Recherche appliquée

Tués à la fin de l'expérimentation pour prélever contenu intestinal, foie, muscle, tissu adipeux, sang et cerveau, 650 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 450 mères et petits. 200 rats vivent en cage individuelle pendant six semaines pour la mesure de la consommation alimentaire, avec deux heures de regroupement par jour, et passent jusqu'à sept tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, après des jeûnes de 15 heures et des privations d'eau de 6 heures. Quarante rates sont anesthésiées, séparées de leur portée pendant trois heures et traites à la main après injection d'une hormone, l'opération étant répétée une seconde fois. Le porteur justifie le choix de l'espèce par une recommandation de la FAO citant l'être humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines, l'enjeu déclaré étant l'effet de la végétalisation de l'alimentation.

Objectifs

La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.

Bénéfices attendus

Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.

Procédures

Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.

Impact sur les animaux

Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.

Réduction

A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.

Raffinement

Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.

Pour tester si des composés en développement réduisent une hyperactivité motrice provoquée par des agents perturbateurs, 900 souris et 900 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Sur 24 semaines, chaque animal peut recevoir jusqu'à quatre traitements par jour, subir des prélèvements sanguins quotidiens et passer jusqu'à 14 tests comportementaux de 90 minutes sur animal vigile. Le porteur annonce des convulsions ou des apathies possibles, une hyper-locomotion transitoire provoquée par les inducteurs, et un jeûne de moins de 16 heures avant le prélèvement terminal de sang. Il précise que si un composé induit des souffrances, la modification des doses ou l'arrêt du traitement sera envisagé "en accord avec notre sponsor", et qu'à défaut de solution l'animal sera tué.

Objectifs

L’hyperactivité ou l’hyper-locomotion est un symptôme présent dans plusieurs pathologies neurologiques, comme la schizophrénie, la maladie d’Alzheimer, le trouble déficitaire de l’attention (TDAH) ou le trouble bipolaire pour citer les plus connus. Cette composante des pathologies doit être prise en compte dans leur traitement global car l’impact sur la vie du patient est notable. Bien que ces troubles présentent des mécanismes physiopathologiques distincts, ils partagent une origine commune liée au déséquilibre des circuits neuronaux impliqués dans le contrôle moteur et l'attention. Pour simuler ces pathologies, différents agents perturbateurs sont utilisés qui impactent l'activité motrice. Ce projet a pour objectif de tester l’efficacité des composés en cours de développement préclinique à réduire l’hyperactivité induite chez le rat et la souris.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, quand nous testons des produits en cours de développement, nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter l’hyperactivité. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.

Procédures

Sur 24 semaines de la procédure, les animaux auront un maximum de 4 traitements par jour. Ce nombre de traitement se rapproche des prises quotidiennes chez l’Homme, notamment lorsque les médicaments ne sont pas disponibles sous forme à libération prolongée ou dans le cas de la prise de plusieurs types de médicaments. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins journaliers (ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) afin de pouvoir suivre les paramètres plasmatiques. En parallèle les animaux effectueront un maximum de 14 tests de comportement (90 min chacun) sur animaux vigiles. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée ce temps comprenant systématique une compression finale afin de contrôler l’hémostase.

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement (douleur passagère, irritation, inflammation, induration mâchonnement et de fausse route pour la voie per os). Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. De plus les inducteurs utilisés provoquent une hyper-locomotion transitoire. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mortpour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse de l’hyperactivité nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 animaux. En effet, selon nos données antérieures un effectif de 10 par groupe permet d’obtenir une bonne puissance statistique. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 30 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu. Pour les rats, nous proposons un tunnel en carton afin de leur permettre de se cacher et des boules de bois permettant de jouer et de grignoter. Pour les souris nous proposons un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher, et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les administrations et les prélèvements qui peuvent être réaliser sous anesthésie le seront. De plus, nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si le traitement par le composé à tester induit des souffrances, nous envisagerons, en accord avec notre sponsor, la modification des doses ou l’arrêt du traitement. Si aucune solution n’est possible, l’animal sera mis à mort. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats ou des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (environ 6 semaines et 200-250g pour le rat et 5 semaines et 25g chez la souris). Nous avons fixé cet âge car les mécanismes de l’hyperactivité que nous induisons ne sont pas dépendants de l’âge et d’après nos études antérieures les animaux de cet âge répondent de façon reproductible et robuste au protocole.

9 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir un cathéter jugulaire ou fémoral sous anesthésie, subir jusqu'à huit prélèvements sanguins en 24 heures, des gavages ou injections jusqu'à trois fois par jour, un hébergement individuel jusqu'à dix jours et jusqu'à 48 heures en cage à métabolisme sans enrichissement. La finalité est de mesurer la pharmacocinétique de candidats médicaments, l'effectif étant estimé d'après l'expérience du laboratoire et "le nombre de demandes de nos partenaires". Le porteur reconnaît que les tests in silico et in vitro suffisent à présélectionner les composés, puis conclut que seul un modèle animal permet de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement.

Bénéfices attendus

A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée : Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie o Par voie intraveineuse à la veine caudale ou via le cathéter sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour • Prélèvements de sang : o Via le cathéter : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via la veine saphène ou caudale en microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via ponction cardiaque en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 50 à 150 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Procédure chirurgicale de pose de cathéter jugulaire et/ou fémoral : o 1 anesthésie gazeuse de 30 minutes maximum par animal sur la durée de la chirurgie. o Administration par voie sous-cutanée d’analgésique. Durée 30 secondes sur animaux vigiles ou anesthésié. Unique ou répétée max 2 fois. o Administration unique par voie sous-cutanée de NaCl pour l’hydratation des animaux. Durée 30 secondes sur animaux anesthésié. • Hébergement individuel post-chirurgie ou post traitement : o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière et matériaux de nidification) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 10 jours. o Cage individuelle à métabolisme sans enrichissement avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 48h.

Impact sur les animaux

Au cours des études, - la chirurgie de pose de cathéter sous anesthésie/analgésie peut entrainer une nuisance, douleur et durée modérée - Les administrations et prélèvements sanguins vigiles peuvent entrainer une douleur légère de courte durée par acte, mais la nuisance peut être légère à modérée par la répétition des actes sur une étude, - L’hébergement individuel post-opératoire peut entrainer une nuisance légère de durée modérée ; - Sur certaines études, l’hébergement en cage à métabolisme peut entrainer une nuisance légère à modérée selon la durée. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les cathéters implantés ne sont pas perméables au-delà de 10 jours pour une implantation à la veine jugulaire et 14 jours pour la veine fémorale. De plus, les composés sont testés pour déterminer les profils d’élimination mais ces données ne sont disponibles que bien après la fin des phases in-vivo. De ce fait, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études.

Remplacement

De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Ces tests préliminaires ex vivo évitent le recours à l’animal. Pour la suite du développement des nouvelles entités thérapeutiques, il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux pour les études de pharmacocinétique. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique. L’estimation du nombre de rats utilisés est basée sur l’expérience acquise sur ce modèle et sur le nombre de demandes de nos partenaires. 9000 rats seront prévus sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Après réalisation des chirurgies, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages conformes à la réglementation pour permettre une bonne récupération post-chirurgicale et éviter qu’ils ne s’abiment les sorties de cathéters ou les plaies en cicatrisation. Ces cages seront équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes pour les animaux. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur. De plus, les procédures sont fortement améliorées grâce à l’organisation de formations complémentaires pour le personnel en relation directe avec les animaux sur les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. De nombreuses publications le démontrent. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - Techniques : compatibilité de volume de prélèvement sanguin total chez un même sujet expérimental; - Scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée.

24 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun opéré des deux yeux au cours de la même intervention, puis gardé vivant trois mois avant d'être tué pour l'analyse des greffons. Un chirurgien ophtalmologiste greffe dans chaque cornée un lenticule de stroma décellularisé et lyophilisé, dix minutes par œil. Le porteur affirme que l'intervention est "totalement indolore en post opératoire", tout en annonçant une vision floue pendant 72 heures, une douleur possible les 24 premières heures et un suivi des points limites fondé sur la Rabbit Grimace Scale et le resserrement des paupières. L'application chez l'être humain reste renvoyée à un objectif "à terme", quand la double greffe et la mise à mort à trois mois relèvent, elles, du protocole arrêté.

Objectifs

La cornée est la membrane transparente située en avant de l’oeil. Elle est constitué de plusieurs couches : - L’épithélium, qui constitue la couche la plus externe - La membrane de Bowman - Le stroma - La membrane de Descemet - L’endothélium, la couche la plus interne Les atteintes de la cornée peuvent toucher son épaisseur sur la totalité ou en partie (épithéliale, stromale ou endothéliale). Ces atteintes génèrent une opacité ou une déformation, dans ce cas l’individu devient non voyant et il est nécessaire de réaliser une greffe de cornée, soit sur toute l’épaisseur, soit sur une partie de son épaisseur. Cependant, le nombre de cornées disponibles pour les greffes, le mode de conservation et sa durée reste limités. Dans le but de surmonter les pénuries et les contraintes, d’autres alternatives sont mises en places. Dans le cas où il est nécessaire de réaliser une greffe lamellaire antérieure (stromale) de la cornée, la mise au point de stroma cornéen décellularisé et lyophilisé serait extrêmement intéressante. Cela permettrait de répondre plus aisément aux différents problèmes de conservation, transport, urgence de greffes et disponibilité. En France, le mode de conservation de la cornée d’origine humaine est l’organoculture à +31°C. Cette méthode nécessite des conditions de stockage volumineux et contraignant. Une alternative à l’organoculture est la lyophilisation de la cornée qui permettra une facilité de stockage ( à température ambiante). Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées. Les méthodes d’analyses permettent d’évaluer la conservation de l’intégrité structurale avant et après réhydratation ainsi que sa transparence. Cependant, il reste nécessaire de confirmer la bonne intégration de ces greffes in vivo (chez le lapin) avant une application chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer la compatibilité, l’intégration ainsi que la transparence au sein de la cornée du lapin du lenticule de stroma décellularisé lyophilisé. L’objectif est à terme une application pour la greffe chez l’humain. Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées.

Procédures

Chaque lapin suivra une procédure chirurgicale sur chaque œil d'une durée de 10 minutes soit un temps opératoire de 20 minutes maximum. Cette intervention consiste à greffer des lenticules lyophilisés au niveau de la cornée. Ce geste est réalisé par un chirurgien ophtalmologiste hautement qualifié.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de la greffe de corné chez le lapin sont les même que chez l'humain. Une vision légèrement floue durant les premiers 72h. Une légère douleur pourrait apparaitre durant les 24 premières heures due à l'inflammation engendrée par le geste opératoire.

Devenir

Tous les animaux sont gardés vivant pour une période de 3 mois à la fin de la procédure de greffe des lenticules, puis ils seront mise à mort pour l'evaluation des greffes.

Remplacement

Remplacement : la technique de lyophilisation de des cornées a été mise au point dans notre laboratoire et testée dans de nombreuse conditions in vitro. Aujourd’hui, nous devons confirmer la bonne intégration et la transparence des greffons stromaux lyophilisés sur la cornée animale avant de pouvoir l’utiliser chez l’homme. La dimension et la composition de la cornée du lapin est proche de celle de l'homme, cela permet une insertion plus facile par le chirurgien. De plus, le stroma cornéen sera préalablement décellularisé pour faciliter l’intégration dans la cornée du lapin.

Réduction

Dans le cadre de la règle des 3Rs : Réduction : Chaque lapin sera opéré des deux yeux. Cette intervention n’est pas cécitante, elle est régulièrement pratiquée en médecine humaine et totalement indolore en post opératoire ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés : - L’oeil droit recevra un lenticule dans l'épaisseur du stroma cornéen (INLAY) - L’oeil gauche recevra un lenticule à la surface du stroma cornéen (OVERLAY) Le nombre de lapins utilisé fait référence aux études antérieures et est nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement fiables et interprétables. Nous utiliserons un test de Wilcoxon ou un test Q de Cochran pour l'interprétation de statistique de nos résultats.

Raffinement

L’ensemble des procédures seront effectuées sous sédation profonde monitorée, couplée à une anesthésie locale médiée par un collyre ophtalmique. Les temps opératoires seront très courts maximum 10 minutes par oeil et pratiqué par un chirurgien qualifié. Afin de garantir une parfaite transposition chez l’humain les soins post opératoire seront les mêmes qu’en médecine traditionnelle : -Injection sous conjonctivale d’anti-inflammatoire en fin d’intervention. -Pommade ophtalmique deux fois par jour jusqu’à cicatrisation totale soit 5 à 7 jours. Chaque semaine, des photos seront réalisées sur les yeux afin de suivre la bonne intégration du greffon cornéen. A 3 mois post-greffe les cornées seront prélevées pour analyses histologiques. La manipulation des lapins sera facilitée par des séances d’entrainement récompensée (Fruity bites) durant les deux semaines d’acclimatation pré-opératoire. Des Bunny Block, des briquettes de bois et de luzerne seront disposés dans la cage de façon alterné afin d'assurer l'enrichissement du milieu et de la musique douce sera diffusée quotidiennement. Les points limites seront déterminés en se basant sur le Rabbit Grimace Scale et essentiellement sur l’Orbital tightening.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le lapin new zealand. L’expérimentation proposée est relativement facile chez le lapin car la dimension de la cornée est proche de celle de l’homme et permet à un chirurgien d’insérer les lenticules de 7-8mm de diamètre avec facilité. Les lapins peuvent sous sédation être facilement examinés au biomicroscope pour la réalisation de photos post-opératoires et sont de très bons candidats pour cette mise au point. L’intervention réalisée chez l’homme sous forme de greffe de cornée n’est pas douloureuse et ne nécessite habituellement aucun antalgique. Stade adulte afin que l'oeil de l'animale ait atteint sa taille maximale. Soit 2kg à 2.5 kg 24 lapins seront utilisés 12 pour une correction à 2 lenticules et 12 pour une correcrtion à 3 lenticules.

90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de prostate humaine, passent au scanner puis sous radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant la croissance de la tumeur, avec des injections intrapéritonéales et rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le but est de mesurer la réponse des vaisseaux tumoraux et l'oxygénation du tissu, données recueillies post mortem. Le porteur justifie l'espèce en indiquant que la souris est "le plus petit animal répertorié" sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne tout en autorisant une greffe tumorale suivie deux semaines.

Objectifs

La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans différents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. En effet, lors de la radiothérapie conventionnelle, l'oxygénation tumorale augmente dans les premières semaines de traitement. L'oxygène présent facilite des réactions physicochimiques qui augmentent la destruction des cellules tumorales. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en termes d'oxygénation du tissu tumoral. Le nombre de vaisseaux, la fraction d'aire hypoxique (sans oxygène) et le pourcentage de vaisseaux perfusés seront déterminés post-mortem. La taille des tumeurs sera également suivie. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.

Bénéfices attendus

La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.

Devenir

Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.

Remplacement

Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.

Réduction

La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).

Poids, comportement et aspect du poil servent de points limites déclenchant la mise à mort anticipée. 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. Chaque animal peut recevoir un implant d'œstrogène posé sous anesthésie, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines, huit prélèvements sanguins, cinq gavages au tamoxifène, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des gavages quotidiens pendant jusqu'à trente semaines, plus une ligature vasculaire. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Une étude réglementaire de toxicologie, précédée d'une étude pilote qui sert aussi à former les chirurgiens, doit ouvrir la voie aux essais cliniques d'un produit de thérapie tissulaire d'origine humaine contre la maladie de Parkinson. 150 rats Nude immunodéprimés, 20 pour le pilote et 130 pour l'étude principale, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous seront tués à la fin, ceux de l'étude principale pour l'examen de leurs organes exigé par la réglementation. Après un jeûne la veille, chaque rat reçoit sous anesthésie une injection dans le cerveau, un acte d'environ deux heures trente, et peut présenter ensuite désorientation, perte d'équilibre, hypothermie, douleur, tremblements ou convulsions. Des tests neurocomportementaux, que le texte ne détaille pas, ont lieu avant l'injection puis quatre et vingt-quatre heures après, et le liquide céphalo-rachidien est prélevé sous anesthésie, sans réveil, avant la mise à mort. Le porteur juge "nécessaire" l'immunodéficience partielle des rats pour réduire le risque de rejet du produit d'origine humaine.

Objectifs

Le premier objectif de ce projet est la validation du modèle d’administration intracérébrale chez le rat immunodéprimés (étude pilote), incluant la formation des chirurgiens. Une fois le modèle validé, le second objectif de ce projet est la réalisation d’une étude réglementaire de toxicologie générale (étude principale) chez le rat immunodéprimés. Cette étude consiste en l’administration unique du produit à tester (futur médicament) suivie d’observations régulières des animaux, pesées corporelle, évaluation des effets sur les paramètres sanguins et analyse macroscopique ou histopathologique, évaluation de la toxicocinétique et pharmacodynamique du produit. Cette étude permettra d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit chez l’Homme avant sa mise sur le marché ou d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - la détermination de la tolérance d'un produit de thérapie tissulaire chez l'animal - l'obtention de l'autorisation d'essai clinique et la réalisation d'essai clinique chez l'homme avec le maximum de sécurité pour les personnes incluses - à long terme la mise sur le marché d'une thérapie innovante permettant de traiter les patients atteints de Parkinson

Procédures

Chaque animal aura une procédure d’injection intracérébrale unique, réalisée sous anesthésie générale volatile avec surveillance anesthésique et une antalgie suffisante (durée environ 2h30). Des tests neurocomportementaux sont réalisés (durant le prétest et +4h et 24h postadministration ; durée approximative : 5 à 7 min). Un prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) et de sang seront réalisés en fin de procédure (avant mise à mort), sur animaux anesthésiés (sans réveil) (durée quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures d’administration intracérébrale sont réalisés sous anesthésie, après mise à jeun la veille. Lors du réveil anesthésique, une désorientation/perte d’équilibre, perte de certains reflexes neurologiques ainsi qu’une hypothermie, une douleur post-injection et baisse d’activité (en raison de la durée de la chirurgie) peuvent être observées temporairement. Des évènements anesthésiques liés à l’anesthésie volatile peuvent survenir. Des signes locaux (oedème, ...) au niveau des sites d’administrations peuvent être observés. Des symptômes neurologiques (tremblement, convulsion,…) peuvent être observés à la suite de la procédure d’administration intracérébrale. Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes (tous les animaux n’ont pas toutes les nuisances) : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors de prélèvement de sang. - Anesthésie de quelques minutes et réveil d’anesthésie (incoordination) lors des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie - Stress lors de changement d’environnement lors d’évaluation neurocomportementale : durée du test en lui-même généralement quelques minutes. - Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration du candidat médicament à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Des points limites précoces adaptés sont mis en place afin d’éviter une prolongation inutile des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures sont rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie).

Devenir

Les animaux de l'étude pilote seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de valider la procédure d’administration. Les animaux de l'étude principale seront euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques et microscopiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapies innovantes, telles que la thérapie tissulaire. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intracérébrale aboutit à une exposition de l’animal au candidat médicament et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologique). Dans ces études, un relevé des signes cliniques et des paramètres sanguins des animaux est requis, ainsi qu’une évaluation macroscopique et microscopique des organes il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les guidelines.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique. Afin de réduire ce nombre au minimum, les techniciens ont été préalablement formés en ex-vivo. Le nombre d’animaux dans ce projet est basé sur les guidelines et est le minimum pour pouvoir interpréter et conclure sur l’évaluation histopathologique et l’analyse de biodistribution. Au total, 150 animaux seront utilisés dans ce projet : 20 animaux pour l’étude pilote, 130 animaux pour l’étude principale. L’étude pilote, sur un nombre limité d’animaux, va permettre de mettre au point et valider la technique d’administration intracérébrale et avant le démarrage de l’étude principale, qui a pour but de déterminer la toxicité d’un candidat médicament sur un nombre plus important d’animaux

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation aux conditions environnementales avant le début des procédures. Les rats seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité comportementale, dans des portoirs ventilés avec filtration de l'air, dans des cages sur fond plastique et sur de la litière de cellulose avec un enrichissement adapté (papier kraft, tunnel, …). La procédure d’administration intracérébrale sera réalisée sous anesthésie générale volatile avec surveillance anesthésique. Une analgésie préventive sera mise en place avant et après administration du produit de l’élément d’essai afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. En raison du potentiel impact de l’administration intracérébrale, une évaluation neurocomportementale sera réalisée durant le pretest et après adminisration. De plus, les animaux ont accès a une eau de boisson filtrées et le matériel qui rentre dans l'animalerie est désinfecté. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile et sont évalués par le vétérinaire en cas d'anomalies. Des anti-inflammatoires / antibioiques seront prescrits en cas de signes d'infection locale et/ ou d'hyperthermie sans atteinte neurologique. L'euthanasie sera réalisée si les signes cliniques suivants sont observés : • convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répétées dans la même journée • incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal • atteinte importante du niveau de conscience et vigilance de l’animal • stéréotypie • hyperthermie supérieure à 40°C ne répondant pas au traitement• signes de détresse et/ou douleur

Choix des espèces

Le rat répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Dans le cadre de ce projet des rats immunodéprimés (rat Nude RNU) seront utilisés afin de permettre l’évaluation toxicologique d’un produit de thérapie tissulaire. Une immunodéficience partielle des animaux est nécessaire afin de réduire le risque de rejet en raison de l’origine humaine du produit de thérapie tissulaire. L’ensemble du projet se fera sur jeunes adultes/adultes afin de mimer les futures conditions d’utilisation clinique.

Nourries pendant 6 à 12 mois de régimes enrichis en gras et en sucre, les souris de ce projet doivent développer une stéatose ou une stéatohépatite, et des tumeurs du foie sont attendues. 3168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements post-mortem. Une partie reçoit sous anesthésie une injection intraveineuse qui fait exprimer un gène, une autre passe une échographie du foie sous anesthésie tous les quinze jours, 8 à 12 fois en moyenne, une autre encore subit une chirurgie terminale, et le porteur annonce une prise de poids importante qui peut modifier leur mobilité et leur comportement. L'injection est intraveineuse selon la liste des procédures, sous-cutanée selon celle des effets attendus, qui évoque l'aiguille passant "au travers de la peau et du péritoine".

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris). Une autre partie de ces animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (3168).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

3168 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.