Recherche appliquée

Microcèbes, petits primates dont le vieillissement cérébral ressemble à celui des humains, 39 individus vont être utilisés dans ce projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une inoculation intracérébrale de deux heures destinée à déclencher des lésions d'Alzheimer, cinq séances d'IRM de trois heures sous anesthésie, cinq prises de sang, des tests de mémoire et des tests de saut, treize d'entre eux recevant en plus un anti-inflammatoire pendant six mois dans de la compote de pomme. Parmi les effets attendus, le porteur cite la douleur post-chirurgicale et "une angoisse pour un animal qui réalise que sa mémoire est déficiente". Il écarte les rongeurs, dont la réaction inflammatoire cérébrale diffère trop de celle des primates, et indique qu'aucun modèle non animal ne permet de suivre l'apparition des lésions.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives. Elle est caractérisée par des pertes de mémoires suivies au cours des années par des troubles cognitifs plus généraux et handicapants. La mort des neurones est liée à l'accumulation dans le cerveau de protéines pathologiques (on les appelle lésions de la maladie d'Alzheimer). Elle est associée à une inflammation du cerveau. Cette dernière est désormais établie comme un régulateur clé de la maladie, mais la nature des interactions entre l'inflammation et la maladie d'Alzheimer n'est toujours pas claire. Il est possible d'induire les lésions de la maladie d'Alzheimer chez un modèle primate non-humain. Notre hypothèse de travail est que la description de l'inflammation en réaction aux lésions de la maladie d'Alzheimer chez un modèle primate non-humain fournira de nouvelles connaissances inestimables vers de futures thérapies contre la maladie d'Alzheimer. Ce projet vise à répondre à deux interrogations scientifiques. 1. Décrire le processus inflammatoire associé aux lésions d'Alzheimer induite chez un primate. 2. Évaluer l'impact sur la maladie d'Alzheimer d'un traitement anti-inflammatoire. Globalement, ce projet permettra de mieux comprendre la maladie d'Alzheimer et de proposer une thérapie adaptée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de 1. Mieux comprendre les interactions entre les lésions de la maladie d'Alzheimer et l'inflammation. 2. Evaluer une thérapie contre la maladie d'Alzheimer avec une approche innovante basée sur l’utilisation d’un anti-inflammatoire.

Procédures

Intervention 1 pour tous les animaux : Etude du comportement des animaux dans des tests qui évaluent leur mémoire et leurs capacités à sauter (animaux arboricoles). -Tests de mémoire : Une session d'accoutumance et 4 sessions d'une heure chacune -Tests de sauts : 4 sessions d'une heure chacune Intervention 2 pour tous les animaux : Réalisation d'examen IRM (imagerie par résonance magnétique) pour étudier la réduction de la taille du cerveau qui est un signe associé à la maladie d'Alzheimer (appelée atrophie cérébrale). -5 sessions de 3 heures chacune Intervention 3 pour tous les animaux : Réalisation de prise de sang pour étudier la santé des animaux. -5 sessions de 5 minutes chacune Intervention 4 pour tous les animaux: Inoculation intracérébrale de composés permettant d'induire la maladie d'Alzheimer ou de composés contrôles (qui n'induisent pas la maladie d'Alzheimer). -1 session de 2 heures. Intervention 5 pour un groupe appelé Alzheimer-Traité (13 animaux) : Thérapie par un inhibiteur de l'inflammation. Le médicament est donné pendant 6 mois, par voie alimentaire mélangé avec de la compote de pomme.

Impact sur les animaux

Intervention 1 (étude comportementale) : Ce test peut entrainer une angoisse pour un animal qui réalise que sa mémoire est déficiente. Intervention 2 (examen IRM) : Stress lié à l'anesthésie lors de la réalisation des examens IRM. Intervention 3 (prise de sang) : Douleur et stress liés à une piqure d'aiguille. Intervention 4 (chirurgie cérébrale) : Douleur post-chirurgie. Réduction des capacités cognitives (légère et en général uniquement détectable dans des tâches comportementales très élaborées). Intervention 5 (Thérapie par un inhibiteur de l'inflammation) : Goût modifié de la compote de pomme entrainant une diminution de l'appétence.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet. Nous voulons étudier l'impact des lésions de la maladie d'Alzheimer et d'une thérapie contre l'inflammation sur les lésions de la maladie d'Alzheimer qui ne peuvent être étudiées qu'en post-mortem par des études histologiques, biochimiques ou transcriptomiques .

Remplacement

L'apparition des lésions de la maladie d'Alzheimer et leur diffusion dans le cerveau dépend de l'interaction entre les lésions, le système immunitaire et le cerveau de l'hôte. Il n'y a actuellement aucun modèle alternatif non animal disponible pour effectuer une analyse complète de la dynamique d'apparition des lésions sans utiliser des animaux. L'inflammation du cerveau est très différente chez les primates et les rongeurs. Nos études ne peuvent donc pas être menées chez des rongeurs. Les tests in vitro ne permettent que d'étudier des aspects non-intégratifs de la maladie d'Alzheimer.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimal d'animaux qui permettra d'obtenir un résultat statistiquement fiable. Le calcul de la taille de l'échantillon a été réalisé en utilisant la cognition (capacité d'apprentissage) comme critère principal et en nous basant sur des résultats expérimentaux obtenus au cours d'études précédentes. Ce calcul a permis de réduire le nombre d'animaux, car si nous n'avions pas fait cette estimation, le nombre d'animaux utilisés aurait été plus élevé.

Raffinement

Pendant toute l'étude, les animaux sont hébergés dans un environnement à température contrôlée, avec cycles jour-nuit optimisés. Eau et nourriture sont fournies à volonté. L'environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. Les animaux sont examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision d'un vétérinaire. Tout examen par imagerie IRM et intervention chirurgicale sont effectués sous anesthésie générale. Des points limites sont mis en place pour limiter la douleur. Toute intervention chirurgicale est effectuée sous anesthésie générale associé à des traitements anti-douleur. En cas de manifestation de douleur, une analgésie sera discutée avec le vétérinaire. Ces mesures garantissent que les conditions de douleur et de souffrance inutile des animaux sont contrôlées.

Choix des espèces

Les travaux sont menés sur des microcèbes adultes car la maladie d'Alzheimer touche les adultes. Le microcèbe est un primate qui présente un vieillissement cérébral très proche de celui de l'homme. Il est possible d'induire artificiellement des lésions de la maladie d'Alzheimer chez cet animal. Il s'agit du seul modèle primate de la maladie d'Alzheimer qui ne repose pas sur une surexpression de protéines anormales. Les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer reposent sur une surexpression de protéines mutées anormales et ne représentent que partiellement la pathologie humaine. Surtout, la réaction inflammatoire des rongeurs est très différente de celle des primates. Le microcèbe est donc idéal pour étudier les relations entre pathologie Alzheimer et inflammation.

Caler les conditions d'injection d'une molécule anti-complément avant un futur protocole d'efficacité: 24 souris vont être utilisées pour cette mise au point, toutes tuées au dixième jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant neuf jours, chacune reçoit une injection quotidienne de complément humain dans le péritoine, trois injections d'anticorps prélevés sur des malades, trois injections sous-cutanées de l'inhibiteur testé et quatre microprélèvements de sang sous anesthésie. Le modèle repose sur une myopathie nécrosante auto-immune déclenchée chez la souris, et le porteur écrit pourtant n'attendre aucune nuisance des molécules, seulement l'inconfort des contentions, des injections et des prélèvements. Aucun résultat thérapeutique n'est attendu de ces 24 souris, dont le rôle se limite à un dosage préalable ouvrant sur un autre protocole.

Objectifs

Notre laboratoire a établi un modèle de myopathies nécrosantes auto-immunes par injection à des souris d'anticorps purifiés de malade et de complément humain. Ce modèle nous a permis de mettre en évidence le rôle pathogène de ces anticorps et du système du complément. Nous avons démontré par le passé l'efficacité préventive d'une molécule empêchant le système du complément de déclencher la maladie (Anti-C5, ou Zilucoplan) dans ce modèle murin. L'objectif général de notre programme est d'évaluer l'efficacité d'une nouvelle molécule inhibitrice du complément dans ce modèle (Anti-C2). L’étude des animaux se fera par une analyse sanguine pour doser la molécule thérapeutique anti-C2 et le complément humain injecté.

Bénéfices attendus

Ce protocole permettra de déterminer les conditions d'injection d'un nouvel inhibiteur spécifique du fragment C2 du complément humain et d'appliquer ces conditions dans un futur protocole qui visera à démontrer son efficacité thérapeutique dans notre modèle murin de myopathie nécrosante autoimmune ouvrant ainsi la porte à un éventuel essai clinique chez les patients atteints de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 microprélèvements de sang de 75 microlitres, prélèvement sur souris anesthésiée, durée de l'acte 20 secondes. Les souris seront injectées quotidiennement avec du complément, en intrapéritonéal, durant 9 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection des IgG en intrapéritonéal, 3 fois par souris , sur une période de 9 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection de l'anti-C2 en sous-cutanée., 3 fois par souris , sur une période de 9 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Cependant, des nuisances pourront être observées chez l'animal lors desphases de contention, des injections ou des prélèvements de sang prévus dans la procédure.

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effet indésirable des molécules ne sont attendues. Cependant, des nuisances pourront être observées chez l'animal lors des phases de contention, des injections ou des prélèvements de sang prévus dans la procédure.

Devenir

Les animaux ayant reçus des injections ne pourront être réutilisés dans un autre protocole. Tous les animau seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de molécules inhibitrices du complément dans une perspective future d’approche à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autres protocoles expérimentaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'auto-anticorps chez la souris et injection du Zilucoplan, inhibiteur du C5. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique de puissance pour déterminer les effectifs exacts nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures, ainsi que de la variabilité des réponses immunologiques (réponse primaire notamment) observées lors de ces protocoles.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellulose (cello dome) et des fibres de coton (Nestlets). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux seront euthanasiés par surdose de CO2 sous anesthésie générale à l'isoflurane en fin de procédure (Jour 10). En cas de douleur, du méloxicam sera administré par voie sous cutanée à la dose de 1mg/kg. Un examen visuel sera pratiqué quotidiennement par deux observateurs indépendants et permettra d’évaluer une éventuelle souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort (réduction de l'activité, dos vouté, poils ébouriffés,difficultés respiratoires, vocalisation, perte d’appétit…) seront mis à mort de manière éthique par surdose de CO2 sous anesthésie générale à l'isoflurane à 2.5% en air grâce à un matériel dédié (Tem Sega, Necrobox et MiniHub) et dans un lieu isolé des locaux d’hébergement.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.

Comprendre pourquoi une maladie génétique rare abîme surtout les vaisseaux du foie et des poumons: 620 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit trois à dix injections en état vigile, et environ un tiers subit une chirurgie avec perfusion menée sous anesthésie, sans réveil. Le porteur indique que les injections provoquent une douleur passagère, un risque d'infection et d'hématome, et que l'invalidation du gène étudié peut entraîner une perte de poids ou une baisse d'activité, l'état des nouveau-nés étant noté sur une grille qui suit la prise de nourriture, la croissance et la respiration. Les souris portent la modification génétique des patients, et le porteur juge "indispensable" d'en étudier à la fois de jeunes et des adultes.

Objectifs

Nous étudions une une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre-autre, par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie génétique rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Différents acteurs sont impliqués dans le développement de cette maladie qui contrôlent qui contrôlent, ensemble, à différents niveaux, la bonne organisation du réseau vasculaire sanguin. Pour comprendre le rôle de chacun de ces acteurs, on utilise des modèles de souris ne produisant plus certains de ces acteurs et on étudie les conséquences de cette perte sur les vaisseaux sanguins. Cette étude pourra apporter un bénéfice certain dans le développement de traitements pour des patients atteints de cette maladie.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à identifier les conséquences de la perte de facteurs connus pour contrôler l’organisation des vaisseaux sanguins principalement dans le foie et les poumons. Ces facteurs sont à l’origine d’une maladie vasculaire génétique. Les patients atteints de cette maladie ont des problèmes de malformations vasculaires hépatiques et pulmonaires. Aucun traitement à cette pathologie n’existe, nécessitant des recherches dans ce domaine.

Procédures

Des injections sur animaux vigiles sont effectuées sur l’ensemble des animaux, au nombre de 3 à 10 maximum et d’une durée inférieure à 30 secondes chacune. Une injection sur animaux anesthésiés est prévue sur moins d’un quart des animaux et d’une durée inférieure à 30 secondes. Une chirurgie avec perfusion est prévue sur environ un tiers des animaux, après administration d’analgésiques et d’anesthésiants, et d’une durée maximale de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections sur animaux vigiles induisent une douleur passagère (quelques minutes maximum), un risque d’infection et d’hématome, ainsi qu’un stress suite à l’immobilisation (maximum 30 secondes). Lorsqu’une chirurgie est prévue, elle est sans réveil et d’une durée inférieure à 10 minutes. Une légère perte de poids ou une diminution d’activité sont possibles à la suite de l’invalidation du gène étudié.

Devenir

Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient euthanasiés, afin de récupérer les organes.

Remplacement

Le développement de cette pathologie fait intervenir plusieurs types cellulaires. Il n’est actuellement pas possible de recréer les interactions cellulaires entre tous ces acteurs in vitro. De plus, les cellules des vaisseaux sanguins ont un phénotype différent d’un tissu à l’autre. Cette différence est fondamentale mais non maintenue en culture. Afin de comprendre pourquoi cette pathologie touche particulièrement les vaisseaux du foie et du poumon, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale, les modèles in vitro n’étant pas adéquats.

Réduction

Nous avons utilisé un logiciel statistique ainsi que les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires pour garantir la validité des résultats avec un nombre d’animaux minimal.

Raffinement

Le bien-être des animaux est évalué quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Dans chaque procédure induisant une douleur, des anesthésiants et des analgésiques sont utilisés. Suite à l’anesthésie (après environ 10 minutes), la perte totale de réactivité est testée en exerçant une pression sur les pattes avant d’effectuer tout geste technique invasif. Chez les nouveau-nés, un examen attentif permet d’évaluer les animaux sur les différents points de la grille de scoring mise en place qui évalue la prise de nourriture du nouveau-né, la croissance et la respiration. Chez l’adulte, un examen attentif permet d’évaluer les animaux sur les différents points de la grille de scoring mise en place qui évalue le changement de poids corporel, l’apparence physique et le comportement.

Choix des espèces

Les souris utilisées ont une modification génétique équivalente à celles des patients atteints de la maladie que nous étudions. Ce modèle murin est le seul existant actuellement permettant d’analyser le développement des malformations vasculaires de cette maladie. Les animaux seront soit des jeunes pour l’étude des vaisseaux en cours de développement, soit des adultes pour l’étude des vaisseaux stabilisés. Certains symptômes de la maladie sont de naissance, tandis que d’autres apparaissent à l’âge adulte. Il nous apparaît donc indispensable d’étudier les 2 âges.

Évaluer pour un sponsor l'efficacité d'un implant d'hydrogel contenant des îlots de Langerhans humains conduit à utiliser 2 000 souris et 500 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués en fin de projet pour récupération des tissus, des organes et du sang. Les implants sont posés ou retirés par chirurgie intrapéritonéale sous anesthésie d'une heure, avec administrations de glucose par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse, jeûnes pouvant aller jusqu'à six heures, et hébergement individuel sans enrichissement pendant deux heures pour la collecte d'urine et de fèces. Le point limite est fixé à plus de 20 % de perte de poids, ou à un maintien au-delà de 15 % pendant plus de trois jours. Le nombre d'animaux par groupe, de 5 à 15, est établi sur les données du sponsor.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel sur une souche de souris immunodéficiente. L’implant est à base d’hydrogel conçu pour le traitement curatif du diabète de type 1 par thérapie cellulaire. En cas de diabète de type 1, les cellules bêta des îlots de Langerhans sont détruites par un mécanisme auto-immun. La transplantation d’îlots de Langerhans est le seul traitement curatif. Cette technique est pratiquée dans différents pays. Cependant, elle se heurte à un obstacle majeur : elle nécessite l’utilisation de traitements immunosuppresseurs lourds (comme toute allogreffe) présentant des effets indésirables importants. L’implant, une matrice immuno-protectrice contenant des îlots de Langerhans, améliore significativement les protocoles actuels de transplantation :

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel chez la souris ou le rat.

Procédures

DDes implants intrapéritonéaux pourront être posés ou retirés par chirurgie. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Des injections ou administration de glucose pourront être réalisées par voie oral, intrapéritonéale ou intraveineuse (durée des injections de quelques secondes). Suite à ces administrations ou injections où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun durant 6h au maximum. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination du composé administré. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement durant une à deux heures (maximum 2heures). En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit (glucose ou autres). Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort lorsque le constat aura été fait que la greffe des ilots de Langerhans est acceptée ou non par les animaux et que l’évaluation de la fonctionnalité des ilots aura été appréciée. Les animaux ayant été greffés ne seront pas réutilisés pour d’autres procédures ou projets.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot sera déterminé sur la base des expériences déjà menées par le sponsor, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue. Un minimum de 5 animaux par groupe devra être inclus (avec un maximum de 15 animaux par groupe). L’utilisation de tests ou d’outils statistiques sur les paramètres mesurés en cours d’étude permettront limiter le nombre d’animaux engagés dans ce projet

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 15% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 15 et 20% du poids : les animaux seront réhydratés avec un soluté de remplissage 1 fois par jour. Une perte de poids de plus de 20% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 15% constituera un point limite. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les poses et retraits d’un implant seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait par animal. Les voies chirurgicales et poses et retraits d’implants seront réalisés par du personnel extensivement formé à la technique. Pour les implants intrapéritoneaux (pose ou retrait), sera ajouté un analgésique administré avant la chirurgie en sous cutané et/ou un anesthésique local en sous cutané au niveau de la zone d’incision avant l’incision. En fonction de la nature des implants, une couverture antibiotique large spectre pourra être mise en place en per et post opératoire. En fonction de la douleur associée à leur pose, une couverture par anti inflammatoire non stéroïdiens sera potentiellement mise en place. Suite aux chirurgies, de la nourriture sera placée en fond de cage pour faciliter l’alimentation. Le comportement des animaux sera surveillé pour évaluer la nécessité de mettre en place une collerette. Les sutures seront nettoyées si besoin. La glycémie sera monitorée au cours des premières heures suivant la pose des implants. En cas d’hypoglycémie (par excès d’insuline synthétisé par les ilots), de la nourriture sera ajoutée, de l’eau sucrée pourra être donné au animaux anisi que des injections de glucose en sous cutanée.

Choix des espèces

La souris et le rat seront privilégiés pour évaluer la pharmacocinétique in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation du diabète. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte permettant la réalisation de la chirurgie dans des conditions optimales. Les animaux adultes pourront mieux supporter la chirurgie et les injections ainsi que les potentiels effets secondaires des composés ou dispositifs à tester.

Toutes tuées à la fin des procédures pour éviter la dissémination d'organismes génétiquement modifiés, 2 770 souris transgéniques sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir une greffe de cellules leucémiques, des injections antitumorales deux fois par semaine pendant quatre semaines, un gavage quotidien sur la même durée, jusqu'à douze prélèvements sanguins et trois prélèvements de moelle osseuse. Une partie est irradiée avant greffe, ce que le porteur qualifie d'affaiblissement modéré et transitoire, les animaux à pathologie avancée perdant du poids et s'affaiblissant jusqu'à l'arrêt de la procédure. Sur le remplacement, il conclut que le modèle murin est "incontournable", notamment parce que les lignées cellulaires cultivées divergent des échantillons de patients.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Les mutations sur lesquelles nous travaillons restent de très mauvais pronostic. Dans l'ensemble, l'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Nos résultats précédents indiquent que le stade développemental (ex: fœtal, nouveau-né ou adulte) dans lequel ces altérations surviennent est important. Nos analyses moléculaires suggèrent que des mécanismes induits par ces fusions et des mécanismes de coopération entre différentes mutations sont importants pour les cellules leucémiques. Il est donc indispensable de développer des modèles physiologiques prenant en compte le stade du développement pour comprendre les mécanismes de la transformation leucémique et tester leurs rôles dans l'initiation ou le maintien des tumeurs. A ce jour, l'étude de l'inactivation de certains gènes in vivo, ainsi que le rôle chez l'animal entier ne peuvent pas encore être complètement remplacés par les modèles sophistiqués de remplacement. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies à mauvais pronostic et de tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, dans le contexte d’un organisme entier.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette à court terme: -De caractériser les mécanismes impliqués dans le développement leucémique, le maintien leucémique, la rechute et la résistance aux traitements. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -D’évaluer l’effet de l’inflammation dans le développement et la propagation leucémique. -A plus long terme, nous visons l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ces leucémies.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend entre quelques secondes et 3 à 5 minutes en fonction de la voie d'injection. -Injection de molécules: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et sont journaliers sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle: jusqu'à 3 prélèvements par souris avec un intervalle d'au moins 15 jours entre deux prélèvements. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général qui récapitule la maladie humaine nécessitant une surveillance renforcée, des soins puis un arrêt de la procédure. Les gavages pourront entraîner un stress léger et un inconfort temporaire. L’irradiation peut également entrainer à court terme un affaiblissement modéré transitoire des souris .

Devenir

Tous les animaux sont transgéniques et doivent être euthanasiés à la fin de la procédure pour éviter la dissémination des OGM. Des analyses post-mortem sur les organes des animaux permettent aussi de caractériser la pathologie par des analyses histologiques.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération de toutes les cellules du sang n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

Pour déterminer l’efficacité des modèles, nous évaluons le développement tumoral entre les groupes contrôles et les groupes expérimentaux à l'aide de différents paramètres (nombre de globules blanc, globules rouges, plaquettes dans le sang; pourcentage de cellules anormales par les analyses de cytométrie en flux; poids des rates et des foies) grâce à un test statistique. La robustesse des modèles est évaluée en confrontant ces résultats au cours du temps. Les nombres calculés dans ce projet sont des nombres maximaux calculés par des méthodes de calcul de puissance ou limités par le matériel cellulaire disponible (ex: dans le cas de populations purifiées de progéniteurs hématopoïétiques). Pour ce projet, nous avons favorisé l'utilisation de modèles transgéniques développés sur la base d'une expression des oncogènes proche de la physiologie et qui développent des hémopathies de manière pénétrante. Ainsi, le développement tumoral est contrôlé et le nombre de souris utilisé correspond précisément au nombre de souris permettant d'obtenir une valeur statistique des résultats.

Raffinement

Les procédures douloureuses sont accompagnées d’anesthésie et d’analgésie appropriées. Les animaux sont observés avec une fréquence adaptée à la procédure. L'utilisation d'une grille de score nous permet de suivre les animaux et d'intervenir pour les soulager en cas d’observation d'une souffrance. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Comme explicité plus haut, l’irradiation peut entrainer à court terme un affaiblissement des souris. Pour prévenir les conséquences après une irradiation léthale suivie de greffe et assurer le confort des animaux durant le premier mois post-irradiation, une nourriture enrichie est mise à disposition.

Choix des espèces

L'espèce souris a été choisie pour les raisons suivantes : -Les souris possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l'homme et de nombreux modèles de souris existent déjà permettant des croisements avec nos modèles. -Les approches précliniques in vivo sur souris sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères. Les nombreux modèles murins déjà disponibles reposent sur la proximité entre le développement des cellules du sang chez l'homme et la souris et ils permettent de comparer les résultats avec ceux d'autres études. Nous utiliserons des souris adultes et/ou des nouveau-nés et des embryons. Les souris adultes auront entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, un article récent montre l’importance d'utiliser des receveurs à différents stade de développement. Ainsi, nous utiliserons à la fois des cellules fœtales (foie fœtal), des cellules de nouveau-nés et des cellules adultes qui seront greffées dans des receveurs soit nouveau-nés soit adultes, âges qui correspondent à la population de patients..

Une tumeur de type glioblastome est induite dans le cerveau, un implant souple est posé dans la zone péritumorale au cours d'une chirurgie sous anesthésie pouvant durer six heures, puis les signaux cérébraux sont enregistrés sur animal vigile jusqu'à trois heures par jour et le sang prélevé chaque semaine. 30 miniporcs sont utilisés dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une hémorragie puis un possible œdème cérébral pendant la chirurgie, un traumatisme local lié à la pose des électrodes et à l'extraction des tumeurs, une douleur modérée après l'opération et des infections aux points de suture. 26 animaux sont tués pour analyses histologiques, les 4 miniporcs restants, non implantés, pouvant être réutilisés dans d'autres projets.

Objectifs

L’objectif du projet de recherche est la vérification et la validation des performances de l’implant intracérébral innovant et de son intérêt théranostique (approche médicale visant à privilégier le développement simultané des aspects diagnostic et thérapeutique). Un verrou technologique actuel concernant les implants neuronaux et leur intérêt thérapeutique est leur capacité à pouvoir enregistrer les neurones sur le long terme. C’est en partie dû au fait que les implants actuels sont rigides, ce qui entraine une réponse inflammatoire de l’organisme forte. L’avantage du développement de notre implant souple est qu’il permet, en étant souple, d’augmenter sa biocompatibilité et de limiter la réaction inflammatoire. Nous avons eu des résultats prometteurs chez les rongeurs. Nous voulons tester la capacité de l’implant cérébral à assurer un interfaçage stable sur le moyen et long terme à l’échelle cellulaire et multi-cellulaire dans le système nerveux central au niveau cortical, chez le grande modèle. Nous voulons tester la biocompatibilité de l’implant et évaluer leur acceptation et leur intégration sur le long terme par le tissu cérébral chez le mini-porc. Cette étude comporte trois axes : - enregistrement de signaux électrophysiologiques corticaux - enregistrement de signaux électrophysiologiques péri-tumoraux - stimulation péri-tumorale : étude des effets sur les signaux électrophysiologiques péri-tumoraux La qualité des implants sera déterminée par leur capacité à assurer une bonne stabilité des enregistrements. En particulier, nous déterminerons la stabilité des formes des potentiels d’action sur des périodes de plusieurs jours.

Bénéfices attendus

Cela permettra de valider un nouveau dispositif qui peut aider les neurochirurgiens à mieux délimiter les marges tumorales, évaluer le pronostic et permettre un ajustement plus précoce du traitement dans une maladie incurable comme le GBM. Il constituera un gain significatif pour les cliniciens, les patients et les systèmes de santé. De plus, ce projet permettra comprendre mieux le fonctionnement de la zone péritumorale.

Procédures

Les animaux sont soumis à : -Procédures chirurgicales et analyse d’imagerie : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 6h, et limitée autant que possible à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. Cette longue procédure permet d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés ; - Les enregistrements signaux cérébraux : sur les animaux vigiles, maximum 3 heures par jour; - Les prises de sang seront effectuées 1 fois par semaine sous anesthésie avec une durée environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la chirurgie et à la période postopératoire. Il s’agit plus précisément de : - stress de l’anesthésie, hypothermie ; - hémorragique puis possible œdème cérébral au niveau du cerveau pendant la chirurgie ; - le traumatisme local provoqué dans le cerveau (par la pose des électrodes et l’extraction des tumeurs) ainsi que la douleur modérée en postopératoire ; - infection au niveau des points de sutures. La principale nuisance attendue sur la partie des enregistrements : l'inconfort lié à la présence des électrodes. Pour les prélèvements (sang) : stress de l’anesthésie, légère douleur possible. Une surveillance des paramètres comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter les complications inattendues.

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques. Les animaux supplémentaires, non utilisés lors de l'implantation, pourront être réutilisés dans d'autres projets.

Remplacement

Nous avons précédemment travaillé avec des cultures cellulaires et des organoïdes, mais à ce stade de l’étude, il est nécessaire de passer à un modèle in vivo. Nous avons besoin d’étudier l’impact des mouvements in vivo sur la stabilité et la robustesse de l’implant à long terme.

Réduction

Conformément au principe des 3R, les matériaux ont été préalablement testés sur des cultures cellulaires afin de minimiser le nombre d'animaux nécessaires pour les essais in vivo. La première étude (preuve de concept) sera réalisée sur un minimum de 10 animaux, incluant 2 supplémentaires. Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum requis pour obtenir des données fiables concernant l’évaluation de la fonctionnalité du dispositif. Cependant, le Règlement Européen 2017/745 exige un nombre suffisant de preuves d'efficacité à travers plusieurs traitements. Le produit est considéré efficace s'il fonctionne sur 10 tumeurs. Par conséquent, une autre étude avec 20 animaux (2 supplémentaires) est envisagée afin de répondre aux exigences réglementaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. La température de la salle d’hébergement sera augmentée après la chirurgie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. La surveillance est renforcée durant la période post-opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportées sur des fiches de suivi adaptées. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal, alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Quant au traitement à la ciclosporine, les animaux seront plus vulnérables aux infections. Par conséquent, un équipement de protection individuelle propre (gants, etc.) sera utilisé pour prévenir l’infection. De plus, un masquant de goût sera utilisé pour rendre le traitement plus appètent. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Une fois implantés, les animaux devront être isolés dans leur enclos pour éviter la détérioration des connecteurs, ce qui rendrait les implants inutilisables et risqués. Cependant, ils pourront interagir visuellement et auditivement avec d'autres animaux dans des enclos voisins, et des jeux (ballons...) enrichiront leur environnement.

Choix des espèces

Le porc (une tumeur induite), à cause de similarités anatomique du cerveau de porc et de l’homme. Le transfert technologique de nouveaux implants chez l’homme impose des tests précliniques dans un modèle animal pertinent. Il sera nécessaire d'évaluer la biocompatibilité des implants et leur capacité à enregistrer l’activité neuronale et la stimuler électriquement de manière stable sur le long terme chez le mini-porc. En effet, ce modèle est plus pertinent que le modèle rat, car son cerveau produit des mouvements importants qui sont une des sources principales de l’instabilité des signaux chez l’homme. De plus, notre laboratoire a un modèle tumeur glioblastome développé et validé chez le minipig. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car la craniectomie doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car la craniectomie doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés.