Recherche appliquée

90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales prostatiques humaines, passent un scanner puis une séance de radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant que la tumeur grossit, ce qui peut selon le porteur atteindre leur mobilité et les fatiguer. Les bénéfices annoncés restent en amont de la clinique : établir si les vaisseaux tumoraux répondent à cette radiothérapie ultra-rapide comme à la radiothérapie conventionnelle, et apporter des connaissances utiles à la communauté scientifique. Sur le remplacement, le porteur affirme que "tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait" et que l'oxygénation d'un tissu ne s'étudie que dans un organisme perfusé.

Objectifs

La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans difféerents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en terme d'oxygénation du tissu tumoral. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.

Bénéfices attendus

La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.

Devenir

Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.

Remplacement

Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.

Réduction

La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).

Vingt et un gavages pour 360 souris, sept injections pour 240 autres, 1 200 prélèvements de selles, un rasage du dos et une ponction de la veine submandibulaire : 600 souris sont soumises à ces actes, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage à la canule et un risque d'infection cutanée lié au rasage. Il s'agit d'explorer le rôle de bactéries intestinales et de produits bactériens sur le comportement, chez des souris dont la réponse immunitaire a été altérée par délétion génique. Chaque souris passe une fois chaque test comportemental, pour 145 minutes cumulées d'épreuves sur trois semaines, sans que ces tests soient nommés.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elles sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies manifestées par des symptômes neuro-psychiatriques (Parkinson, dépression, sclérose en plaque). Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans les manifestations comportementales de l’hôte. Des travaux suggèrent que certaines bactéries et des produits bactériens sont responsables de l’apparition de troubles du fonctionnement du système nerveux central . L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes et d’identifier le rôle des bactéries et des produits bactériens dans la régulation du comportement dans un modèle de souris présentant une réponse immunitaire altérée.

Bénéfices attendus

Validation d’un modèle de souris présentant des modifications spécifiques des cellules neuronales sur des récepteurs de l’immunité innée pour l’étude de manifestations neuro-comportementales. Amélioration de la compréhension de l’influence du microbiote sur le comportement de l’hôte sur le comportement. Amélioration de la compréhension de l’impact des voies immunologiques dans les manifestations comportementales.

Procédures

Gavages : 360 souris seront soumises à 21 gavages (quelques secondes) et 240 à 7 injections (quelques secondes) ou au total, correspondant à une intervention par jour selon le protocole. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes par un expérimentateur qualifié. Prélèvement de selles : 2 prélèvements de selles correspondant à un placement dans un pot de récolte pendant 5 minutes maximum pour les 600 animaux, soit 1200 prélèvements. Rasage : les animaux subiront 1 rasage d’identification d’une durée de 10 secondes soit 360 actes de rasages de 10 secondes. Tests de comportement : tous les animaux subiront 1 fois chaque test comportemental dont la durée maximum est de 30 minutes. La durée cumulée d’épreuves comportementale sera de 145 min sur 3 semaines par animal. Prise de sang, durée inférieure à 15 secondes, 1 fois pour chaque animal.

Impact sur les animaux

stress léger induit par le placement dans un pot de récolte pour les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et la pesées des animaux (une fois par semaine). Douleur liée à la piqure et l’injection d’anesthésique et antalgique et des métabolites de l’étude.. Risque de traumatisme de l’œsophage induit par la manipulation de gavage oral à la canule souple pour administration des bactéries de l’étude. stress induit par la mise en conditions expérimentales des tests comportementaux douleurs et stress induit par la contention manuelle et la piqure effectuée par la lancette lors des prélèvements sanguins par ponction de la veine sub mandibulaire : risque de complication cutanée par infection induit par rasage à la tondeuse d’une zone du dos pour l’identification temporaire nécesaire à l’identification pendant l’enregistrement des vidéos.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre de récupérer le sang et les organes à des fins d'analyse scientifique

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant d'évaluer le lien entre l'étât physiologique du microbiote et les processsus cérébraux complexes comme les comportements Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries intestinales, la composition et l’abondance du microbiote intestinal, et des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et comportementales.

Réduction

Nous avons choisi d’utiliser des groupes de 12 animaux en se basant sur les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres comportementaux.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Les animaux sont hébergés dans des cages transparentes permettant des interactions visuelles. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément une fois par semaine au moment de la pesée des animaux. Enfin des points limites adaptés sont définis pour limiter d’éventuelles souffrances.

Choix des espèces

Les animaux auront 6 à 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur le comportement et l’immunologie, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques de comparaison. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné n’existent que dans ce modèle murin.

Après sept jours d'acclimatation, certaines souris reçoivent la veille de l'expérience une injection intraveineuse de moins de cinq minutes dans un premier établissement. Dans un second établissement du même campus, sous anesthésie profonde, elles sont canulées à la trachée et à une veine, et leur muscle crémaster est exposé pour observer la thrombose ou l'inflammation dans les veinules et les artérioles. Au total, 116 souris, dont certaines génétiquement modifiées pour porter une forme inactive d'une isoforme de PI3K, vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces expériences durent "respectivement 4 et 7 heures" selon la description des procédures, et "maximum 6 heures" selon celle des effets attendus. Toutes les souris sont tuées par excès d'anesthésique à la fin de l'expérience, sans reprendre conscience, le porteur indiquant qu'après ces actes invasifs elles "ne pourraient pas survivre".

Objectifs

L’inhibition d’un isoforme de la protéine d’intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité endothéliale et de la barrière vasculaire dans le contexte thrombo-inflammatoire des accidents cardiovasculaires cérébraux. Alors que les souris exprimant une forme inactive ne présentent aucun phénotype apparent, ces souris sont protégées de la perméabilité vasculaire, de l’oedème, de l’infarctus cérébral, et de la réponse inflammatoire délétère. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisé sur deux établissements utilisateurs présents sur le même campus, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire de l’endothélium et sur la thrombose. L’impact de cette isoforme sera évalué en utilisant des molécules inhibitrices candidates générées par nos collaborateurs.

Bénéfices attendus

Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également la formation et la stabilité du thrombus ainsi que sa capacité à emboliser. Ces embolisations sont critiques car elles sont à l’origine des embolies pulmonaires et des accidents cardiovasculaires cérébraux.

Procédures

Dans l'etablissement 1: seule une injection intraveineuse la veille de l'experimentation sera realisée sur certains lots.l'intervention dure moins de 5 minutes. Dans l'etablissment 2 :Les animaux sont, sous anesthésie profonde, canulés aux niveaux trachéal et veineux, avec une exposition du muscle crémaster dans le but de visualiser les veinules et les artérioles afin d’étudier la thrombose ou l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des experimentations qui durent respectivement 4 et 7 heures.

Impact sur les animaux

Les souris exprimant une forme inactive de l’isoforme de la protéine d'intérêt ne présentent pas de phénotype apparent (phénotype non dommageable). Les deux types d’expérimentations sont sans réveil. Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum 6 heures et seront mis à mort par excès d’anesthésique.

Devenir

les procédures utilisées sont invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures, les animaux ne pourraient pas survivre.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.

Réduction

Dans un soucis d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucun résultat significatif n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la molécule d'intérêt, les expérimentations avec les molécules inhibitrices de la protéine d'intérêt ne seront pas réalisées.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture adlibitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçu par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus et le dévelopement d'une inflammation dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Le recours à l'expérimentation animale est donc l'unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans ce contexte. Par ailleurs, nous travaillons avec des souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt (pas de phénotype dommageable). Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures

Les souris de certains lots reçoivent une injection intraveineuse dans un premier établissement la veille de l'expérience, menée dans un second établissement du même campus. 116 souris, dont certaines génétiquement modifiées pour porter une forme inactive d'une isoforme de PI3K dans tout le corps ou dans les seuls vaisseaux sanguins, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Sous anesthésie profonde, pendant une procédure qui peut durer six heures, elles sont canulées à la trachée et à une veine, et leur muscle crémaster est exposé pour observer la thrombose et l'inflammation dans les veinules et les artérioles. Le porteur qualifie d'"irremplaçable" le recours à la souris, en invoquant des mécanismes "non modélisable par des approches in vitro" et des inhibiteurs qu'il souhaite "valider in vivo".

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer l’impact d'une protéine d'intérêt sur les propriétés antithrombotique et anti-inflammatoire des vaisseaux sanguins autres que ceux du cerveau. L’inhibition d’une protéine d'intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité des vaisseaux dans le contexte de l'accident vasculaire cérébral. Alors que les souris exprimant une forme inactive de cette protéine ne présentent aucun phénotype apparent, ces souris sont protégées de la perméabilité vasculaire, de l’œdème, de l’infarctus cérébral, et de la réponse inflammatoire délétère. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisée sur deux établissements utilisateurs, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire de l’endothélium et sur la thrombose Pour ce projet nous utiliserons un modèle murin qui exprime une forme inactive de la protéine d’intérêt dans tout l’organisme ou uniquement au niveau des vaisseaux sanguin. L’impact de cette protéine sera également évalué en utilisant des molécules stoppant la fonction de la molécule d'intérêt. Ces molécules seront générées par nos collaborateurs.

Bénéfices attendus

Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également la formation et la stabilité du thrombus ainsi que sa capacité à emboliser. Ces embolisations sont critiques car elles sont à l’origine des embolies pulmonaires et des accidents cardiovasculaires cérébraux.

Procédures

Dans EU 1: seule une injection intraveineuse la veille de l'experimentation sera realisée sur certains lots. Dans EU2 :Les animaux sont, sous anesthésie profonde, canulés aux niveaux trachéal et veineux, avec une exposition du muscle crémaster dans le but de visualiser les veinules et les artérioles afin d’étudier la thrombose et l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et seront euthanasiés à la fin de l'experience .

Impact sur les animaux

Les souris exprimant une forme inactive de l’isoforme de la protéine d'interet ne présentent pas de phénotype apparent (phénotype non dommageable). Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum 6 heures et seront mis à mort.

Devenir

les procédures utilisées sont invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures, les animaux ne pourraient pas survivre.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.

Réduction

Dans un soucis d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d'experimentations supplémentaires. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucun résultat significatif n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intêret, les expérimentations avec les molécules inhibitrices de molécule d'intêret ne seront pas réalisées.Pour éviter toute influence de l’expérimentateur sur les résultats les expériences sont réalisées en aveugle (anonymisation des échantillons et des animaux par un autre expérimentateur).

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture adlibitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçu par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié.

Choix des espèces

Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture adlibitum dans un portoir ventillé dans des cages de 482 cm2 de surface. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Pour les deux types d’expérimentation (thrombose et inflammation), les souris sont anesthésiées Les expérimentations d’évaluation anti-inflammatoire pouvant se prolonger jusqu’à 6 heures, nous avons fait le choix de traiter les souris avec un analgésique supplémentaire et différents déjà inclus dans le mélange initial d'anesthesie. L'anesthesie est maintenue par un ajout minuté en intraveineux durant toute la procedure.. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures

L'objet réel de ce projet est de nourrir avec du sang de lapines vivantes un élevage de tiques que l'unité entretient depuis quinze ans. 10 lapines vont être utilisées sur cinq ans, cinq tuées et cinq adoptées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tiques restent fixées sur leurs oreilles quatre à sept jours, sans anesthésie ni pendant la pose ni les jours suivants, et chaque lapine sert trois fois en quatre mois pour couvrir un cycle complet du parasite. Le devenir dépend du caractère de l'animal, celles que le porteur juge trop agressives seront tuées après avis du vétérinaire, les plus dociles proposées à des particuliers.

Objectifs

L’élevage des tiques est bien établi dans l’unité depuis 15 ans. L’objectif principal de ce projet est d’établir et de maintenir des élevages de tiques qui sont les vecteurs de certaines maladies humaines et animales et d’étudier le rôle des tiques dans l’acquisition et la transmission de certains microorganismes aux humains et aux animaux.

Bénéfices attendus

Cet élevage permettra de maintenir des espèces de tiques nécessaires pour différents projets de recherche évaluant les interactions entre les pathogènes et les vecteurs (tiques) pour la compréhension de la transmission des maladies humaines et animales (zoonose).

Procédures

Une lapine sera utilisée pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (oeufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Les lapines ne sont pas anesthésiées ni durant la pose des tiques, ni les jours suivants. Les tiques restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont dues à la piqure des tiques qui restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement de la tique. Cette fixation provoque des lésions peu importantes et parfois des démangeaisons.

Devenir

Les animaux qui sont trop agressifs pour être adoptés et ceux qui auront d’autres anomalies seront euthanasié après avis du vétérinaire de notre laboratoire. Par contre, les animaux en bonne santé et les moins agressifs seront adoptés pas des particuliers.

Remplacement

Les tiques sont des acariens strictement hématophages à tous les stades de développement. Actuellement, aucune alternative de remplacement des lapins pour l’engorgement des tiques n’est disponible, malgré les différents essais que nous avons réalisé dans notre laboratoire pour gorger les tiques sur des membranes artificielles comme c’est le cas des moustiques, puces, punaises de lit et triatomes que nous élevons également au sein de notre laboratoire.

Réduction

Un lapin sera utilisé pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (œufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 3 à 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Un lapin sera donc utilisé 3 fois/an/espèce de tiques. Donc, seulement 2 lapins seront utilisés par an (un pour chaque espèce de tiques de notre élevage) soit 10 lapins pendant la durée totale de ce projet (60 mois).

Raffinement

Pendant la période d’engorgement nous allons proposer le gel Diet Energy de Safe dites qui est un aliment hydraté contenant 63% d’eau. Après engorgement des tiques les oreilles des lapins seront nettoyées avec de la bétadine et les jours suivants jusqu’à guérison des lésions causées par les tiques. Les lapins sont visités chaque jour y compris les week-end et jours fériés pour s’assurer que les animaux ont de la nourriture et de l’eau. Ils seront manipulés en dehors des procédures expérimentales, dans un espace calme, par du personnel formé et habitué. Les cages de chaque lapin seront enrichies avec des foins, des jouets en bois.

Choix des espèces

Le lapin (New Zealand) est l’espèce animale la plus appropriée pour nourrir les trois stades de développement des tiques, compte tenu du fait que c’était l’espèce qui a été utilisée pour adapter et établir un élevage des tiques au laboratoire. Ces lapins sont de grande taille à l'âge adulte, ils sont dociles et donc faciles à manipuler, ce qui est un avantage. Ce projet n'inclura que des lapins adultes en raison de leur taille. La taille des adultes permettra de les manipuler facilement et de nourrir plus de tiques sans utiliser d'animaux supplémentaires. La grande taille des oreilles permet un nourrissage d'un grand nombre d'individus. De plus, cette taille d'oreille nous permet une fixation facile des chaussettes et carcans.

Une perte de 25 % du poids, ou un score de douleur de huit à neuf sur la grille du laboratoire, déclenche la mise à mort. 313 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome mitochondrial rare, elles sont suivies de la naissance jusqu'à deux ans, avec prélèvements sanguins et urinaires à un, deux, quatre et six mois, tests de force et d'endurance et séances d'IRM et d'échocardiographie sous anesthésie aux mêmes âges. Le porteur attend un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire, et présente ce travail comme l'étape préalable au test de candidats médicaments déjà repérés sur des cellules de patients.

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - les symptômes de la maladie retrouvés dans le modèle murin sont équivalents à ceux retrouvés chez l'homme suggérant qu'un candidat médicament efficace dans le modèle murin le sera également chez l'homme Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.