Recherche appliquée

1 940 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 100 finissent morts, 500 sont réutilisés dans un second essai et 1 340 sont renvoyés à l'élevage ou vendus à d'autres éleveurs. Chaque animal peut être piqué jusqu'à quatre fois entre 21 et 180 jours d'âge, à la jugulaire ou à l'oreille, immobilisé au trépied ou au lasso, une contention qui exerce une pression sur le groin et empêche toute fuite pendant deux à cinq minutes. La finalité est de mettre au point des aliments pour porcs d'élevage conventionnel destinés à la consommation humaine, avec des enjeux que le porteur décrit comme économiques, écologiques et sociétaux. Il écrit que les animaux concernés "ne sont pas des animaux de laboratoire mais sont élevés comme en élevage porcin conventionnel", tout en les déclarant au registre européen de l'expérimentation animale.

Objectifs

La mission de notre centre de recherche est de mettre au point des aliments destinés à l’alimentation des porcs, élevés dans des élevages conventionnels à destination de l’alimentation humaine. Au cours de nos essais, nos principales mesures sont les suivantes : consommation d’aliments, évolution de la croissance, suivi de la santé des porcs. Afin d’approfondir certaines thématiques d’essais, nous sommes parfois amenés à réaliser des prélèvements sanguins pour évaluer l’impact de la nutrition sur plusieurs mécanismes de l’organisme animal (reproduction, stress, immunité, etc.). Certains de nos essais s’inscrivent dans la poursuite d’études au niveau cellulaire ayant déjà permis de réduire et cibler le nombre de paramètres à étudier sur les animaux. Le projet consiste donc à réaliser des prélèvements sanguins pour mesurer des paramètres sanguins d’intérêt pour la compréhension des mécanismes de l’organisme (marqueur d’inflammation, marqueur du stress, glycémie, enzymes hépatiques, etc.). L’objectif est d’évaluer les besoins nutritionnels des porcs à plusieurs stades physiologiques pour adapter au mieux les niveaux nutritionnels des aliments. La nutrition des animaux, comme de l’homme, a des effets simultanés sur de nombreux mécanismes biologiques dans l’organisme. Les formules alimentaires pourraient, dans certaines conditions d’élevage, avoir des effets différents sur la santé, la reproduction, le bien-être des animaux et/ou sur la qualité de leurs produits. Avant de généraliser une solution nutritionnelle à un grand nombre d’animaux en élevage, il est nécessaire d’évaluer les impacts sur l’organisme sur un nombre limité d’animaux. Les enjeux sont non seulement économiques (coût de formulation des aliments, performances des animaux), mais aussi écologiques (émissions de gaz à effet de serre), et sociétaux puisque l’alimentation participe au bien-être des animaux. Dans un contexte actuel de réduction de l’impact environnemental des pratiques d’élevages, les formulations des aliments sont particulièrement retravaillées pour incorporer de nouvelles matières premières ou ingrédients (nouvelles sources par ex) répondant à cet enjeu. Cela nécessite de réévaluer l’impact de ces nouveaux aliments sur l’organisme, la croissance et la santé des porcs.

Bénéfices attendus

L’intérêt est d’évaluer les besoins nutritionnels des porcs à plusieurs stades physiologiques pour adapter au mieux les niveaux nutritionnels des aliments. La nutrition des animaux, comme de l’homme, a des effets simultanés sur de nombreux métabolismes. Les aliments testés, bien que répondant aux besoins nutritionnels des animaux, peuvent avoir des impacts métaboliques non décelables macroscopiquement par la seule observation des animaux. Les formules alimentaires pourraient, dans d’autres conditions d’élevage, avoir des effets différents sur la santé, la reproduction, le bien-être des animaux et/ou sur la qualité de leurs produits. Avant de généraliser une solution nutritionnelle à un grand nombre d’animaux en élevage, il est nécessaire d’évaluer les impacts métaboliques sur un nombre limité d’animaux. Pour cela, il est fait appel à des marqueurs tissulaires permettant d’évaluer le statut nutritionnel, l’état de santé, l’état immunitaire ou de stress de l’animal avant et après application d’une stratégie alimentaire. Les enjeux sont non seulement économiques (coût de formulation, performances des porcs), mais aussi écologiques (émissions de gaz à effet de serre), et sociétaux puisque l’alimentation participe au bien-être des animaux. Dans un contexte actuel de décarbonation des pratiques d’élevages, les formulations des aliments sont particulièrement retravaillées pour incorporer de nouvelles matières premières (nouvelles sources, process, variétés) répondant à cet enjeu. Cela nécessite de réévaluer l’impact de ces nouvelles pratiques nutritionnelles sur les métabolismes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins par ponction jugulaire ou cutanée. Les prises de sang sont des actes reconnus d’élevage et sont réalisées par un personnel qualifié et préalablement formé. Ces prélèvements sont réalisés sous contention d’animaux vigiles. La procédure se déroule en 3 phases successives : mise en place de la contention, ponction jugulaire ou cutanée et prélèvement, retrait de la contention et distribution d’une récompense sous forme d’eau sucrée par exemple. La méthode de contention est adaptée en fonction du stade physiologique de l’animal : utilisation d’un trépied ou d’un lasso. Pour la ponction jugulaire, la zone de prélèvement est située à la base du cou. Le sang est récupéré dans des tubes : le volume de sang prélevé peut aller de 5 à 12 ml maximum. Dans le cadre d’une ponction cutanée, la zone peut être l’oreille ou bien la queue. La zone est percée à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette stérile. Les gouttes de sang sont récupérées via la lancette ou un buvard par ex pour être analysées immédiatement. Au global, la phase de contention + prélèvement peut durer entre 2 et 5 min par animal. Un animal âgé de 21 j à 180 j d’âge pourra être prélevé au maximum 4 fois sur cette période d’âge en respectant un intervalle de 2 semaines pour les jeunes animaux (âgés de 21 à 35 j) puis un intervalle d’une semaine pour les animaux âgés de plus de 35 j.

Impact sur les animaux

La réalisation de la contention avec le lasso peut entrainer une douleur légère pendant la durée du prélèvement (entre 2 et 5 min maximum), à cause de la pression exercée par le lasso sur le groin de l’animal. Cette étape peut également entrainer de la peur et du stress puisque cela contraint l’animal et l’empêche temporairement d’accéder à une zone de fuite. Pour réaliser la ponction, la piqure d’aiguille entraine une douleur légère de courte durée, équivalente à la durée du prélèvement et peut induire également du stress et de la peur.

Devenir

En fonction de l’état général des animaux (application des mêmes signes que ceux listés dans les points limites), les animaux poursuivent leur croissance/vie dans nos locaux d’élevage ou sont vendus à d’autres éléveurs. Certains animaux prélevés par exemple en post-sevrage peuvent être réutilisés dans un essai engraissement avec procédure de prélèvement sanguins. Dans ce cas, dans un objectif de prise en compte du bien-être de nos animaux, si il est souhaité de prélever des animaux à la fois en stade post-sevrage et engraissement alors le nombre maximum de prélèvements sur les 19 semaines (7 + 12 semaines) est plafonné à 4 prélèvements, en respectant toujours les 2 semaines d’intervalles minimum entre 21 et 35 j d’âge.

Remplacement

Les méthodes actuelles cellulaires menées en laboratoire ne sont malheureusement pas toujours suffisantes pour comprendre les relations complexes entre les différents mécanismes de l’organisme, entre les individus ou encore avec l’environnement. C’est pourquoi, pour certaines thématiques d’essais, il n’existe pas de méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux. Lorsque d’autres indicateurs (autres que sanguins) sont possibles alors le prélèvement de sang est remplacé par une autre méthode moins invasive (collecte d’urine et/ou de déjection au moment de la défécation). Cette stratégie a d’ailleurs été appliquée dans le passé pour le dosage du cortisol (hormone du stress). Des études récentes montrent que le cortisol contenu dans les poils des porcs est un indicateur de stress chronique car il s’y accumule au cours du temps. Dans ce cas, les prélèvements sanguins peuvent être remplacés par la récolte des poils des porcs. Les animaux placés en essais et concernés par ces procédures ne sont pas des animaux de laboratoire mais sont élevés comme en dans un élevage porcin conventionnel. Nos essais s’inscrivent dans le cadre de la recherche agricole et pour certains dans la poursuite d’études cellulaire ayant déjà permis de réduire et cibler le nombre de paramètres à étudier sur un nombre réduit d’animaux. Lorsque d’autres mesures via des prélèvements moins invasifs tels que la récolte de déjection ou de poils ne sont pas possibles, la prise de sang devient le seul moyen d’obtenir les informations sur les effets des aliments testés.

Réduction

Le nombre de porcs entrant dans cette procédure est étudié pour limiter le nombre d’animaux tout en se donnant suffisamment de chance de montrer une différence de résultat si celle-ci existe (c’est ce qu’on nomme également la puissance statistique). Pour définir ce nombre, nous utilisons un logiciel de statistiques. Par ailleurs, en plus de cette méthode, nous nous appuyons sur notre expérience (traitements statistiques des précédents résultats d’essais depuis 20 ans) ainsi que sur les résultats d’autres études réalisées dans d’autres centres de recherche (nombres d’animaux/groupe dans les études avec résultats significatifs) pour affiner le nombre d’animaux concernés par les prélèvements. En outre, certains animaux concernés par cette procédure entrent également dans le cadre d’essais ayant déjà intégré une phase de recherche au niveau cellulaire permettant de réduire le nombre de paramètres à tester et le nombre d’animaux.

Raffinement

Plusieurs mesures sont intégrées dans la mise en place de la procédure afin de réduire les nuisances sur le bien-être. D’abord, si il est constaté que des animaux à prélever présentent un état de santé affaibli ou s’ils semblent apeurés alors ils sont retirés de la procédure et ne sont pas prélevés. Ensuite, la méthode de contention est réfléchie en fonction de l’âge de l’animal afin que cette dernière soit la plus adaptée à son âge et à son gabarit pour faciliter le prélèvement et donc en limiter sa durée. Une fois le prélèvement réalisé, une récompense sous forme d’eau sucrée est proposée à l’animal. Nos animaux sont entrainés à sortir de leur case et à découvrir leur environnement d’élevage lors des pesées hebdomadaires. Ainsi, ils connaissent cet environnement ce qui réduit leur stress. Par ailleurs, le nombre de tentatives sans réussite du prélèvement est réduit à 2 afin de limiter la durée de contention. Une surveillance particulière des animaux est réalisée durant les 3 jours qui suivent les prélèvements et des soins sont définis en cas d’apparition de signes d’atteinte de la santé des animaux. De plus, l’intervalle entre 2 sessions de prélèvements est allongé à 2 semaines lorsqu’il s’agit de prélever des animaux de 21 à 35 j d’âge.

Choix des espèces

C’est l’espèce cible de notre activité de recherche. Les résultats de nos essais sont valorisés pour améliorer l’alimentation des porcs dans les élevages conventionnels. Les animaux placés en essais et concernés par ces procédures ne sont pas des animaux de laboratoire mais sont élevés comme en élevage porcins conventionnels. Les animaux utilisés sont des porcelets de 3 stades physiologiques différents : Porcelets sevrés âgés de 21 à 42 j et pesant entre 6 et 15 kg (c’est la phase appelée « 1er âge », stade physiologique Post-Sevrage), Porcelets sevrés âgés de 42 à 69 j et pesant entre 15 et 40 kg (c’est la phase appelée « 2ème âge », stade physiologique Post-Sevrage), Porcs sevrés âgés de 69 à 180 j pensant entre 25 et 130 kg (c’est la phase appelée « croissance », stade physiologique Engraissement). C’est sur ces stades physiologiques que nous souhaitons faire avancer nos connaissances.

Injectés en sous-cutané avec un produit de comblement dermatologique, puis passés au scanner à rayons X jusqu'à trois fois le premier jour, une fois par jour les quinze jours suivants, une fois par semaine pendant deux mois, puis une fois par mois jusqu'à la fin de l'étude. 266 rats sont ainsi utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chaque passage d'imagerie se faisant sous anesthésie gazeuse. Le porteur signale des pertes de poids liées aux anesthésies répétées, et une inflammation voire une nécrose possible du site d'injection. 252 rats sont tués pour prélever le site d'injection ou des organes, 10 sont réutilisés pour de la formation continue du personnel et 4 sont adoptés, l'objet réel du projet étant d'améliorer la persistance de produits de comblement du visage.

Objectifs

Les dermal fillers (remplisseurs cutanés) sont généralement utilisés pour des traitements peu invasifs, tels que la restauration du volume du visage dans des cas de dégradations physiques sévères (lésions post-accidentelles, restauration et correction des signes de perte de graisse faciale (lipoatrophie) chez les personnes atteintes du VIH, ... ). Certains produits de comblement se résorbent naturellement avec le temps nécessitant pour les patients de répéter les injections, il est donc nécessaire d'améliorer la persistance de ces produits. La recherche de nouveaux produits, performants et sains pour le patient, est donc un enjeux de santé publique. Ce projet a pour objectif de tester et d’évaluer des dispositifs médicaux injectables de comblement sur le modèle rat. Il comporte plusieurs protocoles visant à évaluer leur comportement (persistance) et la tolérance locale (potentielles réactions locales de type inflammatoire) après injections en sous-cutanée. Lors de ce projet, l'imagerie médicale sera utilisée afin de suivre l'évolution (volume, hauteur, étalement et forme) des produits injectés au cours du temps. Un effet inflammatoire des produits pourra également être mis en évidence par analyse histologique.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera aux développements de nouveaux produits dermatologiques de comblements et éventuellement à leur mise sur le marché dans le but de proposer des produits plus performants et persistants.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 ou maximum 2 injections en sous-cutanée des produits tests en respectant les volumes d’injections recommandés. Ces injections seront réalisées en environ 4 minutes pour les animaux vigiles et en maximum 10 minutes (anesthésie comprise) pour les animaux anesthésiés. Des examens scanners à rayons X seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Un examen scanner dure jusqu’à 20 minutes (anesthésie comprise). La fréquence des examens scanners sera de maximum 3 acquisitions par jour le premier jour, puis maximum 1 acquisition par jour pendant les 15 jours suivants, puis maximum 1 acquisition par semaine pendant les 2 premiers mois puis maximum 1 acquisition par mois jusqu’à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress (pesées, injection de produits et réalisation des acquisitions d’imagerie scanner à rayons X). Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées et/ou inflammation voire nécrose du(des) site(s) d’injection - probablité faible avec des produits de comblement classique).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole car des prélèvements du site d’injection ou d’organe(s) doivent être réalisés pour analyse histologique. Dans la mesure du possible, les animaux réserves qui n’auront finalement pas été inclus dans les études pourront être réutilisés pour de la formation continue du personnel ou adoptés en fin d’étude selon la procédure d’adoption de l’EU.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet ainsi qu’à des exigences réglementaires, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant de manière fiable. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal, etc.

Réduction

Le suivi du comportement des produits injectés réalisé par imagerie médicale scanner à rayons X permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisé par projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la performance du produit au cours du temps, des groupes de minimum 6 sites d’injection par éléments d’essai seront constitués.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux en cages sur portoirs ventilés (hors cas d’isolement des animaux pour agressivité ou blessure sur avis vétérinaire) avec les enrichissements appropriés (bâtonnets de bois, cell-sizzle et tube en bois). Les animaux seront observés quotidiennement afin de déceler précocement tout signe clinique anormal et ainsi mettre en place des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien ou bien mise à mort en cas d’état de santé considérablement dégradé et irréversible). Des pesées régulières seront réalisées : minimum 1 fois par semaine et entre 24 et 72h post-administration des produits de comblement. La fréquence des pesées pourra être augmentée en fonction de l’état clinique des animaux : une pesée quotidienne sera réalisée si l’animal est en perte de poids égale ou supérieure à 15% de son poids maximal atteint durant l’étude (soit une perte de poids de 52.5g pour un animal de 350g). Dans les 24 à 72h post-administration des produits de comblement, une observation du(des) site(s) d’injection sera réalisée pour s’assurer qu’aucune anomalie (rougeur, plaie, nécrose, nécrose ulcérante) n’est visible. L’état général de l’animal sera également observé. Lors des anesthésies, du gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement cornéen et une attention particulière sera apportée à la lutte contre l’hypothermie (tapis chauffant et/ou lampe chauffante).

Choix des espèces

Le rat est l’espèce privilégiée pour les injections sous-cutanées de produit de comblement. Un volume plus important que chez la souris peut-être administré permettant un suivi par imagerie scanner à rayons X au cours du temps. De plus, le rat est très bien caractérisé et présente une similitude avec l’homme concernant sa réactivité au niveau de la peau et des tissus sous-cutanés permettant d’évaluer la biocompatibilité et l'efficacité des produits de comblement. Les rats seront utilisés entre 6 et 10 semaines lors des administrations. Pour ce type d’étude, il n’y a pas de contrainte spécifique lié à l’âge. A partir de 6 semaines, les rats ont un système immunitaire suffisamment développé pour répondre efficacement aux stimuli immunitaires, ce qui les rend appropriés pour ce type d’études.

Soumises à une ou deux injections intraveineuses de nanoparticules lipidiques ou de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie gazeuse, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Une partie d'entre elles passe un test de force où la queue est reliée à un capteur qui enregistre leurs réponses d'échappement pendant cinq minutes. Le projet vise à valider l'effet de ces nanoparticules contre la fibrose musculaire dans des myopathies génétiques comme la dystrophie de Duchenne, et le porteur écrit qu'un essai clinique concluant "devrait" alors permettre de stopper la progression de la maladie chez les patients. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe "pas de modèle in vitro de fibrose musculaire" et que l'élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T exige un milieu physiologique complet.

Objectifs

Notre laboratoire cherche à traiter un certain type de myopathies (maladie des muscles) qui comprennent en particulier la dystrophie musculaire de Duchenne et les dystrophies musculaires des ceintures. Ces myopathies sont des maladies génétiques rares, progressivement invalidantes et conduisent à la perte de la marche. Le muscle sans ses protéines structurales finit par se détruire puis l’apparition de la fibrose rigidifie le tissu et entraîne de sévères complications. Dans la myopathie de Duchenne, la protéine déficiente s'appelle la dystrophine. Cette protéine joue un rôle d'amortisseur au cours des cycles de contraction/relaxation du muscle et un rôle fonctionnel dans la membrane musculaire. Aucun traitement curatif n'est actuellement disponible. Les stratégies visant à ajouter une copie fonctionnelle du gène et/ou à réduire la fibrose constituent l’approche la plus prometteuse pour le traitement de ces myopathies. Des approches de thérapie génique sont en cours d’étude et consistent à introduire un gène médicament dans l’organisme du patient à l’aide d’un vecteur viral inoffensif pour remplacer le gène malade et rétablir le fonctionnement de la protéine. Néanmoins, les tests cliniques utilisant l'administration de versions courtes de la protéine dystrophine (micro-Dystrophine) via un virus adéno-associé (AAV), ont mis en évidence seulement une efficacité partielle du traitement et ont révélé des risques pour la sécurité des patients, tels qu'une réponse immunitaire associée à la dose élevée d'AAV utilisée. C’est pourquoi, dans ce projet, nous souhaitons explorer la technologie des nanoparticules, utilisées dans la formulation de certains vaccins, pour délivrer les ARN messagers de gènes thérapeutiques et réduire la fibrose dans le tissu musculaire. Ces nanoparticules sont le plus souvent lipidiques et permettent un transfert efficace et ciblé de protéine ou d’acide nucléique dans les cellules d’intérêts. Nous souhaitons donc tester dans un premier temps l’immunogénicité de ces particules chez la souris et dans un second temps, tester l'efficacité des nanoparticules pour le transfert de gènes et pour la reprogrammation de cellules T en cellules T anti-fibrose. L'étude permettra en outre de tester l'efficacité thérapeutique de grandes versions de dystrophine ou de dystrophine complète pouvant être logées dans les nanoparticules, ce qui ne pourrait pas être possible dans les AAV étant donné leur capacité de cargo limitée.

Bénéfices attendus

Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Il vise à valider l’effet thérapeutique de nanoparticules lipidiques pour un groupe de maladies humaines sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique pourrait permettre d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse d'une durée maximum de 5 minutes pour vérifier la présence des nanoparticules lipidiques et analyser la réponse immunitaire. Ils seront aussi soumis à l'injection de nanoparticules lipidiques et ou de vecteurs de thérapie génique en intraveineux sous anesthésie gazeuse. Pour la PE1, il y aura 2 prélévements de sangs et une seule injection de nanoparticules lipdiques. Pour la PE2, les souris auront un prélévements de sang et deux injections en intraveineux, soit deux injections de nanoparticules lipidiques à deux semaines d'intervalle, soit une injection de nanoparticules lipidiques et 15 jours après une injection de vecteurs de thérapie génique. La durée d'anesthésie et le temps de d'injection durent moins de 5 minutes par souris. Pour le test de force musculaire, la queue des animaux est reliée à un capteur de force qui va enregistrer les réponses d’échappements des animaux. Ce test est limité à 5 min et ne peut être réalisé qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés. Les nuisances de classe légères sont liées à l’acte d’anesthésie lors de l’injection : du traitement et des prélèvements de sang. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Les nuisances attendues pour le test de force sont de classe legère. Cet acte ne sera fait qu’une fois. En ce qui concerne le modèle utilisé, même s’ils portent une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients.

Devenir

Les animaux de chaque procédure seront tous euthanasiés pour collecter les muscles squelettiques, la rate et les ganglions pour analyser au laboratoire les effets de nos traitements.

Remplacement

Nous réalisons systématiquement des tests préalables in vitro pour exclure les nanoparticules de mauvaise qualité. Nous vérifions la présence de l’ARN messager du gène d’intérêt après infection cellulaire en mesurant l’expression des protéines d’intérêts. Afin de valider l’effet des nanoparticules anti-fibrose sur la fibrose in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro n’est capable de développer cet aspect de la pathologie. En effet, il n’existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l’interaction et l’élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T nécessite un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.

Réduction

Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 160 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôle pour les différents modèles évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Nous administrerons les nanoparticules lipidiques par voie sanguine car c’est le moyen le plus efficace et le moins invasif pour cibler tous les muscles de l’organisme. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi. Aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Les prélèvements de sang à la veine submandibulaire se font sous anesthésie de courte durée. Les doses de nanoparticules injectées sont faibles par injection et d'après les données de la littérature scientifique aucune toxicité n’est attendue. Néanmoins une surveillance de l’état général des animaux sera effectuée régulièrement. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées.

Choix des espèces

Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Les modèles murins inclus dans ce projet portent des anomalies génétiques ciblant le gène de la pathologie chez l’homme qui va entraîner le plus souvent des désordres musculaires sans impact sur l’activité naturelle de la souris. Ces modèles permettent d’analyser les perturbations de la fonction musculaire et sont donc pertinents pour nos études. Nous utiliserons pour ce projet des souris jeunes d’environ 2 mois- 3 mois car c’est à cet âge que les muscles sont les plus permissifs au traitement de thérapie génique. Le développement de la fibrose qui est un frein majeur au transfert de gène musculaire est progressif et la cinétique de dépôts de collagène varie d’un muscle à l’autre. Nous avons vu également dans nos précédents résultats que pour réduire la fibrose de manière significative dans le muscle via des cellules T anti-fibrose, il faut cibler et éliminer le plus tôt possible les cellules fibroblastiques sécrétrices de collagène, soit environ à l’âge de 2 mois.

Produites par l'élevage du laboratoire pour alimenter d'autres protocoles en "utilisation continue", 2 614 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Toutes subissent, au sevrage à quatre semaines, une biopsie du bout de la queue sous anesthésie générale gazeuse pour vérifier leur génotype par PCR, avec une douleur de courte durée au réveil. 2 280 d'entre elles restent en vie, réparties entre le renouvellement des lignées et les expérimentations à venir, les 334 autres étant tuées. Ces lignées portent des gènes humains codant des anticorps pathogènes responsables de maladies de dépôt d'immunoglobulines, et le porteur justifie l'effectif par le fait qu'il couvre l'ensemble de ses lignées sur cinq ans, sans avancer de calcul.

Objectifs

Notre laboratoire développe depuis de nombreuses années des modèles murins transgéniques permettant l'étude d'un groupe de pathologies, les maladies de dépôt d'immunoglobulines monoclonales, qui viennent gravement compliquer certaines maladies hématologiques tel que le myélome multiple. Le pronostic vital des patients est souvent très péjoratif. En lien les médecins en milieu hospitalier, nous avons développé des modèles murins qui surexpriment tout ou parties des anticorps humains pathogènes responsables de ces maladies. Le but de ces modèles est d'étudier les mécanismes physiopathologiques de développement de ces maladies, d'étudier la toxicité de ces immunoglobulines pour les organes touchés et de développer et tester des thérapies innovantes lors d'essais pré-cliniques. La présence de modèles animaux permet de valider ou non le bénéfice de la molécule et de potentiellement la proposer à terme aux patients. Toutes ces études nécessitent donc l'utilisation de différents modèles murins dont le génotype doit être vérifié afin de s'assurer que les animaux présentent bien les caractéristiques attendues. La technique de génotypage décrite dans cet APAFIS consiste en la biopsie d'un bout de queue de la souris afin de contrôler le génotype de l'animal par PCR.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de maintenir les différentes lignées de souris génétiquement modifiées permettant de mener à bien les projets de recherche sur les maladies de dépôts d'immunoglobulines monoclonales. Ces modèles murins sont génétiquement modifié afin d'intègrer une modification génétique précise au sein d'un organisme complet. La modification génétique par l'apport d'un gène humain codant pour une protéine pathogène permet d'analyser et de comprendre la physiopathologie de ces maladies de depôts.

Procédures

Le prélèvement d'un bout de queue nécessaire pour le génotypage sera effectué sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de bout de queue sous anesthésie entrainent une douleur de courte durée aprés le reveil de l'animal. Aucune nuisance ou effet indésirable lié à leur génotype n'est attendu sur les animaux.

Devenir

Sur la totalité des animaux générés, nous attendons 100% de génotypes d'intérêts. Une partie de ces animaux sera maintenue dans la zone d'élevage pour le renouvellement et le maintien de nos lignées, et l'autre partie sera utilisée dans le cadre d'expérimentations (utilisation continue).

Remplacement

les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la physiopathogie des maladies de dépôts qui peut varier par le nombre et la localisation des atteintes d’organes, et ne permettent pas non plus de reproduire l’incidence d’une défaillance d’organe sur un autre organe ou l’organisme dans son entier. D’autre part, les approches thérapeutiques que nous souhaitons tester ont principalement pour objectif de cibler les dépôts d’immunoglobulines et de vérifier les réponses organes. Des modèles murins pour certaines maladies de dépôts ont déjà été développé et ont permis d’atteindre les objectifs précédemment évoqués.

Réduction

Notre laboratoire possède une grande expérience dans l’élevage des lignées murines destinées à la recherche ce qui permet d’anticiper le nombre d’animaux reproducteurs nécessaires au maintien de chaque lignée ainsi que le nombre de portées nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’animaux pour effectuer les diverses expériences. Ce projet comprend un grand nombre d'animaux car il décrit l'ensemble des lignées de souris élevées par notre équipe pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux produits est réduit au minimum afin d'être suffisant pour maintenir la lignée et effectuer les expérimentations ultérieures tout en évitant de produire des animaux inutilement.

Raffinement

La procédure sera réalisée de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux : les prélèvements de tissus seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse et par du personnel qualifié maitrisant ces gestes. Les animaux sont maintenus sous surveillance jusqu’à leur réveil. L'observation régulière des animaux et le suivi de leur comportement permettra d’avoir un contrôle sur leur état de santé et tout animal présentant des signes de souffrance sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Ce type de pathologie, avec en particulier une atteinte rénale, a déjà été reproduit de nombreuses fois avec succés chez la souris. Dans ce projet, les animaux seront mis en reproduction à partir de l’âge de 8 semaines, âge auquel mâles et femelles sont sexuellement matures et jusqu’à l’âge de 20 semaines car les animaux plus âgés (en particulier les femelles) commencent à présenter des difficultés à se reproduire. Le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage, c’est-à-dire à l’âge de 4 semaines.

Les souris utilisées portent un gène humain pathogène prélevé chez un patient, et la moitié seulement développe les dépôts amyloïdes recherchés après induction. 334 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Chacune peut recevoir jusqu'à quatre injections intraveineuses de fibrilles amyloïdes, des injections hebdomadaires pendant deux mois, cinq prélèvements sanguins, et passer tous les un à deux mois une échographie cardiaque après épilation ainsi qu'une imagerie SPECT-CT, un suivi qui peut durer vingt-quatre mois. L'effectif s'explique par ce rendement de 50 % et par l'absence d'outil validé pour détecter la maladie du vivant de l'animal, ce qui conduit à tuer les souris par séries pour vérifier après coup lesquelles étaient atteintes.

Objectifs

Nous avons développé un modèle murin transgénique d’amylose AL qui reproduit en partie la maladie humaine. Ce modèle est basé sur l'expression dans la souris d’une protéine humaine pathogène issue d'un patient. Les dépôts amyloïdes apparaissent principalement dans le coeur suite à une induction par l'injection de fibrilles amyloïdes, et dans des délais variables, allant d’une semaine à quelques mois, dans environ 50% des animaux. Nous ne maitrisons donc pas complètement l’apparition des dépôts d'amylose et nous ne disposons pas encore d’outils fiables nous permettant de les détecter de façon certaine avant la mise à mort de l'animal. Nous voulons donc mettre au point des techniques d'imagerie non-invasives pour détecter l’apparition de l’amylose dans nos souris. La première technique est par échographie cardiaque, déjà testé et qui a révélé un intérêt potentiel. La deuxième est par imagerie nucléaire in vivo (scintigraphie) en utilisant des protéines radiomarquées qui est à priori la méthode la plus sensible et qui est une méthode déjà utilisée chez l'homme et validée chez la souris. Ainsi, l’objectif de ce projet est donc d’une part d’améliorer la reproductibilité de l’induction de l’amylose AL dans notre modèle afin d’en faire un meilleur outil pour des tests pré-cliniques, et d’autre part de mettre au point des techniques de détection de l’amylose in vivo par imagerie afin de s’assurer de la présence de la maladie avant toute procédure supplémentaire (thérapeutique, exploratoire). Une fois que l’on sera en mesure de discriminer les souris positives, des tests thérapeutiques seront réalisés afin de tester leur efficacité.

Bénéfices attendus

L'amylose cardiaque est un problème clinique majeur à l'origine du décès des patients à très brève échéance. Aucun traitement éliminant les dépôts dans le myocarde n'est actuellement disponible. Bien qu’imparfait, notre modèle est le seul permettant de reproduire les phases précoces de la maladie. D'une part, il nous a déjà permis d’élucider une partie des mécanismes physiopathologiques d’apparition de l’amylose AL in vivo, et d’étudier la toxicité des fibrilles amyloïdes dans le cœur. D’autre part, nous avons aussi pu commencer à faire des tests thérapeutiques. Nos résultats ont obtenu un accueil très enthousiaste de la part de la communauté scientifique et nous avons été sollicités par de nombreuses équipes qui souhaitent travailler avec notre modèle. Ce projet vise à la fois à optimiser l’induction de l’amylose (procédure 1) et à développer des outils de détection précoce de la maladie (procédures 1 et 2) afin d'en faire un bon outil pour des tests thérapeutiques (procédure 3). Ces optimisations sont indispensables car une meilleure induction associée à un dépistage précoce de la maladie permettra de fait de diminuer la taille des cohortes nécessaires pour valider les tests thérapeutiques. Enfin, la démonstration de l'efficacité d'un traitement ciblant les dépôts amyloïdes cardiaques chez l'animal (procédure 3) pourrait permettre d'améliorer le pronostic vital des patients. Les résultats de cette étude seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.

Procédures

Les souris de ce projet seront soumises aux procédures décrites précédemment : prises de sang par voie sous-mandibulaire, injections par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intrapéritonéale, ainsi que des techniques non-invasives d'imagerie. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter leur stress, à l'exception des injections par voie intraveineuse ou intrapéritonéale qui seront conduites sur animaux vigiles. Si plusieurs procédures sont réalisées sur un même animal, elles seront espacées dans le temps autant que possible. Chaque souris sera soumise à plusieurs interventions : le prélèvement de sang : 5 fois maximum espacé d'au moins 1 mois, les injections intra-veineuses pour induction : 4 fois maximum espacé de 2 semaines entre chaque injection ; les injections intra-péritonéale et sous-cutanées : une fois par semaine pendant 2 mois maximum ; imagerie par échocardiographie (épilation des souris avant imagerie sous anesthésie) : 1 fois tous les 1 à 2 mois ; imagerie par SPECT-CT : 1 fois tous les 1 à 2 mois.

Impact sur les animaux

Chez l’humain, les signes cliniques de la maladie sont la fatigue, l'essoufflement lors de l’effort physique et la perte de poids. Toutefois, à ce jour, nous n’avons pas constaté d’insuffisance cardiaque symptomatique et/ou de souffrance et/ou de mortalité chez nos animaux en dépit des dépôts amyloïdes, même sur des animaux suivis sur 18 mois après induction. Les dépôts amyloïdes, souvent légers, présents dans le cœur et la rate principalement, semblent asymptomatiques. Cependant, avec l'amérioration de l'induction de la maladie que nous espérons obtenir, un suivi régulier des animaux induits sera effectué (voir grille d'évaluations et points limites) et des mesures seront prises si des effets indésirables sont observés. Les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins peuvent aussi entraîner des hématomes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour réaliser des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la physiopathologie des amyloses. D’autre part, les approches thérapeutiques que nous souhaitons tester ont pour objectif de cibler les dépôts amyloïdes et de stimuler la réponse immunitaire, elles nécessitent de cette façon la totalité de l’organisme dans sa complexité pour pouvoir en étudier l’efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en tenant compte qu'en l'état actuel de nos connaissances, seulement 50% des animaux développent une amylose après induction, et d'autre part qu'il est nécessaire, en l'absence d'outil de suivi validé sur notre modèle, d'euthanasier de façon séquencielle les animaux pour réaliser des analyses anatomopathologiques. La valeur statistique de nos résultats sera analysée avec un test statistique dédié à de faibles nombre d'animaux. Ce test a été utilisé dans nos études précédentes ce qui nous a permis de valider de façon robuste nos résultats. Le meilleur protocole d'induction sera déterminé statistiquement et permettra de diminuer le nombre d'animaux utilisés par la suite. Le suivi longitudinal de nos animaux, grâce au développement de l'imagerie non-invasive, permettra aussi de maîtiser l'évolution de la maladie et de n'utiliser que des animaux réellement positifs pour les tests thérapeutiques.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être et la règlementation (contrôle de la température et de l’hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie et antalgique en cas de douleur). Les souris seront surveillées quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie.

Choix des espèces

Certaines amyloses ont déjà été reproduite avec succès chez la souris. Les études in-vivo chez la souris permettent de mieux évaluer le potentiel thérapeutique des molécules, même si elles ne préfigurent pas des résultats qui seront obtenus chez l'humain. Les animaux seront utilisés à partir de 4 mois et jusqu'à 24 mois en fonction de la vitesse d'apparition des dépôts et des lésions associées qui sont des mécanismes relativement long.

Six rémiges coupées au ras de la peau, quatre prélèvements sanguins à la veine alaire, une anesthésie par injection intramusculaire pour passer au scanner : 333 poulets de chair reproducteurs, mâles et femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. L'objectif déclaré est d'évaluer si la reproduction au sol, sans cage, améliore ou dégrade le bien-être et la santé des reproducteurs, sur trois lignées de vitesse de croissance différente. Les femelles destinées à la radiographie sont mises à jeun, enfermées en caisses, transportées en véhicule sur un kilomètre, pesées, puis anesthésiées, le porteur reconnaissant qu'un accident anesthésique reste possible, apnée prolongée ou arrêt cardiaque. Sur les 333 individus, 273 seront ensuite "disponibles à la vente" comme animaux vivants, les 60 autres étant tués.

Objectifs

En sélection, les lignées de volailles sont, pour une partie de leur vie, hébergées en cage. La reproduction en cage permet un suivi individuel de la ponte, mais surtout une reproduction par insémination artificielle qui limite la consanguinité en contrôlant les couples reproducteurs et de connaître le pedigree de la descendance à chaque génération. Aujourd’hui, nous cherchons à concevoir un élevage sans cage, plus en lien avec les demandes sociétales de bien-être animal. Si la reproduction au sol ouvre la possibilité d’exprimer des comportements naturels positifs (activité, bain de poussière,…), l’effet global sur le bien-être des animaux doit être mieux évalué. Des interactions sociales agressives entre adultes au sol peuvent s’accompagner d’une baisse du bien-être du troupeau, avec l’apparition de picage, de comportements violents voire de cannibalisme. D’autre part, ce mode d’élevage des reproducteurs pourrait avoir un effet sur la santé des mâles comme des femelles. Le but du projet est d’estimer les conséquences d’une reproduction au sol sur le comportement et la santé des reproducteurs, ainsi que sur la diversité génétique des descendants, en utilisant trois lignées génétiques de poulets de chair, variant sur la vitesse de croissance et les caractéristiques métaboliques. Ce projet, en collaboration avec deux unités expérimentales, évaluera comment une reproduction au sol impacte le bien-être et la santé des animaux reproducteurs, et si cet impact varie entre lignées aux caractéristiques distinctes. Le projet implique des prises de sang sur les animaux pour évaluer (i) le taux d’hormones indicatrices de comportements agressifs et du niveau de stress des animaux et (ii) la variation des paramètres immunitaires en fonction du milieu de vie ainsi que des prélèvements de plumes. Les femelles subiront également une anesthésie pour pouvoir évaluer leur santé osseuse de façon peu invasive (CT scan).

Bénéfices attendus

Ce projet est un approfondissement pour soutenir une modification de nos pratiques pour accompagner la transition vers un mode alternatif d’élevage en sélection. A court terme, il permettra l’évaluation des pratiques prenant en compte : les effets positifs ou négatifs d’un élevage au sol sur le bien-être et la santé des animaux reproducteurs. Au niveau scientifique, ce projet permettra une meilleure connaissance des interactions entre environnement d’élevage (cage vs sol) et génétique (croissance lente, intermédiaire ou rapide) sur les performances de reproduction et le comportement des animaux.

Procédures

Les animaux, d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 4 prélèvements sanguins maximum à l’âge adulte, séparés d’au moins 3 semaines entre eux. La technique de prélèvement de sang à la veine alaire ne dure que quelques secondes. Les animaux subiront également un prélèvement de plumes par découpe des rémiges. Nous couperons les plumes une première fois, avant le début de la reproduction, pour s’assurer que les plumes prélevées ont bien poussé pendant la période d’intérêt. Nous préleverons ensuite, six semaines plus tard environ, en coupant 6 rémiges au ras de la peau. Les femelles subiront une anesthésie générale par injection musculaire à l’âge adulte (entre 35 et 41 semaines d’âge) pour une radiographie.

Impact sur les animaux

Les animaux d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 4 prélèvements sanguins à l’âge adulte. Les prélèvements sanguins à l’âge adulte entrainent un risque de douleur légère de courte durée, un léger risque d’hématome et un potentiel stress de contention. La découpe des plumes peut également entrainer une douleur de courte durée. L’injection de l’anesthésique pour les poules peut être douloureuse (intramusculaire). Un accident anesthésique est également possible (apnée prolongée, arrêt cardiaque).

Devenir

Tous les animaux n’ayant subi qu’une procédure légère seront disponibles à la vente (animaux vivants).

Remplacement

Pour évaluer les possibilités de reproduction au sol des poulets de chair et connaître leur impact sur le bien-être, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même. Le comportement des individus ne peut être observé que sur un animal entier. Aucune méthode substitutive ne permet de reproduire la richesse des comportements reproducteurs et de leur impact sur la santé et la diversité génétique.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires pour ce projet a été évalué d'après (i) les résultats d’une première expérimentation (ii) des publications scientifiques, et (iii) des simulations de précision de l'estimation des paramètres physiologiques et génétiques, qui sont les éléments de base de la construction des schémas de sélection. Les effectifs les plus faibles sont pour les mâles. De nombreux caractères seront testés, dont plusieurs ont déjà montré des différences significatives à moins de 20 individus. D’autre part, des prélèvements multiples, permettront de renforcer la puissance des effets observés entre traitements en utilisant moins d’animaux. Les femelles seront, elles, au nombre de 20 par traitement, et des femelles non prélevées seront également présentes pour respecter un sexe ratio de 1 mâle pour 3 femelles en cages et 1 pour 4.4 femelles au sol pour garantir leur bien-être. Les animaux au sol permettront de tester trois traitements différents : au sol en sexes séparés (sans reproduction) et au sol en reproduction libre, pour réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Le calme et une contention soignée pendant la prise de sang seront mis en œuvre. Par ailleurs, les animaux voués à l’expérimentation de la reproduction au sol seront élevés sur copeaux, en groupe, et auront accès à l’aliment selon les schémas de rationnement. Un panel d’enrichissements du milieu sera disponible : plateformes de perchage, cachettes, nids, et distribution de nourriture aléatoire dans la litière. En plus des bienfaits habituels des enrichissements, ces derniers seront cruciaux pour limiter l’agressivité entre les animaux, que ce soit les comportements harceleurs des mâles envers les femelles (cachettes), l’agressivité entre mâles, ou la compétition pour la nourriture (distribution dans la litière favorisant le grattage). Le transport des animaux entre les deux plateformes, à 1km l’une de l’autre, sera organisé ainsi : - Avant le premier repas: mise en caisses des poules qui passeront au CT le matin, elles sont à jeun et sont mises dans des caisses numérotées et adaptées à leur taille et poids (maxi 3 ou 4 poules). - Elles sont transportées en véhicule agréé (transport d’animaux) puis déposées dans le local d’attente chauffé si besoin. - Elles sont pesées individuellement pour définir la dose d’anesthésiant à injecter. - Quatre heures après la mise à jeun les poules commencent à être anesthèsiées, passer au CT scan, et sont remises en caisses - Une heure après l’anesthésie, les poules sont retransportées et remises dans leur condition d’élevage habituelle. Si elles paraissent encore endormies, elles sont isolées jusqu’à réveil complet. - Si la procédure prend plusieurs jours, les poules scannées sont marquées individuellement pour être sur qu’elles ne sont pas manipulées deux jours de suite. Les animaux sont surveillés régulièrement tout au long de la journée et au retour au bâtiment afin de vérifier que tout va bien. Tous les animaux seront visités quotidiennement pendant quelques minutes. Si un animal est blessé ou malade (emplumement, picage) ou s’il est en souffrance (prostration permanente), il sera isolé en infirmerie jusqu’à récupération complète.

Choix des espèces

L’objectif étant l’étude de la reproduction au sol des poulets de chair, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même. Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux adultes, pour phénotyper des reproducteurs.