Recherche appliquée

Former des professionnels de santé à l'implantation de dispositifs médicaux sur des animaux non-humains anesthésiés dont les organes ont la taille de ceux des humains : 600 moutons, 400 cochons, 100 bovins et 25 chiens sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils subissent des prélèvements sanguins pouvant aller jusqu'à un par semaine, des examens d'imagerie et des interventions chirurgicales sous anesthésie générale qui peuvent durer plusieurs heures, précédées d'une mise à jeun de six à seize heures selon l'espèce. Le porteur écrit que tous doivent être mis à mort en fin de procédure pour "parachever la formation en réalisant les prélèvements et analyses ex-vivo", les stagiaires évaluant ensuite à l'œil nu l'organe et le dispositif implanté. Le bénéfice déclaré tient en une phrase, "Répondre à l'obligation de formation des professionnels de santé à la technique d'implantation d'un nouveau dispositif médical", et l'effectif de 1 125 a été fixé sans calcul statistique.

Objectifs

Chaque ann?e de nouveaux dispositifs implantables issus de la recherche sont disponibles pour les professionnels de sant? (en cardiologie, en gastro-ent?rologie, en neurologie, en ophtalmologie et en urologie par exemple) et permettent de soutenir les fonctions d?un organe d?faillant, surveiller les activit?s physiologiques ou administrer des m?dicaments afin de prolonger la survie, traiter une pathologie et am?liorer le confort de vie des patients. On entend par dispositif implantable tout dispositif destin? ? ?tre implant? de fa?on invasive en totalit? dans le corps humain ou ? remplacer une surface ?pith?liale gr?ce ? une intervention chirurgicale et ? demeurer apr?s l'intervention de fa?on temporaire ou d?finitive. Les professionnels de sant? ont l?obligation de se former ? l?utilisation de ces nouveaux dispositifs. L?utilisation d?un dispositif m?dical par un professionnel de sant? ou un patient ne peut se faire sans une information de l?utilisateur, voire une formation pr?alable, elle requiert un apprentissage permettant d?utiliser le mat?riel afin d?optimiser ses performances et de s?approprier les gestes permettant d?assurer ? l?utilisateur une s?curit? maximale d?utilisation. Un m?me produit, s?il est utilis? ou non conform?ment aux recommandations du fabricant, aura ou non la performance valid?e lors de son ?valuation. Les dispositifs m?dicaux sont d?finis comme des produits ?utilisateur-d?pendant?. La directive 93/42/CE modifi?e relative ? l??valuation de ces dispositifs en vue de leur acc?s au march? europ?en qui soumet les industriels ? des obligations en mati?re de gestion des risques pour le produit mais ?galement son environnement, prend en compte ce caract?re ?utilisateur-d?pendant?. Les industriels sont ? ce titre, responsables du recueil, de l??valuation, de la mesure et du d?veloppement de tout ?l?ment susceptible de permettre une utilisation optimale des produits qu?ils commercialisent et d?assurer leur s?curit?. Performances et s?curit? des dispositifs m?dicaux sont corr?l?es ? la formation et ? l?exp?rience de l?utilisateur. De plus, les conditions d?utilisation des dispositifs ne peuvent se r?duire ? des questions d?observance. Ce projet vise ? former les professionnels de sant? ? l?utilisation des dispositifs m?dicaux innovants en situation r?elle sur un animal anesth?si?. Ce projet de recherche se d?roulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU 1/2 et 2/2).

Bénéfices attendus

R?pondre ? l?obligation de formation des professionnels de sant? ? la technique d?implantation d?un nouveau dispositif m?dical, ? sa bonne utilisation et ? son ?valuation fonctionnelle pour la s?curit? pour les futurs patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des pr?l?vements sanguins sur animaux vigiles ou l?g?rement s?dat?s, pour tous les animaux du projet. La fr?quence des pr?l?vements pouvant ?tre couramment d?un pr?l?vement par semaine et d'une dur?e de moins de cinq minutes - Des pr?parations ? l?anesth?sie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cath?ter et en l'injection des produits utilis?s pour la pr?m?dication et l'anesth?sie. Dur?e de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours r?alis?s sous anesth?sie g?n?rale (?vitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'? plusieurs heures en cas d?intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront ?tre r?alis?s dans les EU 1/2 et 2/2. La p?riode d'acclimatation d'une dur?e de 7 jours se fera dans l'EU 2/2. Les proc?dures chirurgicales sans r?veil de formation des professionnels de sant? ? l'utilisation des dispositifs m?dicaux innovants pourront ?tre r?alis?s dans l'EU 1/2 ou 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets ind?sirables attendus sur les animaux sont exactement les m?mes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise ? jeun (12 heures pour les porcs, 12 ? 16 heures pour les ovins et les bovins, 6 ? 12 heures pour les chiens) de l?animal pr?alablement ? l?anesth?sie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cath?ter au moment de la pr?paration de l?anesth?sie, - La phase de r?veil anesth?sique apr?s la proc?dure d'imagerie non invasive, la douleur en phase per-op?ratoire : pour ces dernier point, des mesures de raffinement sont mises syst?matiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours syst?matique ? l'anesth?sie g?n?rale pour les proc?dures d'imagerie non-invasive et chirurgicales avec surveillance du r?veil anesth?sique dans des espaces calmes et sp?cialement am?nag?s, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens sp?cialement form?s supervis?s par des V?terinaires et la prise en charge multimodale de l'analg?sie per-op?ratoire avec l'usage syst?matique de traitements anti-inflammatoire et anti-douleur opiac?s y compris de traitements permettant une analg?sie par voie locale).

Devenir

Pour r?pondre ? l?obligation de formation des professionnels de sant? ? la technique d?implantation d?un nouveau dispositif m?dical, ? sa bonne utilisation et ? son ?valuation fonctionnelle pour la s?curit? des futurs patients, il est n?cessaire de proc?der ? l'euthanasie de tous les animaux du projet en fin de proc?dure pour parachever la formation en r?alisant les pr?l?vements et analyses ex-vivo et permettre aux professionnels d??valuer macroscopiquement l?organe et le dispositif juste implant?s.

Remplacement

La formation des professionnels de sant? aux m?thodes d?implantation des dispositifs m?dicaux regroupe les notions de ma?trise du geste chirurgical mais aussi d??valuation fonctionnelle en temps r?el au moment de l?implantation gr?ce ? l?imagerie. La r?ponse de l?organisme lors des diff?rentes phases de l?implantation du dispositif et son suivi simultan? par des m?thodes d?imagerie pour en assurer l??valuation fonctionnelle n?cessite une formation sur un animal vivant. Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l?homme dans des conditions fonctionnelles qui reproduisent la fonction de l?organe vivant dans l?organisme afin de mimer au mieux la r?alit? d?une intervention.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? ?valu? prospectivement en prenant en compte l'exp?rience du laboratoire sur d'autres projets avec ce m?me type d'approche, et r?duit au minimum n?cessaire pour r?pondre aux objectifs scientifiques et aux besoins en formations du projet, aucune approche statistique n'a ?t? r?alis?e. Pour r?duire le nombre d?animaux, des s?lections par m?thodes d?imagerie peu invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX ?), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d?int?r?t. Les professionnels de sant? en formation re?oivent une formation pr?paratoire th?orique sur site ou de type visio / webinaire en amont de la formation pratique de fa?on ? minimiser le nombre d'animaux utilis?s. Pour r?pondre ? ce m?me objectif de r?duction, les partenaires qui d?veloppent les dispositifs m?dicaux ont ?galement d?velopp?s des outils d?apprentissage avec simulateurs ainsi que des proc?dures permettant de travailler sur des organes explant?s. La pr?cision croissante des outils d?imagerie fonctionnelle permet ?galement de gagner en pr?cision dans les techniques d?implantation et d??valuation des dispositifs et tend ? r?duire le nombre d?animaux n?cessaires.

Raffinement

Les mod?les animaux suivront exactement le cheminement d?un futur patient avec les m?mes exigences et techniques m?dicales mises en oeuvre pour la r?alisation des interventions (personnel hautement qualifi?, plateaux techniques op?ratoires et d?imagerie de pointe). L?ensemble des proc?dures est con?u pour r?duire au maximum le stress, l?angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours syst?matique ? l?anesth?sie g?n?rale durant les interventions d?imagerie et les proc?dures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site m?me des animaleries permet de r?aliser ces examens sur place, r?duisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associ?. Les param?tres vitaux sont enregistr?s et contr?l?s par des techniciens sp?cialis?s en anesth?sie afin d?adapter les perfusions, l?assistance respiratoire et les dosages d?anesth?siques et d?antalgiques. Un suivi de la temp?rature est r?alis? pendant toute la proc?dure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le syst?me de couverture de r?chauffement Bair Hugger? ou des tapis chauffants sont utilis?s. Les protocoles de r?animation sont standardis?s et r?alis?s par des v?t?rinaires chirurgiens sp?cialis?s. Pendant ces proc?dures, des protocoles de prise en charge multimodale de la douleur sont syst?matiquement appliqu?s. En amont des proc?dures, les animaux sont h?berg?s syst?matiquement en groupe sociaux, ils ont acc?s ? un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'h?bergement contr?l?es et ma?tris?es (temp?rature, hygrom?trie et ventilation). Des points limites stricts et sp?cifiques sont appliqu?s tout au long du projet. Les transports d'animaux entre les 2 EU (35 km) seront r?alis?s ? l'aide de v?hicules de types camionnettes ferm?es ayant re?u une autorisation AT1 d?livr?e par la DDPP, ventil?s, climatis?s et sp?cialement ?quip?s pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antid?rapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des temp?ratures lors des trajets, syst?me de surveillance vid?o des animaux). Les personnels en charge sont form?s et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est valid? par un V?t?rinaire.

Choix des espèces

Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l?Homme dans les conditions fonctionnelles de l?organe dans l?organisme vivant pour mimer au mieux la r?alit? d?une intervention, avec l'utilisation d'?quipements de chirurgie et d'imagerie standards utilis?s chez l'Homme. Les diff?rences intersp?cifiques de nature tissulaire, de forme, de taille anatomique et de fonction requi?rent l?emploi de diff?rentes esp?ces de grande taille. Pour chaque formation, le mod?le animal retenu sera identifi? pr?alablement en fonction du dispositif, de ses indications et des sp?cificit?s et des similitudes anatomiques avec l?Homme: les ovins pour les formations int?ressant les domaines de la cardiologie, de la chirurgie vasculaire et de la neurologie principalement, les porcins pour les formations int?ressant les domaines de la gastro-ent?rologie, de l'ophtalmologie et de la cardiologie principalement, plus sp?cifiquement les canins pour la chirurgie des auricules cardiaques et les bovins pour les dispositifs d'assistance cardiaque. Les animaux utilis?s pourront ?tre des juv?niles ou des adultes. L?objectif scientifique est d?avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable ? celle observ?e chez l?Homme.

Produire en série un parasite génétiquement modifiable : 115 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs cæca, y mesurer la charge parasitaire et y noter les lésions. Chacun reçoit Eimeria tenella par la bouche ou par le cloaque, à une dose que le porteur dit calculée pour ne pas déclencher de symptômes, la coccidiose clinique donnant sinon perte d'appétit, soif intense, crête décolorée, prostration et diarrhées sanglantes. Le rendement attendu est de dix millions d'oocystes par poulet infecté, et il faut recommencer régulièrement pour "préserver l'infectiosité de la nouvelle souche transgénique générée". Le porteur écrit avoir publié une culture in vitro qui "permet d'accéder à la totalité des stades du cycle parasitaire", puis qu'elle "ne reproduit que la 1ere multiplication asexuée" et "ne couvre pas la fin du cycle".

Objectifs

Les coccidioses représentant un problème majeur en élevage aviaire, elles entraînent de lourdes pertes économiques. Ces parasitoses sont causées par des apicomplexes intracellulaires obligatoires dont Eimeria tenella. Face au coût élevé des vaccins et l’émergence de parasites résistants aux anticoccidiens, il devient urgent d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. La possibilité de modifier génétiquement le parasite serait un outil précieux pour nos recherches portant sur la compréhension du parasite et la mise en place de nouvelles stratégies de contrôle : suivi de l’infection in vitro et in vivo, identification de facteurs de virulence, génération de mutants ou de vaccins, test d’efficacité de nouveaux traitements. Ce projet a pour but de créer une souche d’Eimeria tenella génétiquement modifiable par des systèmes tels que CRISPR/Cas9 pour réaliser de l’édition de génome dite « propre » et servira de souche de base pour la génération des souches transgéniques pour les recherches futures de l’équipe.

Bénéfices attendus

Le développement d’une souche d’E. tenella génétiquement modifiable permettra d’accélérer les recherches conduisant à l’identification de nouvelles molécules. En effet, cette nouvelle souche premettra de rendre diverses applications possibles (ex : génération de mutants ou de vaccins, identification et caractérisation de facteurs de virulence parasitaires par génétique inverse) plus aisées, robustes et rapides au laboratoire (ex : criblage et test d’efficacité de nouveaux traitements, suivi d’infection in vitro). Des multiplications régulières sur animaux sont nécessaires pour préserver l’infectiosité de la nouvelle souche transgénique générée et ainsi permettre la continuité des études au laboratoire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration par voie orale ou cloacale du parasite Eimeria à une dose qui ne cause pas de morbidité et qui n’induit pas de signes cliniques proches du point limite. L’objectif est de générer une souche d’Eimeria tenella génétiquement modifiable. L’inoculation est réalisée au fond de la cavité buccale de l’animal et n’est pas invasive comme le serait un gavage dans lequel l’embout serait inséré jusqu’à l’oesophage. L’inoculation est de courte durée (20s maximum). De même l’inoculation par voie cloacale n’est pas invasive et est de courte durée (10s). Aucune douleur n'est attendue suite aux deux types d’inoculations. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Elle est effectuée par du personnel expérimenté.

Impact sur les animaux

En coccidiose aviaire, on ne parle pas de virulence mais plutôt de pouvoir pathogène des parasites car la gravité de l’infection est dépendante de la dose infectieuse. La coccidiose clinique est très symptomatique, avec une perte d’appétit, une perte de poids, une soif intense, une crête décolorée, des modifications du comportement (oiseaux prostrés, ailes pendantes), et des diarrhées sanglantes. Ces signes impactent fortement la croissance des jeunes et le taux de ponte des poules. En élevage, la plupart des cas de coccidiose sont des infections subcliniques, qui impactent les performances zootechniques des oiseaux, sans symptômes visibles. Dans le cadre de nos travaux, les doses inoculées aux poulets sont faibles et n’induisent pas de symptômes cliniques. La contention lors des inoculations peut engendrer un stress estimé comme léger et de très courte durée.

Devenir

Pour chaque procédure de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever différents tissus (caeca) et de pouvoir analyser la charge parasitaire contenue et le scoring des lésions.

Remplacement

L’équipe a publié une méthode de culture in vitro qui permet d’accéder à la totalité des stades du cycle parasitaire. Il s’agit là d’une preuve de concept et en aucun cas d’une méthode de production de parasites en grande quantité. La culture in vitro ne reproduit que la 1ere multiplication asexuée (production de mérozoïtes) et ne couvre pas la fin du cycle, c’est-à-dire, les 2 autres multiplications asexuées puis la reproduction sexuée (qui génère les oocystes). Nous avons publié une preuve de concept : avec une souche vaccinale (qui ne fait qu’une seule multiplication asexuée) et sur culture primaire de cellule de rein de poulet, on a réussi à produire in vitro quelques oocystes. Mais la manipulation des Eimeria nécessite la reproduction de 10e7 oocystes (c’est le rendement obtenu pour chaque poulet infecté).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dépend de la prolificité de la souche et du nombre de parasites requis. Pour la souche sauvage utilisée au laboratoire, le rendement en parasites produits peut être déterminé. En revanche pour la souche recombinante à générer, nous n’avons aucune donnée sur sa prolificité.

Raffinement

Chaque inoculum fait l'objet d'une attention particulière pour administrer des doses définies et adaptées à l’espèce présente et ainsi éviter toute pathogénicité. Pour un rendement optimal, la muqueuse intestinale ne doit pas être trop abîmée. Il est donc inutile d’inoculer une dose trop forte de parasites qui pourrait induire des effets pathogènes et donc provoquer de la douleur. Même si la dose inoculée est calculée de manière à ne pas induire de pathogénicité, nous restons vigilants à l’état de santé des animaux : après inoculation de l’agent infectieux, deux visites quotidiennes sont réalisées dans la salle expérimentale afin de surveiller l’éventuelle apparition des premiers symptômes liés à la maladie : plumes ébouriffées, prostration. Ils sont hébergés par groupe de 3 à 20 animaux en parquet, sur litière de miscanthus pour éviter les poussières ou bien en cage, selon les disponibilités des salles d’expérimentation. Ils ont à disposition aliment et eau ad libitum. Pour le raffinement des conditions d’hébergement, des petites plateformes triangulaires ont été placées pour permettre aux poulets de se percher à l’intérieur des parquets.

Choix des espèces

A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative suffisamment efficace (in vitro) pour multiplier les parasites, en routine et en grande quantité. Le poulet est l’espèce hôte exclusive chez laquelle se multiplient les parasites. Des poulets de statut sanitaire contrôlé seront utilisés. L’étroitesse du spectre d’hôtes des parasites du genre Eimeria empêche toute tentative de manipulation d’une espèce parasitaire aviaire sur un modèle animal autre que la poule. Les animaux sont utilisés entre 3 et 7 semaines d’âge, considéré comme l’âge optimum pour un meilleur rendement en parasite.

Toutes tuées à l'issue pour prélever organes et fluides, 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une seule inoculation d'Escherichia coli, dans le péritoine pour une infection généralisée, dans la vessie ou dans le nez sous anesthésie générale pour une infection urinaire ou pulmonaire, avec un prélèvement de sang au bout de la queue sur souris éveillée, puis sept jours de suivi. Le porteur attend une inflammation de l'appareil urinaire et un affaiblissement de l'état général, et fait mettre à mort les souris qui atteignent un point limite fixé par un score clinique noté en aveugle. Il décrit des tests déjà conduits sur cellules en culture, puis affirme que le recours à l'animal reste "irremplaçable" parce qu'aucun tube à essai ne permet de suivre la dissémination de la bactérie entre les organes.

Objectifs

L'étude des facteurs de virulence d'Escherichia coli (E. coli) est importante pour mieux comprendre comment cette bactérie provoque des infections. E. coli est une bactérie naturellement présente dans l'intestin de l'Homme et de nombreux animaux. La plupart des souches sont inoffensives, mais certaines peuvent provoquer des infections parfois graves lorsqu'elles atteignent d'autres organes. Dans ce projet, l'étude porte sur plusieurs types d'infections causées par E. coli : les infections pulmonaires, urinaires et généralisées (septicémie). Ces infections sont de plus en plus fréquentes, notamment à l'hôpital, en particulier chez les patients fragiles, immunodéprimés ou intubés. L'utilisation de modèles murins permet d'étudier, dans un organisme vivant, les mécanismes qui rendent certaines souches de E. coli plus agressives que d'autres. Ces mécanismes comprennent notamment la production de toxines, la capacité de la bactérie à se fixer aux cellules de l'organisme ou à échapper aux défenses immunitaires. Ces recherches permettent de mieux comprendre le développement des infections causées par E. coli. Elles peuvent également aider à identifier de nouvelles cibles pour développer des traitements ou des stratégies de prévention. Cette démarche est particulièrement importante car certaines souches de E. coli deviennent de plus en plus résistantes aux antibiotiques. Mieux connaître les mécanismes qui leur permettent de provoquer une infection peut contribuer à mettre au point de nouvelles approches thérapeutiques, complémentaires ou alternatives aux antibiotiques actuels.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de cette étude sont multiples. Sur le plan fondamental, elle permettra d’identifier les déterminants moléculaires impliqués dans la capacité de certaines souches d’Escherichia coli à coloniser l'hôte, à induire une réponse inflammatoire excessive ou à échapper aux défenses immunitaires. Cette meilleure compréhension des interactions hôte-pathogène contribuera à élucider les mécanismes spécifiques qui différencient les souches commensales (innofensive) des souches pathogènes (qui induisent une maladie). Sur le plan appliqué, ces connaissances pourraient déboucher sur le développement de nouveaux outils diagnostiques permettant de prédire le potentiel pathogène d’une souche, ou sur l’identification de cibles thérapeutiques innovantes, notamment en dehors des approches antibiotiques classiques. À plus long terme, cette étude pourrait ainsi participer à la mise en place de stratégies préventives et thérapeutiques mieux adaptées aux infections à E. coli, en particulier dans un contexte de résistance croissante aux antimicrobiens.

Procédures

Les animaux sont répartis dans trois modèles d'infection selon l'objectif de l'étude : Infection généralisée : injection intrapéritonéale d'une suspension d'Escherichia coli (environ 1 minute), avec ou sans administration d'antibiotique selon le protocole (environ 1 minute). Infection urinaire : administration d'une suspension bactérienne dans la vessie par voie intravésicale sous anesthésie générale (environ 1 minute) avec ou sans administration d'antibiotique selon le protocole (environ 1 minute). Infection pulmonaire : administration d'une suspension bactérienne par voie intranasale sous anesthésie générale (environ 2 minutes) avec ou sans administration d'antibiotique selon le protocole (environ 1 minute). Chaque animal ne subit qu'une seule inoculation bactérienne. Un prélèvement sanguin à l'extrémité de la queue peut être réalisé sur animal vigile (environ 1 à 2 minutes) afin d'étudier la réponse immunitaire de l'organisme. Les animaux sont suivis jusqu'à 7 jours avec une surveillance clinique régulière. À la fin de l'étude, ou si un point limite est atteint, les animaux sont mis à mort selon une méthode réglementaire afin de permettre le prélèvement des organes pour les analyses.

Impact sur les animaux

Certaines de ces procédures expérimentales pourront entrainer des effets indésirables chez l’animal avec des effets locaux (inflammation de l’appareil urinaire) ou encore systémiques (affaiblissement de l’état général par exemple). Pour les effets locaux nous prévoyons d'utiliser un anesthésiant local, pour les effets systémiques nous aménagerons l'environnement de la souris pour qu'elle ait un accès facilité à la nourriture et la boisson. La gestion de la douleur engendrée par ces différentes procédures sera suivi à l’aide d’une grille d’évaluation de score clinique. Lorsqu'un point limite sera atteint l'animal en questionsera mis à mort et autopsié.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des organes et fluides biologiques nécessaires aux analyses microbiologiques, histologiques, immunologiques et moléculaires prévues dans le projet. Ces analyses nécessitent la collecte de tissus qui ne peut être réalisée sur des animaux maintenus en vie. Aucun animal ne pourra donc être réutilisé, replacé ou maintenu en vie à l’issue de la procédure.

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives in vitro ont été préalablement réalisées pour démontrer l'impact des différentes souches mutées ou des inhibiteurs sur les cellules eucaryotes en culture. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’examiner la dissémination bactérienne entre les différents organes. De plus les objectifs sont de découvrir le(s) rôle(s) des différents facteurs de virulences sur la colonisation de E. coli, ainsi que d’identifier des inhibiteurs de E. coli qui permettront de diminuer sa virulence et enfin de mesurer les effets des facteurs environnementaux sur leur expression in vivo. En effet suivant l’organe cible de E. coli, l’environnement sera forcément très différent (exemple vessie vs poumons). Or on sait que les interactions entre la bactérie et son environnement vont être très importants et non négligeables dans notre étude, et cette interaction complexe ne peut être modélisée in vitro.

Réduction

L’ensemble des modèles décrit dans cette saisine sont déjà mis en place au laboratoire : modèle d’injection dans la vessie, du sepsis ou encore de l’infection pulmonaire. De plus nous utiliserons des inhibiteurs déjà testés in vitro et décrit dans la littérature ou utilisés chez l’homme dans d’autres contextes. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (signes cliniques, charge bactérienne, prélèvements de tissus et fluides lors de la nécropsie) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. De plus une étude longitudinale de la présence de bactérie sera réalisée avec un système de visualisation 3D sur animal vigile. Cet outil nous permettra de suivre le niveau d’infection des souris de manière longitudinale sans les euthanasier, nous permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées au nombre de 5 par cage en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 2 fois par mois (tous les 15 jours). Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont 5-10 jours d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement et plus fréquemment pendant les phases aigues. Les points limites seront définis selon une valeur objective de score clinique obtenue par observation « en aveugle » de chaque animal (l’observateur n’a pas connaissance du groupe expérimental afin de réduire le biais cognitif). Si un point limite est atteint alors l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude des facteurs de virulence de E. coli dans des conditions in vivo. De plus la littérature sur les différents modèles proposés avec E. coli est largement décrite. Nous utliserons des souris de 5 à 9 semaines suivant le modèle expérimental. Dans la littérature, les souris utilisées pour les différents modèles décrits sont classiquement âgées entre 6 à 9 semaines. Nous prenons une marge d’une semaine pour respecter la période d’acclimatation.

Injectées une fois par jour pendant dix jours, contenues à chaque administration, pesées deux fois par semaine, 6 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite les tests moteurs, poutre, rotarod jusqu'à 40 tours par minute et agrippement, puis l'open field pendant trente minutes et cinq minutes de nage forcée, chacun précédé d'une nouvelle injection. Sept jours d'hébergement individuel en cage calorimétrique, sans enrichissement, closent le protocole avant la mise à mort et le prélèvement des organes. Le porteur écrit que le nombre de souris "est réduit à son minimum" et le rattache à la littérature et à sa propre expérience, sans donner de calcul pour ces 6 780 individus.

Objectifs

La perte d’appétit, pouvant aller jusqu’à l’anorexie, est un problème fréquent dans de nombreuses situations de maladie ou après des épisodes de stress physique ou psychologique importants. Elle peut entraîner une perte de poids, une fatigue marquée et une dégradation de l’état général, rendant le rétablissement plus difficile. Ce phénomène constitue aujourd’hui un enjeu important pour la santé. Le projet vise à étudier l’effet de différentes substances capables d’agir sur ces mécanismes biologiques de faim, afin de mieux comprendre comment l’appétit et l’équilibre énergétique peuvent être influencés. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour limiter la perte d’appétit et améliorer l’état nutritionnel dans des situations de maladie sévère.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes biologiques impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Il permettra d’identifier et de comparer des substances susceptibles de moduler ces paramètres, et de sélectionner les candidats présentant les profils d’efficacité et de tolérance les plus favorables.

Procédures

Injections (10 max par souris; 1 fois par jour pendant 10 jours; durée

Impact sur les animaux

Administrations (injections et contention quotidienne) : peuvent provoquer une douleur légère au point d’injection et un stress transitoire lié à la manipulation, sans chirurgie ni anesthésie générale. Variations de prise alimentaire induites par les composés : peuvent entraîner des fluctuations du poids corporel (jusqu’à une perte de poids significative) avec possible altération transitoire de l’état général (baisse d’activité, pelage altéré, posture inhabituelle). Tests locomoteurs, moteurs et comportementaux : peuvent induire un stress aigu et transitoire lié à l’environnement nouveau et à l’effort demandé. Calorimétrie indirecte : l’hébergement individuel et l’absence d’enrichissement pendant l’enregistrement peuvent générer une gêne/anxiété transitoire liée à l’isolement.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Pour étudier de manière intégrée la prise alimentaire, le poids corporel, le comportement et le métabolisme énergétique, un modèle souris est indispensable. La souris est le modèle le plus pertinent pour cette étude, car elle présente des similitudes avec la physiologie humaine et constitue une référence largement utilisée dans les travaux sur la régulation métabolique.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience des différents modèles présentés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, des premiers tests ont été effectués in vitro.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur et aux bonnes pratiques de l’établissement utilisateur. Ils sont maintenus en cages collectives de même sexe, avec un accès ad libitum à une alimentation standard et à l’eau, en dehors des contraintes strictement nécessaires à certaines procédures expérimentales. L’environnement est systématiquement enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, favorisant l’expression des comportements naturels et contribuant à la réduction du stress. Une période d’acclimatation est respectée avant toute intervention expérimentale. Un suivi clinique régulier est assuré tout au long des procédures, permettant une détection précoce de toute altération de l’état général. Les critères surveillés incluent le comportement, l’activité spontanée, l’aspect du pelage, la posture, la mobilité et la respiration. Des points limites précoces et prédictifs, spécifiques à chaque procédure, ont été définis et appliqués de manière stricte afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique, en raison des similitudes fonctionnelles avec la physiologie humaine et de la sensibilité de la souche C57BL/6 aux variations nutritionnelles. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines d’âge. À ce stade, ils ont atteint la maturité physiologique et métabolique, garantissant la robustesse des mesures expérimentales et limitant l’impact de la croissance sur l’interprétation des résultats.

Les molécules testées sont celles de clients, administrées aux doses que ces clients ont fixées : 2 100 souris et 2 800 rats, 4 900 au total, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever tissus et sang. Une hypertension et une hypertrophie cardiaque leur sont provoquées par un régime gras et salé ou par perfusion de substances, puis les composés sont administrés une à deux fois par jour pendant quatre mois au plus. Des pompes et des capteurs de pression sont implantés au cours de chirurgies de dix à vingt minutes, souris et rats passent 40 heures en cage individuelle sans enrichissement puis 24 heures en cage à métabolisme sur grille, et courent sur tapis roulant sous stimulation électrique. Les mesures terminales se font par pose d'un cathéter dans la carotide, sous anesthésie et sans réveil, au service d'une prestation préclinique vendue à des commanditaires extérieurs.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité mondiale, il est primordial de poursuivre la recherche dans ce domaine afin d’identifier et d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels. Les atteintes cardiovasculaires peuvent se présenter sous de nombreuses formes (anomalies de la fonction cardiaque, de la structure du cœur) et sont dépendantes de nombreux facteur de risque : l’âge, le sexe, les maladies métaboliques (diabète et obésité), l’hypertension, le tabagisme, … Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie, il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie, en incluant une ou plusieurs comorbidités. Le développement de modèles prédictifs et robustes ainsi que leur utilisation en recherche pré-clinique permettront d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels.

Bénéfices attendus

Pour l’essentiel, la prise en charge des patients consiste à traiter les symptômes et les complications associées ainsi que la mise en œuvre de mesures concernant l’hygiène de vie des patients (alimentation, arrêt du tabac, activité physique). Malheureusement, cela peut s’avérer inefficace. Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie humaine, afin de comprendre les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. L’ensemble des expériences effectuées ont pour but de valider ou non l’efficacité de nouvelles cibles ou futurs médicaments. Les animaux seront traités avec les molécules de nos clients aux doses qu’ils auront déterminées.

Procédures

L’hypertension et de l’hypertrophie cardiaque seront induites chez des rats hypertendus avec ou sans régime spécifique (gras, riche en sel) ou par infusion de molécules pharmacologiques. Les composés à tester seront administrés, sur une durée maximum de 4 mois, une à deux fois par jour. L'administration dure 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Des pompes permettant une diffusion du composé en continu pourront être implantées sous la peau des animaux (chirurgie de 10 minutes sous couverture analgésique). Si le projet requiert des mesures de pressions sur animaux vigiles et/ou sur des périodes de plusieurs heures, des capteurs de pressions seront chirurgicalement implantés (chirurgie de 15-20 minutes sous couverture analgésiques) et un suivi post-opératoire sera mis en place. Des prélèvements de sang (uniques ou répétés) seront réalisés à maximum 4 reprises (2 minutes). Les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose pourront être effectués (7 mesures du taux de sucre dans le sang après administration de sucre et ce à 4 reprises pendant le projet). Les animaux seront soumis à des suivis longitudinaux de la fonction cardiaque et vasculaire sous anesthésie gazeuse (20 minutes maximum). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement (contact visuel mais pas olfactif et auditif). Pour la fonction rénale, la mise en place d’un patch, nécessitera une courte anesthésie (moins de 10 minutes) puis le test sera effectué sur animaux vigiles. La mesure des paramètres urinaires se fera en cage métabolique (24 heures, isolé sur grille). Au maximum, ces examens seront effectués avant la phase d’induction, à la fin de l’induction, au milieu et à la fin des traitements soit 4 fois. Il aura 2 examens sous anesthésie par semaine maximum. Au-delà, ils devront être distribués sur plusieurs semaines. Pour faire les échographies et fixer les patchs, nous devrons au préalable dépiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. En fin de procédure, les animaux seront soumis à un test d’effort réalisé sur un tapis de course. Les mesures terminales nécessiteront la mise en place d’un cathéter dans la carotide au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sans réveil.

Impact sur les animaux

Selon le modèle, une dysfonction cardiovasculaire sera induite plus ou moins rapidement et va engendrer chez les animaux des nuisances. Chez le rongeur, les effets indésirables se manifesteront sous différentes formes : comportementale (hyper ou hypoactivité, isolement, agressivité, hygiène), modification des prises hydriques et alimentaires (perte de poids et déshydratation), aspect général (aspect du pelage, manque d’hygiène) ... Ces altérations du comportement seront détectées lors des visites quotidiennes. Dans certains cas, les animaux seront nourris, au plus tôt à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet avec un régime enrichi en graisse et ou en sel. Cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : hypertension artérielle, obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer un inconfort. Les administrations (jusqu’à 4 mois, 1 à 2 fois par jours) et les prélèvements de sangs peuvent engendrer un stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques, bien que non invasives, nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires en cages métaboliques, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h générant un stress et un inconfort. Lors des tests de course sur tapis roulant, les animaux seront soumis à un stress et une douleur légère (stimulation électrique). Les mesures de dépense énergétique et télémétrique imposent un isolement qui engendre un stress. L’induction par infusion d’agents pharmacologiques (pour l’induction de la pathologie ou du traitement) nécessite l’implantation sous-cutanée d’une mini-pompe ; les mesures de pressions sur animaux vigiles requièrent la mise en place d’un capteur et d’un émetteur. Dans les 2 cas, la mise en place de ces 2 dispositifs se fera au cours d’une intervention chirurgicale et entrainera une convalescence des animaux les jours suivant les interventions.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus et le sang dans le but d’évaluer l’efficacité des composés grâce à des marquages histologiques, des analyses d’expression de gènes ou protéines dans le coeur, de paramètres cardiovasculaires et de la fonction rénale dans le sang...).

Remplacement

Les nouveaux médicaments doivent avoir validé leur efficacité pré-clinique (chez l’animal) avant de passer en phase clinique (chez l’homme). L’utilisation des animaux permet de réaliser ces tests dans un système intégré et donc d’augmenter la prédictibilité des effets chez l’homme. Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions cardiaques associées aux complications métaboliques, vasculaires et rénales ne peuvent être pleinement reproduites que dans un système in vivo pour le moment. Le remplacement par un animal d'une autre classe (comme le poisson zèbre) ne permettra pas une analyse aussi précise des mécanismes pathologiques à cause de sa très petite taille et contrairement aux rongeurs il n’appartient pas aux espèces réglementaires pour le développement de nouveaux médicaments.

Réduction

Le projet a été organisé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux tout en prenant en compte la mortalité (environ 10%) et la variabilité interindividuelle lors du développement de la dysfonction (10% des animaux exclus après répartition à la fin de l’induction). Ces estimations sont basées sur notre expérience, au sein de la société, des modèles induits par régime ou par agents pharmacologiques, des données bibliographiques et d’échanges avec d’autres chercheurs. La possibilité de réaliser des mesures non invasives permettra un suivi longitudinal sur les paramètres cardiovasculaires, métaboliques et rénaux pour chaque animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Par ailleurs, chaque animal est utilisé pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie.

Raffinement

Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …), nous nous scorerons son état selon la grille de score spécifique (en pièce jointe). Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une blessures cutanées un protocole de soin sera effectué (désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas, l’animal concerné sera mis à mort. Lors de la procédure, des mesures non invasives de la fonction cardiaque, vasculaire, rénale et métabolique peuvent être répétées sur un même animal (suivi longitudinal) en ayant recours à des techniques d'imagerie. Pour les mesures effectuées sur animaux vigiles, une habituation au dispositif sera réalisée. Pour les procédures qui peuvent induire de la douleur chez l’animal une analgésie pré, per et post-opératoire est mise en place pour la prévenir et la réduire.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont largement utilisés et caractérisés par la communauté scientifique afin d’évaluer les effets de molécules sur les fonctions cardiovasculaires dans des modèles de maladies cardiovasculaires. Il est possible d’induire chez ces espèces des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine (échographe, doppler, …). Le choix de l'espèce se fera en fonction des physiopathologies développées dans chacune des 2 espèces, des caractéristiques connues (publications, projets ultérieurs), des cibles thérapeutiques et des validations pharmacocinétiques, de la nature du traitement testé. L’ensemble des procédures décrites dans le projet concerne des animaux sevrés (minimum 4 semaines). Si l’étude le requiert, les expérimentations pourront être réalisées sur des animaux plus âgés afin de considérer le vieillissement (comorbidité connue) comme les facteurs aggravants de la pathologie.