Recherche appliquée

Immunodéficientes par construction, donc incapables de rejeter les cellules leucémiques humaines qu'on leur transplante, 288 souris vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules prélevées chez des patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique, développent le cancer dans leur moelle osseuse, leur sang et leur rate, puis subissent quatre injections de molécules inhibitrices et un prélèvement de sang à 35 jours, le tout à l'état vigile. Elles sont toutes tuées, en fin de procédure ou à l'atteinte des points limites, pour prélever la moelle et la rate et y doser les cellules leucémiques. Le porteur écrit que le remplacement par des méthodes sans animaux "n'est plus possible à ce stade" du projet, les molécules ayant déjà été testées sur des cellules de patients.

Objectifs

La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) est un cancer du sang. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute restent élevés (de l’ordre de 25%). Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous transplantations des cellules leucémiques issues de patients dans des souris immunodéficients qui vont développer le cancer afin d’étudier l’effet thérapeutique de nouvelles molécules inhibitrices du cancer.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies, nous avons identifié de nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne donc la découverte de nouvelles molécules inhibitrices et donc de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques. Une seule injection est prévue par souris, durée de 5 minutes par injection. Après la transplantation, des injections des molécules inhibitrices se feront sur animaux vigiles. Quatre injections par souris sont prévues, durée par injection de 5 minutes. Trente-cinq jours après la transplantation, un prélèvement de sang sur animaux vigiles est prévu. Un seul prélèvement par souris, durée du prélèvement de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Les injections et prélèvements sur animaux vigiles engendreront du stress et de la douleur au point de piqure.

Devenir

La mise à mort sera effectuée sur les animaux soit en fin de procédure, soit lorsque des points limites auront été atteints. Les animaux seront tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever des tissus (les moelles osseuses et les rates) afin de doser la présence des cellules leucémiques.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les anticorps et les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que ces molécules qui vont être étudiées in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les courbes de survie, nous utiliserons des groupes de 7 souris, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Comme il s’agit d’animaux immunodéficients, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours après 35 jours). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être étudié en thérapie clinique, il est nécessaire de mener des études précliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin. L’hématopoïèse et la leucémogenèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules leucémiques.

Un primate est choisi ici parce qu'il est proche de l'humain, et le singe écureuil plutôt que le macaque parce que sa tête entre dans des IRM plus puissantes. 18 singes écureuils vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une lésion chirurgicale du cerveau destinée à provoquer une héminégligence, soit la perte de perception de la moitié du champ visuel, et chaque animal peut subir jusqu'à quatre chirurgies de sept à huit heures ainsi que quatre séances d'IRM de sept heures. L'isolement nécessaire aux tâches comportementales peut provoquer des stéréotypies et des dépilations, et les animaux lésés sont tués trois puis douze mois après l'opération, pour confirmer par histologie ce qui a été observé de leur vivant.

Objectifs

Une très large majorité des cas d’accident vasculaire cérébral droit montre des troubles de la perception consciente qui conduisent à des symptômes neuropsychologiques handicapants tels que l’héminégligence. Ce trouble se caractérise par une perte de la perception de la moitié du champ visuel. Les patients héminégligents semblent vivre dans un monde amputé d’une moitié ; ils ne mangent pas la partie gauche de leur plat, ne voient pas les obstacles situés sur le côté gauche, mais plus important encore, la vie quotidienne d’un patient héminégligent présente plusieurs dangers, qui incluent des risques d'accidents de la route et des chutes graves. Seulement quarante pourcents des patients héminégligents récupèrent une capacité visuelle normale dans les 6 mois qui suivent leur accident vasculaire. Cela signifie que chaque année, 480.000 nouveaux patients européens resteront héminégligents, ce qui nuit à leur qualité de vie et les empêche de retourner au travail. Il a récemment été démontré qu'une bonne communication entre deux aires du cerveau (le lobe frontal et le lobe pariétal) est essentielle à la récupération de l’héminégligence. Cependant, chez l’animal, la récupération de l’héminégligence est rapide et spontanée même dans les cas de coupure de communication entre ces deux régions du cerveau. Les primates utilisent donc un mécanisme de récupération qui n’existe pas chez l’être humain. C’est pourquoi ce projet propose d’étudier la récupération de l’héminégligence chez le primate afin de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques chez l’être humain.

Bénéfices attendus

En étudiant la récupération de l’héminégligence chez le primate, ce projet a pour objectifs de mieux en comprendre les mécanismes et ainsi d’en déduire de nouvelles pistes thérapeutiques. A terme un traitement pourrait améliorer la récupération des patients souffrant d’héminégligence suite à un accident vasculaire cérébral. De plus, en validant l'utilisation du primate comme modèle d’héminégligence et en proposant des tests d’évaluation de ce trouble adaptés, notre étude apporte une base indispensable aux tests de traitements pharmacologiques. Cette étape est nécessaire avant la mise en place des essais chez l’être humain. Cela représente un gain de temps important dans le processus de développement d’éventuels traitements.

Procédures

Tous les animaux réaliseront 4 séquences complètes d’imagerie par résonance magnétique (IRM) au maximum et avec une durée maximale de 7 heures. Afin de maintenir la tête des animaux pendant les enregistrements, un dispositif sera implanté sur la tête d’une partie des animaux au cours d’une procédure chirurgicale (1 fois, 8 heures au maximum) réalisée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. Il est possible que d’autres chirurgies soient effectuées (3 au maximum par animal, 7 heures maximum par chirurgie) dans le cas où l’animal perdrait son dispositif ou si les soins d’entretien devenaient difficiles. Ces animaux auront ainsi au maximum 4 chirurgies (1 pour la pose du dispositif, 1 pour sa remise en place et 2 entretiens pour l’entretien du dispositif). Afin de créer le trouble de l’héminégligence, une lésion chirurgicale du cerveau est réalisée durant une chirurgie chez une partie des animaux avec une durée d’anesthésie maximale de 8 heures. Afin d’éliminer la douleur durant la chirurgie et après l’opération, les animaux recevront des anti-douleurs. Les animaux implantés du dispositif d’observation participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau et des neurones pendant qu’ils réalisent des tests visuels. Ces enregistrements dureront au maximum 2 heures sur une période comprise entre 3 et 12 mois. Les animaux anesthésiés participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau. Ces enregistrements dureront au maximum 2 heures sur une période comprise entre 3 et 12 mois. Les animaux seront euthanasiés. Les deux groupes ayant eu une lésion seront euthanasiés respectivement 3 et 12 mois après la lésion. Le groupe contrôle seront euthanasiés après que l’euthanasie des deux autres groupes ait été réalisée.

Impact sur les animaux

Il est attendu que la lésion réalisée induise une perception altérée de la moitié de leur vision et impacte leur comportement (déplacement et alimentation difficiles pouvant entraîner une perte de poids). L’espèce présente une sensibilité à l’anesthésie avec notamment un risque augmenté d’arrêt cardio-respiratoire. Les animaux ayant eu une chirurgie (retrait d’une partie du crâne, lésion et pose de chambre d’enregistrement/système de fixation de la tête) pourront ressentir de la douleur à la suite de la chirurgie. La chirurgie peut, dans certains cas, causer une accumulation de liquides et/ou abîmer la couche de tissu protectrice du cerveau. Les animaux soumis à une anesthésie et à une chirurgie pourront présenter des difficultés à se déplacer (de 1 à 4 jours). L’implantation d’une chambre d’enregistrement/système de fixation de la tête peut induire une difficulté à se déplacer et des collisions à cause de l’encombrement (pendant quelques jours avec une variabilité individuelle). L’isolement nécessaire aux tâches comportementales peut induire un stress chez l’animal concerné. Celui-ci peut notamment se manifester par des stéréotypies (gestes répétitifs, rythmés sans but apparent) ou des dépilations. Suite à des bagarres, une chute ou un choc, l’animal pourrait perdre son dispositif composé de la chambre d’enregistrement et du système de fixation de la tête. L’installation de la chambre d’enregistrement peut faciliter une infection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures afin de pouvoir effectuer différents prélèvements (cerveau...) pour des analyses post-mortem. Les analyses histologiques qui nécessitent l’euthanasie des animaux sont indispensables pour confirmer les données obtenues sur l’animal vivant afin de répondre à notre objectif scientifique. Il n’existe à ce jour aucune méthode qui nous permettrait d’obtenir cette confirmation sans nécessiter l’euthanasie des animaux.

Remplacement

Ce projet a pour objectifs de comprendre et de manipuler à des fins thérapeutiques les processus de récupération du cerveau suite à un accident vasculaire chez le primate. Ces processus sont complexes ce qui rend difficile/impossible à l’heure actuelle leur modélisation. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Par ailleurs, il est indispensable d’obtenir des données d’études sur les modèles animaux avant de pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques chez les patients humains. Le modèle animal et en particulier l’utilisation du primate non-humain est donc le plus pertinent pour espérer une transposition à l’homme la plus fiable possible.

Réduction

La taille des groupes et le nombre total d’animaux nécessaire pour cette étude a été déterminée par des calculs de puissance. L’espèce présente une sensibilité à l’anesthésie avec notamment un risque augmenté d’arrêt cardio-respiratoire. Ainsi, il a été ainsi établi que 18 animaux au total seraient nécessaires pour la réalisation de ce projet. Des tests statistiques seront réalisés pour obtenir une interprétation fiable des résultats. Deux animaux de ce projet ont déjà réalisé des procédures de classe légère ou modérée lors d’un précédent projet validé par le comité́ d’éthique et ayant obtenu une autorisation.

Raffinement

Les procédures du projet ont été raffinées en plusieurs points. Tout d'abord, pour l'état général des animaux, les entraînements comportementaux se font par renforcement positif (récompense) pour créer une routine qui limite les contentions et le stress lors des manipulations et les tâches demandées. Des adaptations ont également été faites pour l'hébergement, l'enrichissement et l'alimentation afin de stimuler les animaux (recherche de nourriture, jeux, vidéo...) et limiter les comportements anormaux (mouvements répétitifs, immobilité). Ensuite, pour les chirurgies et IRM du projet, ces actes sont réalisés sous anesthésie générale avec la mise en place d'anti-douleurs adaptés (avant, pendant et après l'opération), surveillance accrue de l'animal anesthésié pour éviter toutes les complications (déshydratation, baisse de la température, rythmes cardiaque et respiratoire, infection...). Ces risques sont bien identifiés et une réponse est apportée à chaque point. Par exemple, des tapis chauffant pour la température, du gel ophtalmique pour l’hydratation des yeux, une désinfection et utilisation de matériel stérile pour éviter l’infection, un anesthésique local pour l’intubation et l’installation des barres d’oreilles (dispositif de maintien de la tête fixe), l’intubation pour sécuriser la respiration, du matériel chirurgical permettant d’avoir un geste précis et de limiter les saignements... Le dispositif implanté sera le plus petit possible pour le confort de l’animal et sera posé dans des règles strictes d’asepsie. La fréquence des IRM sera limitée à une fois par semaine. Durant la phase post opératoire, à chaque anesthésie la récupération de l’animal devra être complète avant la poursuite du reste du projet. Après lésion, les animaux sont hébergés par 2 dans des cages ajustables pour prévenir les chutes. Ces cages conservent des aménagements permettant une stratification de l’espace tout en préservant l’animal des risques de chute. Une alimentation riche pourra être proposé pour faciliter la récupération. À la suite des différentes chirurgies, les comportements alimentaires et sociaux des animaux peuvent être modifiés, ils feront donc l’objet d’une surveillance augmentée. Des observations post-anesthésie et post-chirurgie régulières et rigoureuses seront faites pour détecter le moindre inconfort de l’animal.

Choix des espèces

La complexité des processus de récupération d'un accident vasculaire cérébrale rend indispensable d’utiliser un modèle suffisamment proche de l’Homme pour tester ensuite de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le primate non-humain est ainsi un modèle particulièrement approprié pour notre étude. De plus, les capacités d’apprentissage des singes permettent la réalisation de tâches comportementales similaires à celles réalisées par l’Homme. La complexité du cerveau rend difficile/impossible à l’heure actuelle, la modélisation de ces processus. Il est primordial d’étudier ces aspects dans un modèle primate non-humain. Il y a plusieurs raisons motivant le choix du singe écureuil par rapport à d’autres espèces de primates : Le choix de cette espèce a été fait car le singe écureuil est plus facile d’accès et est particulièrement adapté à ce genre d’étude en comparaison du macaque. La taille de cette espèce est un paramètre intéressant puisqu’il permet d’utiliser des appareils IRM plus puissants dont le diamètre d’entrée est plus petit. De plus, le choix ne s’est pas porté sur les rongeurs car contrairement aux primates non humains, les rongeurs ne semblent pas présenter de symptômes d’héminégligence. Par ailleurs, nous n’avons pas choisi le macaque car il a été démontré qu’une lésion de la zone cérébrale causant le trouble de l’héminégligence chez cette espèce induisait des symptômes qui pouvaient perdurer plusieurs mois, voire même plusieurs années. Ces différents points expliquent les raisons pour lesquelles nous avons décidé d’utiliser le modèle du singe écureuil pour ce projet. Les animaux utilisés seront tous adultes (âge supérieur à 3 ans). Étant donné que l’âge est un facteur de risque pour les accidents vasculaires cérébraux, nous utiliserons des animaux les plus âgés possibles. En effet, il a été observé chez d’autres espèces de primates que par rapport aux plus jeunes, les animaux âgés étaient plus sensibles à la lésion et que le syndrome obtenu était généralement plus stable.

180 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et ceux de tous les groupes subissent environ quarante anesthésies générales, autant de prises de sang, une trentaine d'écouvillonnages du nez et de la trachée et l'implantation d'une puce de télémétrie. Les macaques infectés par un virus de la grippe ou par le SARS-CoV-2 subissent en plus quatre prélèvements de moelle osseuse, quatre biopsies de ganglions et jusqu'à huit semaines d'hébergement individuel, dont le porteur écrit qu'il peut entraîner "un stress ou de l'ennui". Il s'agit de tester des anticorps et d'autres immunothérapies avant un éventuel essai clinique. Une partie des macaques est tuée pour prélever des tissus, l'autre gardée en vie pour des réinfections ou un suivi de convalescence, et peut-être réattribuée à d'autres études : d'après les prévisions, 108 seraient tués et 72 réutilisés.

Objectifs

La grippe et le Covid sont des maladies respiratoires causés respectivement par les virus influenza et le SARS-CoV-2. La transmission interhumaine de ces virus se fait principalement par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration).Les personnes à risque et les stratégies thérapeutiques de ces deux maladies étant assez similaires, nous avons choisi de mener nos recherches à l’intérieur d’un seul projet. Actuellement, aucun traitement spécifique ne permet d’atténuer efficacement et systématiquement les maladies causées par le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. De nombreuses personnes notamment les personnes immunodéprimées (personne au système immunitaire fragile) ou âgées sont encore lourdement impactées par la Covid-19 ou la grippe avec des effets secondaires qui demeurent importants. De plus, dans le cas du SARS-CoV-2, l’émergence continuelle de variant d’intérêt (VOC) et l’absence de vaccins efficaces contre l’ensemble de ces variants anciens ou émergents nécessite le développement permanent de nouveaux traitements par immunothérapie. Dans le cas de la grippe, les souches qui circulent en hivers sont différentes d’une année sur l’autre. Cette diversité impose d’ajuster chaque année la composition du vaccin pour y introduire les souches les plus récentes en circulation et qui circuleront aussi probablement dans les mois suivants. De plus, ces virus saisonniers diffèrent en termes d’impact sur la population et de sévérité. Le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nous permettrait de mieux faire face à une épidémie de grippe en cas de faible efficacité du vaccin. Dans ce contexte, nous testerons différentes types de traitements comme des anticorps permettant d’améliorer la réponse adaptive ou ciblant directement les virus du SARS-CoV-2 ou les virus grippaux. La mise en place de traitements par immunothérapie efficaces contre ces virus respiratoires pourrait aussi représenter une alternative capable de stimuler la réponse immunitaire en cas de baisse d’efficacité des vaccins (population immunodéprimée, apparition d’une souche génétiquement très éloignée…). Ces traitements sont en phase de développement préclinique et la démonstration d’une efficacité dans notre modèle macaque permettrait une avancé en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les molécules thérapeutiques qui auront montré des résultats satisfaisants chez le primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’Homme. Elles pourront notamment, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre les virus respiratoires tels que le SARS-CoV2 ou la grippe.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Anesthésie générale (40 fois environ, 30min, tous les groupes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (4 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus de la grippe ou de la covid (1 fois, 15 minutes, groupes exposés) - Prélèvement de sang (40 fois environ, 5 minutes, tous les groupes). - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Biopsie de ganglions lymphatiques (4 fois environ, 30 minutes, groupes exposés) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (30 fois environ, 2 minutes, tous les groupes) - Lavage broncho-alvéolaire (10 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Prélèvement de LCR (liquide cérébrospinal) (4 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Imagerie in vivo (10 fois environ, 45 minutes, tous les groupes) - Pléthysmographie (mesure de l'ensemble des volumes pulmonaires) (10 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Hébergement individuel (1 fois, 8 semaines maximum, groupes exposés)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux traitements: Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza ou le SARS-CoV2 : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux traités. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélever différents tissus et procéder à des analyses (charge virale, lésions pulmonaires…). L’autre partie des animaux sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents. Il n’est pas exclu que ces animaux soient réattribués à d’autres études après avis vétérinaire.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer la protection induite par différents traitements par immunothérapie contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. Ce type d’évaluation nécessite un modèle expérimental proche de l’Homme, permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite au traitement et à l’infection virale. A ce jour, le macaque est le modèle qui représente le mieux ces infections respiratoires chez l’Homme. Du fait de sa proximité génétique avec l’Homme, les cibles des immunothérapies sont aussi exprimées chez le macaque, et pas nécessairement dans le modèle des petits animaux. Toutefois, les traitements par immunothérapie évalués ont été préalablement testés in vitro et dans un modèle de petits animaux avant d’être testés chez le PNH.

Réduction

Les études pilotes de distribution et persistance du traitementse font sur 2 animaux et nous permettent de sélectionner les traitements par immunothérapie les plus pertinents, la dose et la voie d’administration. Nous maitrisons les modèles de grippe et de SARS-CoV-2, cette expérience nous permets d’utiliser des contrôles historiques dans les études d’efficacité ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux contrôles tout en permettant une analyse statistique robuste. Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

L’ensemble des interventions et les prélèvements seront réalisés regroupés au maximum et sous anesthésie générale des animaux. Une diversification de l’alimentation et complémentation de celle-ci pourra être instaurée en cas d’une baisse de l’alimentation due à des anesthésies répétées Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être appliquée par une désinfection et une analgésie locale. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de la température peut induire une réaction tel qu’un gonflement et un suintement de la plaie. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique comme une désinfection et une analgésie locale. L’administration des traitements pouvant entrainer une réaction locale comme des démangeaisons et douleurs, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. L’exposition aux virus influenza et SARS-CoV2 peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. Si apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé.. Une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Les modèles d’infection par le SARS-CoV2 ou par les virus grippaux chez le macaque sont déjà mis au point dans notre département. Des grilles de score avec des points limites ont déjà été établis et utilisés au sein de notre département lors de différentes infections avec ces virus. L’hébergement se fera en groupe pour les études pilotes. Pour les études d’efficacités, les animaux seront mis en individuel pour la période d’adaptation avant l’exposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée, ils seront remis en groupe. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition virale.

Choix des espèces

Les modèles de petits animaux comme la souris ne sont pas un hôte naturel du SARS-CoV-2 et des virus influenza et leur le système immunitaire est très différent de celui de l’humain. Toutefois, la majorité des candidats sont déjà testés dans un modèle petit animal ou in vitro avant d’être testés chez le macaque PNH. Le macaque a été choisi comme modèle animal, car il présente une réponse immunitaire et physiopathologique semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires similaires. A ce jour, a été mis au point un modèle d’infection efficace des macaques cynomolgus par voie respiratoire. Les macaques sont d’excellents modèles pour reproduire la forme non sévère des maladies COVID19 et grippes, ils sont donc pertinents pour tester des molécules thérapeutiques. Ces espèces représentent le modèle le plus pertinent réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de traitements par immunothérapie contre les virus respiratoires : la réponse immunitaire et la réponse aux traitements sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire est maitrisés chez ces espèces contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires comme le furet. La grippe et le Covid infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum 2 ans. Enfin, les traitements candidats pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

Six tubages par la bouche jusqu'au rumen et douze prises de sang, sur trois jours répartis sur trois semaines : 12 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis toutes rejoindront leur troupeau. La moitié d'entre elles est d'abord entraînée pendant environ trois mois, par renforcement positif au clicker, à coopérer à ce prélèvement de jus de rumen, l'autre moitié formant le groupe témoin. Le porteur cherche à savoir si un tel entraînement, mené en amont des expériences, faciliterait les prélèvements "tout au long de la vie de l'animal". Il s'attend à ce que le tubage déclenche "une réaction intense (stress, agitation, comportement de défense) mais de courte durée", tête immobilisée au cornadis par un lève-tête. Les vaches retenues sont des Prim'Holstein primipares "n'ayant jamais été soumises à une quelconque procédure", choisies dans le troupeau de l'établissement.

Objectifs

Le recours à des bovins fistulés au niveau du rumen permet de réaliser des prélèvements de contenu ruminaux d’intérêt pour la recherche. L’utilisation des vaches fistulées est aujourd’hui remise en cause et des alternatives doivent être recherchées. Parmi elles, le prélèvement par tubages gastro-oesophagien (PGO) a été identifié comme une alternative satisfaisante concernant la qualité des échantillons prélevés en vue de réaliser des expérimentations in vitro nécessitant l’utilisation de jus de rumen pour étudier par exemple les gaz à effet de serre ou le microbiote. Toutefois, nous ne savons pas quelles sont les émotions que peut ressentir un bovin lors de ce type de prélèvement qui nécessite l’introduction temporaire (2 minutes), par la bouche, d’un tube, jusqu’au rumen pour prélever 1 ou 2L de jus de rumen (sur un volume total de 100-150L environ). L’entraînement des animaux s’est développé dans le cadre des soins vétérinaires, au sein des parcs animaliers, chez les animaux de compagnie, et plus récemment chez les chevaux ou chez les génisses. Lors de l’entraînement, l’animal apprend à coopérer pour la réalisation de gestes. Cette démarche n’est, à ce jour, pas utilisée chez les bovins. Or, l’entraînement pourrait aussi – à l’instar des autres espèces - être utilisé pour réduire ou limiter les émotions négatives des bovins associées au prélèvement, qui est un évènement courant dans les troupeaux bovins en ferme. Le présent projet vise à étudier : 1) la capacité des bovins à apprendre à coopérer avec les humains pour un prélèvement gastro-oesophagien, via un entraînement basé sur le renforcement positif 2) leur capacité de mémorisation de cet entrainement ; 3) évaluer les réponses comportementales des animaux en lien avec leurs émotions pendant les phases d’apprentissage. Lors de la mise en oeuvre du projet, les 3 entraineurs/préleveurs seront des personnes formées, et qui pratiquent depuis plusieurs années l'entrainement aux soins des bovins et équidés.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet permettront d’améliorer les connaissances concernant les capacités cognitives des bovins, et leur utilisation pour le raffinement des prélèvements en expérimentation animale. Ce projet permettra ainsi de savoir s’il est possible, pour les expérimentateurs (animaliers, techniciens, chercheurs), de développer et mettre en place un programme d’entraînement en amont des expérimentations pour faciliter les prélèvements tout au long de la vie de l’animal. Cela permettra d’adapter, dans de futurs projets, l’approche globale des animaux afin de raffiner le prélèvements et les expériences nécessitant de collecter du contenu ruminal.

Procédures

Durant la période d’entrainement (3 mois environ), l’objectif est que les vaches coopèrent pour trois prélèvements par tubage par vache sur une journée. Pendant cette période, quatre prises de sang par vache seront réalisées au total. A chaque fois, les prises de sang (quelques secondes) seront réalisées lors d’une contention de 20 minutes. Durant les 3 jours de prélèvement gastro-oesophagien (post-entrainement), les vaches subiront selon la même méthode : 6 prélèvements (100mL) par tubage gastro-oesophagien et 12 prises de sang au total sur 3 jours répartis sur 3 semaines.

Impact sur les animaux

Nous pouvons nous attendre à ce que le prélèvement par tubage gastro-oesophagien déclenche une réaction intense (stress, agitation, comportement de défense) mais de courte durée. Les animaux sont habitués à la contention et aucune réaction particulière n’est attendue. Les prises de sang induisent une nuisance légère de très courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie et réintégreront le troupeau à la fin des procédures.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer l’espèce car cette étude de comportement et de bien-être animal sera effectuée sur l’espèce cible (bovin).

Réduction

Afin de répondre aux objectifs du projet, 12 vaches (6 par lot) seront mobilisées selon un schéma randomisé et longitudinal. Pour la période ‘entraînement, les capacités d’apprentissage des vaches du lot 1 (n=6) seront décrites. Pour la période ‘prélèvement’, les réponses de vaches répartis en deux traitements seront comparées : – Lot 1 (n=6) : vaches entraînées. Ces vaches auront été entraînées à coopérer pour le prélèvement gastro-oesophagien via un entraînement basé sur le renforcement positif (clicker training) – Lot 2 (n = 6) : vaches témoin. Ces vaches ne seront pas entraînées, mais seront soumises à une fréquence de présence humaine en quantité équivalente au lot 1. Des études antérieures sur génisses utilisant le clicker-training et sur un effectif similaire ont montré des résultats très encourageants. de plus, l’entraînement étant une phase particulièrement chronophage, la taille des groupes a été définie par rapport aux possibilités d’entraînement sur la ferme expérimentale

Raffinement

Les animaux seront logés en stabulation libre respectant leur bien-être : ils seront maintenus en groupe social stable, auront accès à des zones de couchage avec matelas, d’alimentation et d’abreuvement conformes aux besoins de leur espèce, ainsi qu’à des brosses. A la fin de l’étude, ces bovins rejoindront leur troupeau d’origine. Pour tous les prélèvements, les vaches seront placées (contenues) au cornadis ; nous immobiliserons la tête des vaches à l’aide d’un dispositif de lève-tête, placé devant le cornadis. Les manipulateurs qui réaliseront les prélèvements gastro-oesophagien et les prises de sang ont tous été formés par un vétérinaire maîtrisant le geste.

Choix des espèces

Il n'existe à ce jour aucun moyen alternatif d'obtenir les données attendues dans ce projet sans avoir recours à l'expérimentation in vivo sur vache laitière. Il s’agit de vaches laitières de race Prim’Holstein (race la plus fréquente en France). Les vaches seront des vaches primipares n’ayant jamais été soumises à une quelconque procédure et notamment à aucun PGO. Elles seront sélectionnées parmi le troupeau de l’établissement utilisateur.

1 225 rats vont être utilisés dans ce projet, chacun recevant un fil de suture serré autour d'un globe oculaire pour faire monter la pression, puis une anesthésie par semaine pendant un mois et jusqu'à huit instillations de gouttes par jour. Tous sont tués à l'issue pour l'analyse des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit les examens ophtalmiques comme "totalement indolores et non invasifs" parce qu'ils se pratiquent aussi en cabinet chez l'humain, et reconnaît ailleurs que la pose du fil peut causer une douleur légère à modérée pendant les premières heures. Les bénéfices annoncés, identifier des cibles thérapeutiques et fournir des données précliniques avant les essais humains, restent au futur, la mise en place du modèle étant l'objet immédiat du projet.

Objectifs

Le glaucome est une maladie oculaire chronique caractérisée par des lésions progressives du nerf optique, souvent associées à une élévation de la pression intra-oculaire (PIO). Cette pression élevée résulte généralement d’un déséquilibre entre la production et le drainage de l’humeur aqueuse, un liquide clair à l’intérieur de l’œil. Le glaucome peut entraîner une perte de vision irréversible si elle n’est pas traitée. Il existe plusieurs types de glaucome, mais le plus courant est le glaucome à angle ouvert, où le système de drainage de l’œil est partiellement obstrué. Les symptômes peuvent inclure une vision floue, des douleurs oculaires et une perte progressive du champ visuel. Le glaucome touche environ 1 à 2 % de la population mondiale de plus de 40 ans, avec une prévalence qui augmente avec l’âge. En France, environ 800 000 personnes sont traitées pour le glaucome, mais on estime que 400 000 à 500 000 personnes supplémentaires pourraient être atteintes sans le savoir. Malgré les traitements disponibles, certains patients peuvent ne pas répondre adéquatement aux thérapies conventionnelles, ce qui peut conduire à une progression de la maladie. Les traitements actuels visent principalement à réduire la PIO, mais ils ne sont pas toujours efficaces pour tous les patients. La recherche sur le glaucome est donc cruciale pour développer de nouvelles méthodes de diagnostic et de traitement. Comprendre les mécanismes sous-jacents de l’élévation de la PIO et des lésions du nerf optique peut conduire à des thérapies plus efficaces et à une meilleure prévention de la cécité liée au glaucome.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de la mise en place d'un modèle expérimental chez l'animal sont multiples et visent principalement à améliorer la compréhension de cette maladie ainsi qu'à développer de nouveaux traitements. Ce projet pourra nous aider à : 1. Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l'efficacité de nouveaux traitements potentiels ou de médicaments existants pour ralentir ou inverser la progression de la maladie. 2. Observer comment les traitements sont absorbés, distribués, métabolisés et excrétés dans un organisme vivant, ce qui est crucial pour le développement de médicaments. 3. Fournir des données précliniques sur la sécurité et l'efficacité des traitements avant de passer aux essais sur l'homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’intervention : 1. L’établissement du modèle est réalisé avec la mise en place d’un fils de suture autour du globe oculaire. 1 seule fois par animal, le jour de l’induction. Cette étape ne devrait pas durer plus de 5 à 10 minutes sans compter l’anesthésie et le réveil de l’animal. Un seul œil est concerné. 2. Les anesthésies qui ne devraient pas durer plus d’une vingtaine de minutes, le temps du réveil. Ces anesthésies seront réalisées 1 fois pour l’induction et lors d’examens pour maintenir l’animal immobile soit 1 fois par semaine et durant 1 mois. 3. Les examens ophtalmiques (lampe à fente, tomographie, électrorétinogramme) qui sont réalisées soit quotidiennement la première semaine pour la tonométrie et la lampe à fente soit 1 fois par semaine. Ces examens ne durent pas plus de 5 minutes par animal. Les animaux seront anesthésiés afin de faciliter l’évaluation et maintenir l’animal immobile. Tous ces examens sont pratiqués chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation et également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ils sont totalement indolores et non invasifs. 4. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures durent moins d’une minute. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

La mise en place d’un fil de suture autour du globe oculaire est un acte chirurgical sans difficulté́ technique pouvant entrainer pour l’animal un léger inconfort notamment à cause de la pression exercée et des frottements. Les pesées hebdomadaires, les contentions quotidiennes et répétées nécessaires pour les observations, le suivi ou les administrations des produits peuvent induire chez l’animal un stress non négligeable bien que ces actes qui ne durent tout au plus que quelques dizaines de secondes soient réalisés par un personnel sensibilisé et formé au bien-être. Il en va de même pour les piqures réalisées notamment pour l’anesthésie des animaux. De l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un inconfort et un stress supplémentaire est attendue, elle sera minimisée par l’utilisation de lampes ou d'armoires chauffantes. L’administration des produits pourraient entrainer l’apparition de signes d’irritation comme des rougeurs et un inconfort. Bien que les travaux publiés ne montrent pas de changement de comportement, d'effet secondaires ou de manifestations de douleur, on ne peut pas exclure que l'affection recherchée, soit l’élévation modérée de la pression intraoculaire, entraine une douleur légère à modérée durant les premières heures qui suivent la mise en place des fils de sutures.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques ; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Les animaux, hébergés par deux au minimum, sont maintenus sur toute la période de l’étude dans un environnement enrichi (bouts de bois, tunnel) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Afin de minimiser au maximum le stress des animaux, le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des animaux tout comme le suivi sanitaire quotidien. Dans le cas de l’administration de produits par injections péri ou intraoculaire, une anesthésie générale sera pratiquée et associée à une anesthésie locale. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum tout comme l'administation si nécessaire d'un analgésique. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement

Choix des espèces

Ce modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques depuis 2015 et est bien caractérisé chez le rongeur. Ce modèle, chez la souris et le rat est relativement facile et rapide à mettre en place chez ces animaux avec une bonne reproductibilité, une bonne fiabilité et relativement peu de nuisances ou d'effets indésirables. De plus, ces animaux ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée.

Une lésion de la cornée pratiquée sur un œil, des gouttes instillées jusqu'à huit fois par jour, des injections dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical, des examens sous anesthésie légère. 2 240 lapins et 2 280 rats vont être utilisés dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, au service à la fois de la recherche, de tests d'efficacité réglementaires et de la formation professionnelle. Le porteur rappelle que la cornée est un tissu "richement innervé et sensible" et attend une gêne ou une douleur de quelques heures après l'induction de la lésion. Tous les animaux ayant suivi la procédure complète sont tués pour les évaluations histologiques et le dosage des produits.

Objectifs

Le but de ce projet est d'utiliser un modèle expérimental de cicatrisation cornéenne consécutif à une lésion de la cornée chez le lapin et le rat. Ce modèle contribuera à participer au développement de substances thérapeutiques qui amélioreront la cicatrisation en luttant contre l’apparition de la fibrose et des opacités. Un modèle expérimental de cicatrisation cornéenne de l’épithélium seul ou de l’épithélium et du stroma a déjà été mis en place dans notre établissement. Le but de cette demande est de pouvoir à nouveau utiliser ces modèles afin de tester l’efficacité de substances thérapeutiques sur l’amélioration de la cicatrisation cornéenne. Les traumatismes de la cornée sont un problème de santé majeur dans le monde et un des principaux motifs de consultation aux urgences ophtalmiques. Les opacités cornéennes sont la quatrième cause de cécité dans le monde. La cornée est le tissu transparent et avasculaire, ne contient pas de vaisseaux sanguins ou lymphatiques, situé en avant de l’œil, elle est finement structurée en trois couches : épithélium séparé par une membrane basale du stroma et un endothélium coté interne. L'organisation des fibres du stroma et l'absence de vaisseaux garantissent la transparence de la cornée. L'épithéllium est en contact avec le film lacrymal et l'endothélium avec l'humeur aqueuse (liquide présent dans la partie antérieure de l'œil entre la cornée et l'iris). La transparence de la cornée, élément crucial pour notre vision, est altérée lors d’une lésion qui peut avoir des origines multiples : infections, traumatismes physique ou chimique, greffes de cornée, complications de chirurgie réfractive au laser pour corriger les défauts de la vision (myopie, hypermétropie, astigmatisme…) ou dystrophies cornéennes (maladies héréditaires entraînant des malformations de la cornée). L’atteinte des différentes couches de la cornée peut aboutir à des réactions cicatricielles au niveau de l’épithélium ou du stroma selon la profondeur de l’atteint, entrainant des apparitions de vaisseaux, des opacités cornéennes permanentes jusqu'à la cécité. Le stroma contient les kératocytes qui secrètent les constituants de la matrice extracellulaire, les kératocytes quiescents se différencient en myofibroblastes activés lors de blessure. L’activation excessive des kératocytes et la présence de fibre de stress dans les myofibroblastes, sont responsables d’une cicatrisation fibreuse générant des opacités.

Bénéfices attendus

Les pathologies de la cornée sont un réel handicap et un problème majeur de santé publique puisqu’elles peuvent conduire à la cécité. Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements réparateurs pour rétablir la transparence de la cornée après un traumatisme.

Procédures

La mise en place de la pathologie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique le jour de l’induction. Les procédures correspondantes décrites en détails dans la partie 4 ne dureront pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, le modèle induit une lésion de la cornée. La cornée est un tissu richement innervé et sensible, un seul œil sera induit. L’induction de la lésion cornéenne devrait entrainer une gêne ou une douleur pendant quelques heures après l’induction. Elle sera soulagée par l’administration d’un analgésique. Nous avons déjà expérimenté ces modèles dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

Les modèles in vitro existants ne permettent pas de recréer un environnement approprié pour conserver simultanément l’épithélium et l’endothélium, les durées de conservation sont limitées, il n’existe pas de modèle de cornée reconstituée complète permettant d’observer la cicatrisation, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétrique ou non paramétrique suivant la distribution des données. Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Les modèles in vitro existants ne permettent pas de recréer un environnement approprié pour conserver simultanément l’épithélium et l’endothélium, les durées de conservation sont limitées, il n’existe pas de modèle de cornée reconstituée complète permettant d’observer la cicatrisation, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Une analgésie sera mise en place lors des procédures d'induction. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.