Recherche appliquée

Des cellules de cancer du sein triple négatif sont injectées à des souris, la tumeur mammaire est retirée sous anesthésie deux à trois semaines plus tard, puis les métastases pulmonaires sont suivies par imagerie une fois par semaine pendant quatre semaines. 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Le porteur décrit un travail préalable sur lignées cellulaires humaines et organoïdes pulmonaires, et réserve à l'animal l'étude de la progression métastatique elle-même. Sur les nuisances attendues, il retient la piqûre, "gêne de courte durée", puis mentionne des métastases pulmonaires capables d'entraîner une gêne respiratoire.

Objectifs

La progression métastatique des cancers reste le principal défi en oncologie. Le cancer du sein occupe la première position parmi les cancers féminins, et son sous-type le plus agressif, dit « triple négatif », métastase principalement dans le poumon. Les projets de notre équipe visent à comprendre les mécanismes qui permettent aux cellules cancéreuses d’atteindre le tissu pulmonaire. Dans notre équipe, nous utilisons le modèle organoïde pour étudier l’interaction entre le tissu pulmonaire et les cellules du cancer du sein. Nos données montrent que la présence de cellules cancéreuses qui métastasent spécifiquement dans le poumon in vivo modifient l’expression de gènes liés à la réponse inflammatoire dans le poumon. Notre hypothèse est donc la suivante : les cellules cancéreuses induisent un état pro-inflammatoire et donc pro-métastatique dans le poumon via une communication à distance. En partant de nos données ex vivo, notre objectif en utilisant le modèle animal est de comprendre le rôle de ces gènes liés à la réponse inflammatoire dans l’établissement de la niche métastatique pulmonaire. En modélisant la progression métastatique dans des souris sauvages ou déficientes de ces gènes, nous cherchons à comprendre la dynamique du microenvironnement pulmonaire dans le contexte des métastases.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet avanceront notre compréhension des processus métastatiques, essentielle pour arriver à terme de mieux prendre en charge des patients atteints de cancer, tout d’abord en cas de rechutes, mais surtout à les prévenir. Notre projet vise le cancer du sein triple négatif, le sous-type le plus agressif du premier cancer détecté chez les femmes, pour lequel les avancements thérapeutiques sont les plus urgents. Nous envisageons que la compréhension du rôle de gènes liés à la réponse inflammatoire dans la prévention des métastases pulmonaires pourrait donner suite aux études évaluant le potentiel thérapeutique des molécules ciblant ces gènes.

Procédures

Dans un premier lot, les animaux vigiles seront injectés avec des cellules tumorales (durée du geste

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de l’administration des cellules par injections intraveineuses ou injections dans l’abdomen seront celles liées à la piqûre elle-même (gène de courte de durée). L’injection de cellules tumorales causera le développement des tumeurs au niveau mammaire ou des métastases pulmonaires, qui pourront entrainer respectivement une gêne à la mobilité ou une gêne respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nous utilisons plusieurs stratégies de remplacement : (1) Tout d’abord, pour étudier les mécanismes intrinsèques aux cellules tumorales de propension métastatique, nous disposons de plusieurs lignées cellulaires humaines de cancer du sein triple négatif qui diffèrent dans leurs potentiels et tropismes métastatiques. Nous utilisons donc systématiquement ces modèles in vitro. (2) Pour mieux comprendre l’interaction entre les cellules tumorales et le tissu pulmonaire, nous utilisons le modèle organoïde. Nous dérivons des organoïdes pulmonaires des cellules souches pluripotentes humaines, et procédons aux co-cultures avec les cellules de cancer du sein. Seuls les gènes candidats dont nous aurons montré l’importance dans ces deux systèmes seront ensuite étudiés in vivo. Cependant, la progression métastatique est un processus multi-organe, qui implique plusieurs étapes complexes, et enfin l’établissement dans le tissue secondaire. Modéliser ce processus ex vivo reste encore un défi à atteindre. Nous envisageons donc à procéder à l’utilisation des organoïdes vascularisés, et ensuite assemblés avec les cellules immunitaires pour mieux modéliser la progression métastatique. Cependant, l’animal vivant reste le modèle le plus adapté pour l’étude de progression tumorale, surtout métastatique, car ce processus est multi-organe. L'apprentissage des gestes techniques sera réalisé dans un premier temps sur mannequins puis sur cadavres frais.

Réduction

Nous allons utiliser le nombre minimal d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs. Nous utiliserons systématiquement l’imagerie pour les suivis de la progression métastatique dans le poumon. Cette méthode permet d’éviter la mise à mort des animaux à différents temps pour le suivi des métastases pulmonaires. Chaque mise à mort des animaux sera exploitée et optimisée en récoltant un maximum de prélèvements, permettant ainsi de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. Dans les procédures où la tumeur primaire est enlevée chirurgicalement, les tumeurs seront récupérées pour différentes analyses. L'utilisation de mannequins ou de cadavres pour l'apprentissage des gestes techniques permettra de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux, et les valeurs seuil sont définies pour commencer les soins nécessaires ou mettre à mort les animaux. Les gestes invasifs ou nécessitant l’immobilité de l’animal seront réalisés sous anesthésie générale avec recours aux analgésiques si nécessaire. Toutes les mesures seront prises pour éviter l’hypothermie, la déshydratation et le stress respiratoire liés à l’anesthésie. Les soins post-opératoires seront mis en place pour réduire la douleur et l’inconfort des animaux : surveillance accrue, analgésie, prévention des infections, aliment hydraté. L'apprentissage des gestes techniques sera réalisé de manière séquentielle, sur mannequin puis sur cadavre frais avant de passer à l'animal vivant. L'acquisition du geste technique sear validée, par des opérateurs expérimentés, grâce à des critères précis et précoces.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier la biologie de cancer en général, et pour comprendre le processus métastatique en particulier. Cela est dû au fait que les systèmes de plusieurs organes (y compris pulmonaire, vasculaire, immunitaire) sont comparables à ceux de l’homme et très bien caractérisés depuis plusieurs décennies. De plus, le modèle souris et les procédures utilisées sont très bien établis et standardisés dans le domaine. La disponibilité de lignées génétiquement modifiées et de souris immunodéficientes est un autre atout très important pour la faisabilité des expériences et pour les greffes de cellules humaines. Les souris adultes, âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour toutes les expériences. Le cancer du sein se manifeste chez les femmes adultes, et les souris de cet âge sont couramment utilisées pour modéliser la progression métastatique par greffe des cellules cancéreuses

Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.

Procédures

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)

Impact sur les animaux

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.

Réduction

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.

358 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour le prélèvement du cerveau et des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe soixante minutes immobilisé dans un tube de contention pour inhaler un aérosol de particules de tungstène, après six séances d'habituation à ce tube réparties sur deux semaines. Une partie reçoit en plus une irradiation gamma du corps entier, puis viennent quatre échographies de trente minutes et cinq prélèvements sanguins échelonnés sur trois mois. Le rat a été retenu parce que la plateforme d'inhalation du laboratoire est dimensionnée pour lui : les animaux doivent peser 350 grammes à quinze grammes près pour tenir dans les tubes sans trop y bouger.

Objectifs

Le concept d’exposome prend en compte le fait que, tout au long de sa vie, un individu va être exposé à un ensemble de polluants environnementaux et professionnels qui vont avoir une répercussion sur sa santé. Ces expositions multiples peuvent produire des effets plus prononcés que lorsque l’on considère un polluant séparément. Notre projet porte sur les effets biologiques d’une coexposition à un stresseur chimique et à un stresseur radiologique sur le cerveau. Ce nouveau projet, fort de la base de résultats acquis au cours des projets précédents, viendrait compléter les connaissances en se concentrant sur la vascularisation du cerveau. Les stresseurs sélectionnés : particules de tungstène métal - valence chimique de notre co-exposition - et irradiation gamma – valence radiologique - sont pertinents au regard de ceux auxquels les travailleurs du nucléaire pourraient être exposés de façon accidentelle lors de taches spécifiques qu’ils auraient à effectuer. L’objectif de notre étude est d’identifier les mécanismes impliqués dans la réponse de la vascularisation cérébrale à une exposition aigüe à des doses faibles de rayonnements ionisants, associée ou non à l’inhalation d’un aérosol particulaire de tungstène chez le rat in vivo. Les analyses réalisées permettront d’étudier si l’exposition à ces deux stresseurs ensemble induit des effets potentiellement plus prononcés que lorsque les expositions se font séparément. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sera réalisée à différents niveaux d’analyse : de l’expression de gènes, à la cellule jusqu’au fonctionnement et à l’intégrité des vaisseaux. Cette approche permettra d’identifier les principaux processus biologiques qui sont affectés selon les différents types d’exposition.

Bénéfices attendus

En associant les résultats de ce projet avec les précédentes études, nous pourrons mieux comprendre le rôle de la vascularisation cérébrale dans les effets observés en lien avec notre schéma de coexposition. Ces résultats permettront de prendre en compte l’ensemble des effets avec les autres composantes du cerveau, notamment les différents types cellulaires : les neurones, les cellules gliales. A plus long terme, cette étude alimentera les réflexions sur l'évolution du système de radioprotection dans la gamme des faibles doses de rayonnement ionisants. Cette étude permettrait une meilleure identification des risques réels pour une optimisation des normes d’un point de vue sanitaire et la connaissance des effets biologiques après exposition à des doses faibles combinées à un autre stresseur sur le cerveau.

Procédures

Un nombre réduit d’animaux participeront à la mise au point de certaines étapes : prélèvements sanguins répétés sur animal anesthésié (max 5 prélèvements par animal) et réalisation d’échographie avec produit (1 injection i.v. par animal sur animal anesthésie suivie d’une échographie). Les animaux seront exposés en une seule fois à un aérosol de particules de tungstène (durée 60 min en tube à contention). Pour l’habituation à cette contention, ils auront eu 6 séances d’habituation d’une durée allant de 10 à 60 min réparties sur deux semaines à raison de 3 séances par semaine. Certains lots recevront une dose unique d’irradiation sous la forme de rayonnement gamma en corps entier à une faible dose de 50 mGy. Pour cette irradiation, ils seront placés dans une boite d’irradiation. Ils seront en vigile pour cette irradiation. La durée de l’irradiation est d’une minute. La durée totale de la mise en boite, transport dans le bâtiment, irradiation et remise en cage n’excède pas 30 minutes. Certains lots seront exposés aux deux types de stresseurs dans la même journée en dose unique également. Pour tous les animaux, les échographies et les prélèvements de sang sont non invasifs et effectués sous anesthésie. Les animaux auront 4 séances d’échographies de 30 minutes chacune : une avant l’exposition, puis à 24 heures, 28 jours et 3 mois. Le nombre de prélèvements sanguins est de 5 reparti entre 15 minutes et 3 mois post-exposition, et le volume n’excèdera pas 500 microlitres à chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Les protocoles d’exposition impliquent des périodes de contention dont le stress est réduit par des procédures prévues. Les expositions par inhalation et/ou d’irradiation ne sont pas susceptibles d’induire de douleurs nécessitant l’administration de produits antalgiques, ni avant, ni après la procédure. Les prélèvements sanguins et les administrations i.v. nécessitent une piqure qui va entrainer une douleur légère et de courte durée. Ces actes seront réalisés sur des animaux anesthésiés dans le respect des bonnes pratiques. Il n’est pas attendu d’effet secondaire des produits administrés. Les animaux seront surveillés après chaque manipulation.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les rats seront euthanasiés pour prélever les organes (cerveau, poumons, notamment) pour permettre de réaliser les analyses biologiques (biologie moléculaire, histologie) complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Pour mimer l’exposition corps entier à une irradiation externe et à une inhalation sous la forme d’un polluant particulaire qui mime nos situations d’exposition professionnelles, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition sur un modèle intégré (système nerveux central, voies aériennes supérieures, poumons, reins). Pour répondre à nos objectifs scientifiques, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles de rayonnement ionisant et à l’inhalation de particules. Elles ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique. Cet argument est également valable pour les modèles d’organoïdes de cerveau car ils n’intègrent pas les cellules responsables de la réponse neuroinflammatoire. Il est également très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules. Dans ce projet l’idée est d’évaluer la vascularisation organique cérébrale, et la niche neurovasculaire qui regroupe différents types cellulaires qui ne peuvent pas être tous cultivés en même temps. De plus, il n’est pas possible d’évaluer l’irrigation fonctionnelle du cerveau dans des modèles in-vitro.

Réduction

Au total, 358 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques. Des analyses statistiques ont permis d’optimiser le nombre d’animaux par groupe selon les effets attendus. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de la littérature existante sur des schémas d’exposition similaires et sur le retour d’expérience des projets précédents.

Raffinement

Les rats font l’objet d’un suivi quotidien. Ils sont pesés à l’arrivée pour vérifier la conformité avec le poids demandé au fournisseur. Ils sont également pesés au cours de la procédure d’habituation aux tubes à contention, témoin de leur état de santé et de l’adéquation de leur prise de poids avec la taille des tubes. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues à des bagarres par exemple entrainera l’euthanasie anticipée. Si le comportement d’un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids. Lors des différentes procédures, un arrêt cardiaque durant l’anesthésie sera traité par massage cardiaque. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement. Le transfert des animaux de l’animalerie à la plateforme d’irradiation située dans le même bâtiment se fera en boite de transport opaque et possédant un filtre. Le stress potentiel lié à ce transport est nettement réduit pas la procédure d’habituation à la contention. Les prises de sang et les injections par la veine caudale sont réalisées sous anesthésie.

Choix des espèces

Le rat est le modèle de référence pour les études en toxicologie de l’inhalation en mode nose-only. La plateforme d’inhalation que nous possédons au laboratoire est également adaptée au rat : vitesse des flux d’air au sein de la chambre d’inhalation, taille des tubes de contention, taille des emplacements dans la chambre d’inhalation. Cette espèce est le modèle utilisé dans les protocoles d'inhalation précédents réalisés au laboratoire. Le rat est également un modèle de référence pour les systèmes physiologiques étudiés dans ce projet : système nerveux, voies olfactives : épithélium nasal, nerfs olfactifs et bulbes olfactifs, voie pulmonaire. Ainsi, nos résultats pourront être comparés aux précédentes études que ce soit celles du laboratoire et celles issues de la littérature pour les modes d’exposition par inhalation, mais également par irradiation. Les rats sont utilisés au stade adulte de 12 semaines afin de pouvoir comparer les résultats obtenus avec les expériences précédentes au laboratoire et avec la littérature portant sur les effets d’exposition par inhalation à des particules métalliques et par irradiation externe. Le stade adulte correspond au stade auquel l’homme est le plus exposé par ces modes d’exposition combinés pour la population cible que nous visons, c’est-à-dire les travailleurs. Tel qu’évoqué précédemment, le rat mâle de 12 semaines sera utilisé et le poids à l’arrivée doit être situé aux alentours de 350 ± 15 grammes pour tous les animaux afin d’être dans la gamme de taille et de poids adéquate pour pouvoir rentrer dans les tubes à contention au bout des deux semaines d’habituation. Il faut qu’ils puissent être capables de rentrer dans les tubes tout en étant suffisamment contenu à l’intérieur afin de limiter les mouvements dans les tubes pendant les expositions à l’aérosol et qu’ils ne s’agitent pas trop.

Automutilation, saignement incontrôlable, perte de poids supérieure à 15 % : un seul de ces signes suffit à déclencher la mise à mort. 96 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour que leur calvaria soit prélevée et analysée. Chaque animal reçoit deux trous de quatre millimètres percés dans la partie supérieure du crâne, comblés par un matériau expérimental, puis des radiographies hebdomadaires sous anesthésie courte et deux injections de colorants. La perte osseuse visée chez l'humain concerne la mâchoire, mais le crâne a été retenu parce qu'il simplifie l'opération.

Objectifs

L'objectif du projet est de tester de nouveaux matériaux pour combler une perte osseuse importante (plus de 1 cm²) dans la mâchoire humaine. Ces matériaux doivent favoriser la repousse osseuse, permettre une bonne circulation sanguine et lutter contre les bactéries. L'expérience sera menée sur des rats. Au lieu de la mâchoire, nous choisirons la partie supérieure du crâne pour créer le défaut osseux. Cela simplifiera l'opération et améliorera le bien-être des animaux en réduisant les risques de complications. Les matériaux testés forment une structure poreuse composée d'un plastique biodégradable et de particules de verre spéciales, parfois enrichies d'un élément antibactérien. Ils sont conçus pour être suffisamment solides pour être manipulés par les chirurgiens et supporter la repousse osseuse. Nous avons déjà évalué plusieurs propriétés de ces matériaux, notamment leur dégradation dans l'eau, leur toxicité pour les cellules et leur efficacité contre les bactéries. Des essais préliminaires sur des rats n'ont montré aucun effet secondaire négatif.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider chez les animaux le potentiel de régénération osseuse et de revascularisation d’un matériau poreux constitué d’un réseau de bioverres (supplémentés ou non avec un ion cationique) et d’un polymère biodégradable. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement pour la reconstruction osseuse consécutive à l’ORN (ostéoradionécrose, une complication sévère de la radiothérapie, liée à un défaut de cicatrisation du tissu osseux). Ce matériau a pour objectif d’être pratique à utiliser pour les cliniciens et efficace pour la repousse osseuse, la revascularisation et ayant effet antibactérien (propriété de l’ion cationique).

Procédures

Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé ou non en cation au niveau d’un défaut osseux critique sur la partie supérieure du crâne (calvaria) de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Certains des animaux seront anesthésiés de manière hebdomadaire sur des temps courts pour effectuer des radiographies de suivi de repousse osseuse (temps 10 à 20 secondes). L’ensemble des animaux vigiles seront aussi soumis à deux injections intrapéritonéales de colorants vitaux de quelques secondes, 14 et 2 jours avant leur mise à mort. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.

Impact sur les animaux

Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (4 mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie, l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) seront attentivement regardés.

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort. Les cadavres des animaux seront évacués exceptés les calvarias qui seront prélevées, fixés et préparées pour réaliser les analyses radiologiques et histologiques au laboratoire qui permettront l’évaluation de la néoformation osseuse et des propriétés angiogéniques des biomatériaux.

Remplacement

Cette étude portant sur le tissu osseux, il n'existe pas de solution de remplacement utilisant des invertébrés L'utilisation de rongeurs reste donc nécessaire afin de vérifier si les nouveaux matériaux sont bien tolérés par l'organisme et s'ils favorisent la croissance osseuse. Dans ce but, des études ont été réalisées en laboratoire sur des cellules, il est maintenant nécessaire de tester nos matériaux sur des petits animaux vivants pour observer les effets réels sur un organisme entier.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les biomatériaux utilisés ont été sélectionnés en amont et déjà testés in vitro et in vivo (expérience pilote) pour leur biocompatibilité. Lors de la procédure, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animal, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. De plus, une étude bibliographique nous a permis de déterminer la quantité d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs (n=7). Cela nous permet ainsi de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, reproductibles et valorisables. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au strict minimum.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à sa mise à mort en fin d’étude. Une analgésie chimique est assurée en pré- et post-opératoire. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 20 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les rats seront ensuite transférés dans une couveuse chauffante le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, les rats seront hébergés en groupe sociaux de 2 individus par cage avec enrichissement physique sous forme de tunnel en carton 12x9cm, un bâton de bois à ronger et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Les animaux seront observés tous les jours. Cela étant, nous serons vigilants à ces critères: - Signes cliniques notables (Le point limite est atteint en présence de 3 signes simultanés) Lésion sans effraction cutanée Signes spécifiques: grattage de cicatrice en regard de la reconstruction calvariale Agitation/agressivité Hypomotilité/hyporéactivité Incoordination modérée Stéréotypie Poil piqué Coloration anormale de la peau Flaccidité musculaire généralisée Gonflement abdominal Zone ano génitale souillée Fèces liquides Fèces mucoïdes Perte de poids inférieure à 15% Diminution/absence de prise de nourriture -Signes cliniques sévères (Le point limite est atteint en présence d’un seul signe) Lésion sévère automutilation masse ulcérée Signes spécifiques: infection de la cicatrice, saignement incontrôlable, plaie suintante Akinésie Décubitus Difficulté/impossibilité de mobilisation Incoordination marquée Tremblements généralisés Convulsion Hémiplégie Persistance du pli cutané Coloration jaune ou bleue des muqueuses Voussure du dos/dos cambré Absence de fèces Urines rouges Perte de poids supérieure à 15% Absence de prise de nourriture> à 2/jour En cas d’apparition d’un de ces symptômes malgré le traitement antalgique adapté ou en cas d'atteinte du point limite l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

L’utilisation du rat est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgés de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.

Un gavage jusqu'à deux fois par jour, une injection intrapéritonéale quotidienne et trois mesures de glycémie par semaine, vingt semaines durant : 11 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Certaines injections se font dans la veine de l'œil, sous anesthésie. Il s'agit de tester des composés dans trois modèles de diabète auto-immun, dont des souris rendues diabétiques par transfert de cellules immunitaires ou par la streptozotocine. Le porteur décrit la souris NOD comme un modèle "très performant" et juge le recours à la souris "incontournable", au motif qu'aucun modèle in vitro ne permettrait d'étudier ces mécanismes immunitaires.

Objectifs

Le diabète représente un enjeu majeur de santé publique dont l’importance ne cesse de s’accroitre. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune complexe qui résulte de la destruction spécifique des cellules pancréatiques qui produisent l'insuline et de la perte de la capacité à contrôler le niveau de glucose dans le sang. La maladie survient suite à une réaction anormale du système immunitaire. Ce projet vise à tester des composés dans 3 modèles de diabète auto immun. Ce travail pourrait permettre de trouver de nouveaux traitements du diabète de type 1.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de diabète de type 1.

Procédures

1) Mesure de glycosurie grâce à une bandelette, 3 fois par semaine, test rapide en prélevant naturellement une goutte d’urine lorsque l’animal urine, en 10 sec sur animal vigile. 2) Dosage glycémique avec un lecteur de glycémie capillaire, 3 fois par semaine et pendant 20 semaine à l’apparition d’une glycosurie positive. Test rapide par une goutte de sang prise à la queue (piqure avec une aiguille fine), en 10 sec sur animal vigile. 3) Dosage de la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose réalisé une fois par étude : 4 mesures réalisées en 10 secondes sur 2 heures de test sur animal vigile 4) L’injection de splénocytes ou lymphocytes en intraveineux est réalisé en 20 sec sous anesthésie et après traitement antalgique au niveau de l’œil. 5) Les composés ou leur solvant seront administrés par gavage (maximum deux fois par jour), par voie intraveineuse (maximum trois fois par semaine) ou intrapéritonéale (une fois par jour) pendant 20 semaines maximum: moins d’une minute à chaque administration, vigile. 6) Trois autres prélèvements au maximum dans une journée, veine saphène médiale ou submentale (n’excédant pas en tout 150μL, répartis sur 1 ou 2 jours, 15 minutes en tout, vigile) pour l’analyse de la pharmacocinétique des composés.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Le diabète est une pathologie silencieuse qui ne déclenche pas de signe clinique douloureux. Il peut être responsable d’une augmentation de la soif et d’une déshydratation et tardivement une perte de poids. Ces manifestations sont précédées d’une augmentation du taux de sucre dans le sang et les urines. Les injections intrapéritonéales ou intraveineuse et les prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue induisent une douleur de courte durée. L’animal peut subir un stress au cours de l’anesthésie ou lors de l’administration par gavage ou par le injection intrapéritonéales.

Devenir

Les souris seront mises à mort. Les tissus seront collectés post-mortem pour l’analyse de la physiopathologie.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle alternatif in vitro n’est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun. La souris NOD représente un modèle très performant et hautement informatif. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle de la souris est incontournable.

Réduction

Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique.

Raffinement

Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, 3-5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs. Les injections intraveineuses à l’œil sont réalisées sous anesthésie générale avec un analgésique. Les injections à la queue et les prélèvements à la queue sont effectuées sous anesthésie locale.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris est basée sur une littérature abondante décrivant les différents modèles de diabète de type 1 chez la souris. La souris NOD ou encore induit par le transfert de splénocytes ou de lymphocytes à des souris immunodéficientes ou encore traité avec de la streptozotocine. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés d’intérêt à visée anti-inflammatoire sur un système immunitaire mature.

Greffées avec des cellules de lymphome humain, 581 souris reçoivent ensuite jusqu'à vingt gavages, vingt injections et cinq séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie l'implantation de la tumeur d'intervention chirurgicale "légère" et décrit les traitements comme sources d'une douleur "légère à court terme", tout en prévoyant de peser et d'observer les souris deux fois par semaine pour les mettre à mort avant leur mort "naturelle". La mise à mort sert à récupérer les organes et les tumeurs.

Objectifs

Le lymphome est le cancer du sang le plus répandu et le sixième cancer le plus répandu dans le monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B consiste en une chimiothérapie ou une greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (maladie récidivante) ou ne répondent pas au traitement (maladie réfractaire), généralement avec des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. Les analyses génomiques des lymphomes diffus à grandes cellules B ont montré des altérations de l'épigénome (modifications des histones et méthylation de l'ADN), ainsi que des mutations fréquentes dans les gènes ayant un rôle épigénétique. Ces connaissances ont conduit au développement de médicaments inhibant les protéines épigénétiques. Cependant, les résultats des essais cliniques testant des médicaments épigénétiques pour traiter le lymphome n’ont pas été aussi prometteurs que prévu. Nous émettons l'hypothèse que les médicaments épigénétiques ont montré une faible efficacité jusqu'à présent car ils ont été utilisés en monothérapie, ce qui plaide en faveur de l'utilisation de thérapies combinatoires. L'objectif de ce projet est d'étudier l'efficacité des thérapies épigénétiques combinatoires dans le lymphome dans le but de concevoir de nouveaux traitements prometteurs qui peuvent être testés plus avant dans des essais cliniques.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’étudier de nouveaux traitements contre le lymphome diffus à grandes cellules B . Bien qu’il existe un traitement standard pour ce type de lymphome, il n’est efficace que chez 60 % des patients et repose sur la chimiothérapie, qui est associée à des effets secondaires toxiques. Par conséquent, la découverte de thérapies plus efficaces et ciblées constituerait une avancée significative dans le traitement des patients atteints de lymphome diffus à grandes cellules B .

Procédures

Les souris qui développeront des lymphomes seront surveillées. Nous manipulerons (contention) les animaux une ou deux fois par semaine pour les peser et les observer à la recherche de signes de formation de tumeurs : perte de poids, réduction des mouvements, posture voûtée, fourrure ébouriffée, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Certaines souris subiront une intervention chirurgicale légère pour recevoir la tumeur (une fois), ce qui implique l’utilisation d’anesthésie ; certaines souris recevront une injection pendant 1 minute pour transférer les cellules tumorales (une fois) ou détecter les cellules tumorales (une fois par semaine) ; et certaines souris recevront le traitement par injection ou par voie orale quotidiennement pendant 4 semaines maximum. Types d’interventions : - Contentions pour pesées et mesures : durée = 5 secondes / nombre = 12 - Intervention chirurgicale sous anesthésie/analgésie : durée = 10 minutes / nombre = 1 - Administration par gavage sur animal vigile : durée = 1 minute / nombre = 20 - Administration par injection sur animal vigile : durée = 30 secondes / nombre = 20 - Administration par injection sur animal anesthésié : 30 secondes / nombre = 1 - Imagerie corporelle non invasive sous anesthésie : durée = 5 minutes / nombre = 5

Impact sur les animaux

Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou de mouvements lents. En outre, la manipulation des souris pendant la surveillance du développement du lymphome peut induire du stress. Et il peut y avoir une inflammation au site d’injection. Les souris qui reçoivent des lymphomes diffus à grandes cellules B primaires subiront une intervention chirurgicale, qui implique l'utilisation d'anesthésie. Le traitement par injection ou par voie orale peut également provoquer du stress et des douleurs légères à court terme.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des tumeurs pour leur étude ultérieure.

Remplacement

Compte tenu de la complexité des mécanismes impliqués dans le lymphome, aborder ce problème uniquement par des analyses in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour étudier cette maladie humaine. Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cellules de lymphome et les concentrations toxiques déterminées pour chaque composé contre les cellules tumorales mais pas contre les cellules saines. Il faut maintenant vérifier que cet effet se produit également in vivo en utilisant différents modèles de lymphome humain. Aucune méthode alternative n’est donc pour l’instant apte à remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expériences in vivo permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux.

Réduction

Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes, ce qui permettra de calculer le nombre d'animaux strictement nécessaires à ce projet. Par ailleurs l’utilisation de l’imagerie permettant une étude sur la durée des mêmes animaux est un élément de réduction.

Raffinement

Nous avons établi une grille d’évaluation avec des seuils de coupure précoces adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant la rigueur scientifique, notamment en augmentant la surveillance lors de l’observation des changements de poids, de mouvement, d’apparence physique et de comportement ; et en ajoutant de l’eau gélifiée et de la nourriture à l’intérieur de la cage lorsque des symptômes de lymphome apparaissent. D’autre part, après le transfert des cellules de lymphome et le traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement, permettant de détecter toute apparition de signes durables de souffrance. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone. Concernant les souris immunodéficientes, elles seront hébergées à raison de 5 maximum par cages, sur des portoirs ventilés où les paramètres environnementaux sont contrôlés, nourries à volonté avec de l'eau stérilisée par filtration et des aliments adaptés, dans un milieu enrichi (neslets et igloo dans chaque cage). Un suivi journalier est effectué par le personnel animalier. L'ensemble des manipulations se fera en conditions stériles avec des gants et du matériel stérile pour éviter toute contamination des souris qui sont immunodéficientes.

Choix des espèces

Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules tumorales dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Les conditions optimales de réalisation des xénogreffes nécessitent d’implanter de jeunes adultes, soit des souris âgées de 6-8 semaines.