Recherche appliquée

80 rats vont être utilisés, chacun passant trois fois la même série, deux tests moteurs et une prise de sang sous anesthésie, avant puis à deux reprises après une chirurgie du cerveau qui induit une forme de maladie de Parkinson. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et tous les rats sont tués à la fin pour prélever leur cerveau. Selon la méthode d'induction, ils peuvent présenter une baisse de motivation, ou des déficits moteurs qui gênent leurs déplacements et leur alimentation et s'accompagnent d'une perte de poids. Le texte ne nomme ni les deux tests moteurs ni ce qui provoque la maladie pendant l'opération de 45 minutes. Les retombées pour les patients, un diagnostic précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques, dépendent de composés encore à identifier, alors que chaque rat subit l'opération du cerveau.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre les modifications précoces qui accompagnent la progression de la maladie de Parkinson dans deux modèles animaux complémentaires, chacun mimant des caractéristiques pathologiques et des stades différents de la maladie.

Bénéfices attendus

Outre une meilleure connaissance des modifications comportementales et du métabolisme (ensemble des transformations chimiques et biologiques qui s'accomplissent dans l'organisme) qui accompagnent la progression de la maladie de Parkinson, cette étude permettra l’identification de composés biologiques qui serviront de marqueurs de la pathologie et favoriseront le diagnostic précoce de la maladie pour une prise en charge optimale des patients, mais également l’identification de composés biologiques qui pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux tests moteurs (l’un de 10 minutes le premier jour, l’autre d’une heure le deuxième jour) et un prélèvement sanguin (le 3ème jour, sous anesthésie générale, durée de 5 minutes) avant induction de la maladie par chirurgie du cerveau (durée de la chirurgie : 45 minutes). Puis les animaux seront à nouveau soumis à ces mêmes tests moteurs et prélèvement à deux temps différents à distance de la chirurgie (une et quatre semaines pour un modèle et trois et dix semaines après pour l’autre modèle).

Impact sur les animaux

Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.

Raffinement

Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ils sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront un à trois mois.

Séparées de leur mère pendant vingt-quatre heures au neuvième jour de vie, en hypoglycémie, en hypothermie et en état de stress, les souris de ce projet reçoivent ensuite, à partir du soixante-troisième jour, une injection quotidienne de psychotrope pendant deux semaines. 646 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent les traitements, dans l'eau de boisson pendant trente jours ou par injection abdominale pendant quatorze, puis une roue d'activité pendant quatre semaines, puis les tests comportementaux, activité locomotrice, labyrinthe d'anxiété, mémoire de travail, réflexe de sursaut, reconnaissance d'objet, interactions sociales. 500 souris sont tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, les 146 autres partent vers d'autres projets, dont 86 femelles gestantes et 60 utilisées comme stimulus social.

Objectifs

Affectant près de 1% de la population, la schizophrénie est une maladie psychiatrique fréquente hautement handicapante du fait de la triade de symptômes qu’elle engendre : symptômes positifs (hallucinations, idées délirantes), négatifs (repli social, émoussement affectif) et cognitifs (déficits de mémoire, d’attention). La prise en charge thérapeutique des patients schizophrènes est incomplète car les déficits cognitifs et les symptômes négatifs sont encore mal pris en charge par les antipsychotiques actuels. Par ailleurs, ces traitements ont de nombreux effets secondaires et environ 30% des patients y sont résistants. La mise au point d’approches thérapeutiques innovantes est donc un enjeu majeur de santé publique. L’étiologie de la schizophrénie reste inconnue, cependant, l’hypothèse majoritaire est qu’elle serait d’origine multifactorielle, impliquant une interaction entre facteurs génétiques et environnementaux. Ce projet se positionne dans le développement d’un nouveau modèle murin associant trois facteurs (vulnérabilité génétique, stress précoce et consommation de psychotrope) qui sera tout d’abord caratérisé d’un point de vue comportemental. Dans la deuxième partie du projet, des traitements d’intérêt (molécules et activité physique et leur combinaison) seront évalués.

Bénéfices attendus

L’un des objectifs de cette étude est d'examiner, d’une part, la validité d’un nouveau modèle animal d’un point de vue comportemental (caractérisation de déficits dans des tests modélisant les différents symptômes de la pathologie) puis post-mortem (modifications cérébrales qui seront corrélées aux modifications comportementales) puis de tester les effets de différentes stratégies thérapeutiques médicamenteuses ou non et leur combinaison. Ce projet a pour ambition de proposer des améliorations dans la prise en charge des patients souffrant de schizophrénie : non seulement des traitements pharmacologiques adjuvants aux traitement actuels et qui ne recouvrent pas l’ensemble des symptômes, mais aussi des traitements non-pharmacologiques basés sur l’activité physique spontanée. En effet, l’activité physique pourrait constituer un moyen efficace pour lutter contre la sédentarité de ces patients et les problèmes de santé associés, mais aussi pour lutter contre les effets secondaires des traitements chroniques et améliorer le fonctionnement cérébral en stimulant les phénomènes de plasticité. Il trouve donc une application certaine santé humaine.

Procédures

Dans un premier temps, les souris seront séparées de leur mère durant 24h à l’âge de 9 jours. Puis, à l’âge de 63 jours, les mêmes animaux recevront une administration quotidienne durant 14 jours d’un psychotrope par voie sous-cutanée. Chaque injection nécessite une contention de l’animal et prendra environ 1 minute par souris. Une partie des animaux sera ensuite soumise à des traitements pharmacologiques dans l’eau de boisson pendant 30 jours et/ou administration par injection intrapéritonéale pendant 14 jours, ou non-pharmacologiques (mise à disposition d’une roue d’activité accessible par un petit tunnel à partir de la cage d’hébergement pendant 4 semaines). Les animaux vont ensuite réaliser plusieurs tests comportementaux afin, tout d’abord, de mesurer leur activité locomotrice/exploratrice (1fois, 30 minutes), leur niveau d’anxiété (1 fois 5 minutes dans un labyrinthe), les performances de mémoire de travail (1 session de 5 minutes). D’autres tests seront également réalisés afin d’évaluer le réflexe de sursaut (1 session de 25 min), les performances de mémoire de reconnaissance d’objet et enfin de mesurer les interactions sociales (1 session de 5 minutes suivie de 2 sessions de 10 minutes. A l’issue de l’expérimentation comportementale, la moitié des animaux seront exposés à une procédure de mise à mort menée sous analgésie et anesthésie profondes d’une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Lors de la séparation maternelle de 24h, les animaux sont en état d’hypoglycémie, d’hypothermie et de stress psychologique (nuisance modérée). Une légère perte de poids transitoire peut être observée suite à la séparation et une augmentation de l’anxiété à l’âge adulte peut être observée, il s’agit d’un état prévu à la suite de cette manipulation qui fait partie de la modélisation. Les animaux recevront des injections quotidiennes (durée d’injection : environ 1 minute, durant 14 jours d'une molécule qui induit des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.) et qui sont la base du modèle de cette pathologie (nuisance modérée). Il ne s’agit pas à proprement parler de douleur mais d’une certaine déstabilisation du fonctionnement du cerveau qui peut induire une certaine angoisse. Une partie des animaux sera ensuite soumise à des traitements pharmacologiques dans l’eau de boisson pendant 30 jours (nuisance légère) et/ou administration par injection intrapéritonéale pendant 14 jours (nuisance modérée). Enfin, un certain niveau de stress sera possiblement ressenti aux tests comportementaux qui seront réalisés (nuisance légère).

Devenir

Une partie des animaux des procédures (500 souris) seront mis à mort après les études comportementales. Le cerveau de ces animaux sera prélevé pour des exploitations scientifiques (analyses électrophysiologiques ex vivo, quantification de différents marqueurs associés à la schizophrénie) Les souris restantes seront réutilisées dans d’autres projets (86 souris gestantes + 60 souris stimulus).

Remplacement

Ce projet se positionne sur le développement d’un nouveau modèle de schizophrénie pour tester par la suite une approche thérapeutique innovante pour traiter les symptômes non pris en charge par les traitements actuels. S’agissant d’études comportementales faisant appel à des fonctions cérébrales très intégrées, aucun modèle in vitro ne peut remplacer, à l’heure actuelle, l’utilisation des animaux vivants dans notre projet. De plus, il n’existe aujourd’hui qu’une seule espèce où le génome a été modifié pour porter la délétion du gène de la sérine racémase, la souris.

Réduction

Toutes les procédures incluront des mâles et des femelles. En effet, les recommandations récentes concernant la recherche sur la schizophrénie ont souligné l’importance d’évaluer les deux sexes dans la mise au point de modèles précliniques. En effet, la schizophrénie touche aussi bien les hommes que les femmes avec des différences en termes d’intensité des symptômes et d’âge d’apparition. De plus, nous souhaitons tester un potentiel nouveau traitement, qui a pour but final d’être efficace aussi bien chez les femmes que chez les hommes, donc nous souhaitons d’emblée tester des femelles et des mâles. Nous nous attendons à observer des différences entre les deux sous-populations. Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en fonction du niveau d’effet attendu a priori pour les études comportementales, pour obtenir une puissance statistique suffisante. Une analyse statistique sera réalisée a posteriori via l’utilisation de tests statistiques adaptés afin de comparer les données obtenues.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages contenant un igloo en papier mâché et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine (habituation au cycle inversé jour / nuit), puis seront manipulés et pesés durant 1 semaine avant de débuter les expérimentations et régulièrement durant la durée totale de chaque expérimentation afin de les habituer au contact humain. De plus, au moins 30 min avant le début de chaque test, les animaux seront placés dans la pièce d’expérimentation pour leur permettre de s’habituer à l’environnement. L’accès à une roue constitue aussi un enrichissement par rapport aux cages standards, en augmentant l’espace disponible pour les animaux et en leur permettant de faire de l’activité physique volontairement. Un traitement pharmacologique sera administré dans l’eau de boisson, ce qui réduit le stress des animaux par rapport à un traitement par gavage ou par injection. Enfin, l’utilisation d’anesthésique volatil et d’analgésique sera effectuée pour l’implantation des puces et la mise à mort. Par ailleurs des points limites précis seront mis en place afin de déceler le plus précocement possible un état de souffrance ou de détresse des animaux.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus). Il s’agit comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. Son comportement est bien connu et décrit dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, exercice physique, réflexe de sursaut, activité spontanée). Par ailleurs, notre modèle comprend une composante génétique (mimant la prédisposition génétique, bien démontrée chez l’homme), or, il n’existe à l’heure actuelle aucune autre espèce animale disponible qui porte la délétion du gène codant pour la sérine racémase. Les animaux seront testés une fois devenus adultes entre 84ème et le 114ème jour post-natal, correspondant chez l’Homme à la période symptomatiques. Avant ces tests, des étapes sont nécessaires : - Séparation maternelle au 9ème jour de vie post-natale, mimant un stress environnemental précoce, facteur de risque de la pathologie - Exposition subchronique à une drogue durant l’âge jeune adulte (du 63ème au 76ème jour), période caractérisée par une exposition accrue aux substances psychotropes chez les patients Les études en électrophysiologie et immunohistochimie seront réalisées post-mortem.

Une injection sous la peau de la patte ou de la face suffit à provoquer chez eux une inflammation, puis une hypersensibilité douloureuse au toucher. 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués sous anesthésie profonde pour prélever les tissus nerveux. L'objectif est de comprendre comment cette inflammation dérègle un canal des astrocytes, un travail qui prolonge des résultats déjà obtenus au niveau trigéminal. Le porteur programme sept séances de tests comportementaux de trente-cinq minutes chacune, sans dire lesquels, et qualifie ces mesures de peu douloureuses puisque l'animal peut retirer sa patte.

Objectifs

Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la genèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Les objectifs de ce projet est d'étudier si il y aussi une dérégulation en condition inflammatoire au niveau de la patte et de la face.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 1 : Injection sous-cutanée (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face ou de la patte selon le modèle). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.

Remplacement

L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tous ces éléments. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après les données antérieures le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux sont stabulés de façon à avoir un enrichissement social. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à partir de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale d'anestésique sous sédation profonde. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Enfin, comme énoncé précédemment, ce projet fait suite à d'autres études et doit donc être réalisé sur la même souche de rat. Pour les expériences comportementales et l'étude protéique, nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 8 semaine, comme dans les projets précédents (125g à 250g).

Infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, après implantation d'une puce de télémétrie dans le dos et trois prises de sang à la joue, 70 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend des symptômes généralisés et une perte de poids, sans mortalité, avec une guérison en quatre jours. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever les poumons, la rate et le sang, l'essai visant à confirmer in vivo trois anticorps neutralisants identifiés par séquençage de répertoires immunitaires et intelligence artificielle. Leur pouvoir neutralisant équivaut, écrit-il, à celui du seul anticorps encore efficace sur les variants circulants, dont la vente est restreinte aux États-Unis.

Objectifs

L’utilisation d’anticorps monoclonaux issus de patients ciblant les protéines de surface d’un virus a déjà fait ses preuves dans la lutte contre le SARS-CoV-2. Cependant, l’émergence de nouveaux variants viraux d’intérêt dont le variant Omicron, compromet la bonne efficacité des anticorps monoclonaux utilisés en thérapeutique. Ainsi, il est nécessaire d’apporter régulièrement des évolutions thérapeutiques avec le développement d’anticorps à activités neutralisantes plus larges. Nous avons identifié des anticorps dirigés contre le SARS-CoV-2 à partir de séquençages de répertoires immunitaires de patients infectés et guéris de la COVID-19 combinés aux technologies d’Intelligence Artificielle développées par une entreprise. Nos travaux se focalisent particulièrement sur l’obtention d’anticorps neutralisants de large spécificité qui conservent leur efficacité sur les nouveaux variants d’intérêt du SARS-CoV-2 en circulation ou à venir. Dans ce cadre, trois anticorps à très forte affinité et à haut pouvoir neutralisant ont été identifiés, avec la capacité de neutraliser différents variants du SARS-CoV-2, et ciblant chacun des épitopes différents de la protéine virale S. Leur capacité neutralisante est équivalente à celle d'un autre anticorps commercialisé (unique) encore efficace sur les variants circulants actuels et dont la vente est restreinte aux USA. Ainsi, le fort pouvoir neutralisant de ces 3 anticorps en fait de bons candidats à visée thérapeutique. Il nous semble nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ainsi, nous nous attendons à ce que ces 3 anticorps injectés à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 initient une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de symptômes, comme attendu avec un anticorps thérapeutique à visée clinique.

Bénéfices attendus

La validation des anticorps thérapeutiques testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’ameliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19. Cela permettra également de confirmer le processus d’identification rapide in silico d’anticorps thérapeutiques développé par notre groupe d’étude lors d’une nouvelle émergence virale de coronavirus ou d’une virose inconnue (virus X) comme soutenu par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS).

Procédures

Tous les animaux, soit 70 souris. Une puce dorsale d’identification et de télémétrie sera injectée en sous-cutané pour une souris (12 minutes par animal, une fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Inoculation des anticoprs thérapeutiques ou placebo par voie intra-péritonéale sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique neutralisatante des anticorps. (5 minutes par animal, 1 fois). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale en voie intra-péritonéale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois). Prélèvements nasaux sous anesthésie gazeuse. L'objectif est d'analyser la réponse immmunitaire mucosale (5 min, 2 à 3 fois par animal).

Impact sur les animaux

Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptomes généralisés mais sans mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire est attendue suivi d’une guérison totale au bout de 4 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations du sensor télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, rate, swab, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution pour remplacer ce modèle murin qui permettra de restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain. Ce modèle de souris transgéniques a été mis au point spéicifiquement afin de pallier les difficultés rencontrées avec les précédents modèles animaux et en absence de méthode alternatives . Le modèle de souris transgénique est bien décris dans la littérature développant la pathologie attendue et induisant une réponse immunitaire, afin répondre aux attentes du projet sur la protection antivirale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base de l’étude de la réponse immunitaire et virale.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, aus sein d'une animalerie confinée, en isolateur durant l'infection infection expérimentale. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les souris sont anesthésiées par injection par voie intra-péritonéale avant chaque instillation intranasale. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type graines de Tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.

Quinze minutes le nez maintenu au contact d'un aérosol de bacilles de la tuberculose, puis un gavage d'antibiotique cinq jours par semaine pendant quatre semaines : 5940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour compter les bactéries dans leurs organes. L'objet réel du projet est bactérien, il s'agit de savoir quelles fonctions permettent au bacille de survivre à la fois au traitement et à la réponse immunitaire, la souris fournissant le lieu de l'infection. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit les granulomes des phases tardives et que le modèle animal reste "incontournable". Les bénéfices annoncés, des traitements plus courts et plus efficaces, restent au conditionnel, l'infection de près de six mille souris étant, elle, planifiée sur cinq ans.

Objectifs

La tuberculose reste un problème majeur de santé publique dans le monde entier. Cette maladie se caractérise par la persistance des bacilles de la tuberculose chez l’hôte et la longueur des traitements antibiotiques. Plusieurs résultats suggèrent un lien entre la tolérance bactérienne aux médicaments, c'est-à-dire la capacité à supporter certains niveaux d'antibiotiques pendant un certain temps, et la capacité bactérienne à résister à la réponse immunitaire de l'hôte. Cependant, les études qui font le lien entre ces deux domaines manquent cruellement. Nous proposons ici d'explorer les fonctions et les adaptations importantes pour survivre au traitement médicamenteux et à la réponse immunitaire de l'hôte chez les bacilles de la tuberculose. Notre objectif est d’évaluer si cibler des fonctions importantes pour la persistance chez l’hôte et la tolérance aux antibiotiques permet une meilleure efficacité des traitements et une élimination plus rapide des bacilles. Dans des travaux antérieurs, nous avons sélectionné des mutants de bacilles de la tuberculose présentant une persistance accrue chez la souris. Nous avons constaté que la tolérance à l’isoniazide et la rifampicine, deux antituberculeux utilisés en clinique, était également accrue chez ces mutants. Dans un premier temps, nous avons entrepris de caractériser les mutations responsables et les mécanismes moléculaires sous-jacents. Nous construirons ensuite des souches recombinantes de bacille de la tuberculose dans lesquels les gènes identifiés seront soit inactivés soit placés sous contrôle d’un promoteur inductible à la doxycycline. Enfin nous évaluerons dans le modèle souris l'effet synergique des médicaments et de l’inactivation de ces gènes. Les résultats attendus devraient mettre en lumière les caractéristiques mycobactériennes expliquant la pandémie actuelle de tuberculose et fournir des perspectives intéressantes pour le contrôle de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur la tolérance aux médicaments chez les bacilles de la tuberculose et le lien entre la tolérance et la persistance chez l’hôte traité ou non-traité. Les résultats attendus devraient également fournir des informations sur l'effet synergique de la réponse immunitaire et des antibiotiques sur des souches recombinantes altérées pour la tolérance aux médicaments. Ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques intéressantes contre la tuberculose dans le but de réduire la durée des traitements et d’augmenter leur efficacité.

Procédures

Les animaux seront infectés avec des bacilles de la tuberculose. Pour cela, les souris seront maintenues dans des chambres individuelles de contention permettant de maintenir le nez de la souris en contact avec l’aérosol. Cette opération dure 15 minutes. Certains groupes d'animaux recevront 5 jours par semaine pendant 4 semaines maximum une dose d’antibiotique donnée par gavage.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus à deux niveaux dans nos expériences: 1) lors de l’infection des animaux, et 2) lors des traitements antibiotiques . Pour le 1er niveau, il s’agit de nuisances modérées (contention) d’une durée d’environ 15 min. Enfin, concernant les antibiotiques, les animaux subiront une contention de quelques minutes 5 jours sur 7 pendant 2 ou 4 semaines. L’impact de cette manipulation sur le bien-être des animaux sera évalué lors d’expériences préliminaires.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes, tel que les bacilles de la tuberculose. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de l’infection telles que la persistance ou la transmission. Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire les granulomes rencontrés dans ces phases tardives et d’étudier la réponse bactérienne aux stress rencontrés dans ceux-ci. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle pour ces études. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’humain. Dans ce projet, les souches mutantes de Mycobacterium tuberculosis seront testées au préalable in vitro et dans des modèles cellulaires mimant les étapes précoces de l'infection. Le modèle souris sera utilisé en cas de résultats positifs pour mimer les étapes tardives.

Réduction

Les différentes phases du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.

Raffinement

Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et administration des antibiotiques, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces. L’expérience implique un traitement antibiotique quotidien (5 jours sur 7). Nous réaliserons deux expériences préliminaires pour évaluer le stress et la contrainte sur les animaux et choisir la voie d’administration la moins contraignante pour les animaux tout en permettant d’observer l’effet des antibiotiques. Au cours de ces expériences préliminaires, nous déterminerons aussi le temps le plus précoce auquel un effet des antibiotiques est détecté

Choix des espèces

Pour notre projet visant à explorer le lien entre tolérance aux antibiotiques et persistance chez l’hôte par le biais de l'étude de souches bactériennes mutantes, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistance variable à la pathologie , ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard sept jours après le début de la procédure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une seule administration du composé, une injection dans l'abdomen ou un gavage de trente secondes, et son sang comme ses organes sont prélevés après la mise à mort. Le projet ne mesure pas l'efficacité de la molécule mais son trajet dans le corps, absorption, diffusion, élimination, afin de choisir la dose et la voie des futures études sur des souris atteintes de cancers du sang. Le porteur indique avoir calculé l'effectif par groupe avec des logiciels statistiques reconnus, sans dire combien de groupes il prévoit ni ce qui conduit à 370 animaux.

Objectifs

Les cancers hématologiques comme les leucémies, les myélomes et les lymphomes, sont des cancers qui se développent à partir de cellules du sang. En France chaque année, 33 000 personnes sont touchées par ces pathologies, en particulier les enfants, jeunes adultes et personnes âgées. Ils représentent 7% des cancers. Les traitements des cancers hématologiques peuvent entrainer un certain nombre d’effets indésirables et leur efficacité diffère selon les patients. Malgré ces traitements, l’espérance de vie des personnes touchées par ces types de cancer varie de 2 à 5 ans après le diagnostic. Nous nous intéressons dans ce projet à un potentiel nouvel agent anticancéreux : une petite molécule qui a montré lors de précédentes études, un effet prometteur sur des cellules de cancers hématologiques. Cette molécule ou composé est capable d’être internalisé par les cellules, et d’empêcher l’interaction de différentes molécules, ce qui permet de perturber la survie et la prolifération des cellules tumorales puis de jouer sur leur résistance à différents stress cellulaires. Une étude de ce composé a déjà été réalisé au préalable chez la souris, celle-ci avait pour but de définir sa tolérance par l’animal selon les modes d’administration. Ayant connaissance de ces informations, le présent projet vise à étudier le devenir de ce composé dans l’organisme une fois administré. Différentes voies d’administrations, différentes doses seront testées chez l’animal et une analyse du composé dans le plasma au cours du temps, nous permettra alors d'étudier au bout de combien de temps celui-ci est-il est détectable dans le sang, la quantité maximale que l'on va pouvoir atteindre et au bout de combien de temps il va être éliminé. L’objectif principal étant alors grâce à ces informations, de conclure quant à la voie et la fréquence d’administration, ainsi que la dose, qui seront préférées pour de futures études d’efficacité de ce traitement sur des souris atteintes de cancers hématologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il y a encore aujourd’hui des patients atteints de cancer hématologiques réfractaires aux traitements sur le marché. L’étude va permettre de développer de manière préliminaire une nouvelle molécule qui permettra au mieux de guérir les patients atteints de ce type de cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Administration des traitements : contention et injection des composés en intrapéritonéal (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes) ou en gavage (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes). Les prélèvements de sang et d'organes sont réalisés en post-mortem.

Impact sur les animaux

Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille lors de l'injection intrapéritonéale. Les administrations par voie orale avec sonde de gavage génèrent un stress de quelques secondes lors de la contention. Aucun signe de toxicité particulière lors de l'administration du composé aux doses testées dans ce projet n'ont été observé chez la souris lors de l'étude préalable de tolérance.

Devenir

Tous les animaux auront été mis à mort au plus tard 7 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin de pouvoir réaliser les prélèvements prévus dans la procédure.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation de notre composé d’intérêt ont été réalisées (études de cytotoxicité) ayant permis de sélectionner les types de cancer sur lequel il serait le plus efficace. Ensuite, le passage chez la souris a permis l’évaluation de sa tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans l’organisme nécessitent d’être étudiés et définis sur l’organisme vivant sain avant de tester dans de projets futurs son efficacité sur organisme malade. Pour cette raison nous devons effectuer cette étude sur la souris.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude préliminaire qui permettra de définir le cheminement du composé dans l'organisme. Pour la comparaison des quantitiés maximales du composé dans le plasma entre chaque groupe traité, nous utiliserons un test statistique fiable à multiple comparaisons. Pour le choix du nombre de souris par groupe qui nous permettra de pouvoir observer des différences entre les groupes et de choisir la dose ainsi que le mode d'administration les plus adéquats chez la souris, nous avons utilisé des logiciels statistiques reconnus. Les résultats de ce projet seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les souris seront observées tous les jours par le personnel de l'animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et 7 jours sur 7 dans le cadre de ce protocole par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Pour les groupes dont le composé ou le véhicule sera administré par voie orale en gavage, des sondes de gavages en plastique flexibles évitant l'irritation et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

Afin de plus tard développer cette molécule thérapeutique chez l'Homme, nous devons au préalable observer son devenir dans l'organisme chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées chez le chien ou le primate. Pour ce faire, nous souhaitons étudier les paramètres pharmacocinétiques qui correspondent à : son absorption, sa distribution, sa métabolisation et son élimination en analysant les quantités de celui-ci dans le sang à différents temps après injection, dans les deux sexes chez la souris non consanguine. Les souris non consanguines sont utilisées pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments. Ainsi, les souris non consanguines présentent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressantes pour les études de tolérance. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.

2 880 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois administrations par jour pendant trois semaines et subir six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, 2 700 souris sont tuées et 180 réutilisées ailleurs, ces dernières étant celles sur lesquelles un geste invasif a été pratiqué sans qu'un candidat médicament leur soit administré. Gavage à la sonde, injections intraveineuses après passage en enceinte thermorégulée, injections intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales et sous-cutanées, instillations oculaires, recueil d'urine de quatre heures, examen ophtalmologique, prélèvement en veine jugulaire sous anesthésie juste avant la mise à mort : le porteur ajoute que la molécule testée peut par elle-même provoquer des effets cliniques. Il s'agit de trouver la dose maximale tolérée avant les études d'efficacité, et le porteur présente ce projet comme une réduction des contraintes futures, puisque les études suivantes utiliseront davantage de souris.

Objectifs

L’objectif principal de la recherche et développement (R&D) est de développer de nouveaux candidats médicaments chimiques ou biologiques qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. des études préliminaires in vivo de sécurité non clinique sont mises en place sur des espèces rongeurs afin de déterminer un profil de sécurité robuste des nouvelles molécules avant administration chez l’Homme,. le développement d’un médicament nécessite d’évaluer à la fois : - la sécurité : par des études de toxicologie sur la souris (procédures encadrées par la présente DAP). - l’efficacité : à l’aide d’études de pharmacologie sur la souris (modèle mimant la pathologie) (procédures encadrées par d’autres DAP). Ces études in vivo de sécurité non clinique interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études vivo d’efficacité) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après des étapes de caractérisation/sélection in vitro (modèles cellulaires de toxicité) et in silico (ex. analyse informatique de la génotoxicité). A ce stade ni la dose efficace ni la première dose toxique in vivo ne sont connues. La réalisation de ces études chez la souris permet de déterminer un intervalle de doses tolérées par l'animal ainsi que la dose maximale à ne pas dépasser. Ces données sont essentielles pour que les études de pharmacologie, utilisant un effectif plus important de souris, puissent être réalisées dans des conditions optimales. Dans ce projet, des études de sécurité non clinique chez la souris seront réalisées afin de prédire la toxicité chez l’animal dans les études d’efficacité qui nécessiteraient d’utiliser de fortes doses et/ou des doses potentiellement toxiques (souvent le cas en oncologie). Elles permettent d’évaluer sur une courte durée et avec moins d’animaux si la dose et le schéma d’administration seront bien tolérés dans les études d’efficacité. L’utilisation de doses croissantes dans ces études peut permettre d’identifier la Dose Maximale Tolérée (DMT) pour un produit (ou un nouveau véhicule) et de l’utiliser en toute sécurité dans les études ultérieures. Ces études utilisent des souris ayant le même fond génétique (modèle non pathologique avec phénotype dommageable non exprimé) que les études d’efficacité afin qu’elles soient les plus prédictives possibles.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet aux doses envisagées en efficacité et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental. Cette approche permet ainsi de réduire les contraintes auxquelles les animaux seraient soumis dans les études d’efficacité par la suite et qui, elles, utiliseront un nombre plus important d’animaux.

Procédures

- A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 3 semaines) de composés par voie orale ou parentérale - A l’administration sous-cutanée d’analgésique avant l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 4h heures sur sable hydrophobe (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang en veine jugulaire réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, nécessitant une contention légère au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet et pour une durée de procédure pouvant aller de 1 jour à 3 semaines, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : •Administration orale de la molécule : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 3 fois par jour). (Degré de sévérité léger) •Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection de la douleur (maximum 2 fois par jour) (Degré de sévérité modéré). •Administrations intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou sous-cutanées : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur (maximum 3 fois par jour). Degré de sévérité léger pour une ip unique ou modéré si l’administration ip est réitérée. Pour les autres types d’administrations degré léger. •Instillation oculaire (topique externe) : la contention d’une durée de moins de 15sec peut générer du stress et la molécule administrée de la douleur pour l’animal. (maximum 1 fois par jour) (Degré de sévérité léger) •Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte, veine mandibulaire ou à la veine caudale : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) (Degré de sévérité modéré) •Recueil urinaire (sable hydrophobe) : le changement d’environnement et l’isolement de courte durée (4 heures maximum) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal (Degré de sévérité léger). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet sera euthanasié à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalo-rachidien pour analyse et d’organes pour lecture anatomopathologique. . Tous les animaux pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule pourront être réutilisés dans un autre projet

Remplacement

Ce projet couvre les études de sécurité très précoces réalisées sur les candidats médicaments de notre recherche, études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. De méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo. Cependant, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes après ces premières étapes de sélection par des méthodes alternatives. Les études incluses dans ce projet ont un design optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données essentielles pour les études ultérieures.

Réduction

Les molécules les plus prometteuses sont sélectionnées à l’aide de tests vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux est adapté à la variabilité des paramètres étudiés et prend en compte l’homogénéité des souches, la disponibilité de données historiques pour les paramètres étudiés et de leur variabilité. Pour ces études, le nombre habituel d’animaux est déterminé pour être le compromis le plus efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint. Il permet d’intégrer de la mixité male/femelle dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Exceptionnellement ce nombre peut être ponctuellement augmenté dans le cas où la variabilité d’un paramètre serait élevée (ex : haute variabilité individuelle dans la distribution du produit). Ces études permettent de confirmer les premières données in vitro, avant de réaliser les études vivo nécessaires à la poursuite du développement de la molécule. Elles participent à la réduction du nombre total d’animaux utilisés par projet thérapeutique car les résultats obtenus sécurisent les études de pharmacologie utilisant un nombre d’animaux plus important en prédisant la toxicité éventuelle aux doses testées. Selon la procédure, un ensemble d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, collecte d’urine, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire. Dans le cas d'un véhicule bien connu, les données historiques internes vont permettre de réduire le nombre d'animaux dans l'étude en supprimant le groupe témoin véhicule). En cas de protocole particulier (ex : nouveau schéma d’administration ou besoin de suivre plus précisément un paramètre/biomarqueur particulier), le service de biostatistiques pourra aider à définir le design expérimental adapté. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) peu invasive, rapide, permet de permet de réduire le nombre d’animaux en réalisant une cinétique complète sur un même individu (sans animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal.

Raffinement

Ces études permettent de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque pour les animaux. Des observations cliniques approfondies sont réalisées chaque jour. Les administrations pourront être réalisées de manière décalée : si un premier animal traité présentait des signes cliniques précoces (30 minutes après traitement par ex.), les autres animaux du groupe pourraient ne pas être traités ou leur dose administrée pourrait être diminuée. Dans tous les cas, si apparition de signes cliniques, une décision rapide est prise entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la SBEA et les équipes en charge des animaux. Cette décision peut mener à une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de dose ou une euthanasie, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude (si besoin utilisation du score d’une grille de points limites spécifique à la souris). L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement strictes empêchant ainsi l’expression du phénotype dommageable lorsque les animaux utilisés sont immunodéprimés. Les animaux sont manipulés par un personnel technique formé au bien-être animal afin de limiter le stress et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier (ex : contention pour administration intraveineuse. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel (signes cliniques nécessitant l’isolement, recueil urinaire), avec de l’enrichissement adapté à la souris (matériel de nidification). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive et peu stressante, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques. Elle permet d’éviter le placement de l’animal dans une enceinte thermorégulée pour la dilatation des vaisseaux. La durée du recueil urinaire sera limitée à son minimum (max 4h) et réalisé en cage conventionnelle en remplaçant la litière par du sable hydrophobe. Cela permet d’éviter l’usage de cage à métabolisme (environnement plus stressant). Dès qu’un acte expérimental nécessite une incision (ex: prélèvement de sang en veine jugulaire), une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

L‘unique procédure de ce projet sera réalisée sur l’espèce souris car elle intervient en amont des études d’efficacité réalisées sur ce modèle. De plus cette espèce présente une forte homologie génétique et physiologique avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature, par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont chez le rongeur. Pour se placer dans les mêmes conditions que les études d’efficacité puis les études requises ultérieurement, les souris utilisées seront des jeunes adultes et adultes, correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.