaments.

Réduction

Le nombre d'animaux est d?termin? ? partir de l'exp?rience historique de notre EU et d'une analyse statistique de puissance. Les calculs coupl?s ? notre exp?rience indiquent qu'un effectif de 12 animaux par groupe est n?vessaire et suffisant pour mettre en ?vidence un effet biologiquement pertinent. Pour chaque lot, des analyses statistiques seront utilis?es pour comparer soit 2 groupes entre eux soit plusieurs groupes au groupe contr?le.

Raffinement

Une p?riode d?acclimatation au nouvel environnement de 5 jours minimum sera respect?e avant que les animaux ne soient inclus dans le protocole exp?rimental. Toutes les manipulations seront r?alis?es par du personnel form?. Les doses du produit inducteur de sommeil utilis?es dans ce projet ont ?t? choisies d?apr?s la litt?rature et l?exp?rience acquise dans notre EU pour que celles-ci, seule ou lorsqu?elle est coupl?e ? l?administration d?une r?f?rence positive qui augmente la dur?e du temps de sommeil, n?induisent aucun probl?me de r?cup?ration des animaux apr?s leur r?veil. Les animaux seront soumis ? une grille de scoring sp?cifique adapt?e ? l?exp?rience durant toute la p?riode de sommeil et pendant les 72h qui suivent l?exp?rience s'ils sont gard?s en vie. Si des animaux pr?sentent des signes de souffrance au cours de l'?tude, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajout?s dans les cages et le v?t?rinaire en sera inform?. Si un animal atteint un des crit?res d?arr?t pr?d?finis dans notre grille de scoring ? un moment donn? de l'exp?rience, il sera imm?diatement mis ? mort. Si le candidat m?dicament est administr? de fa?on chronique et par voie intrap?riton?ale, une alternance du site d?administration sera r?alis?e. Si l?administration du candidat m?dicament est effectu?e par voie intranasale, une habituation progressive ? la manipulation, ? la contention sp?cifique li?e ? l?instillation intranasale et ? l?instillation en elle-m?me sera effectu?e. Chaque s?ance d?habituation est accompagn?e d?une r?compense alimentaire pour l?animal. Si le projet n?cessite un pr?l?vement sanguin celui-ci sera effectu? sur animaux anesth?si?s.

Choix des espèces

La souris a ?t? retenue pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique dans l'?valuation pr?clinique des effets des substances d'essai sur le syst?me nerveux central. Cette esp?ce est largement utilis?e et valid?e dans les mod?les de s?dation et notamment d'hypnose induites par le pentobarbital. Le test du sommeil induit par le pentobarbital est un mod?le historiquement d?velopp? et largement document? chez la souris. L'utilisation de la souris facilite ?galement la comparaison des donn?es obtenues avec celles issues de compos?s de r?f?rence ou d'?tudes ant?rieures. La souris pr?sente par ailleurs des caract?ristiques physiologiques, neurobiologiques et pharmacologiques bien connues, ainsi qu'une sensibilit? adapt?e ? la mise en ?vidence des effets s?datifs, hypnotiques ou stimulants des substances ?tudi?es. Aucune m?thode alternative in vitro, ex vivo ou in silico ne permet actuellement de reproduire l'int?gration des m?canismes pharmacocin?tiques et pharmacodynamiques impliqu?s dans l'induction du sommeil observ?s chez un organisme vivant. L'utilisation d'animaux demeure donc n?cessaire pour r?pondre aux objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront utilis?s ? l'?ge de 6 ? 15 semaines, correspondant au stade de jeune adulte. ? cet ?ge, les syst?mes physiologiques impliqu?s dans l'absorption, la distribution, le m?tabolisme et l'?limination des substances administr?es sont pleinement d?velopp?s, permettant une ?valuation fiable et reproductible des effets pharmacologiques des candidats m?dicaments. L'utilisation d'animaux jeunes adultes permet ?galement de limiter la variabilit? li?e aux processus de croissance observ?s chez les animaux plus jeunes ainsi qu'aux modifications physiologiques associ?es au vieillissement. Cette tranche d'?ge correspond ? celle utilis?e dans la majorit? des ?tudes de pharmacologie comportementale et pour laquelle le laboratoire dispose de donn?es historiques de r?f?rence. Le recours ? des animaux de cet ?ge contribue ainsi ? la robustesse scientifique du mod?le tout en permettant de limiter le nombre d'animaux n?cessaires ? l'obtention de r?sultats interpr?tables.

Les souris rejoignent l'évaluation des vaccins une fois leur tumeur parvenue à 150 mm3. 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour tester des vaccins contre le carcinome à cellules de Merkel. Huit servent d'abord à caler la dose de cellules tumorales, les trente-deux autres reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau puis quatre injections vaccinales espacées d'une semaine, avant d'être tuées vingt-huit jours plus tard. Le porteur indique qu'une graine de tournesol ou une cacahuète est proposée après chaque injection, et justifie l'effectif de huit souris par lot par une puissance statistique suffisante, sans donner de calcul.

Objectifs

Le carcinome ? cellules de Merkel (CCM) est un cancer rare et agressif de la peau qui touche principalement les personnes ?g?es de plus de 65 ans et les personnes dont le syst?me immunitaire est affaibli. Sa fr?quence augmente progressivement et la survie des patients ? 5 ans reste limit?e. Lorsque la maladie est avanc?e et ne peut pas ?tre trait?e par chirurgie, les possibilit?s th?rapeutiques restent encore insuffisantes pour obtenir des r?ponses durables chez tous les patients. L'objectif de ce projet est de d?velopper et d'?valuer de nouveaux vaccins th?rapeutiques capables d'aider le syst?me immunitaire ? reconna?tre et ? ?liminer les cellules tumorales du carcinome ? cellules de Merkel. Pour cela, des souris seront utilis?es afin de reproduire la maladie et d'?tudier l'efficacit? de diff?rents vaccins candidats. Apr?s l'apparition des tumeurs, les animaux recevront soit un vaccin candidat, soit une pr?paration contr?le. L'?volution de la taille des tumeurs sera ensuite suivie afin de d?terminer si ces nouveaux traitements permettent de ralentir ou de r?duire leur d?veloppement.

Bénéfices attendus

Cette ?tude vise ? ?valuer une nouvelle strat?gie th?rapeutique pour les carcinomes ? cellules de Merkel (CCM) dus au MCPyV pr?sentant une r?sistance primaire ou acquise aux immunoth?rapies actuellement disponibles. L'efficacit? de cette approche sera appr?ci?e au travers de sa capacit? ? ralentir la croissance tumorale, ? r?duire le volume des tumeurs, voire ? obtenir une r?gression tumorale. Au-del? de ce projet, ce travail permettra de valider le potentiel d?une plateforme vaccinale fond?e sur l'utilisation de la capside du virus de l'h?patite B comme vecteur d'antig?nes. Cette d?monstration de preuve de concept pourrait ouvrir la voie au d?veloppement de nouvelles strat?gies vaccinales th?rapeutiques applicables ? d'autres cancers ou ? des maladies infectieuses.

Procédures

L'ensemble des animaux exp?rimentaux recevront une injection sous-cutan?e de cellules tumorales (proc?dure 1) ou dans le cadre de la proc?dure 2 une injection sous-cutan?e de cellules tumorales et 4 injections sous-cutan?es de pr?parations vaccinales espac?es d?une semaine (J0, 7, 14, 21).

Impact sur les animaux

Les contraintes pour les animaux au cours de cette ?tude seront principalement li?es au stress occasionn? par les manipulations et les contentions, ainsi qu'? une douleur l?g?re et temporaire associ?e aux injections r?alis?es pour l'implantation des tumeurs et l'administration des vaccins candidats. Ces interventions seront de courte dur?e (moins de 20 secondes par injection et par manipulation). Le volume maximal des tumeurs ainsi que leur localisation ont ?t? choisis afin de limiter autant que possible l'impact sur les d?placements et les activit?s normales des animaux. Toutefois, le d?veloppement des tumeurs peut entra?ner une alt?ration de l'?tat g?n?ral des souris, pouvant se traduire par une perte de poids, une diminution de la mobilit? ou une baisse de la r?activit?. Les animaux feront l'objet d'une surveillance r?guli?re afin de limiter leur inconfort et d'intervenir d?s l'apparition de signes de souffrance.

Devenir

Proc?dure 1 : Les 8 souris utilis?es pour d?terminer la dose de cellules tumorales ? injecter seront euthanasi?es au plus tard ? J28 apr?s l'implantation des cellules tumorales, ou avant ce d?lai si un point limite d?fini dans le protocole est atteint. Proc?dure 2 : Les 32 souris utilis?es pour l'?valuation des vaccins candidats seront incluses dans l'?tude apr?s atteinte d'un volume tumoral de 150 mm?. Elles seront euthanasi?es ? J28 apr?s la premi?re injection de pr?paration vaccinale, ou plus t?t si elles atteignent un point limite exp?rimental. Les pr?l?vements r?alis?s apr?s euthanasie permettront l'analyse des tumeurs et des organes internes afin d'?valuer la r?ponse immunitaire induite et l'efficacit? des traitements.

Remplacement

Malgr? les progr?s r?alis?s dans le d?veloppement d'organo?des int?grant des cellules du syst?me immunitaire, ces mod?les ne permettent pas, ? ce jour, de reproduire l'ensemble des m?canismes impliqu?s dans l'induction et le d?veloppement d'une r?ponse immunitaire adaptative. L'?valuation de l'efficacit? d'une vaccination th?rapeutique n?cessite donc le recours ? un animal immunocomp?tent, seul capable de d?velopper une r?ponse immunitaire int?gr?e, faisant intervenir l'ensemble des populations cellulaires et des m?canismes effecteurs observ?s chez l'Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux n?cessaires dans chaque groupe exp?rimental a ?t? d?termin? afin d'obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d'animaux utilis?s conform?ment au principe de R?duction (8/lot)

Raffinement

Les injections r?alis?es par voie sous-cutan?e sont des proc?dures rapides, associ?es ? une douleur faible et transitoire. Le geste technique est parfaitement ma?tris? par les personnels impliqu?s dans la manipulation des animaux, limitant ainsi le stress et l'inconfort li?s aux interventions. Afin de favoriser une exp?rience positive lors des manipulations, une r?compense alimentaire (graine de tournesol ou cacahu?te) sera propos?e aux souris apr?s chaque injection, qu'il s'agisse de l'administration des cellules tumorales ou des pr?parations vaccinales. - Mise en place de points limites grad?s : une grille d??valuation des points limite a ?t? cr??e prenant en compte l?apparence g?n?rale, l?activit?, le poids corporel, le volume et l?aspect de la tumeur, la g?ne locomotrice li?e au d?veloppement de la tumeur et l??tat clinique global. En fonction de l??volution de ces diff?rents signes, la surveillance des animaux sera renforc?e et une prise en charge sera adapt?e.

Choix des espèces

La souris repr?sente l'animal classiquement d?crit dans litt?rature, pour ce type d?exp?rimentation. L'utilisation de ce mod?le nous permettra de valider nos observations dans un syst?me immunocomp?tent ce qui est essentiel pour envisager un d?veloppement chez l'humain par la suite. Les souris arriveront au stade 6 semaines et seront incluses dans l??tude ? 7 semaines apr?s une semaine d'acclimatation. A cet ?ge, le syst?me immunitaire est mature et permet d?avoir des r?ponses immunitaires optimales.

Choisies pour ne pas rejeter les cellules humaines qu'on leur greffe, 120 souris reçoivent chacune une injection de cellules immunitaires humaines dans le cerveau, au cours d'une chirurgie de quarante-cinq à soixante minutes sous anesthésie générale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris seront tuées. Entre l'opération et la fin de l'étude, elles sont pesées deux fois par semaine et saignées tous les quinze jours sous anesthésie, à la jugulaire, à la saphène ou à la queue. Le porteur indique que l'injection de cellules humaines dans le cerveau peut provoquer une inflammation locale ou des troubles neurologiques, une perte d'équilibre ou de coordination, et que le liquide céphalo-rachidien est prélevé juste avant la mise à mort.

Objectifs

Le cerveau contient des cellules immunitaires spécialisées, appelées microglies, qui jouent un rôle essentiel dans son bon fonctionnement. Elles participent à la protection du cerveau contre les infections, éliminent les cellules endommagées et contribuent au maintien de l'équilibre du système nerveux. De nombreuses études ont montré que ces cellules sont également impliquées dans plusieurs maladies neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ou certaines maladies inflammatoires du cerveau. L'objectif de ce projet est de développer un nouveau modèle de souris dans lequel des cellules immunitaires humaines du cerveau pourront être implantées et étudiées. Ce modèle permettra de mieux comprendre le comportement de ces cellules dans un organisme vivant et d'observer leur capacité à survivre, à se développer et à s'intégrer dans le cerveau. Les différentes sources de cellules humaines seront comparées afin d'identifier celle qui permet d'obtenir le modèle le plus fiable et le plus représentatif de la biologie humaine. Des analyses seront ensuite réalisées pour vérifier que les cellules implantées sont présentes dans le cerveau et qu'elles présentent les caractéristiques attendues. À terme, ce modèle pourra être utilisé pour améliorer la recherche sur les maladies neurologiques et faciliter le développement de nouveaux traitements. Il contribuera également à disposer de modèles expérimentaux plus proches de la biologie humaine, ce qui pourrait améliorer la qualité des études précliniques et favoriser le développement de thérapies plus efficaces pour les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre au point un modèle de recherche plus représentatif du fonctionnement des cellules immunitaires humaines du cerveau que les modèles actuellement disponibles. Les connaissances acquises aideront les chercheurs à mieux comprendre le rôle de ces cellules dans le fonctionnement normal du cerveau et dans le développement de certaines maladies neurologiques. À moyen terme, ce modèle pourra être utilisé pour étudier les mécanismes impliqués dans des maladies telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques ou d'autres maladies inflammatoires et neurodégénératives. Il pourra également servir à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques avant leur utilisation chez l'Homme. Le modèle développé dans ce projet pourra être réutilisé dans d'autres travaux de recherche sur les maladies du système nerveux central. Il constituera un outil utile pour la communauté scientifique et contribuera à améliorer les connaissances sur le rôle des cellules immunitaires du cerveau, avec pour objectif à long terme de favoriser le développement de traitements plus efficaces au bénéfice des patients.

Procédures

Chaque souris subira une seule intervention chirurgicale sous anesthésie générale (45 à 60 minutes). Les animaux seront pesés (moins de 5 min, deux fois par semaine) Les prélèvements sanguins seront effectués tous les 15 jours sous anesthesie par une des voies suivantes • Jugulaire (moins d’1 min) • Saphène (moins d’3 min) • Queue (moins d’1 min) Le prélèvement de liquide cephalo-rachidien sera réalisé juste avant la mise à mort de l’animal. Les prélèvements de tissus/organes seront réalisés post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient ressentir un inconfort lié aux différentes étapes de l'étude. La randomisation pour former des groupes homogènes peut entrainer un stress de 1-2j lié au changement de congénères L'intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale peut entraîner une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée pendant quelques jours, ainsi qu'une diminution temporaire de l'activité ou de l'appétit. Des médicaments contre la douleur seront administrés afin de limiter ces effets. Les prélèvements de sang peuvent provoquer un inconfort de courte durée au moment de la manipulation et de la ponction. Le régime alimentaire utilisé pour préparer les animaux à la transplantation est généralement bien toléré, mais une légère baisse de la consommation alimentaire ou une perte de poids modérée peut parfois être observée. Dans de rares cas, l'injection de cellules humaines dans le cerveau peut entraîner des complications, telles qu'une inflammation locale ou l'apparition de troubles neurologiques (par exemple une diminution de l'équilibre, de la coordination ou de l'activité). Bien que ces effets soient peu fréquents, les animaux feront l'objet d'une surveillance attentive tout au long de l'étude. Les souris seront observées chaque jour afin de détecter rapidement tout signe de douleur, de souffrance ou de mauvaise récupération. Si un animal présente une altération importante de son état de santé ou des signes indiquant qu'il pourrait souffrir de manière durable, il recevra les soins appropriés. Si son bien-être ne peut pas être rétabli, il sera euthanasié de façon à éviter toute souffrance inutile.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes, de sang, et de liquide cephalo-rachidien nécessaires pour évaluer la réussite de la transplantation

Remplacement

Avant de recourir aux animaux, des méthodes alternatives, telles que des cultures de cellules humaines produites en laboratoire sont utilisées. Ces méthodes permettent d'étudier certaines caractéristiques des cellules et de vérifier leur qualité avant leur utilisation. Cependant, l'objectif de ce projet est de comprendre comment ces cellules humaines survivent, se déplacent, s'intègrent et fonctionnent dans le cerveau au sein d'un organisme vivant. Il est également nécessaire d'étudier leurs interactions avec les autres cellules du cerveau et de mesurer certains marqueurs biologiques présents dans le sang ou le liquide entourant le cerveau. À l'heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet de reproduire l'ensemble de ces phénomènes complexes. Le recours aux animaux est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les expérimentations sont limitées au strict nécessaire et ne sont réalisées que lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues par d'autres méthodes. Les connaissances acquises grâce à ce projet pourraient également contribuer, à terme, au développement de modèles expérimentaux plus performants et permettre de réduire encore davantage le recours aux animaux dans les recherches futures.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il a été déterminé à partir des connaissances scientifiques disponibles. Chaque animal fournit un grand nombre d'informations. Plusieurs analyses différentes seront réalisées à partir des mêmes prélèvements de sang, de liquides biologiques et de tissus, ce qui permet d'éviter d'utiliser des groupes supplémentaires d'animaux. De plus, les mêmes souris seront suivies tout au long de l'étude grâce à des prélèvements réalisés à différents moments, ce qui permet d'observer l'évolution des cellules transplantées sans avoir à utiliser de nouveaux animaux à chaque étape. Les procédures expérimentales ont été soigneusement préparées et seront réalisées par du personnel qualifié afin de limiter les échecs techniques qui pourraient conduire à répéter les expériences.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape du projet afin de limiter autant que possible la douleur, le stress et l'inconfort. Les souris sont hébergées dans des conditions adaptées à leurs besoins, avec de la nourriture et de l'eau à volonté, des matériaux leur permettant de construire un nid, des abris et un environnement favorisant leurs comportements naturels. Elles bénéficient d'une période d'adaptation avant le début des expériences. Toutes les interventions sont réalisées par du personnel spécialement formé. La greffe est effectuée sous anesthésie générale et des médicaments contre la douleur sont administrés avant et après l'intervention afin de limiter l'inconfort. Les animaux sont maintenus au chaud pendant leur réveil et leur état est surveillé attentivement jusqu'à leur récupération complète. Pendant toute la durée de l'étude, les souris sont observées quotidiennement afin de vérifier leur état de santé, leur comportement, leur alimentation et leur poids. Une surveillance renforcée est mise en place après la chirurgie. Si un animal présente des signes de douleur, de souffrance ou une altération de son état de santé, il reçoit rapidement les soins appropriés. Lorsque son bien-être ne peut plus être assuré ou que son état risque de se dégrader, il est euthanasié sans attendre la fin de l'étude afin d'éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris a été choisie car il s'agit de l'espèce la plus utilisée et la mieux connue pour étudier le fonctionnement de cellules humaines dans un organisme vivant. Elle partage de nombreuses caractéristiques biologiques avec l'Homme, ce qui en fait un modèle particulièrement utile pour comprendre certaines maladies et développer de nouvelles approches thérapeutiques. Les souris utilisées dans ce projet présentent également des caractéristiques particulières qui permettent l'implantation de cellules humaines sans qu'elles soient rejetées, ce qui est indispensable pour atteindre les objectifs de l'étude. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte, à l'âge d'environ huit semaines. À cet âge, le cerveau est complètement développé et fonctionne de manière stable. Cela permet d'étudier dans de bonnes conditions l'implantation, la survie et le comportement des cellules humaines greffées, tout en limitant les variations liées à la croissance ou au vieillissement. Les jeunes souris adultes récupèrent également généralement mieux après une intervention chirurgicale que les animaux plus âgés, ce qui contribue à limiter les contraintes liées aux procédures expérimentales et à améliorer leur bien-être.

Injectées dans l'abdomen à répétition, soumises à des frottis vaginaux et à des prises de sang hebdomadaires, 120 rattes Wistar subissent une stimulation ovarienne destinée à tester un anticorps censé augmenter le nombre d'ovocytes récoltés. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, et toutes les rattes seront tuées pour des prélèvements d'organes destinés à des analyses morphologiques, histologiques et endocriniennes. Le porteur signale un risque de passage de liquide vers la cavité abdominale, suivi par dosage de l'hématocrite, et un point limite fixé à 15 % de perte de poids qui déclenche la mise à mort. Il écrit par ailleurs que "La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés".

Objectifs

L’objectif du projet est d’améliorer la réponse à la stimulation ovarienne. En effet, les échecs de procréation in vitro sont souvent dus à une mauvaise réponse des patientes à la stimulation ovarienne lors de leur prise en charge en assistance médicale à la procréation. L'hormone anti-Müllérienne est un des principaux régulateur des différentes étapes de la folliculogénèse. C'est pourquoi, nous avons développé un anticorps bloquant anti AMH et nous avons montré qu’un traitement avec cet anticorps est capable d’induire une ovulation chez des rattes anovulantes. Nous prévoyons maintenant de tester si cet anticorps pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récoltés après une stimulation ovarienne chez des rates Wistar ovulantes.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patientes répondant mal à la stimulation ovarienne en procréation médicalement assistée. Actuellement, en cas de mauvaise réponse à la stimulation ovarienne, les doses de gonadotropines sont augmentées ainsi que le nombre de stimulations ovariennes mais souvent sans qu'une amélioration du nombre d’ovocytes récoltés soit observée. La seule alternative pour ces patientes est alors le don ovocytes.

Procédures

Les animaux subiront au maximum un prélèvement de sang par semaine d’un volume inférieur à 5 % du volume sanguin total soit 2 à 4 prélèvements en fonction du protocole. Les animaux seront traités par des injections intra-péritonéale d’anticorps. Nous privilégions cette voie d'administration car nos tests précédent avec des injections en sous cutanée donnaient de moins bons résultats. Ce type de traitement avec des injections répétées d’anticorps anti-AMH a déjà été réalisé sur une durée plus longue (1 mois) sans effet secondaire. La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés.

Impact sur les animaux

Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection intra péritonéale et les prélèvements sanguins, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins, le volume de sang prélevé à chaque prise de sang (2 maximum, 1 par semaine) sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).

Devenir

Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux analyses morphologiques, histologiques, endocriniennes ...

Remplacement

Sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico. L’anticorps anti-AMH utilisé dans ce projet est une IgG de rat, développée et validée dans cette espèce, notamment dans des modèles de dysfonction ovarienne. De plus, le fait que le rat ait une réponse plus modérée que la souris à la stimulation ovarienne en fait un meilleur modèle pour mettre en évidence une augmentation du nombre d'ovocyte après stimulation ovarienne comme nous l'avons déjà observé. L’utilisation de rattes permet ainsi de s’appuyer sur des données préexistantes robustes concernant sa spécificité, son efficacité et sa tolérance. De plus, la nature homologue de cet anticorps garantit une compatibilité optimale avec l’espèce étudiée et limite le risque de réponse immunitaire anti-anticorps lors d’administrations répétées. À l’inverse, son utilisation chez la souris pourrait induire une réponse immune dirigée contre cet anticorps hétérologue, ainsi qu’une incertitude quant à sa capacité à reconnaître et bloquer efficacement sa cible. Enfin, un changement d’espèce nécessiterait des études préalables de validation, impliquant l’utilisation d’animaux supplémentaires, ce qui serait contraire au principe de Réduction. La voie intrapéritonéale a été retenue sur la base de données expérimentales préalables issues de notre équipe, ayant montré une meilleure efficacité de l’anticorps anti-AMH par rapport à la voie sous-cutanée. L’utilisation de la voie sous-cutanée entraînerait ainsi une diminution de l’efficacité du traitement et une variabilité accrue des réponses, nécessitant une augmentation du nombre d’animaux pour atteindre une puissance statistique suffisante, ce qui irait à l’encontre du principe de Réduction. La voie intra-veineuse n'a jamais été testée car la majorité de nos protocoles incluent des injections répétées. Il faudrait tester cette nouvelle voie d'injection ce qui augmenterait le nombre d'animaux et irait à l’encontre du principe de Réduction. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect des bonnes pratiques (choix du matériel adapté, volumes conformes aux recommandations, contention appropriée). Une surveillance clinique régulière des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, conformément au principe de Raffinement.

Réduction

Le projet comporte trois protocoles expérimentaux distincts visant à évaluer l’effet du schéma d’administration de l’anticorps anti-AMH sur la réponse à la stimulation ovarienne (1, 3 ou 4 injections). Chaque protocole comprend deux groupes (IgG témoin vs anticorps anti-AMH), avec un effectif de 20 animaux par groupe (soit 40 animaux par protocole).Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préalables et de la variabilité observée dans ce modèle de ratte, déjà caractérisé dans notre équipe. Ces données permettent d’estimer de manière fiable le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. La taille des groupes a ainsi été définie de manière à éviter à la fois un sous-dimensionnement (conduisant à des résultats non conclusifs et à la répétition des expériences) et un surdimensionnement (utilisation excessive d’animaux), conformément au principe de Réduction. Les trois protocoles correspondent à des schémas d’administration distincts et complémentaires, nécessaires pour répondre à la question scientifique posée. Leur dissociation permet d’éviter l’introduction de facteurs de confusion expérimentaux. Par ailleurs, plusieurs paramètres biologiques seront analysés chez les mêmes animaux, permettant de maximiser les données obtenues par individu. Les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité interindividuelle et ainsi optimiser les effectifs requis. Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données (tests paramétriques ou non paramétriques), afin d’optimiser la détection des différences entre groupes sans augmentation du nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation en amont des procédures expérimentales afin de réduire le stress lié aux interventions. Les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des recommandations en vigueur, en limitant les volumes à moins de 5 % du volume sanguin total et en espaçant suffisamment les prélèvements afin d’éviter toute altération de l’état général des animaux. Les injections intrapéritonéales, susceptibles d’induire une gêne locale, seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté et dans des conditions de contention maîtrisées, afin de minimiser la douleur et le stress. Un suivi clinique quotidien des animaux sera réalisé afin de détecter précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (altération de l’état général, prostration, poils hirsutes, irritation au point d’injection, perte de poids). En cas d’apparition de tels signes, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée et, si nécessaire, de mesures correctives telles que l’adaptation des conditions d’hébergement ou une réduction des manipulations. En cas de signes cliniques persistants, les animaux pourront être retirés du protocole expérimental et exclus de l’analyse, afin de préserver leur bien-être. Un point limite sera appliqué en cas de perte de poids supérieure à 15 % du poids initial, conduisant à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance prolongée. Par ailleurs, des administrations répétées d’anticorps par voie intrapéritonéale (toutes les 48 h pendant 15 jours) ont déjà été réalisées dans notre équipe sans impact observable sur le bien-être des rattes. Afin de renforcer le suivi du raffinement, des dosages de marqueurs biologiques seront réalisés avant et après traitement, incluant notamment des paramètres de tolérance générale (ALAT, ASAT pour la fonction hépatique). Un hématocrite sera également mesuré en fin de protocole. En effet, dans le contexte de stimulation ovarienne, une réponse excessive au traitement peut entraîner une augmentation de la perméabilité vasculaire, à l’origine d’un passage de liquide vers la cavité abdominale (ascite). Ce phénomène peut être associée à une altération de l’état général des animaux. L’élévation de l’hématocrite constitue ainsi un indicateur indirect de cette situation. En cas d'anomalies biologiques, les animaux concernés feront l'objet d'une surveillance renforcée, et pourront être retirés du protocole ou mis à mort.

Choix des espèces

La rate Wistar est un modèle validé pour l’étude de la physiologie de la reproduction et de la stimulation ovarienne. Son cycle œstral court (4–5 jours), bien caractérisé et reproductible, permet une analyse fine des mécanismes hormonaux et folliculaires. Les profils endocriniens présentent des similitudes fonctionnelles avec ceux observés chez l’humain, conférant à ce modèle une bonne pertinence biologique. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien et l’environnement systémique nécessaires à l’étude de la réponse à une stimulation hormonale. L’anticorps anti-AMH utilisé a été développé et validé chez le rat. Son utilisation chez la souris exposerait à un risque de réponse immunitaire et nécessiterait des études de validation supplémentaires, impliquant l’utilisation d’animaux additionnels, ce qui serait contraire au principe de Réduction. Femelles adultes de 2 à 4 mois, correspondant au début de l’âge adulte lorsque le stock d’ovocyte est encore important.

Déjà utilisées dans un autre protocole, 6 vaches laitières taries sont reprises pour tester un vaccin nasal contre la besnoitiose, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tête bloquée au cornadis, chacune subit quatre prises de sang de trente millilitres, quatre écouvillonnages nasaux, trois instillations du vaccin et jusqu'à vingt-huit prises de température rectale. L'effectif tient à la disponibilité de ces six vaches, le porteur indiquant qu'il n'est pas modulable puisqu'elles proviennent d'un protocole antérieur. Toutes seront mises à mort à l'issue, au motif qu'elles auront été soumises à des produits expérimentaux.

Objectifs

La besnoitiose, caus?e par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), repr?sente une menace significative pour l??levage bovin. Maladie r?-?mergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites pr?sents dans la peau peuvent ?tre transmis par l?interm?diaire d?insectes ou d?aiguilles avec une progression jusqu?? 20% de nouveaux animaux infect?s par an dans les troupeaux touch?s. La phase f?brile est caract?ris?e par un larmoiement, un jetage nasal, une congestion des muqueuses, de la fi?vre ; puis la phase des ?d?mes touche toutes les r?gions du corps rendant les d?placements difficiles ; puis vient la phase de d?pilation et scl?rodermie accompagn? d?amaigrissement. La mort, spontan?e ou provoqu?e, peut atteindre jusqu?? 10 % des animaux infect?s. Cette maladie est ?galement une cause d?infertilit? des m?les pouvant impacter des taureaux de grande valeur g?n?tique. Aucun traitement curatif n?est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limit?s au d?pistage et ? l??limination des animaux malades, ce qui est difficile pour les animaux asymptomatiques, ou au contr?le des insectes. Le d?veloppement d?un vaccin efficace offrirait aux ?leveurs une meilleure strat?gie de contr?le de cette maladie. Le but de ce projet est d??valuer l?immunog?nicit? et l?efficacit? d?un vaccin sous-unitaire ? administration nasale contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitu? de prot?ines de B. besnoiti associ?es ? un muco-excipient ? base d?amidon. Les vaches seront immunis?es par voie intranasale pour d?clencher une r?ponse immunitaire muqueuse et syst?mique. Ces r?ponses seront ?valu?es par le suivi de l?apparition d?anticorps muqueux et s?riques sp?cifiques de B. besnoiti et par la production de mol?cules inflammatoires par les cellules sanguines. Le vaccin sera test? sur 6 vaches r?utilis?es et h?berg?es conform?ment aux directives europ?ennes, avec un enrichissement appropri? aux bovins. Toute m?dication interf?rant avec la r?ponse immunitaire est ? ?viter.

Bénéfices attendus

Les b?n?fices attendus sont la mise en ?vidence du d?veloppement d?une immunit? contre Besnoitia besnoiti, ? l?aide d?un vaccin nasal. Ces r?sultats sont essentiels pour envisager le d?ploiement de la vaccination de bovins dans les zones end?miques en France. Cet outil de lutte est attendu par les acteurs du secteurs (?leveurs impact?s, groupement de d?fense sanitaire qui soutient les ?leveurs dans la gestion de la besnoitiose).

Procédures

Les animaux seront soumis ? des pr?l?vements sanguins sous contention de la t?te au cornadis (environ 5 minutes par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des pr?l?vements nasaux par ?couvillonnage sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; d?instillation du vaccin par voie intranasale sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 3 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des prises rectales de la temp?rature (environ 5 minutes par animal, entre 16 et 28 fois avec un maximum de 2 fois par jour pendant 3 jours apr?s vaccination).

Impact sur les animaux

Les prises de sang peuvent ?tre source de stress et de douleur mod?r?e. Au total, 4 prises de sang de 30 mL chacune, ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. L??couvillon dans la narine peut provoquer une sensation de d?mangeaison limit?e ? la dur?e du geste. Au total, 4 ?couvillonages ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. La prise rectale de la temp?rature peut occasionner une g?ne passag?re. Le pr?l?vement de sang au niveau de la veine jugulaire n?cessite une contention de la t?te ? l?aide d?un cornadis et d?un licol. Le pr?l?vement nasal se fera ? la suite pour profiter de l?immobilisation de la t?te de l?animal.

Devenir

A l'issue de la proc?dure 1, les 6 animaux seront mis ? mort ?tant donn? qu?ils auront ?t? soumis ? des produits exp?rimentaux.

Remplacement

Il n?existe ? ce jour aucune alternative non animale permettant d??tudier les r?ponses immunitaires. L??tude des r?ponses immunitaires n?cessite d?immuniser et de faire des pr?l?vements sur des animaux vivants. Le bovin est l?h?te de B. besnoiti. C?est donc la seule esp?ce pertinente pour ?tudier les r?ponses immunitaires d?un vaccin ? destination des bovins.

Réduction

Il s?agit d?une ?tude exploratoire sur des animaux r?utilis?s issus d?un autre protocole afin de ne pas en utiliser d?autres (r?duction). Le nombre d?animaux n?est donc pas modulable. Le fait que chaque animal soit son propre t?moin n?gatif permet d?avoir un lot unique et d?augmenter la robustesse des r?sultats. Pour les dosages de cytokines produites par les cellules sanguines stimul?es ex vivo, le test statistique non param?trique (2 ?chantillons appari?s) pourra ?tre utilis? pour d?terminer si la diff?rence entre le point avant vaccination (J0) et chaque point apr?s vaccination (J14, J28, J47) est significative. Une simulation r?alis?e avec l?outil de calcul de puissance de ce test indique que 6 individus sont n?cessaires pour atteindre 95 %, sans tenir compte de la grande variabilit? individuelle d?j? observ?e avec les cellules bovines et pour une augmentation attendue d?au moins 50 % de cytokines produites.

Raffinement

Les animaux ayant d?j? ?t? utilis?s, ils resteront dans leur environnement habituel. Ils ont d?j? ?t? acclimat?s et habitu?s aux pr?l?vements sanguins. Les prises de sang et les immunisations intranasales ne n?cessiteront qu?une contention minimale (au cornadis). Dans leur pr?cedent ?levage, les animaux ont d?j? ?t? habitu?s ? l?alimentation au cornadis. Un renforcement positif (granul?s pour vaches par exemple) sera appliqu? apr?s chaque immunisation et pr?l?vements. La vaccination ne devrait pas entrainer d?effet ind?sirable grave et toute m?dication pouvant interf?rer avec les r?ponses immunitaires (tels que les anti-inflammatoires) est proscrite. Enrichissement du milieu par : des brosses de grattage, des blocs de sels min?raux et de la paille r?guli?rement chang?e pour le couchage. Enrichissement social : les animaux seront h?berg?s en groupes stables et auront au minimum deux visites quotidiennes des animaliers.

Choix des espèces

Le bovin est l?esp?ce cible du vaccin test? dans cette exp?rimentation. Les vaches laiti?res sont au stade adulte et taries qui correspond au stade majoritairement infect? par B. besnoiti. En effet, le risque est li? aux piq?res d?insectes et il augmente avec l??ge des animaux.

Former des professionnels de santé à la pose de dispositifs implantables : 1125 animaux non-humains vont être utilisés, 600 moutons, 400 cochons, 100 bovins et 25 chiens, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal subit des prélèvements sanguins hebdomadaires sur animal vigile ou légèrement sédaté, un jeûne de six à seize heures selon l'espèce, puis une chirurgie de formation sans réveil qui peut durer plusieurs heures. Certains sont transportés sur trente-cinq kilomètres entre deux établissements pour des séances d'imagerie. Le porteur indique que la mise à mort de tous ces animaux non-humains sert à parachever la formation, en permettant aux stagiaires d'évaluer à l'œil nu l'organe et le dispositif qui vient d'y être implanté.

Objectifs

Chaque ann?e de nouveaux dispositifs implantables issus de la recherche sont disponibles pour les professionnels de sant? (en cardiologie, en gastro-ent?rologie, en neurologie, en ophtalmologie et en urologie par exemple) et permettent de soutenir les fonctions d?un organe d?faillant, surveiller les activit?s physiologiques ou administrer des m?dicaments afin de prolonger la survie, traiter une pathologie et am?liorer le confort de vie des patients. On entend par dispositif implantable tout dispositif destin? ? ?tre implant? de fa?on invasive en totalit? dans le corps humain ou ? remplacer une surface ?pith?liale gr?ce ? une intervention chirurgicale et ? demeurer apr?s l'intervention de fa?on temporaire ou d?finitive. Les professionnels de sant? ont l?obligation de se former ? l?utilisation de ces nouveaux dispositifs. L?utilisation d?un dispositif m?dical par un professionnel de sant? ou un patient ne peut se faire sans une information de l?utilisateur, voire une formation pr?alable, elle requiert un apprentissage permettant d?utiliser le mat?riel afin d?optimiser ses performances et de s?approprier les gestes permettant d?assurer ? l?utilisateur une s?curit? maximale d?utilisation. Un m?me produit, s?il est utilis? ou non conform?ment aux recommandations du fabricant, aura ou non la performance valid?e lors de son ?valuation. Les dispositifs m?dicaux sont d?finis comme des produits ?utilisateur-d?pendant?. La directive 93/42/CE modifi?e relative ? l??valuation de ces dispositifs en vue de leur acc?s au march? europ?en qui soumet les industriels ? des obligations en mati?re de gestion des risques pour le produit mais ?galement son environnement, prend en compte ce caract?re ?utilisateur-d?pendant?. Les industriels sont ? ce titre, responsables du recueil, de l??valuation, de la mesure et du d?veloppement de tout ?l?ment susceptible de permettre une utilisation optimale des produits qu?ils commercialisent et d?assurer leur s?curit?. Performances et s?curit? des dispositifs m?dicaux sont corr?l?es ? la formation et ? l?exp?rience de l?utilisateur. De plus, les conditions d?utilisation des dispositifs ne peuvent se r?duire ? des questions d?observance. Ce projet vise ? former les professionnels de sant? ? l?utilisation des dispositifs m?dicaux innovants en situation r?elle sur un animal anesth?si?. Ce projet de recherche se d?roulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU 1/2 et 2/2).

Bénéfices attendus

R?pondre ? l?obligation de formation des professionnels de sant? ? la technique d?implantation d?un nouveau dispositif m?dical, ? sa bonne utilisation et ? son ?valuation fonctionnelle pour la s?curit? pour les futurs patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des pr?l?vements sanguins sur animaux vigiles ou l?g?rement s?dat?s, pour tous les animaux du projet. La fr?quence des pr?l?vements pouvant ?tre couramment d?un pr?l?vement par semaine et d'une dur?e de moins de cinq minutes - Des pr?parations ? l?anesth?sie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cath?ter et en l'injection des produits utilis?s pour la pr?m?dication et l'anesth?sie. Dur?e de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours r?alis?s sous anesth?sie g?n?rale (?vitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'? plusieurs heures en cas d?intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront ?tre r?alis?s dans les EU 1/2 et 2/2. La p?riode d'acclimatation d'une dur?e de 7 jours se fera dans l'EU 2/2. Les proc?dures chirurgicales sans r?veil de formation des professionnels de sant? ? l'utilisation des dispositifs m?dicaux innovants pourront ?tre r?alis?s dans l'EU 1/2 ou 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets ind?sirables attendus sur les animaux sont exactement les m?mes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise ? jeun (12 heures pour les porcs, 12 ? 16 heures pour les ovins et les bovins, 6 ? 12 heures pour les chiens) de l?animal pr?alablement ? l?anesth?sie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cath?ter au moment de la pr?paration de l?anesth?sie, - La phase de r?veil anesth?sique apr?s la proc?dure d'imagerie non invasive, la douleur en phase per-op?ratoire : pour ces dernier point, des mesures de raffinement sont mises syst?matiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours syst?matique ? l'anesth?sie g?n?rale pour les proc?dures d'imagerie non-invasive et chirurgicales avec surveillance du r?veil anesth?sique dans des espaces calmes et sp?cialement am?nag?s, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens sp?cialement form?s supervis?s par des V?terinaires et la prise en charge multimodale de l'analg?sie per-op?ratoire avec l'usage syst?matique de traitements anti-inflammatoire et anti-douleur opiac?s y compris de traitements permettant une analg?sie par voie locale).

Devenir

Pour r?pondre ? l?obligation de formation des professionnels de sant? ? la technique d?implantation d?un nouveau dispositif m?dical, ? sa bonne utilisation et ? son ?valuation fonctionnelle pour la s?curit? des futurs patients, il est n?cessaire de proc?der ? l'euthanasie de tous les animaux du projet en fin de proc?dure pour parachever la formation en r?alisant les pr?l?vements et analyses ex-vivo et permettre aux professionnels d??valuer macroscopiquement l?organe et le dispositif juste implant?s.

Remplacement

La formation des professionnels de sant? aux m?thodes d?implantation des dispositifs m?dicaux regroupe les notions de ma?trise du geste chirurgical mais aussi d??valuation fonctionnelle en temps r?el au moment de l?implantation gr?ce ? l?imagerie. La r?ponse de l?organisme lors des diff?rentes phases de l?implantation du dispositif et son suivi simultan? par des m?thodes d?imagerie pour en assurer l??valuation fonctionnelle n?cessite une formation sur un animal vivant. Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l?homme dans des conditions fonctionnelles qui reproduisent la fonction de l?organe vivant dans l?organisme afin de mimer au mieux la r?alit? d?une intervention.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? ?valu? prospectivement en prenant en compte l'exp?rience du laboratoire sur d'autres projets avec ce m?me type d'approche, et r?duit au minimum n?cessaire pour r?pondre aux objectifs scientifiques et aux besoins en formations du projet, aucune approche statistique n'a ?t? r?alis?e. Pour r?duire le nombre d?animaux, des s?lections par m?thodes d?imagerie peu invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX ?), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d?int?r?t. Les professionnels de sant? en formation re?oivent une formation pr?paratoire th?orique sur site ou de type visio / webinaire en amont de la formation pratique de fa?on ? minimiser le nombre d'animaux utilis?s. Pour r?pondre ? ce m?me objectif de r?duction, les partenaires qui d?veloppent les dispositifs m?dicaux ont ?galement d?velopp?s des outils d?apprentissage avec simulateurs ainsi que des proc?dures permettant de travailler sur des organes explant?s. La pr?cision croissante des outils d?imagerie fonctionnelle permet ?galement de gagner en pr?cision dans les techniques d?implantation et d??valuation des dispositifs et tend ? r?duire le nombre d?animaux n?cessaires.

Raffinement

Les mod?les animaux suivront exactement le cheminement d?un futur patient avec les m?mes exigences et techniques m?dicales mises en oeuvre pour la r?alisation des interventions (personnel hautement qualifi?, plateaux techniques op?ratoires et d?imagerie de pointe). L?ensemble des proc?dures est con?u pour r?duire au maximum le stress, l?angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours syst?matique ? l?anesth?sie g?n?rale durant les interventions d?imagerie et les proc?dures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site m?me des animaleries permet de r?aliser ces examens sur place, r?duisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associ?. Les param?tres vitaux sont enregistr?s et contr?l?s par des techniciens sp?cialis?s en anesth?sie afin d?adapter les perfusions, l?assistance respiratoire et les dosages d?anesth?siques et d?antalgiques. Un suivi de la temp?rature est r?alis? pendant toute la proc?dure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le syst?me de couverture de r?chauffement Bair Hugger? ou des tapis chauffants sont utilis?s. Les protocoles de r?animation sont standardis?s et r?alis?s par des v?t?rinaires chirurgiens sp?cialis?s. Pendant ces proc?dures, des protocoles de prise en charge multimodale de la douleur sont syst?matiquement appliqu?s. En amont des proc?dures, les animaux sont h?berg?s syst?matiquement en groupe sociaux, ils ont acc?s ? un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'h?bergement contr?l?es et ma?tris?es (temp?rature, hygrom?trie et ventilation). Des points limites stricts et sp?cifiques sont appliqu?s tout au long du projet. Les transports d'animaux entre les 2 EU (35 km) seront r?alis?s ? l'aide de v?hicules de types camionnettes ferm?es ayant re?u une autorisation AT1 d?livr?e par la DDPP, ventil?s, climatis?s et sp?cialement ?quip?s pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antid?rapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des temp?ratures lors des trajets, syst?me de surveillance vid?o des animaux). Les personnels en charge sont form?s et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est valid? par un V?t?rinaire.

Choix des espèces

Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l?Homme dans les conditions fonctionnelles de l?organe dans l?organisme vivant pour mimer au mieux la r?alit? d?une intervention, avec l'utilisation d'?quipements de chirurgie et d'imagerie standards utilis?s chez l'Homme. Les diff?rences intersp?cifiques de nature tissulaire, de forme, de taille anatomique et de fonction requi?rent l?emploi de diff?rentes esp?ces de grande taille. Pour chaque formation, le mod?le animal retenu sera identifi? pr?alablement en fonction du dispositif, de ses indications et des sp?cificit?s et des similitudes anatomiques avec l?Homme: les ovins pour les formations int?ressant les domaines de la cardiologie, de la chirurgie vasculaire et de la neurologie principalement, les porcins pour les formations int?ressant les domaines de la gastro-ent?rologie, de l'ophtalmologie et de la cardiologie principalement, plus sp?cifiquement les canins pour la chirurgie des auricules cardiaques et les bovins pour les dispositifs d'assistance cardiaque. Les animaux utilis?s pourront ?tre des juv?niles ou des adultes. L?objectif scientifique est d?avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable ? celle observ?e chez l?Homme.

Quinze séances de prélèvement par porcelet, dont treize écouvillons nasaux et treize prélèvements de fèces : 48 cochons sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever poumons et ganglions. Une partie est vaccinée, puis tous sont exposés au virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin ou à un tampon témoin, exposition qui peut provoquer chez 10 à 50 % d'entre eux une fièvre dépassant 40 °C pendant un à trois jours, de la toux, des éternuements et une baisse d'appétit. Trois échographies pulmonaires sont réalisées sous anesthésie, et le porteur envisage d'en tenter quelques-unes sans anesthésie pour en évaluer la faisabilité. Le bénéfice annoncé à court terme est d'informer éleveurs et vétérinaires "d'un effet (ou non) d'une supplémentation alimentaire en algues sur la réponse vaccinale anti-SDRP", une supplémentation que le porteur décrit comme "peu chère et facile à mettre en place en élevage".

Objectifs

Le syndrome dysg?n?sisque et respiratoire porcin (SDRP) est une maladie virale tr?s fr?quente chez les porcs en ?levage intensif dans le monde, avec des impacts ? la fois ?conomiques et sur le bien-?tre des animaux. Il provoque des troubles de la reproduction chez les femelles adultes, des troubles respiratoires qui peuvent ?tre l?taux chez les porcelets allait?s, et augmente la sensibilit? aux infections bact?riennes secondaires, conduisant ? une surutilisation des antibiotiques. Il existe des vaccins qui r?duisent les sympt?mes sans emp?cher la transmission du virus. Depuis une dizaine d'ann?es, les extraits d'algues, utilis?s dans les traitements ? court terme ou lors de la vaccination, sont empiriquement reconnus par les ?leveurs pour leurs effets positifs sur la sant? des porcs. Ce projet a pour objectif d??valuer l?effet d?une suppl?mentation alimentaire en extraits d?algues sur l?am?lioration de l?efficacit? des vaccins anti-SDRP chez le porc : les r?sultats auront une port?e ? la fois clinique (avec l?am?lioration potentielle de l?efficacit? des vaccins commerciaux par une suppl?mentation alimentaire) et plus fondamentale (avec l??tude de la stimulation immunitaire par le vaccin et par les algues). Notre ?tude pr?c?dente a montr? qu?une suppl?mentation en extrait d?algues des porcs pendant 3 jours autour de la vaccination anti-SDRP induisait des changements globaux du syst?me immunitaire, comme observ? dans le sang. De plus, cette suppl?mentation a ?galement augment? la r?ponse vaccinale, mesur?e par le taux d?anticorps totaux dirig?s contre le virus. Ces r?sultats encourageants ne permettent cependant pas d??valuer l?effet de la suppl?mentation en algue sur la protection r?elle contre la maladie. Pour cela il nous faut infecter les animaux vaccin?s afin de mesurer si les animaux suppl?ment?s en algues pr?sentent moins de sympt?mes (protection clinique) et moins de virus (protection viral) que les animaux non-suppl?ment?s en algues. Ce projet permettra de r?pondre ? ces questions. En plus d??valuer l?efficacit? du vaccin avec ou sans suppl?mentation en algues pour prot?ger sp?cifiquement contre la maladie SDRP, nous ?tudierons l?impact des algues et du vaccin sur les r?ponses immunitaires non-sp?cifiques, appel?es r?ponses inn?es. Ce ph?nom?ne pourrait ?tre induit par les extraits d?algues ou le vaccin att?nu?, et permettre une meilleure protection g?n?rale contre toutes les maladies respiratoires rencontr?es par les animaux.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet informera les ?leveurs et v?t?rinaire d?un effet (ou non) d?une suppl?mentation alimentaire en algues sur la r?ponse vaccinale anti-SDRP. Une suppl?mentation alimentaire sur 3 jours autour de la vaccination est peu ch?re et facile ? mettre en place en ?levage ? certains ?levage utilisant d?j? de telles suppl?mentations au quotidien ? certaines p?riodes de vie ? et pourrait ?tre recommand?e. L?am?lioration de la vaccination anti-SDRP ?tant un enjeu majeur en ?levages porcin. A moyen terme, les r?sultats concernant l?immunit? entra?n?e seront un premier pas ? la compr?hension de ce m?canisme chez le porc. Si le vaccin en lui-m?me ou la suppl?mentation en algues induisent un entra?nement b?n?fique des monocytes et/ou des macrophages cela permettrait d?am?liorer les protocoles vaccinaux en ?levage. Il serait alors ?galement int?ressant d??valuer ce m?canisme lors d?autres vaccinations contre d?autres pathog?nes et avec diff?rents types de vaccins. A long terme, ces donn?es participeront ? une meilleure compr?hension du fonctionnement de ce vaccin et de la suppl?mentation en algues, participant au corpus de donn?es n?cessaire ? l?am?lioration de la pr?vention du SDRP et de la conduite d??levage porcin face aux pathog?nes respiratoires.

Procédures

Les animaux seront pr?lev?s 15 fois sur la totalit? de l?exp?rimentation, avec au minimum un pr?l?vement de sang. Parmi ces 15 dates de pr?l?vements, 13 d?entre elles comporteront ?galement un ?couvillon nasal (en alternant les narines entre 2 pr?l?vements) et 13 d?entre elles comporteront des f?ces (dur?e entre 1 et 3 min). Une partie des animaux sera vaccin?e ? J0. Tous les animaux seront expos?s, soit ? un tampon, soit au virus SDRP. Trois ?chographies pulmonaires seront r?alis?es au cours de l?exp?rimentation sur animal anesth?si? (au maximum 20 minutes). Nous pourrons tester l??chographie sans anesth?sie (comme fait sur l?homme) sur quelques animaux pour en ?valuer la faisabilit?.

Impact sur les animaux

La suppl?mentation en algue et la vaccination ne devraient engendrer aucun effet ind?sirable, elles sont d?j? largement utilis?es en ?levage et nous avons d?j? test? ces techniques dans une ?tude pr?c?dente sans observer d?effet sur les animaux. L?exposition ? une souche peu virulente de virus SDRP peut induire chez 10 ? 50% des animaux une hyperthermie courte et mod?r?e (>40?C, mais atteignant rarement plus de 41?C pendant 1 ? 3 jours, alors que la temp?rature corporelle normal d?un porc est de 39?C). Une possible toux et des ?ternuements, avec ?ventuellement une respiration rapide et une l?g?re baisse d?app?tit peuvent ?tre observ?s jusqu?? 2 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasi?s pour pouvoir collecter diff?rents organes d?int?r?t : les poumons, les ganglions.

Remplacement

Des exp?riences pr?liminaires ont ?t? r?alis?es in vitro pour tester diff?rents lots d?extraits d?algues et leur effet sur les cellules immunitaires. Cependant, l?effet d?une mol?cule in vitro et son effet apr?s ingestion et passage par le syst?me digestif in vivo ne sont ?videmment pas similaires. De plus, il est impossible de pr?dire l?effet des extraits d?algues sur la mise en place des r?ponses immunitaires adaptatives (anticorps) ? l?aide d?exp?rimentation in vitro car cette r?ponse immunitaire d?pend d?un trop grand nombre de param?tres incluant l?immunit? de la m?re pendant la gestation et l?allaitement, le d?veloppement embryonnaire, le processus de production des cellules immunitaires dans la moelle osseuse et le thymus, et des param?tres de stimulation du syst?me immunitaire inn? qui ne sont pas encore connus.

Réduction

Le nombre d?animaux d?fini pour l??tude a ?t? d?termin? en tenant compte de la variabilit? inter-individuelle chez le porc, en nous basant sur nos exp?riences pr?c?dentes et la litt?rature Ainsi, le nombre d?animaux par groupe nous permettra de comparer ? l?aide d?ANOVA ou de t-tests les param?tres mesur?s (taux d?anticorps neutralisants et charge virale notamment) entre les groupes. De plus, avant de r?aliser cette ?tude, une premi?re ?tude in vivo avait ?t? r?alis?e en ?levage porcin conventionnel avec des pr?l?vements de sang et de fluides nasaux, sans euthanasies des animaux. Ces premi?res donn?es nous ont permis d?affiner le protocole et de r?duire le nombre d?animaux n?cessaires.

Raffinement

Les animaux seront h?berg?s en lots de 6 animaux stables au cours de toute la dur?e d??tude (3 m?les et 3 femelles). Les lots peuvent se voir et se sentir. Ils seront aliment?s ? volont? et auront acc?s ? discr?tion ? l?eau. Le confort thermique sera assur? par des lampes chauffantes ou par la temp?rature de l?animalerie. Il y aura un ballon et un nunchaku ou/et cha?nes dans chaque lot pour permettre les jeux. L?exp?rimentation commencera par 2 semaines d?acclimatation pour que les porcelets s?habituent ? leur nouvel environnement. Cette p?riode permet ?galement aux animaliers de ? conna?tre ? les animaux. Un renforcement positif sera mis en place avec des fraises tagada ou du pop-corn ou autres. Les porcelets seront ?galement entra?n?s ? recevoir la suppl?mentation orale en algue avec une ? deux premi?res sessions avec du jus de pomme. Certains pr?l?vements (animaux dont le poids est sup?rieur ? 30 kg) et expositions au virus seront r?alis?s sur animaux anesth?si?s. Le suivi des animaux sera fait en partie par t?l?m?trie (syst?me Plexx) gr?ce ? des puces de temp?ratures. La prise de temp?rature se prendra avec un lecteur et l?animalier viendra biper les animaux. Les puces seront administr?es par l??leveur.

Choix des espèces

Le porc est l?esp?ce cible de la maladie cible (SDRP) ainsi que des traitements (suppl?mentation alimentaire en algue et vaccination) ?tudi?s. Les animaux seront utilis?s apr?s le stade sevrage ce qui correspond ? la p?riode o? il y a transfert entre ?levage et potentiellement contamination. Le stress g?n?r? par ces transferts rend les animaux plus sensibles aux maladies. Un m?lange de m?les et de femelles (50/50) sera fait dans les groupes. La vaccination en ?levage a ?galement lieu ? la p?riode d?finie dans l??tude afin d??tre au plus pr?s des conditions des ?leveurs.