Recherche appliquée

Vingt-quatre injections dans l'abdomen, quarante gavages, deux instillations dans la gorge et une chirurgie de quinze minutes s'enchaînent sur deux mois pour chaque souris concernée. 1 214 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, dont une partie du seul fait qu'elles n'ont pas le génotype recherché. Le modèle repose sur une lignée génétiquement modifiée qui développe une fibrose de la peau et des poumons, à laquelle le projet ajoute des contaminants de l'environnement comme la silice, pour tester des molécules bloquant l'activation immunitaire. Les souris circulent entre trois établissements, et le porteur ne précise ni en quoi consiste l'acte chirurgical ni comment il arrive à 1 214 animaux.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.

Devenir

Une partie des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. L'autre partie seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques.

Remplacement

Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.

Jusqu'à 15 % d'animaux en plus sont inclus dans chaque étude pour former des groupes homogènes après la chirurgie. 2 800 souris et 350 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée directement dans la prostate sous anesthésie générale, une partie des animaux étant castrée lors d'une seconde intervention, avant des IRM d'une heure sous anesthésie et des traitements répétés par injection ou par voie orale. La société qui porte le projet se présente comme prestataire de services en recherche préclinique et affirme que les méthodes sans animaux ne permettent pas de prévoir l'efficacité d'un candidat médicament, les reconstructions de tumeurs en 3D restant selon elle "marginales".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer de la prostate est le deuxième plus mortel (environ 398 000 décès en 2022 pour environ 1,5 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer de prostate greffés directement au niveau de la prostate, les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

La greffe de la tumeur est faite sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min). La castration des animaux sera réalisée sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min) L’IRM est réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. Les animaux sont traités par injection (intraveineuse ou intrapéritonéale) ou par voie orale. Les traitements seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane), mais les animaux pourront être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si l’anesthésie est contre-indiquée. Les animaux seront immobilisés par une contention douce pour mesurer la taille des tumeurs (inférieur à 30 secondes) Les prélèvements de sang (1 minute) seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane) mais les animaux pourront également être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si le geste est rapide (inférieur à 30 secondes) et génère moins de stress à l’animal que l’anesthésie générale elle-même.

Impact sur les animaux

- La castration pourra entrainer une douleur et une gêne modérée pendant 1 ou 2 jours - L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur lié une gêne, un envahissement de la cavité abdominale ou pelvienne, de l’ascite. Il est possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs, du poids et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. -A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger de 1 à 2 jours. -Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. L’injection intraveineuse, intrapéritonéale ou per os pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.

Devenir

Sachant que les animaux sont porteurs de tumeurs, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera deux groupes avec tumeur, un groupe contrôle (non traité ou traité avec le véhicule) et un groupe traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 5 à 15 animaux. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).

Raffinement

Les animaux sont pesés et le volume tumorale est estimé 2 fois/semaine minimum. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond des cages après les chirurgies et dès l’observation d’une perte de poids >10%. Une réhydration sera mis en place par perfusion sous cutanées et/ou alimentation humide pour les souris si necessaire. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. Les chirurgies sont réalisées sur matelas chauffants jusqu’au réveil de l’animal. La greffe est réalisée en condition aseptique sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique opiacé 30 min avant et un anesthétique local. Les animaux reçoivent une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien en pré-opératoire et post-opératire et des soins adaptés.. Les administrations/prélèvements sont réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible. Certaines administrations sont réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements sont effectués en suivant les recommandations de la SBEA. Dans le cas de chirurgie sans réveil une anesthésie profonde est réalisée avec administration d’un analgésique local (lidocaïne et bupivacaïne), d’un alpha2 agoniste et d’un opiacé débutée 30min avant la chirurgie. Les principaux points limites sont listés en détail dans les procédures. Si des signes cliniques sont observés, l’animal est mis en observation et un traitement est mis en place si possible. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines minimum lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter le développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.

Irradiées puis greffées avec des cellules sanguines humaines, 960 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 480 d'entre elles portant deux mini-os humains implantés sous la peau. Pour 240 souris, le protocole prévoit vingt injections, quarante administrations par voie orale et quinze séances d'imagerie sous anesthésie, et 480 subissent un prélèvement de moelle osseuse au fémur. Le porteur écrit qu'il est facile de mesurer la souffrance de la souris et d'y remédier rapidement, et indique dans la même demande que le développement de la leucémie entraîne une paralysie du train arrière. Toutes seront tuées pour prélever moelle osseuse, rate, colonne vertébrale et ossicules.

Objectifs

L’hématopoïèse est un processus finement régulé qui aboutit à la production de toutes les cellules sanguines, à partir de cellules souches et de progéniteurs (CSPH) localisés, chez l’adulte, dans la moelle osseuse. Nous souhaitons tester l’hypothèse selon laquelle certaines anomalies génétiques décrites dans des leucémies de l’enfant peuvent transformer des CSPH humaines normales. Il est établi que les caractéristiques fonctionnelles et d'expression des CSPH changent durant le processus de formation du système sanguin, débutant dans l'embryon et se concluant à l'âge adulte. Nous avons également montré que des facteurs solubles produits notamment par la moelle osseuse participent grandement au développement leucémique. La poursuite de notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes du développement leucémique à partir de cellules humaines sensibles à la transformation, ainsi que d’évaluer plus précisément la contribution de la moelle osseuse, dans ce processus et dans la réponse aux traitements. Pour cela, nous utiliserons des CSPH humaines dans lesquelles sera exprimée génétiquement une fusion entre deux gènes, découverte dans des leucémies de l’enfant et distinctes de celles de l’adulte, nous les transplanterons dans des modèles de souris receveuses permissives aux greffes de cellules d’origine étrangère dans lesquelles nous aurons implanté ou pas des petits fragments de moelle osseuse humaine normale (appelés ossicules). Les objectifs du projet sont les suivants : Objectif 1 : Définir la cellule à l’origine de la transformation leucémique chez l’enfant Nous voulons définir la ou les CSPH humaines sensibles au développement leucémique sous l’influence de la fusion génique d’intérêt, afin de mieux comprendre dans quel type cellulaire la pathologie est initiée. Objectif 2 : Etudier le rôle la moelle osseuse humaine sur le développement leucémique Nous voulons étudier l’influence de moelle osseuse humaine, avec des modèles appelés ossicules, sur le développement de la leucémie induite par l’anomalie génique étudiée. Objectif 3 : Etudier le rôle de la moelle osseuse humaine sur la réponse à des traitements Nous étudierons l’influence des modèles, appelés ossicules, sur la réponse des cellules leucémiques à une thérapie ciblée identifiée récemment.

Bénéfices attendus

Les leucémies pédiatriques liées à une anomalie génétique spécifique touchent surtout les très jeunes patients, et malheureusement, il n'existe pas encore de traitement ciblé pour ces cas. Dans nos recherches précédentes, nous avons découvert que les cellules sanguines fœtales sont plus sensibles au développement de la leucémie que des cellules sanguines post-natales, et que l'environnement autour de ces cellules joue un rôle important dans ce processus. Cependant, de nombreuses questions sur la manière dont cette transformation se produit restent encore sans réponse. Le projet que nous souhaitons développer vise à mieux comprendre cette maladie. Les modèles que nous proposons sont essentiels pour découvrir comment la leucémie se développe à partir de cellules humaines et permettront de mieux refléter la complexité de cette maladie dans un organisme vivant, comme la souris. Dans le cas de la leucémie associée à l’anomalie génétique étudiée, notre projet pourrait également aider à mettre au point et tester de nouveaux traitements spécifiques qui doivent d'abord être validés sur des modèles précliniques avant de pouvoir être proposés aux patients. À plus long terme, ces modèles pourraient également être adaptés pour étudier d'autres maladies infantiles, notamment des leucémies liées à d'autres anomalies génétiques. Cela permettrait de proposer de nouveaux protocoles de traitement, essentiels pour ces différentes maladies infantiles.

Procédures

1 Irradiation en vigile : 2min, 960 animaux 1 Injection de cellules humaines sous anesthésie : 2min, 960 animaux 1 Prélèvement de moelle osseuse sous anesthésie : 5min, 480 animaux 1 Prélèvement de sang sous anesthésie : 3 min, 720 animaux 1 Injection de cellules humaines qui constitueront les mini-os humanisés sous anesthésie : 5min, 480 animaux 20 Injections de molécules sur animal vigil : 1min, 240 animaux 2x20 Traitements par la voie orale sur animal vigil : 2min, 240 animaux 15 Suivis du traitement sous anesthésie par bioluminescence : 10min, 240 animaux

Impact sur les animaux

-L'irradiation avant la transplantation provoque une anémie qui dure environ dix jours. - Les prélèvements de sang et de moelle osseuse à l’os du fémur peuvent causer des douleurs localisées, précocement après que le geste ait été fait. -Les mini-os humanisés implantés sous la peau des souris peuvent causer une gêne localisée. -le suivi de la progression de la maladie par bioluminescence peut entrainer un stress -les traitements par gavage ou injection sous-cutanée peuvent entrainer stress et inconfort/douleur localisé (point d’injection) -le développement de la leucémie entraine une paralysie du train-arrière.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédures. Les tissus/organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, colonne vertébrale, ossicules) seront prélevés et les cellules qui y sont contenues seront soumises à une caractérisation qui nous permettra d’identifier la quantité et la qualité des cellules leucémiques présentes dans les organes en question. Cela permettra de comparer les différents groupes de souris afin de pouvoir tirer les conclusions suite à nos observations.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude des leucémies, l’expérimentation sur des animaux, comme les rongeurs, est essentielle pour comprendre comment la maladie se développe dans un patient. Les méthodes de culture cellulaires (in vitro) ne permettent pas de reproduire fidèlement tous les mécanismes qui se ont lieu dans un corps vivant. Les modèles animaux, et notamment les souris, sont les seuls à pouvoir imiter fidèlement les processus complexes comme la migration et le développement des cellules sanguines, qu’elles soient saines ou malades. Bien que nous utilisions des systèmes de culture en laboratoire aussi souvent que possible, ils ne reproduisent pas toutes les étapes du développement de la leucémie, que ce soit dans la moelle osseuse ou dans d'autres organes. En plus, ces modèles de culture ne démontrent pas le processus complet de transformation en leucémie, contrairement aux modèles vivants (in vivo). C'est pourquoi les expériences sur les rongeurs sont indispensables et complètent les stratégies de culture en laboratoire. En plus de cela, ce projet vise à proposer un traitement qui devra être testé sur ces modèles animaux avant de pouvoir être utilisé chez les patients.

Réduction

Nous avons à cœur de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Les groupes d’étude comprendront entre 8 et 10 souris par groupe. Chaque expérience sera réalisée 2 ou 3 fois de manière indépendante afin d’obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique. Si les résultats de deux expériences sont statistiquement significatifs, nous pourrons décider de ne pas réaliser une troisième expérience. Lorsque nous devons tester plusieurs traitements en suivant la même procédure, nous réaliserons les expériences en même temps pour comparer tous les groupes avec un seul groupe témoin. Cela permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’utilisation du modèle d’ossicules (mini-os humanisés) permet aussi de limiter le nombre d’animaux. Chaque souris portera 2 ossicules (un sur chaque flanc), ce qui nous permettra d’augmenter le nombre d’ossicules testés sans avoir besoin d’utiliser plus de souris.

Raffinement

Les animaux utilisés pour atteindre les objectifs du projet seront régulièrement surveillés par l’équipe et le personnel animalier afin de repérer tout changement de comportement et éviter autant que possible toute douleur, souffrance ou stress inutile. Afin d’améliorer le bien-être des souris vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement dans la cage en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons pour plus de confort. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de sang et de moelle osseuse réalisé pour apprécier le développement leucémique. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale. Des critères, appelés points limites, seront définis pour assurer le bien-être des animaux et limiter leurs souffrances en cas de progression irréversible de la maladie.

Choix des espèces

La souris est un petit mammifère facile à élever et à reproduire en captivité. Comme sa génétique et son comportement sont bien connus, il est facile de mesurer son bien-être, sa souffrance et son stress et d’y remédier rapidement. Cela en fait un excellent modèle pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. De plus, la souris partage 99% de ses gènes avec l’être humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux pathologies humaines, aidant ainsi à améliorer leur compréhension et leur traitement. Enfin, les souris reproduisent les étapes principales du développement des leucémies, ce qui en font de bons modèles d’étude, en particulier de traitements. Les souris que nous utiliserons dans ce projet sont des souris immunodéficientes (qui n’ont pas de système immunitaire fonctionnel), qui peuvent recevoir des greffes de cellules sanguines humaines, qu’elles soient normales ou leucémiques. Ces souris, élevées dans des conditions spécifiques, ne présentent pas les défauts associés à leur immunodéficience. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, qui, selon les recherches de notre laboratoire, montrent une excellente capacité à accepter des greffes après injection, que ce soit pour des cellules normales ou malades.

Un rein retiré chirurgicalement en début d'expérience pour concentrer l'effet des anticorps sur celui qui reste : 42 hamsters dorés vont être utilisés pendant 77 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent six injections d'anticorps humains dans le sang, subissent des prélèvements de sang et d'urine deux fois par semaine, et sont isolés quatre heures à chaque recueil urinaire. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer un syndrome néphrotique, avec œdèmes, perte de poids, troubles du rythme cardiaque, hypertension et perte de motricité. Le hamster a été retenu après le constat que souris, rats, lapins et cobayes n'expriment pas la protéine visée dans le rein, le porc l'exprimant aussi mais étant jugé moins facile à élever.

Objectifs

La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux. Des recherches ont identifié plusieurs cibles d’anticorps auto-immuns, notamment des protéines présentes à la surface des neurones, comme la contactine 1. Chez certains patients, une PIDC survient en parallèle d’une maladie auto-immune rénale appelée glomérulopathie extramembraneuse (GEM), une pathologie dont l’évolution clinique peut être variable, allant parfois jusqu’à une perte totale de la fonction rénale. Bien que la co-occurrence de ces deux maladies ait été fréquemment observée, leur lien direct n’a jamais été formellement établi dans la littérature scientifique. Récemment, la contactine 1 a été détectée dans les petits amas de vaisseaux sanguins qui participent à la filtration rénale. Par ailleurs, des anticorps dirigés contre la contactine ont été identifiés simultanément dans le nerf et le rein, renforçant l’hypothèse d’un mécanisme commun. L’objectif principal de ce projet est de confirmer, à l’aide d’un modèle hamster, le rôle des anticorps anti-contactine 1 dans le développement de cette maladie rénale. Il s’agit également d’analyser les dysfonctionnements cliniques et tissulaires provoqués par ces anticorps afin de mieux comprendre cette pathologie. Les résultats de cette étude pourraient permettre d’améliorer les outils de diagnostic et de proposer des traitements adaptés pour les patients humains souffrant de cette maladie complexe.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de confirmer l'implication des anticorps anti-contactine et leur lien avec le développement d’une atteinte rénale induisant des modifications biochimiques et histologiques. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la glomérulopathie extramembraneuse ainsi que dans le développement de tests de dépistage et d’évaluation de la maladie si le rôle pathogène des anticorps est confirmé et si leur concentration a une valeur pronostique.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans une seule procédure qui se déroulera en plusieurs étapes sur une durée de 77 jours. Des injections d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux auront lieu 6 fois au cours des 77 jours pour induire une maladie rénale. Des prélèvements sanguins et urinaires auront également lieu deux fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Les injections et les prélèvements réalisés deux fois par semaine ne dureront pas plus de 10 minutes. Les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention afin d'éviter la douleur et diminuer leur angoisse. L'un des deux reins des animaux sera retiré en début d’expérimentation pour optimiser l’action des anticorps sur le rein restant. Cette chirurgie ne durera pas plus d'une heure et sera réalisée sous anesthésie générale avec une gestion rigoureuse de la douleur.

Impact sur les animaux

Les hamsters pourront ressentir un léger stress lors des injections de substances (anesthésiques, anticorps) ou des prélèvements. Les injections d'anticorps pourraient entrainer l'apparition d'un syndrome néphrotique . Ainsi, ces injections peuvent provoquer différents symptômes : fatigue, oedèmes, perte de poids, troubles du rythme cardiaque, hypertension artérielle ainsi que des atteintes neurologiques et une perte de la motricité des animaux. La chirurgie visant à réaliser une néphrectomie peut provoquer des douleurs post-opératoires, un risque d'infection, des anomalies de la coagulation, des troubles électrolytiques, une anorexie, une léthargie et une déshydratation. De plus, les animaux seront isolés en moyenne deux fois par semaines pendant 4 heures afin de prélever leurs urines, cela pouvant provoquer du stress et de l'angoisse chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps anti-contactine1.

Remplacement

L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection des anticorps anti-contactine1 humains induit chez le Hamster des altérations neurologiques et de la fonction des reins similaires à celles observées chez l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif.

Réduction

Le modèle de Hamster visant à recréer une maladie rénale avec des injections d'anticorps étant unique, il est difficile de prévoir quels seront les changements sur les différents paramètres cliniques et anatomopathologiques testés. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum à 14 animaux par groupe en utilisant les données publiées chez l’homme.

Raffinement

Nous attachons une importance majeure sur les conditions d’hébergement et la qualité de vie des animaux. C’est pourquoi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Pour les phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un antidouleur sera administré à l’animal. Dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs.

Choix des espèces

Nous avons préalablement recherché in vitro la contactine dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries souris, rats, lapins et cochons d’Inde mais aucun d’entre eux n’exprime la contactine dans le rein. Seul le Hamster et le porc expriment cette protéine dans leur reins. Notre choix s'est ensuite porté sur le modèle hamster car plus facile à élever. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 10-14 semaines, pour des raisons techniques (poids entre 100-120g), permettant des groupes homogènes.

Toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées de bléomycine cinq jours par semaine pour provoquer un durcissement de la peau, une inoculation quotidienne de Porphyromonas gingivalis dans la bouche, et pour une partie d'entre elles la pose de ligatures autour de quatre molaires trois fois par semaine sous anesthésie générale. Le porteur décrit la pose des ligatures comme non douloureuse et précise dans la même rubrique qu'aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré, ces médicaments risquant d'interférer avec les résultats. Sur le remplacement, il écrit que la règle "n'est pas applicable dans le cas de ce projet".

Objectifs

La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune rare qui touche près de 10000 personnes en France, principalement les femmes. Elle est caractérisée par une fibrose des tissus (la peau notamment), des anomalies des vaisseaux et une dérégulation du système immunitaire. La cause n’est pour le moment pas connue. Un dérèglement du microbiote, avec un déséquilibre entre les bactéries positives et négatives de notre flore microbienne (appelé dysbiose), a été impliqué dans le développement de nombreuses maladies autoimmunes, dont la sclérodermie systémique. La parodontite est une pathologie inflammatoire d’origine infectieuse très répandue dans la population mondiale, puisqu’elle touche plus de 50% de la population âgée de plus de 50 ans. Elle se caractérise par une infection et une inflammation des tissus de soutien des dents appelé parodonte, qui comprend la gencive, l’os alvéolaire et le ligament alvéolodentaire. La parodontite aboutit au déchaussement, voire à la perte des dents. Elle est la conséquence d’un déséquilibre du microbiote parodontal. La bactérie Porphyromonas gingivalis joue un rôle clé dans cette pathologie. Notre hypothèse est que la dysbiose du microbiote parodontal et en particulier la présence de la bactérie Porphyromonas gingivalis pourrait représenter un facteur de risque et avoir un impact sur le développement de la sclérodermie systémique. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de souris permettant d'étudier l'impact de la dysbiose du microbiote parodontal dans le développement de la sclérodermie systémique.

Bénéfices attendus

La cause de la sclérodermie systémique n’est pour le moment pas connue, mais les facteurs environnementaux, et notamment certains microorganismes, jouent un rôle dans le déclenchement de la maladie. La mise en évidence de l’implication d’une dysbiose du microbiote parodontal, et en particulier de la bactérie Porphyromonas gingivalis, dans le développement de cette maladie autoimmune rare permettra ainsi d’améliorer la compréhension de la sclérodermie systémique, ce qui nécessaire pour pouvoir développer de nouveaux traitements dans le futur. Il n’existe en effet pour le moment pas de traitement permettant de guérir cette pathologie, qui a un fort impact sur la qualité de vie et la survie des patients

Procédures

Les animaux sont soumis à une injection sous-cutanée de bléomycine (réalisée 5 jours par semaine), qui est une molécule ayant pour effet de provoquer une fibrose de la peau, afin de reproduire la sclérodermie systémique. La réalisation de ces injections est rapide (moins de 2 minutes). Pour induire la dysbiose du microbiote parodontal, une partie des souris sera soumise à une inoculation quotidienne avec une solution contenant la bactérie Porphyromonas gingivalis, qui sera appliquée uniquement au niveau de la bouche à l’aide d’une canule à bout mousse. Chez l'autre partie des souris, une pose de ligatures imbibées avec une solution contenant la bactérie Porphyromonas gingivalis sera en plus réalisée autour des molaires maxillaires 3 fois par semaine, afin de reproduire une parodontite. La pose des ligatures au niveau de 4 molaires est un geste nécessitant un temps d'une dizaine de minutes en tout. Les animaux seront également soumis à des prélèvements sanguins qui seront réalisés toutes les 2 semaines et qui nécessitent un temps inférieur à 5 minutes. La plupart de ces procédures (injections initiales de bléomycine, pose des ligatures, prélèvements sanguins) sera réalisée sous anesthésie générale, à l’exception de l’inoculation buccale de la bactérie Porphyromonas gingivalis, qui est une application rapide d’un petit volume de solution au niveau de la bouche de l’animal, et des injections de bléomycine après habituation de l’animal à une récompense.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées de bléomycine initiales, le placement des ligatures imbibées de la bactérie Porphyromonas gingivalis, et les prélèvements de sang au niveau de la veine submandibulaire seront réalisés sur animal anesthésié (anesthésie générale par injection de kétamine/xylazine ou anesthésie gazeuse à l'aide d'isoflurane). Les nuisances liées aux anesthésies répétées sont inhérentes a toute anesthésie. L'utilisation de l'isoflurane pour l'anesthésie présente un aspect aversif pour la souris, cependant l'anesthésie génère un stress moins important que de réaliser les gestes à l'état vigile. La bléomycine est glycopeptide qui induit une inflammation et une fibrose cutanée progressive lorsqu’il est injecté par voie sous-cutanée. Les animaux vont donc développer une fibrose au niveau de la zone d’injection, c’est-à-dire au niveau du haut du dos. Porphyromonas gingivalis est une bactérie qui est impliquée dans le développement d’une inflammation gingivale. L’induction de la parodontite par Porphyromonas gingivalis n’est cependant pas assez longue pour obtenir une destruction complète de l'os qui soutient les dents et donc une mobilité ou une perte de dents chez les souris. La parodontite induite n’entravera pas l’alimentation des souris. Un suivi quotidien du bien être des animaux et de leur poids sera mis en place dès le début des procédures grâce à une grille de suivi comprenant des points limites.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans les procédures sera mis à mort à la fin des procédures (prélèvement post mortem de différents organes afin de réaliser les différentes analyses) ou en cas d'atteinte des points limites.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable dans le cas de ce projet. En effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier l’impact de la bactérie Porphyromonas gingivalis sur la physiopathologie de la sclérodermie systémique. Nous étudions notamment les réponses immunitaires et la production d'autoanticorps, qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à l'utilisation de modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire ainsi que les mécanismes physiopathologiques parodontaux, car les connaissances et les outils d’analyse chez la souris sont très développés dans les domaines de l'immunité et de la parodontologie.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été décidée. Nous nous basons sur des protocoles déjà bien établis dans la littérature. La pertinence des résultats sera évaluée à l'aide de tests statistiques appropriés. Le nombre minimal d'animaux par groupe expérimental pour chaque question posée a été calculé et il est de 5 à 14 animaux par groupe. Toujours dans un souci de réduction, le nombre d’animaux exact nécessaire pour chaque procédure sera commandé auprès de fournisseurs agrées et nous ne réaliserons pas de croisements.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière au bien-être animal notamment via le raffinement des conditions d’hébergement. Les groupes de souris utilisés pour les expériences seront placés dans les cages expérimentales à couvercle filtrant (6 maximum par cage) avec enrichissement (tubes en polycarbonate rouge translucides, nids, frisures de carton...) sur des portoirs ventilés deux semaines avant le début des procédures, afin de réduire au maximum le stress animal. Une habituation à la manipulation sera réalisée de façon quotidienne après la première semaine d’acclimatation, jusqu’au début de la procédure. Certaines procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront pesés et suivis quotidiennement à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, décritz pour chaque procédure, afin de les soustraire à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites specifiques. Des soins péri- et post-opératoires seront également réalisés. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante (37°C) immédiatement après les anesthésies afin de maintenir leur température corporelle jusqu’à leur réveil de l'anesthésie. Une application de gel au niveau des yeux sera réalisée à intervalles réguliers jusqu’au réveil pour lubrifier la surface oculaire et de prévenir la déshydration, ainsi que l’apparition d’éventuelles lésions de la cornée. La pose des ligatures au niveau des molaires n'est pas une procédure douloureuse. Elle nécessite cependant d’être réalisée sous anesthésie générale car elle nécessite le maintien d'une ouverture buccale de la souris pendant quelques minutes. Nous ne pourrons cependant pas administrer d'anti-inflammatoires en cas de douleur, car ces médicaments pourraient interférer avec les expériences réalisées. Cependant, les gestes réalisés et notamment la pose de ligatures ne sont pas des gestes douloureux et ne nécessitent pas la mise en place d'un traitement antalgique.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en immunologie, en particulier dans le domaine de l'auto-immunité, le système immunitaire des souris étant proche du système immunitaire humain. Nous disposons de nombreuses techniques d'analyse du système immunitaire chez la souris et de l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 12 semaines, qui sont des souris avec système immunitaire complètement mature et chez qui la croissance osseuse du maxillaire et la physiologie du parodonte sont établies.