Recherche appliquée

Jusqu'à 21 prélèvements sanguins par animal sur douze semaines, plafonnés à 15 % du volume sanguin total sur 28 jours : 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une maladie auto-immune leur est déclenchée par jusqu'à quatorze injections d'anticorps dirigés contre leurs plaquettes, ce qui peut provoquer pétéchies, anémie, hématomes et saignements mal contrôlés. La plupart sont tuées pour prélèvement d'organes, 300 d'entre elles pouvant être réutilisées si elles n'ont reçu qu'une administration unique et n'ont montré aucun signe clinique. Le porteur, prestataire de services en recherche préclinique, range ce modèle dans le panel qu'il propose à ses clients pour évaluer des candidats médicaments avant les essais chez l'humain.

Objectifs

La thrombocytopénie immunitaire (ITP) est une maladie auto-immune hétérogène, caractérisée par la déplétion plaquettaire médiée par des cellules immunitaires. Cette pathologie est invalidante et potentiellement mortelle et résulte de la production d'anticorps antiplaquettaires entraînant une destruction accélérée des plaquettes et par conséquent un taux de plaquettes faible (thrombocytopénie). L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle murin permettant de reproduire les phénomènes de la thrombocytopénie le plus prédictif possible afin de refléter la pathologie chez l’homme et de pouvoir évaluer de nouveaux traitements. Le modèle consiste en l’injection d’anticorps dirigés contre des protéines plaquettaires chez des souris. Un suivi de la concentration plaquettaire dans le sang périphérique est fait pour confirmer le déclenchement de la maladie.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pour la recherche, spécifiquement dans des maladies médiées par le système immunitaire (inflammation, maladies auto-immunes, etc). Ce projet a pour finalité la mise au point d’un modèle chez la souris qui récapitule les aspects clés de l’ITP chez l’homme, et l’évaluation de l’efficacité de candidats médicaments. Ce modèle permettra de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à un modèle préclinique prédictif permettant de transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin résoudre ou réduire la pathologie.

Procédures

Les animaux seront pesés avant induction et l’étude durera au maximum 12 semaines. L’ITP est induite par un seul ou plusieurs traitements consécutifs (maximum 1 fois par jour pendant 7 jours consécutifs, pouvant être répété après une semaine de repos entre les différentes périodes d’induction, ou une fois toutes les 48h pendant maximum 4 semaines). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par différentes voies. Le nombre, le volume et la fréquence d’administration suivront les recommandations de SBEA (Structure du bien-être animale). Des prélèvements de sang, d’urine ou de fèces pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 15 minutes si anesthésie). Le nombre et la fréquence des prélèvements seront adaptés à la durée de la procédure et suivront les recommandations du comité d’éthique. Le volume et le nombre de prélèvements sanguins seront ajustés de manière à ne pas dépasser 10% du volume sanguin total (VST) de l'animal par prélèvement. Sur 28 jours consécutifs, le volume total prélevé sera limité à 15% du VST (ou 20% si les animaux sont réhydratés), avec un maximum de 7 prélèvements. Pour les études de durée maximale de 12 semaines, jusqu'à 21 prélèvements seront faits (soit 7 prélèvement maximum sur 28 jours consécutifs). La technique la plus éthique sera systématiquement privilégiée, et ces recommandations pourront être adaptées en fonction des effets observés sur les animaux lors de la première expérience pilote.

Impact sur les animaux

Pour déclencher la maladie, les animaux recevront l’anticorps d’induction par voie IP ou IV en une seule injection ou plusieurs injections (maximum 14 injections d’induction de la maladie) ) espacées d’au minimum 24h, et des prélèvements de sang seront réalisés, ce qui pourrait induire une douleur et un stress léger à modéré. La douleur générée sera limitée à la piqure d’une aiguille. Les animaux pourront recevoir un traitement ce qui pourra générer une douleur et un stress modéré de très courte durée. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2 jours. Bien qu’il ne soit pas décrit de signes cliniques dans la littérature, nous ne pouvons pas exclure que des signes cliniques seront constatés sur les animaux suite à l’induction de la maladie (pertes de poids modérées, pétéchies, anémie modérée, tendance aux hématomes, saignements moins contrôlés) . Le protocole sera affiné lors de l’étape pilote afin de trouver une dose ne générant pas de signes cliniques invalidants.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de différents organes, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt. Pour les animaux ayant reçu une administration unique de composé ou uniquement des injections de véhicule, n’ayant pas eu de signes cliniques, et n’ayant pas besoin de prélèvements terminaux pour atteindre l’objectif de l’étude pourront être réutilisés (Avec l’accord du vétérinaire).

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. En moyenne, une étude comprendra 50 animaux (au moins 20). Nous estimons effectuer environ 10 études par an sur 5 ans. Dans le modèle, il a été démontré que 5 à 10 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévues pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et prélèvements et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.

Raffinement

Le suivi des animaux (signes cliniques transitoires éventuels pendant l’induction de la thrombocytopénie immunitaire) sera documenté et détaillé dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en fonction de l’évolution de la connaissance du modèle. Si l’un les signes de douleurs persistent l’animal sera mis en observation et si nécessaire un traitement antalgique opioïde mis en place. Les actes peu stressants (administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress. Ces administrations/prélèvements sont réalisées par des techniciens formés dont les compétences ont été validées et suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. Après les prélèvements sanguins, une compression sur le site de prélèvement sera effectuée pour favoriser la coagulation ; les animaux seront remis dans leurs cages après vérification de la bonne coagulation. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie.

Choix des espèces

- L’induction de l’ITP chez des souris est bien documentée dans la littérature. - Les modèles d’administration d’anticorps en intrapéritonéale ou intraveineuse pour l’induction de l’ITP chez des souris sont les plus utilisés dans le domaine et ressemblent le mieux à la maladie chez l’homme. - Pour ce modèle, diverses souches de souris immunocompétentes seront utilisées. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (au moins 6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient un poids et un système immunitaire mature pour faciliter l’induction de la maladie.

Greffés d'une tumeur sous la peau, dans la peau ou dans le coussinet graisseux mammaire, gavés jusqu'à cinq fois par jour et saignés jusqu'à quatre fois par jour à la veine saphène, 88 000 souris et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme réduire le nombre de manipulations au strict nécessaire, dans un projet dimensionné pour environ 170 études par an pendant cinq ans, à la demande de clients. Les animaux dont la tumeur ne pousse pas sont utilisés pour entraîner le personnel au gavage et aux prélèvements sanguins, ou tués pour fournir des organes témoins. Ceux qui passent d'une procédure à la suivante sont tués à la fin de la seconde, les autres à la fin de la leur.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements dans des modèles ectopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses à un site ne correspondant pas à celui de la tumeur d’origine) chez la souris ou le rat pour les cancers dont les besoins sont non satisfaits. Ce projet comprend quatre procédures : -Développement de modèles ectopiques - Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie (PK/PD) d’une molécule d’intérêt chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de la tolérabilité d’une molécule d’intérêt après administration unique ou répétée chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de l’efficacité d’une molécule d’intérêt sur des modèles ectopiques chez le rongeur. La première étape qui permettra par la suite d’évaluer une nouvelle molécule d’intérêt thérapeutique est le développement de modèles ectopiques. La greffe sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour des cellules tumorales d’origine humaine (xénogreffe) ou sur des animaux immunocompétents de même espèce que la lignée tumorale (modèles syngéniques). En fonction des cellules injectées, les greffes seront réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire. Trois types d’études pourront ensuite être réalisées sur ces souris/rats porteurs de tumeurs décrites ci-dessous. L’évaluation de la PK/PD est réalisée en analysant les concentrations sanguines et/ou tissulaires d’un composé ainsi que les niveaux d’expression/activation de biomarqueurs associés après administration unique ou répétée du composé. Le modèle PK/PD établi est indispensable pour la détermination des doses et fréquence à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et il permet également de prédire les doses à administrer lors des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’Homme. L’évaluation de la tolérabilité d’un composé est réalisée à des doses thérapeutiques déterminées par des études de pharmacocinétique sur souris naïves et des études PK/PD effectuées en amont. Elle consiste en l’administration unique ou répétée d’un composé et à l’observation de signes cliniques des animaux pour déterminer la/les doses et/ou la fréquence d’administration qui pourront être utilisées dans les études consécutives.

Bénéfices attendus

A l’origine de plus de 10 millions de décès par an, le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Les principaux traitements aujourd’hui consistent en la chirurgie et la chimiothérapie, souvent associées à une radiothérapie. Malgré ces options thérapeutiques, le nombre important de décès par an souligne l’inefficacité de ces traitements et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans le domaine de l’oncologie. A long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales à l’aide d’une aiguille réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire sous anesthésie gazeuse : durée 30 secondes 1 seule fois pendant l’étude. Dans le cas de l’utilisation d’un trocart, sous anesthésie gazeuse : durée 30 sec 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs : o Avec le pied à coulisse : durée 30 secondes 2 à 3 fois par semaine sur animaux vigiles. o Avec l’appareil de bioluminescence : durée 10 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max5xjour), intrapéritonéale (max4xjour), sous-cutanée (max4xjour), intramusculaire (max2xjour), intratumorale (1 injection/jour), ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. • Traitement par irraidation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence o par voie intrapéritonéale (max3xsemaine) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée. Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine caudale : durée 30 secondes (max 2xjour) o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 4xjour) o via la veine mandibulaire : durée 30 secondes (max 2xjour) o via amputation unique de la queue (coupe 1 à 2 mm sur l’extrémité non innervée de la queue) durée 1 min (max 10xjour). • Prélèvements de sang sur animal anesthésié à l’isoflurane o via la veine sublinguale (max 1x/jour).

Impact sur les animaux

Nuisances des animaux : pour chacune des procédures, les animaux seront injectés avec des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (sévérité légère) et tatoués (sévérité légère). Certains modèles tumoraux peuvent nécroser, d’où l’intérêt de choisir un site d’injection de cellules tumorales adapté (voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire) grâce à la procédure de développement de modèles pour éviter ces nuisances aux animaux. Pour les procédures de PK/PD, de tolérabilité et d'efficacité, les animaux sont traités avec des molécules pendant quelques jours à plusieurs semaines qui peuvent parfois être mal tolérées notamment durant les études de tolérabilité (dose du composé importante) et d’efficacité (traitement à long terme). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux utilisés pour la procédure de développement de modèles peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou de tolérabilité puis seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Les animaux utilisés pour une étude de tolérabilité peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou d'efficacité et seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Pour les procédures de PK/PD et d'efficacité, ainsi que pour les animaux des procédures développement de modèles et de tolérabilité non-réutilisés, les animaux seront mis à mort à l’issue de leur procédure respective. Quelque soit la procédure, des prélèvements de sang et de tissus pourront être réalisés et feront l’objet d’analyses ultérieures (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …).

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces modèles in vitro sont utilisés autant que possible en amont pour limiter le recours à l’animal. Cependant, ils ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme) sans recours à l’animal. En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d'observer une activité sur les modèles qui font l’objet des procédures de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’études prévues pour ce projet se base sur l’analyse rétrospective des trois dernières années, nous estimons que pour les 5 ans de ce projet, 170 études environ seront conduites par an. Les données de mise en place des modèles obtenus dans la procédure développement de modèle" permettront de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de PK/PD, de tolérabilité ou d'efficacité. Une analyse de puissance statistique sera appliquée pour la détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s'assurer de la bonne adéquation du nombre d'animaux par groupe et de la puissance statistique recherchée. Les animaux qui sont exclus des études pour des raisons de taille tumorale trop petite ou trop grande sont toujours utilisés pour permettre d’avoir soit des tissus témoins pour la détermination du pourcentage de liaison aspécifique ou de la concentration des molécules d’intérêt dans les tumeurs. Si des tumeurs n’ont pas du tout poussé, les animaux pourront être utilisés pour des entraînements à différents gestes techniques tels que le gavage ou les prélèvements sanguins ou pour récupérer des matrices blanches (organes, sang, plasma). De plus les procédures sont interconnectées et les animaux peuvent être utilisés pour plusieurs procédures limitant de ce fait l’utilisation d’animaux. Les animaux de la procédure "développement de modèle" peuvent être inclus dans une procédure de PK/PD ou de tolérabilité. Les animaux inclus dans une procédure de tolérabilité pourront également être inclus dans une étude de PK/PD ou d’efficacité.

Raffinement

Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée des procédures. En cas d’apparition de signe de douleur, une injection unique en sous-cutanée d'analgésique sera réalisée. Une fiche de suivi des signes cliniques sera mise en place. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées et d’appliquer des points d’arrêt anticipés les plus précoces possibles. Ainsi, à partir d’un total de 4, un suivi vétérinaire sera mis en place avec une surveillance renforcée des animaux et des mesures complémentaires seront prises telles qu’aliment humide au sol ou ajout d’enrichissement, et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limite établis, il sera immédiatement euthanasié. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles ectopiques de cancer chez la souris et le rat existent dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références, etc…) Les données de la littérature indiquent clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine du cancer, nous utiliserons donc des animaux adultes.

Pour créer des modèles vivants de gliomes pédiatriques de la ligne médiane, des tumeurs que le porteur décrit comme universellement incurables, 3 450 souris immunodéprimées de cinq à huit semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le cerveau, sous anesthésie générale, une greffe stéréotaxique issue d'une biopsie tumorale d'enfant, puis jusqu'à 52 séances d'imagerie hebdomadaires, soit un an de suivi. Les tumeurs mettent quatre à douze mois à se développer et peuvent provoquer ataxie, perte d'appétit, prostration et perte d'équilibre, exceptionnellement une exorbitation des yeux. La procédure s'arrête quand la tumeur émet un seuil de lumière prédéfini, et toutes les souris sont tuées pour analyse de leur cerveau.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mettre au point des modèles in vivo de tumeurs universellement incurables à ce jour ainsi que de tumeurs chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes chez le patient. Ces tumeurs sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs corticales de l’enfant et il est nécessaire de pouvoir les étudier plus spécifiquement. Compte tenu de la rareté du matériel primaire disponible et de l’absence de modèles pertinents de ces deux maladies, nous prévoyons de développer des modèles in vivo en réalisant des greffes intracérébrales à partir de biopsies tumorales de patients au diagnostic et/ou à la rechute. Récemment, notre groupe a pu développer les premiers modèles in vivo au monde de gliomes diffus de la ligne médiane à partir de biopsie de patient au diagnostic. Cependant, il reste crucial de renforcer la diversité génétique des modèles ainsi que d’élargir à d’autres types cancéreux afin de généraliser nos hypothèses et de consolider les statistiques sur une plus large cohorte. Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux, nous développons en parallèle des cultures cellulaires primaires permettant dans un premier temps d’étudier à la fois la biologie de la tumeur mais également sa réponse à de nouvelles thérapies anticancéreuses. Néanmoins, ces modèles alternatifs ne nous permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement (tumeurs cérébrales infiltrantes et métastatiques) ou encore la réponse aux traitements qui implique souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, immunitaire…).

Bénéfices attendus

Obtenir un modèle murin génétiquement modifié de gliomes diffus de la ligne médiane permettra de mieux comprendre les étapes précoces du développement de ces tumeurs, pour le moment encore inconnu. Cette compréhension permettra d’identifier les modifications précoces menant à l’apparition de cellules tumorales permettant l’exploration de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Greffe stéréotaxique sous anesthésie générale et analgésie adatée: 1 par animal, durée entre 1 et 5 minutes. Séance d'imagerie sous anesthésie générale : une fois par semaine, durée 1-5 minutes, nombre maximal : 52 (correspondant à un an de suivi au maximum).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées à la greffe d'une tumeur dans le cerveau. La greffe, sous anesthésie générale occasionnera une petite plaie sur le dessus du crâne, qui entraînera une gêne légère et temporaire. Par la suite, on pourra éventuellement observer des symptômes neurologiques qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie), perte d'appétit et donc perte de poids, prostration des animaux, perte d’équilibre. L’augmentation de la pression intracrânienne peut exceptionnellement entraîner des symptômes tels que l'exorbitation des yeux, l'atteinte de l’oreille interne qui entraineraient l'arrêt immédiat de la procédure.

Devenir

Les animaux ayant tous les greffes de tumeurs dans le cerveau, ils devront être euthansiés à la fin de la procédure pour examens et analyses sur leur cerveau.

Remplacement

Une singularité des gliomes de la ligne médiane (composée du thalamus, du pont et de la moelle épinière), résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures de la ligne médiane dans un premier temps, puis plus largement de tout le cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur environnement qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la barrière hématoencéphalique, qui isole le cerveau du reste de l’organisme, est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire de développer des modèles de greffes afin d’évaluer une nouvelle médication avant les phases cliniques. Les molécules médicamenteuses potentiellement identifiées par la suite seront testées sur des modèles de cultures cellulaires afin de limiter leur toxicité lors du traitement des animaux, en déterminant des concentrations et une posologie adéquate. Une des perspectives de ce projet, est également d’étudier le système immunitaire dans toute sa complexité, ce qui n'est possible que dans un animal vivant.

Réduction

Pour la primogreffe (P0), nous voulons uniquement savoir si la biopsie est tumorigène ou non. Pour cela, nous nous contenterons donc de ne greffer que 3 animaux par tumeur afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé (réponse : oui/non). Si après la primogreffe, les souris présentent des tumeurs, alors nous réaliserons 4 passages successifs afin d’avoir suffisamment de matériel pour stabiliser le modèle, stocker la tumeur et réaliser des tests histologiques et moléculaires sur ces modèles à chaque passage : 1 souris servira au passage, 1 souris pour l’analyse histologique, 1 souris pour l’analyse moléculaire et 2 souris pour la cryoconservation du modèle.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale et recevront des anti-douleurs par voie sous cutanée dès l’arrivée des premiers symptômes neurologiques ou de la douleur.. Les animaux seront examinés quotidiennement. Ils seront stabulés en groupes sociaux avec un enrichissement environnemental. Les animaux auront des examens en imagerie chaque semaine, et la détection éventuelle de tumeurs emettant un seuil de lumière prédéfini conduira à l'arrêt de la procédure pour ces aimaux. Des points limites précoces et précis ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées permet de favoriser la prise de greffe de tumeurs et de lignées cellulaires cancéreuses humaines. Les animaux utilisés auront entre 5 et 8 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (3 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 4 et 12 mois selon les modèles), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.

96 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun passant 41 jours en cage individuelle et quatre heures par jour sans accès à la nourriture. Ils sont pesés neuf fois, observés chaque jour, et soumis à des tests de dix minutes portant sur la réactivité émotionnelle en environnement nouveau, la reconnaissance d'objets et la mémoire. Le projet évalue si varier les odeurs de leur cage et de leur aliment change leur comportement, leur cognition et leur neurobiologie. Le porteur annonce des retombées pour les élevages de rongeurs puis, plus loin, pour les bovins et les ovins, alors que les rats sont isolés puis tués pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Les rats sont des animaux qui utilisent énormément leur odorat. Pourtant, ils sont le plus souvent élevés dans des cages monotones et peu variés d'un point de vue des stimulations olfactives. Si on considère plus particulièrement leur alimentation, ils sont le plus souvent nourris avec un seul aliment complet, sous forme de granulés ou de poudre, ce qui correspond à un environnement alimentaire monotone (même aliment tous les jours) et sans variété (un seul aliment complet offert). Les rats sont pourtant des animaux omnivores opportunistes et leur comportement alimentaire naturel incorpore divers types d'aliments, variant dans le temps et l'espace. Ainsi, dans la nature, les rats passent une grande partie de leur temps à rechercher des aliments, en utilisant leur odorat. L'objectif de ce projet est de proposer une diversité sensorielle dans l'environnement des rats (sur l'aliment ou dans la cage) et d'en évaluer les conséquences comportementales (comportement alimentaire, comportement d'exploration olfactive, réactivité émotionnelle), cognitives (mémoire, reconnaissance d’objets) et neurobiologiques (notamment système de la récompense).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont une meilleure connaissance des réponses comportementales et neurobiologiques des animaux se voyant proposer une diversité sensorielle dans un milieu d'élevage classiquement monotone. Il s'agit d'acquérir des connaissances fondamentales qui pourront être appliquées dans les élevages de rongeurs, et être potentiellement transposées à des animaux d'intérêt agronomique (bovins, ovins, ...).

Procédures

Tous les animaux sont soumis à des observations comportementales quotidiennes dans leur milieu de vie. Ils sont tous soumis à des pesées hebdomadaires (9 pesées par animal au total ; durée maximale de la pesée = 1 min ; durée maximale des manipulations pour la pesée, incluant la pesée = 3 min). Tous les animaux sont soumis à des tests comportementaux individuels visant à évaluer leur réactivité émotionnelle face à un environnement nouveau (une seule fois, 10 min), leurs apprentissages pour des objets nouveaux dans un environnement familier (une seule fois, 10 min), leur mémoire dans un environnement familier (une seule fois, 10 min), ainsi qu'un aliment odorisé nouveau dans leur cage de vie (deux fois, 1h - 30 min).

Impact sur les animaux

Les animaux rencontreront des situations pouvant être perçues comme stressantes au cours de ce projet, notamment : - Ce projet implique une légère restriction alimentaire (4h/j). Avant d'être habitués à ce rythme d'alimentation, les animaux peuvent ressentir une légère faim et/ou une frustration modérée. - Le suivi des consommations alimentaires à l'échelle individuelle implique une vie en cage individuelle, impliquant un isolement social partiel (j11-j52) pouvant impacter négativement et modérément le bien-être de l'animal. - Certains tests comportementaux sont mis en place pour évaluer la réactivité émotionnelle des animaux ; ils induisent donc un stress modéré. - Les pesées hebdomadaires nécessitent une manipulation douce de l'animal et le passage dans une cage de pesée (litière propre) sur une courte durée (

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Le rat est le modèle d'intérêt de cette problématique scientifique, cherchant à étudier l’influence d’une diversité sensorielle sur ses comportements alimentaires, sa cognition et sa neurobiologie, il ne peut donc pas être remplacé.

Réduction

Aux vues des variabilités inter-individuelles généralement observées dans le cas de mesures comportementales et d'analyses des structures et stimulations cérébrales, un effectif de 16 individus par groupe et par sexe (soit 96 animaux au total), divisé en deux sous-groupes pour les analyses des structures et stimulations cérébrales, est recommandé pour conduire cette expérimentation et permettre une analyse statistique fiable des données récoltées.

Raffinement

Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par la présence de bâtons de bois pouvant être grignotés, de matériel de nidification, d'objet à manipuler (boule à thé), et la présence de stimulations olfactives variées pour 2 groupes sur 3. Le raffinement des procédures expérimentales se traduit par la mise en place de phase d'acclimatation à l'environnement de vie, d'habituation aux procédures expérimentales, et de familiarisation progressive aux odeurs. La restriction alimentaire 4h/j est spécifiquement mise en place en fin de phase diurne, quand les animaux sont au repos et consomment pas (ou très peu) d'aliment pour réduire les effets négatifs potentiels. La période de vie en cage individuelle est réduite autant que possible au regard des objectifs scientifiques du projet. L'isolement social n'est pas total puisque des communications olfactives, visuelles et auditives sont possibles dans l'élevage. Une feuille de papier, type sopalin, est ajoutée en tant qu’enrichissement occupationnel, pouvant aussi servir de matériel de nidification, pendant les périodes d'isolement social partiel des animaux. De plus, lors de ces périodes, un enrichissement social est mis en place avec des animaux réunis en paires stables (toujours les mêmes animaux réunis ensemble), dans une cage d'hébergement standard dédiée, 1h/j, 6j/7. Lors du changement de litière dans les cages de vie, une partie du nid des animaux est transféré dans la nouvelle litière pour permettre une continuité olfactive et limiter le stress potentiellement induit par la modification sensorielle de leur environnement de vie.

Choix des espèces

Les rats représentent 8% des animaux utilisés à des fins scientifiques et ils sont élevés dans des conditions olfactives qui peuvent ne pas répondre à leurs besoins naturels et comportementaux. En effet, ce sont des animaux curieux, olfactifs, omnivores opportunistes qui sont pourtant élevés dans des environnements olfactifs et alimentaires plutôt monotones. La question de la diversité sensorielle et de son influence potentielle sur les comportements alimentaires, la cognition et la neurobiologie est donc tout à fait pertinente chez cette espèce. Les animaux étudiés sont âgés de 4 semaines (stade juvénile) à 11 semaines (début de la phase adulte). Cette période correspond à une période de maturation du système olfactif chez les rats, ce qui rend donc cette période pertinente pour répondre à nos questions de recherches.