Recherche appliquée

4 800 souris et 1 440 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, un même groupe passant jusqu'à trois des cinq protocoles, et les souris modèles de trisomie 21, de syndrome de l'X fragile ou de narcolepsie les cinq, parce qu'elles sont disponibles en quantités limitées. Souris et rats sont placés dans le labyrinthe de Barnes, le labyrinthe en Y, le test de reconnaissance de nouvel objet, le rotarod et le test des trois chambres, avec pour une version une restriction alimentaire sur huit jours et, pour une autre, une lumière et un bruit forts destinés à les pousser vers un refuge. Des candidats médicaments leur sont administrés à différents moments du protocole. 1 320 animaux contrôles pourront être réutilisés dans d'autres projets, les autres sont tués, à commencer par ceux dont le traitement risquerait d'interférer avec une expérience ultérieure.

Objectifs

Il existe de multiples formes de mémoire chez l’humain, avec notamment la mémoire déclarative (ou explicite, que l’on peut verbaliser), qui est perturbée dans de nombreuses pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, l’autisme, ou encore des maladies génétiques telles que la trisomie 21, le syndrome de l’X Fragile… Afin de chercher des pistes thérapeutiques à ces pathologies, il est nécessaire de passer par des tests chez l’animal, et donc de pouvoir évaluer leur mémoire déclarative de manière objective, car ils ne peuvent pas la verbaliser. Différents types de tests comportementaux ont été mis au point dans ce but, en utilisant des stratégies distinctes. Un première stratégie vise à approcher la mémoire déclarative humaine chez l’animal en mettant en jeu un sous-type de cette forme de mémoire, la reconnaissance/familiarité, qui peut être évaluée chez le rongeur. Le test le plus utilisé est celui de reconnaissance de nouvel objet, que nous utiliserons dans ce projet. Une seconde stratégie utilisée pour évaluer la mémoire chez l’animal repose sur un parallèle existant entre mémoire déclarative humaine et mémoire spatiale animale, qui reposent toutes les deux sur les mêmes structures cérébrales et qui partagent des mécanismes. Divers dispositifs ont été validés dans la littérature afin d’étudier cette mémoire spatiale chez la souris et le rat, et nous en utiliserons deux dans ce projet : le labyrinthe de Barnes et le labyrinthe en Y. Grâce à ces trois tests comportementaux évaluant des types de mémoire différents, nous avons pour objectif de tester l’effet sur la mémoire de nouveaux candidats médicaments développées dans notre centre de recherche (dont la majorité ont pour cible des récepteurs du système nerveux central). C’est pourquoi nous travaillerons tout d’abord sur des animaux standards dans un contexte physiologique afin de tester l’effet sur la mémoire des composés en conditions basales. Nous prévoyons aussi d’utiliser des modèles murins de pathologies génétiques (Trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile) afin d’étudier l’effet bénéfique potentiel de nos composés pour réduire les déficits cognitifs présents dans ces modèles.

Bénéfices attendus

A court terme, et à l’échelle du laboratoire dans le développement préclinique de nouvelles entités pharmacologiques, ce projet permettra de caractériser l’effet de ces entités sur différents types de mémoire (reconnaissance d’objet, reconnaissance spatiale et sociale, mémoire à court ou long terme, flexibilité cognitive, mémoire procédurale). En travaillant tout d’abord chez des animaux standard en condition physiologique, on pourra ainsi sélectionner des composés présentant des effets pro-mémoire intéressants pour des applications dans des pathologies comportant des déficits mnésiques (exemples : maladie d’Alzheimer, schizophrénie, autisme…). Où à l’inverse, nous pourrons par exemple exclure du développement préclinique des molécules ayant un effet néfaste sur la mémoire. D’autre part, ce projet inclus trois modèles murins de maladies génétiques (trisomie 21, syndrome de l’X Fragile et narcolepsie), qui permettront de tester l’effet de nos nouvelles entités pharmacologiques sur les déficits cognitifs présents dans ces pathologies. Ainsi, à plus long terme et à l’échelle du développement clinique, ce projet pourrait permettre de fournir des données scientifiques précliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

Ce projet comporte 5 protocoles différents et indépendants. Dans le cas d’utilisation de souris et de rats standards, un même groupe de souris pourra être testé au maximum dans 3 des 5 protocoles. En revanche, dans le cas de l’utilisation des 3 modèles souris de la trisomie 21, du syndrome de l’X Fragile et de la narcolepsie, les mêmes souris seront soumises aux 5 protocoles car ces souris sont disponibles en quantités limitées. Le premier protocole est le test du labyrinthe de Barnes. Ce protocole sera déroulera sur plusieurs jours (une à deux semaines), et pour chaque journée chaque animal ne sera testé dans le labyrinthe qu'une à trois fois pour une durée de 3 minutes maximum chacune. Le second protocole est le test du labyrinthe en Y, qui pourra se décliner en 3 versions différentes. La première version se fera en un seul essai de 8 minutes ; la seconde version impliquera une restriction alimentaire légère (pour motiver la recherche de récompenses alimentaires) et se déroulera sur 8 jours avec au maximum 3 essais par jour de quelques minutes ; la troisième version aura lieu sur 1 à 2 jours avec 2 essais de 5 min séparés de 1h à 24h. Le troisième protocole de ce projet est le test de reconnaissance de nouvel objet. Ce test a lieu sur 2 jours, avec trois phases de 5 à 10 minutes chacune au sein du dispositif et séparées de 4-5h à 24h. Le quatrième protocole est le test de rotarod qui comporte 2 à 5 jours d’apprentissage comportant 1 à 4 essais par jour, avec un test de rappel composé de 1 à 4 essais 2 à 7 jours plus tard. La durée de chaque essai sera inférieure à 5 minutes. Le cinquième et dernier protocole est celui du test des 3 chambres, qui comporte 3 phases de 10 minutes, avec un délai entre les deux dernières phases allant de 1 min à 24h. Pour chacun des 5 protocoles de ce projet, des candidats médicaments seront administrés aux rongeurs à différentes phases du protocole (avant l’entraînement, avant le test de mémoire…) selon l’effet recherché.

Impact sur les animaux

Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, dans le cadre d'un protocole spécifique, les rongeurs pourront être soumis à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d'un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. Enfin, toutes nos procédures impliquent une manipulation des animaux pour les introduire dans les différents dispositifs, ce qui est source de stress, mais qui sera atténué par une habituation préalable et par le transport dès que possible via des tunnels ou sur le bras de l'expérimentateur pour éviter le soulèvement par la queue.

Devenir

Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort, tout comme les souris modèles de pathologies génétiques qui ne peuvent pas être réutilisées dans d'autres projets. Cependant, les animaux contrôles standards pourront être réutilisés dans d’autre projets selon les objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (ou par une personne compétente désignée par lui) ou par le vétérinaire.

Remplacement

Ce projet ayant pour but de tester l’action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire normale et pathologique, il est nécessaire de passer par des modèles animaux avant toute administration à l’homme. En effet, l’évaluation d’un processus aussi complexe et intégré que la mémoire, mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée in vitro ou in silico.

Réduction

Un effectif minimum de 16 souris/12 rats par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours après l’arrivée des animaux est prévue avant le début des expérimentations. Tout au long des études, les animaux sont hébergés e, groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, igloo, appareil de nidification…), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi du bien-être par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Chaque animal est manipulé et pesé quotidiennement en phase active de protocole afin de diminuer le stress induit par la manipulation. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration de produits afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont très classiquement utilisés dans la littérature au sein de tests comportementaux évaluant la mémoire, et les protocoles sont bien établis pour ces deux espèces, en particulier pour les trois tests utilisés dans ce projet. De plus, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire telle qu’elle est testée chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire humaine, avec même des tests mnésiques réalisés chez la souris qui peuvent être transposés de manière très fidèle chez l’humain. D’autre part, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour lesquelles les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. En effet les tests de mémoire sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d’attention fonctionnelles.

Une goutte ophtalmique dans l'œil droit chaque jour pendant douze à vingt-quatre jours, une biopsie de queue chez les nouveau-nés, un examen des yeux sous anesthésie générale puis un prélèvement sanguin : 2 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent une mutation qui les rend progressivement aveugles, et sont utilisées pour tester quatre composés contre la dégénérescence rétinienne. Les souris dont le génotype ne correspond pas à celui attendu sont tuées dès l'élevage, comme les femelles une fois accouplées. L'effectif de 2 650 n'est rattaché à aucun calcul, le porteur indiquant seulement que les accouplements ont été calculés d'après les expériences antérieures.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de 4 composés dans le traitement de la dégénérescence rétinienne, due au défaut d’un gène, dans des modèles de souris porteurs de mutation de ce gène.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’efficacité d’un ou plusieurs composé(s) chimique(s) pour traiter la dégénérescence rétinienne provenant de mutations génétiques connues et représentant une cible thérapeutique majeure pour la dégénérescence rétinienne. Ce composé a déjà montré des résultats prometteurs in vitro et in vivo après une administration intrapéritonéale.

Procédures

Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de 1 à 2 millimètres sera prélevée. Les animaux seront soumis à 1 goutte ophtalmique dans l’œil droit (environ 10 secondes/administration) tous les jours pour une durée allant de 12 à 24 jours. Les animaux seront soumis à une évaluation de l’état des yeux par un examen ophtalmologique réalisé le dernier jour de traitement, sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant (environ 15min/examen). Enfin, à la fin de l’examen ophtalmologique, chacun des animaux sera soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (30 secondes/prélèvement).

Impact sur les animaux

La maladie provoque une atteinte de la vue progressive allant jusqu'à la cécité. Ce phénotype est dommageable même si les souris aveugles ont un comportement tout à fait normal, sans souffrance apparente. Administrations ophtalmiques répétées : risque d’inflammation oculaire. Injection intrapéritonéale d’anesthésique : léger stress et risque d’hypothermie Examen ophtalmologique : risque de cataracte transitoire Prélèvement submandibulaire : léger stress

Devenir

A l’issue de la procédure d’élevage les animaux sont mis à mort après accouplement ou si leur génotype n’est pas celui attendu. Concernant les protocoles thérapeutiques, les animaux sont mis à mort et les organes seront recolletés post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les recherches préliminaires ayant permis l’identification des molécules thérapeutiques qui font l’objet de cette étude ont été menées sur des cellules issues des patients afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’une rétine, il n’a pas été possible de substituer des approches cellulaires aux modèles de souris impliqués dans ce projet à visée thérapeutique.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien à nos expériences. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux. De plus, un seul œil sera traité, permettant de conserver l’œil controlatéral comme contrôle interne.

Raffinement

Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, du coton, des maisonnettes en carton et des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger seront ajoutés dans la cage. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après l’intervention pour vérifier qu’ils sont bien réacceptés par leur mère. Les examens ophtalmologiques seront réalisés sur une surface chauffante, sous anesthésie générale après injection d’un mélange de produits anesthésiques adaptés. L’application de points limites stricts et spécifiques au projet conduira à prendre en charge la douleur et la souffrance éventuelle des animaux.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, l’œil est un organe facilement accessible et l’organisation structurale de la rétine d’une souris est très proche de celle de l’homme. La validation thérapeutique du composé sera initiée à 6 jours de vie (avant l’ouverture des yeux et le début de la dégénérescence rétinienne) et sera poursuivie jusqu’à un stade suffisamment évolué de la maladie pour différencier les souris contrôles des souris porteuses de la maladie, mais suffisamment précoce pour observer un effet thérapeutique, soit 18 ou 21 jours pour le modèle présentant une atteinte rétinienne précoce ou 30 jours pour celui présentant une atteinte rétinienne progressive.

100 rats porteurs de mutations du gène CLCN4 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils passent une batterie de tests entre douze et vingt semaines d'âge, activité locomotrice et anxiété pendant trente minutes, coordination, force musculaire, comportement compulsif, apprentissage et mémoire sur huit jours, plus trois nuits d'isolement en cage individuelle pour évaluer un état dépressif. La mise à mort sert à prélever les organes pour des analyses histologiques et protéomiques. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de comprendre cette maladie neurodéveloppementale rare par un modèle animal, et conclut que seul l'animal permet d'en caractériser les symptômes, les approches in vitro se limitant selon lui aux mécanismes.

Objectifs

La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.

Bénéfices attendus

Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.

Procédures

Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); AMENDEMENT-1 - ajout d'un test pour évaluer la dépression (3*16h); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide AMENDEMENT-1 - sous anesthésie. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant. AMENDEMENT-2: Le prélèvement et fixation des organes sera réalisé sous anesthésie profonde

Impact sur les animaux

Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype, les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention durant quelques secondes. AMENDEMENT-1 - une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux. AMENDEMENT-1 - Le test de préférence du saccharose nécessite d'isoler les animaux pendant 3 nuits, tout en gardant le contact visuel avec leurs congénères: les animaux seront placés seuls dans des cages d'hébergement de 17h à 9h le lendemain matin pendant 3 jours. De 9h à 17h, les animaux retrouveront leur cage et leur congénère d'origine. AMENDEMENT-2: Le prélèvement et fixation des organes sera réalisé sous anesthésie profonde.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)

Remplacement

L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.

Raffinement

Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. AMENDEMENT-1 - L'isolement des animaux lors du test de préférence du saccharose (3*16h) se déroulera dans des cages d'hébergement avec enrichissement (nid, bâton et balle à ronger). Ces cages sont transparentes et les animaux continueront d'avoir un contact visuel avec leurs congénères.

Choix des espèces

Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.

Produites pour alimenter d'autres projets du même laboratoire sur les maladies neuromusculaires, 25 400 souris de sept lignées génétiquement altérées vont être élevées et génotypées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 20 865 d'entre elles et modéré pour 4 535. Chaque souriceau subit entre le septième et le douzième jour de vie un prélèvement de queue et un tatouage des phalanges, l'ensemble prenant moins de cinq minutes. Les animaux porteurs des pathologies étudiées peuvent développer une atteinte locomotrice, une respiration accélérée ou des signes de déshydratation, et le porteur indique les tuer avant l'apparition des symptômes lorsqu'aucune expérience ne les attend. Les autres sont maintenus en vie pour la reproduction ou versés à des projets applicatifs, l'effectif de 25 400 étant estimé à partir de l'historique de production de l'établissement et de "besoins" susceptibles d'évoluer.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux d'élevage à des fins d'utilisation scientifique. Il permettra l’élevage de 7 souches de souris génétiquement altérées nécessaires à la mise en œuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie des maladies étudiées dans notre Laboratoire et de trouver des approches thérapeutiques innovantes pour des maladies neuromusculaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour un groupe de maladies humaines rares et orphelines de médicaments, sur des modèles de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de maladies neuromusculaires rares.

Procédures

Les prélèvements de tissus à partir d'un très petit morceau de queue sont réalisés sur animaux vigiles. Cet acte est réalisé en même temps que le tatouage des phalanges et n’est pratiqué qu’une seule fois. Au total, moins de 5 minutes sont nécessaires pour réaliser ces deux actes par animal. En effet, si les prélèvements de tissus s'executent en moins d'une minute, les instruments doivent être désinfectés entre chaque animal ce qui peut prendre 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu sur jeunes animaux vigiles pour le génotypage. La contention d’animaux jeunes pour se faire peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures. Les animaux porteurs des pathologies étudiées dans notre Laboratoire peuvent présenter un phénotype dommageable de type atteinte locomotrice, polypnée ou signes de déshydratation. Ces symptômes peuvent correspondre à un degré d'inconfort jugé modéré.

Devenir

Euthanasie des animaux ou maintien en en vie pour la reproduction ou une utilisation continue dans des projets applicatifs.

Remplacement

Un effort de remplacement est réalisé en amont voire en parallèle du programme d'élevage. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions biologiques qui se posent à nous à l'aide de modèles cellulaires. L’utilisation d’animaux dans des études n'est effective que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions biologiques. Par exemple, lorsqu'il est nécessaire d’étudier les symptômes liés à des troubles du comportement moteur caractéristiques des maladies neuromusculaires que nous étudions ou encore pour étudier la biodistribution d’un traitement dans l'organisme.

Réduction

Nous avons prévu d’utiliser un total de 25400 souris pour fournir les animaux nécessaires à l'ensemble des expériences pour les 5 années d'études à venir sachant que nos besoins peuvent évoluer en fonction d'éventuelles ré-orientations des objectifs scientifiques à l'appui de nouvelles publications scientifiques et de nouveaux résultats. Aussi nous sommes-nous basés sur les données statistiques de 2022 et 2023 ainsi que sur l'historique des données de production des lignées maintenues dans notre établissement pour faire cette estimation. Cette base d'estimation nous amène à envisager une moyenne de 5080 souris par année pour les 7 lignées de souris objet de ce dossier, soit un total de 25400 souris sur 5 ans. Les deux sexes seront utilisés dans les protocoles lorsque la maladie n’est pas liée au sexe ou que le projet n’est pas dépendant d’un des deux sexes.

Raffinement

Dans ce programme d’élevage, les animaux mimant les pathologies étudiées seront utilisés pour les projets applicatifs ou seront euthanasiés avant l’apparition des symptômes. Nous évitons ainsi l’expression du phénotype dommageable quand il n’est pas associé à un besoin expérimental. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (maisonnette en cellulose, bâtonnets en bois, élément pour la confection des nids, copeaux, tunnel, autres éléments spatiaux d'enrichissement) et sont observés quotidiennement. Au moment du sevrage, nous ne séparons les fratries que par sexe et ne regroupons pas les mâles (frères et germains) à plus de 2 semaines d'écart d'âge pour limiter le risque d’agressivité. De la nourriture est ajoutée directement sur le sol de la cage et des pipettes d’eau plus longues sont mises en place pour que les juvéniles sevrés ou les animaux présentant une atteinte locomotrice aient facilement accès à l'eau et à l'aliment. Le cas échéant, un aliment hydratant et nourrissant peut être placé à même le sol dans une coupelle pour les animaux déshydratés. Pour ne plus attraper les animaux par la queue lors du change des litières, les zootechniciens utilisent leurs mains jointes en creux ou des tubes pour inciter les animaux à passer d’une cage à l’autre par eux-mêmes. Concernant les biopsies de tissu pour l'identification génétique des animaux, elles sont effectuées une seule fois entre 7 et 12 jours de vie par prélèvement d'un très petit bout de queue (moins de 0,5 mm). Ce prélèvement de tissu est réalisé à un âge où l’ossification et l’innervation des tissus ne sont pas encore bien différenciées.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter les mutations génétiques responsables des différentes maladies étudiées dans notre Equipe, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques mimant ces maladies. Les animaux de ce projet d’élevage seront utilisés à un stade précoce pour les identifications individuelles (microtatouage) et l'identification génétique ; et à un stade plus tardif de maturité sexuelle pour le renouvellement des reproducteurs.